Summary
Denne artikel beskriver udviklingen af en metode til at fremkalde akut eller kronisk tør øjensygdom hos kaniner ved at injicere concanavalin A til alle dele af orbital lacrimal kirtel system. Denne metode, overlegen i forhold til dem, der allerede er rapporteret, genererer en reproducerbar, stabil model af tørre øjne egnet til studiet af farmakologiske midler.
Abstract
Tør øjensygdom (DED), en multifaktoriel inflammatorisk sygdom i okulær overflade, påvirker 1 ud af 6 mennesker verden over med svimlende konsekvenser for livskvalitet og udgifter til sundhedspleje. Manglen på informative dyremodeller, der opsummerer de vigtigste funktioner, hindrer søgningen efter nye terapeutiske midler til DED. Tilgængelige DED dyremodeller har begrænset reproducerbarhed og effekt. En model præsenteres her, hvor DED er induceret ved at injicere mitogen concanavalin A (Con A) i orbital lacrimal kirtler af kaniner. Innovative aspekter af denne model er brugen af ultralyd (US) vejledning for at sikre optimal og reproducerbar injektion af Con A i ringere lacrimal kirtel; injektion af Con A i alle orbital lacrimal kirtler, der begrænser kompenserende produktion af tårer; og brug af periodiske gentagne injektioner af Con A, der forlænger tilstanden af DED efter behag. DED og dets reaktion på teststoffer overvåges med et panel af parametre, der vurderer tåreproduktion, stabiliteten af tårefilmen og hornhindens og konjunktivalslimhindens status. De omfatter tåre osmolarity, tåre break-up tid, Schirmer's tåre test, rose bengal farvning, og tåre lactoferrin niveauer. Induktionen af DED og overvågningen af dets parametre er beskrevet i detaljer. Denne model er enkel, robust, reproducerbar og informativ. Denne dyremodel er velegnet til undersøgelse af tårefysiologi og af DED's patofysiologi samt til vurdering af kandidatlandenes effektivitet og sikkerhed til behandling af DED.
Introduction
Tør øjensygdom (DED) er en kronisk tilstand med høj prævalens og sygelighed1,2,3,4. Inflammation spiller en central rolle i sin patogenese5,6. DeD's patosysiologi er begrebsbaseret som følge af enten underproduktion eller overfordampning af tårer; førstnævnte er også kendt som vandig-mangelfuld DED7. Sjögrens syndrom, en grundigt undersøgt prototypisk årsag til DED, påvirker primært de lacrimal kirtler (LGs) og er et slående eksempel på deres betydning i PAtogenese af DED. DED behandles ofte med kunstige tårer, som giver midlertidig lindring, eller med cyclosporin eller lifitegrast, som begge undertrykker okulær inflammation. Ingen af de tilgængelige behandlinger for DED er optimale, hvilket nødvendiggør udviklingen af nye agenter8,9.
Jagten på nye terapeutiske midler til DED hæmmes af tre store udfordringer: manglen på et anerkendt lægemiddelbaseret molekylært mål, som kan være undvigende i betragtning af des onfysiologiske kompleksitet; den sparsomme lige så mange lovende agenser og manglen på dyremodeller, der opsummerer centrale funktioner i DED.
Som med de fleste lægemiddeludvikling indsats, informative dyremodeller af DED er et afgørende efterforskningsredskab, på trods af den aksiomatiske erklæring om, at ingen dyremodel helt opsummerer en menneskelig sygdom. Mus, rotte, og kanin modeller af DED er de mest almindeligt anvendte, mens hunde og primater anvendes sjældent10,11. De fleste af de mere end 12 kanin DED modeller rapporteret til dato forsøg på at reducere tåre produktionen ved enten at fjerne LP'er eller ved at hindre deres funktion12,13,14,15,16. Sådanne tilgange omfatter kirurgisk resektion af ILG; lukning af sin ekskretionskanal og forringet LG-funktion ved bestråling eller injektion af et af følgende: aktiverede lymfocytter, mitogener, botulinumtoksin, atropin eller benzalklonium. Større begrænsninger af disse metoder er deres inkonsekvens og den hyppige delvise undertrykkelse af riveproduktionen.
Concanavalin A (Con A), en lectin af vegetabilsk oprindelse, er en potent stimulator T-celle delmængder og har været anvendt i eksperimentelle modeller af hepatitis17 og DED18. Den oprindelige Con A-baserede model blev rapporteret til at tilbyde betydelige fordele, herunder dens relative enkelhed; inflammatorisk celletilstrømning i LP'erne, efterligne sygdomme som Sjögrens; stimulering af de proinflammatoriske cytokiner IL-1β, IL-8 og TGF-β1; reduceret tårefunktion, der overvåges ved måling af tårefluoresceinrydning og brudpå tanderne (TBUT) og lægemiddelreaktion vist for en anti-inflammatorisk kortikosteroid.
Da denne lovende metode blev anvendt, blev der ud over dens fordele konstateret begrænsninger, som nødvendiggjorde dens overordnede revision og drastiske forbedringer. Tre kritiske mangler ved metoden er dokumenteret. For det første var modellen akut. den inducerede DED aftaget efter ca. 1 uge. For det andet var dyrenes reaktion inkonsekvent. Som påvist, i "blinde" transkutane injektioner til ringere LG (ILG), Con A blev leveret kun tilfældigt til den målrettede kirtel. Detaljeret undersøgelse af Anatomi i ILG viste, at dens størrelse kan variere så meget som 4-fold19 gør sådanne injektioner "hit-or-miss" indsats. Endelig, selv når ILG blev injiceret, den overlegne LG (SLG) ofte kompenseret for den reducerede tåre flow, hvilket gør modellen problematisk.
Disse centrale begrænsninger blev overvundet ved at indføre tre ændringer af metoden, genererer en overlegen dyremodel af DED. For det første blev injektionen af Con A i ILG udført under ultralydsvejledning (US), hvilket sikrede, at Con A kom ind i kirtlen. Injektionens succes blev bekræftet ved at opnå et amerikansk billede efter injektionen, som vist i figur 1. For det andet, for at fjerne den kompenserende tåre bidrag SLG, både palpebraal og orbital dele af denne kirtel blev injiceret med Con A. Endelig, denne akutte model af DED blev konverteret til en kronisk ved gentagne injektioner af Con A hver 7-10 dage. DeD af 2 måneders varighed er let opnås hos disse kaniner. Denne fremgangsmådes succes er blevet dokumenteret i det store oghele 19.
Som allerede nævnt er en vigtig anvendelse af dyremodeller af DED at bestemme effekten og sikkerheden af kandidatterapeutiske midler. Nytten af denne model blev demonstreret ved studiet af fosforsulindac (OXT-328), en ny anti-inflammatorisk lille molekyle20,21 administreres som øjendråber. Dens effektivitet blev påvist baseret på et panel af parametre for DED19. Den relative enkelhed og informative karakter af denne model også tilladt side-by-side sammenligning af fosforaninertil de to FDA godkendte lægemidler til DED, cyclosporin og lifitegrast, viser sin stærke prækliniske overlegenhed.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Review Board of Stony Brook University og udført i overensstemmelse med ARVO-erklæringen for anvendelse af dyr i oftalmologiske og visionsforskning.
1. Dyr og boliger
- Anskaf New Zealand White (NZW) kaniner vejer 2-3 kg.
- Der anbringes kaninerne enkeltvis i bure med streng temperatur (65 ± 5 °F) og fugtighed (45 ± 5%) Kontrol. Belysningen skal have en 12 timers on/off cyklus.
- Give ubegrænset adgang til vand og standard kanin chow. Eliminer kostberigelser, da de kan indeholde vitamin A, der påvirker øjet.
- Klimadyrene i mindst 2 uger før baselinemålinger eller induktion af tørre øjne.
2. Metoder til anæstesi og dødshjælp
BEMÆRK: Alle procedurer kræver mild sedation undtagen Con A injektion, der kræver moderat sedation.
- Til mild sedation injiceres acepromazin (1 mg/kg) subkutant over skuldrene med en 26-gauge nål. Slutpunkt for mild sedation: dyr opretholde en afslappet hoved position med øreflipmer ikke længere helt oprejst.
BEMÆRK: Hvis det relevante endepunkt ikke nås, kan der gives en yderligere injektion af acepromazin. Dyr bør altid forblive vågen, lydhør etose over for berøring af deres knurhår, og aldrig vise langsomvejrtrækning. - For moderat sedation, først give dyrene acepromazine som ovenfor. Når slutpunktet er nået (se ovenstående note), giv isofluran ved hjælp af en gasmaske med O2 flow indstillet til 1 L/min og isofluran levering sat til 5%(figur 2).
- Administrere isofluran indtil kaninens kropstone er helt afslappet og ørerne er helt diskette.
BEMÆRK: Der bør ikke forekomme kompenserende muskelbevægelser, når dyret er tændt på siden; vejrtrækning altid forbliver spontan. - Spontan bedring sker inden for 2-5 min: tegn omfatter spontane hovedbevægelser og øget eller normal muskeltone. Når den eksperimentelle procedure er afsluttet med moderat sedation, observere kaniner i ca 30 min eller indtil deres adfærd vender tilbage til normal.
BEMÆRK: Oftalmologisk salve er ikke påkrævet under nogen form for sedation. 1) I mild sedation, dyr er stadig opmærksomme og opretholde en blink refleks. Ved moderat sedation er hæmningen af blinkrefleksen så kort, at okulær overflade ikke er i fare. 2) Placering af oftalmologiske salve på okulær overflade udelukker visualisering af strukturer vurderet under testning. - Eutanasi: Brug en overdosis af intravenøs pentobarbital (100 mg/kg).
3. Fjernelse af nictiterende membran
- Udfør fjernelse n under akklimatiseringsperioden (normalt den første uge) for at muliggøre fuldstændig og præcis evaluering af hornhinden.
-
Injektion til højre nictitating membran
BEMÆRK: Hvis den nictiterende membran i begge øjne skal fjernes, er det enkleste at gøre dette i en session. Start med det ene øje og fortsæt som beskrevet. For klarhed af beskrivelsen, denne metode starter med det rigtige øje.- Placer kaninen i en passende størrelse fastholdetaske.
- Fremkald mild sedation som beskrevet i trin 2.1.
- Påfør 25 μL konserveringsfri lidocain på højre øje ved hjælp af en mikropipette.
- Placer et fleksibelt wirelåg mellem øjenlågene.
- Ved hjælp af 0,3 pincet (eller tilsvarende), tag fat i nictiterende membran på sit spids og udvide den over hornhinden.
- Injicer lidocain 1% med 1:100.000 adrenalin subconjunctivally i bunden af nictiterende membran ved hjælp af en 26-gauge skarp nål(Figur 3A). En moderat bleb bør dannes over nictitating membran.
- Fjern speculum.
- Udfør en identisk injektion med venstre nictiterende membran.
-
Skæring af nictiterende membran
- Efter ca. 5 min. anbringes låget spekulum tilbage i højre øje. Tag fat i og træk den pænere membran tilbage ved toppen ved hjælp af 0,3 pincet (eller lignende).
- Skær nictiterende membran af ved sin base ved hjælp af Westcott saks eller tilsvarende (Figur 3B).
BEMÆRK: Blødning er minimal og kræver typisk ikke ætse. Ikke desto mindre, en høj temperatur batteri cautery er altid holdes i nærheden, hvis yderligere hæmostase er nødvendig. - Fjern speculum.
- Placer aktuel antibiotika salve på øjet (f.eks neomycin, polymyxin, bacitracin, og hydrocortison).
- Lad harderiankirtlen intakt. Den harderiske kirtel ses undertiden, når den nictiterende membran er trukket tilbage.
BEMÆRK: Hvis en stor hvid masse eller vævshøjde ses i den nasale eller overlegne subconjunctival region efter nictiterende membran er fjernet, membranen blev resected for tæt på sin base tillader harderian kirtel til spontant prolaps. For at forhindre dette i efterfølgende procedurer, lad mere af nictitating membran i bunden. - Lad okulær overflade til at helbrede i mindst 1 uge, før yderligere manipulationer er lavet eller okulære overflade analyser udføres.
4. Måling af tørre øjne parametre og indsamling af tåre prøver
BEMÆRK: Mål DED-parametre baseret på behov for undersøgelsesprotokol (f.eks. ved baseline og derefter angivne tidspunkter). Målinger for DED bør ske i følgende rækkefølge, med en streng indsats for at trofast kopiere dem hver gang. Alle dyr skal testes på omtrent samme tidspunkt på dagen (± 1 time) for at minimere døgnrytmen. Disse målinger kræver normalt et hold af to efterforskere.
- Læg kaninen i en fastholdepose. Fremkalde mild sedation.
- Tear Osmolarity22
- Blink øjenlågene 5-10 gange manuelt for jævnt at fordele tårelaget på okulær overflade.
- Træk forsigtigt det nederste låg tilbage.
- Prøve tårer med TearLab Osmometer ved krydset af palpebraal og bulbar conjunctiva langs den nederste fornix, bare posterior til bunden af den afkortede nictiterende membran.
- Mål osmolarity ved hjælp af TearLab Osmolarity Test efter producentens anvisninger.
- Tear break-up tid (TBUT)
- Mørkere plads til denne analyse.
- Placer et wirelåg mellem øjenlågene.
- Påfør et fald på 50 μL på 0,2 % fluorescein over hornhindens overflade ved hjælp af et mikropipette. Hvis selv fordelingen af fluorescein over hornhinden ikke opnås med den første dråbe, placere et andet fald.
- Start straks en timer.
- Overhold pre-hornhinden tåre film under et blåt lys. TBUT defineres som den tid, det tager at udvikle sorte prikker, linjer eller indlysende forstyrrelser af fluoresceinfilmen (figur 4). Hvis det er nødvendigt, skal du bruge kirurgiske lapes, der giver +1,50 forstørrelse for bedre at visualisere tidlige tegn på break-up. Skærm i op til 1 min. hvis brud det som defineret her sker efter 1 min, skal du optage TBUT for kun 60 s.
- Schirmer's Tear Test (STT)
- Påfør en 25 μL dråbe konserveringsfri lidocain på okulær overflade.
- Placer en Weck celle kirurgisk spyd i ringere fornix at absorbere resterende lidocain og enhver tårevæske. Brug om nødvendigt det nederste øjenlåg til at dække svampens proksimale ende for at hjælpe med at holde det på plads (figur 5A).
- Efter ca 30 s, fjerne Weck svamp.
- Indsæt straks en Schirmer's tåre test strip i rummet mellem hornhinden og palpebral conjunctiva på midten af det nederste låg.
- Start straks en timer(figur 5B).
- Efter 5 min, måle længden af den fugtede del af strimlen; Dette er STT-værdien.
- Udfør mål i treeksemplarer, og rapporter gennemsnittet af de 3 aflæsninger som STT-værdien.
- Indsamling af tåreprøver
- For at indsamle tåreprøver til analyse af niveauer af forskellige analysander i dem, såsom lactoferrin, efter at STT-værdien er registreret ved 5 min, skal du lade strimlen være på plads, indtil der er opnået fugtning på mindst 20 mm.
BEMÆRK: Hvis der ikke forekommer tilstrækkelig befugtning, efter at DED er blevet induceret, skal du rykke strimlen dybere ind i den nederste fornix for at hjælpe med at nå dette endepunkt på rimelig tid. - Skær den fugtede strimmel og læg straks i 490 μL kølede Tear Collection Buffer (4% BSA, 1M NaCl, 0,1% Tween-20 i PBS med proteinase hæmmer cocktail).
- Opbevar prøverne på is, indtil de kan opbevares ved -80 °C, hvor de skal forblive, indtil de er blevet assayed.
- For at indsamle tåreprøver til analyse af niveauer af forskellige analysander i dem, såsom lactoferrin, efter at STT-værdien er registreret ved 5 min, skal du lade strimlen være på plads, indtil der er opnået fugtning på mindst 20 mm.
- Rose Bengal Farvning (RBS)
- Påfør 50 μL konserveringsmiddelfri lidocain på hornhinden ved hjælp af en mikropipette.
- Efter 30 s, sted 25 μL af 1% steg bengal på okulær overflade og manuelt blinke øjenlåget til at fordele det jævnt.
- Start straks en timer.
- På 3,5 min, placere en wire låg speculum mellem lågene.
- På 4,0 min, fotografere den overlegne konjunktival og hornhinde overflade (Figur 6).
BEMÆRK: Juster til den type kamera, der bruges. Typiske indstillinger: digital enkelt-linse refleks kamera, blænde prioritet tilstand (blænde 13 eller derover), ISO 6000, 100 mm makroobjektiv fastgjort med to 12,5 mm forlængerrør, manuel fokustilstand, linse ved maksimal forstørrelse, og belysning fra makro / ring flash indstillet til automatisk med gennem-the-linse mode. Ringen flash fokus lampe er tændt for at støtte fokus på hornhinden. - Gennemfør alle billeder til begge øjne inden for 1 min.
- Score okulær overflade farvning ved hjælp af NEI metode23 ændret som følger. Må ikke lønklasse 6 separate konjunktival zoner. Score den overlegne conjunctiva af hvert øje. Dette er den del af konjunktival overfladen let fotograferes uden at manipulere kloden. Manipulation kunne artefactually ændre farvning af okulær overflade.
- Tåre lactoferrin niveauer er et surrogat mål for tåre produktion fra lacrimal kirtler. Analyse tåre lactoferrin i tårer indsamlet som ovenfor ved hjælp af et enzym-forbundet immunsorbent assay24 kit efter instruktioner fra producenten.
5. Induktion og behandling af tørre øjne
BEMÆRK: Tre dele af orbital lacrimal kirtel systemet injiceres.
- Se kaninerne med acepromazine 0,2 mg/kg subkutant.
- Shear pelsen i periorbital og hovedbund område og helt fjerne eventuelle resterende pels ved hjælp af Nair. Lad huden helt glat for bedre visualisering af de anatomiske kendetegn og USA-guidet injektion af concanavalin A (Figur 7).
- Fremkald moderat sedation som beskrevet ovenfor.
- Injektion af palpebraal del af den overlegne lacrimal kirtel (PSLG)
BEMÆRK: Udfør først injektion af PSLG.- Påfør det passende øje 25 μL konserveringsfri lidocain 1% med et mikropipette.
- Evert det øverste øjenlåg og anvende blide mediale tryk på den bageste orbital fælg, indtil protuberance markerer palpebraal del af kirtel ses. PSLG fremstår som en lille pæreformet højde i den bageste (tidsmæssige) del af det øverste låg.
BEMÆRK: For at se kirtelvævet under indlæringsprocessen anvendes 5 % fluorescein til området (figur 8A). Tårer kan ses streaming fra den pæreformede PSLG. Anvendelse af fluorescein er ikke nødvendig for administrationen af Con A; Det gøres kun til illustration formål at vise kirtelvæv. - Brug fine-tandede pincet og en 27-gauge nål på en tuberkulin sprøjte, direkte trænge ind i kirtlen ved hjælp af en transconjunctival tilgang. Nålen 2 mm frem i vævet og tilføres 500 μg Con A i et volumen på 0,1 ml (figur 8B).
BEMÆRK: Denne injektion kan nogle gange være smertefuld. Hvis det er nødvendigt, skal dyrene holdes under isofluran, indtil injektionen er afsluttet.
- Injektion af orbital overlegen lacrimal kirtel (OSLG)
BEMÆRK: OSLG følger i hurtig rækkefølge.- Påfør mediale pres på kloden forårsager OSLG at stikke ud fra den bageste incisure (se ref25 for anatomi, hvis det er nødvendigt). Påfør mediale pres på kloden(Figur 9, rød pil) med forspringet af OSLG fra den bageste incisure. Den protuberance fungerer som grov lokalisering for at finde den bageste incisure.
- Brug buede pincet med tips lukket for at indrykke området, indtil knoklet åbning i kraniet mærkes. Dette vil være slids-lignende med en anterior / posterior retning under protuberance.
- Påfør beskedent tryk med pincet til at efterlade en indrykning i huden, som vil tjene som vartegn for nål placering (Figur 10A).
- Sæt en nål (tuberkulin sprøjte med en 27-gauge, 5/8-tommer nål) vinkelret på huden over indrykningsmærket (Figur 10B) ~ 1 /4 tommer i snittet, derefter omdirigere nålen posteriort og eksternt mod den laterale canthus sigter mod midtpunktet mellem injektionsstedet og knoklet fælg.
BEMÆRK: Hvis snittet ikke er præcist målrettet med nålen, kraniet blokerer sin avancement. - Når nålens nav er nået, injiceres langsomt 1000 μg Con A i et volumen på 0,2 ml (figur 10C).
- Fuldfør injektionen af både PSLG og OSLG inden for 2-3 min.
- Fjern dyret fra isofluran sedation (hvis det endnu ikke er gjort). Injektion af ringere lacrimal kirtel (ILG) kan normalt udfyldes uden yderligere sedation.
- Injektion af den ringere lacrimal kirtel
- Se dyret fra siden. ILG's fremtrædende plads kan ses langs den nederste forreste del af kredsløbet (figur 11A).
- Tegn en lodret linje ved hjælp af en kirurgisk mærkningspen eller passende permanent markør på huden, hvor den overfladiske del af ILG-kirtlen overgange fra dens overfladiske (mere eksterne) hvilested på zygomatisk knogle til dens mere mediale placering i kredsløbet. Dette er typisk ringere end den anterior limbus (Figur 11A).
- Identificer slutningen af zygomatic knoglen ved at feje den vertikalt holdt amerikanske sonde over denne linje på huden. ILG-overgangen opstår, hvor billedet af kirtlen skifter fra klart afgrænset (hyperechoic linje af zygomatic knoglen ses langs den nederste kant af kirtlen i billedet) til en uden en genkendelig mediale kant (zygomatic knogle ekko er ikke længere til stede, Figur 1).
- Overhold håndstykkets relative position på den linje, der trækkes på huden, når den amerikanske skærm viser denne ændring. Dette er det "injektionssted", hvor Con A skal gives.
- Kontroller injektionens dybde, så Con A placeres i kirtlen på et punkt, der lige skal mediale stilk mod den zygomatiske bueknogle.
- Anstil injektionens dybde på følgende måde: Indstil den ønskede injektionsdybde som dybden af zygomatisk knogle (hyperechoic signal) plus 1 mm. Træk denne værdi fra nålens kendte længde (15 mm i dette eksempel).
- Sæt nålen ind i kirtlen på "injektionsstedet" ~12 mm, og træk den langsomt tilbage, indtil længden af den eksponerede nål uden for kroppen (målt med kirurgiske calipre) er lig med forskellen beregnet i 5.8.6 (Figur 12). Tilføres 1000 μg Con A i 0,2 ml.
BEMÆRK: For at sikre, at kirtelkapslen gennembores og ikke blot skubbes af nålen, skal nålen indsættes ~12 mm eller næsten til navet, før dens tilbagetrækning begynder. - Gentag USA for at bekræfte injektionens succes. ILG bør udvise et karakteristisk hypoechoic-rum (figur 1).
BEMÆRK: ILG injektion er den, der bedst tolereres af dyrene26 og er derfor gjort sidst.
- Gennemfør hele proceduren for at injicere alle kirtler i begge øjne inden for 10 min. Dette vil kræve, at der opnås kompetence i proceduren.
BEMÆRK: Et enkelt sæt injektioner i de 2 orbital lacrimal kirtler vil fremkalde akut DED varig 1-2 uger. - For DED af længere varighed, injicere Con A nøjagtigt som over hver 7 dage. Op til 6 sådanne injektioner er blevet udført med succes.
6. Pleje efter proceduren
- Efter injektion af Con A skal dyrene i deres fastholdelsesposer overvåges i mindst 10-20 min, eller indtil bedøvelseseffekten er slidt ned.
- Lad ikke dyrene være uden opsyn, før de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency. Returner dem ikke til deres individuelle bure, før de er fuldt tilbagebetalt.
- Smerter efter proceduren er normalt mild og varer mindre end 48 h. Vurder smerter med kaningrimasseskalaen. Giv om nødvendigt en enkelt dosis subkutan ketorolac (5 mg/kg). For mere svære smerter, give subkutan buprenorphin 0,1 mg/kg hver 8 timer.
Representative Results
Con A injektioner induceret en stærk inflammatorisk respons i lacrimal kirtler karakteriseret ved en tæt lymfocytisk infiltrere (Figur 13), ledsaget af nedsat tåre produktion. Alle tåreparametre blev markant ændret(tabel 1 og tabel 2). Desuden blev tårelactoferrinniveauer undertrykt (kontrol = 3,1±0,45 vs. Con A injiceret = 2,7±0,02 ng/mg protein (gennemsnitlig ± SEM); p<0,03). Slutresultatet var en kompromitteret hornhinde og konjunktival epitel, fremgår af øget rose bengal farvning (Figur 6).
Injektion af de tre orbital LG væv produceret en konsekvent og ensartet DED tilstand i modsætning til de stater, der opnås ved tidligere metoder18,27. De vigtigste bidragydere til dette resultat var den amerikansk styrede injektion af ILG og injektionen af OSLG. Tabel 1 opsummerer de vigtigste resultater af denne metode. Alle ændringer er i overensstemmelse med svær DED.
Et enkelt sæt Con A injektioner producerer DED varer omkring 1 uge; alle kliniske parametre normaliseres ved dag 10 (tabel 2). Sekventielle Con A injektioner omkring 1 uges mellemrum forlænge varigheden af DED i overensstemmelse hermed. For eksempel, det andet sæt Af Con A injektioner på dag 7 fastholder DED i 2 uger og så videre. Efter ca. 5 sæt injektioner bliver DED-tilstanden ofte permanent uden behov for yderligere injektioner.
Når kaniner med Con A-induceret DED blev behandlet med den nye agent phosphosulindac, det markant undertrykt sygdommen. Efter en uges behandling med dette middel steg TBUT f.eks. Mekanistisk, fosforsulindac faldt niveauet af to afgørende interleukins, IL-1β (8,4 ± 1,2 vs 21,2 ± 6,6 pg/mg protein; p<0,03) og IL-8 (4,9±1,7 vs. 13,5±5,0 pg/mg protein; p<0.05)19.
Figur 1: Ultralydbillede af den ringere lacrimal kirtel. Øverste panel: ILG, da den bevæger sig dybere i kredsløb for at ligge under zygomatic buen. Den stiplede linje repræsenterer den linje på huden, hvorigennem den amerikanske sonde er fejet. Midterste paneler: Da håndstykket fejes hen over denne linje, søger eksaminatoren efter tab af det zygomatiske knogleekko, der er til stede i venstre billede (pil)og forsvinder i højre side. Nederste paneler: Billeder af ILG taget før (venstre) og efter(højre)injektion af Con A. Udvikling af et stort cystisk rum i kirtlen bekræfter korrekt levering. Genoptrykt med tilladelse19. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Gasmaskesedation. Dette fotografi viser gasmaske giver kort moderat sedation med isofluran. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fjernelse af nictiterende membran. (A) Injektion af lidocain/adrenalin. (B) Afkortning af nictiterende membran i bunden med Westcott saks. C) Den okulære overflade visualiseret lettere efter fjernelse af nictitating membran. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Måling af tåreopløsningstid. (A) Ensartet grøn tåre film udseende af hornhinden overflade under blåt lys umiddelbart efter påføring af fluorescein dråber. (B) Hornhindeoverflade, der allerede har gennemgået markant opløsning, som fremgår af flere mørke rande og lineære striber i fluorescein. Break-up tid registreres, så snart den første mørke plet eller linje udvikler sig. De to lyseblå cirkler er refleksioner af lyskilden ud af hornhinden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Schirmers tåretest. (A) Korrekt placering af Weck-Cel svampen i den nederste fornix at fjerne enhver resterende aktuel lidocain opløsning og baseline tårer. Ved at placere den bageste kant af den trekantede svamp under den nederste låg margen, kan man opretholde en meget ensartet teknik til at tørre okulær overflade før placeringen af tårestrimlerne. (B) En tårebånd, der er placeret på en passende placering midt på det nederste låg mellem globus og nederste låg (palpebral conjunctiva). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Rose bengal farvning. Øvre: Fotografier af hornhindens overflade. Venstre: Ingen rose bengal farvning er til stede før behandling med Con A. Højre: Diffus hornhinde og conjunctival farvning ses i den øverste nasalkvadrant post-injektion (øverst til højre). Lavere: Conjunctival indtryk cytologi fra den overlegne bulbar conjunctiva. Venstre: Talrige bægerceller er til stede før behandling. Højre: Epitelceller er til stede, men bægerceller er fraværende efter behandling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Forberedelse af kanin til concanavalin A injektioner. (A) Små saks bruges til at fjerne pels, så lettere visualisering af landemærker til at identificere orbital overlegen lacrimal kirtel. (B) Nair bruges til at fjerne hår, der er tilbage efter klipning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Injektion af palpebraal lacrimal kirtel. (A) Den palpebral lacrimal kirtel, der optræder som en pæreformet højde i den bageste tidsmæssige del af det øverste låg. Tårer ses streaming fra overfladen af denne kirtel efter påføring af et fald på 2% fluorescein. (B) Den palpebrale lacrimal kirtel injiceres, mens kaninen får moderat sedation. En investigator trækker øjenlåget tilbage, optimerer eksponeringen af kirtel, og sikrer masken, mens den anden investigator injicerer kirtel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Lokalisering af orbital overlegen lacrimal kirtel. Ændringer i hudkonturer angiver placeringen af OSLG, da det stikker ud gennem den bageste fortrædning. Skiftevis mediale pres på kloden(stor pil)forårsager den overlegne orbital kirtel til prolaps, som ses som en lille højde i huden. Denne højde vil stige i størrelse, hver gang trykket anvendes(små pile). Placeringen af denne kirtel er normalt i overensstemmelse med den bageste orbital fælg. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Injektion af orbital overlegen lacrimal kirtel. (A) Anvendelse af bænsomt tryk på kraniet med fintanderede pincet i det område, der fremskred som i figur 9. En tynd slids-lignende åbning i kraniet kan palperet. Efterlader en lille indrykning mærke med pincet i høj grad hjælper placering af nålen under injektion. (B) Nålen indsættes vinkelret gennem incisuret. Hvis den placeres forkert, dens passage er stoppet af knoklet kraniet. (C) Nålen er vinkelret mod den laterale kanthus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11: Lokalisering af den ringere lacrimal kirtel. (A) Den overfladiske del af ILG, der ses gennem det nederste låg. Det kurvede pennemærke angiver den nederste position af kirtlen. Den lodrette linje, under nasal limbus, betegner den omtrentlige position, hvor ILG overgange til en dybere position i kredsløb et og fungerer som en visuel reference for USA. B) amerikansk håndstykke, der fejer hen over den lodrette linjes område den amerikanske monitor vil vise, hvor zygomatic knoglen ender, hvor ILG overgange, og hvor Con A injektion skal gives ("injektionssted"). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 12: Injektion af den ringere lacrimal kirtel. Injektion af ILG sker på det sted, identificeret af USA. Injektionsdybden beregnes som beskrevet i teksten (trin 5.8.6). Calipre (set bag nålen) sikre, at nålen er placeret på den rette dybde før injektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 13: Histologi af lacrimal kirtler. Vævsdele af en normal ringere lacrimal kirtel med typisk tubulo-alveolær struktur (A) og efter injektion af Con A (B), viser markant lymfocytisk infiltrere med effacement af struktur. Lignende inflammatoriske infiltrerer ses i den overlegne lacrimal kirtler. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Injektionsmetode | TBUT, sek. | Tear Osmolality, Osm/L | STT, mm | |||
| Oprindelige | Efter injektion | Oprindelige | Efter injektion | Oprindelige | Efter injektion | |
| gennemsnitlig ± SEM, % ændring | ||||||
| ILG uden amerikansk vejledning | 58,5 ± 1,5 | 44,5 ± 7,7 | 297 ± 4,9 | 300 ± 3,8 | 15,2 ± 0,9 | 12,9 ± 2,2 |
| %ændring | -23% | 1% | -15% | |||
| p=0,05 | p=0,36 | p=0,21 | ||||
| USA-guidede ILG + PSLG | 59,4 ± 0,6 | 11,4 ± 4,2 | 296 ± 4,7 | 326 ± 3,7 | 15,1 ± 1,3 | 10,7 ± 1,8 |
| % ændring | -81% | 10% | -29% | |||
| p<0.0001 | p<0.0001 | p<0.03 | ||||
| USA-guidede ILG + PSLG + OSLG | 60 ± 0,0 | 6.2 ± 1.3 | 299 ± 2,9 | 309 ± 2,8 | 14,6 ± 0,9 | 9,9 ± 1,3 |
| % ændring | -90% | 3% | -32% | |||
| p<0.0001 | p<0.008 | p<0.002 | ||||
| Alle værdier blev målt på dag 6 efter en enkelt injektion af Con A i de anførte kirtler. Alle sammenligninger blev foretaget med baseline. * ILG, ringere lacrimal kirtel; PSLG, palpebraal del af overlegen lacrimal kirtel; OSLG, orbital del af overlegen lacrimal kirtel; USA, ultralyd. | ||||||
Tabel 1: Injektionsteknikkens virkning og antallet af injektionssteder på tør øjesværhedsgraden.
| Oprindelige | Dag 6 | Dag 13 | Dag 21 | |
| 1 injektion | 2 injektioner | 3 injektioner | ||
| TBUT, sek. | 58,5 ± 1,5 | 44,5 ± 7,7 | 29,2 ± 7,8 | 12,8 ± 3,9 |
| % ændring | -24% | -50% | -78% | |
| p=0,17 | p=0,001 | p<0.0001 | ||
| TOsm, Osm/L | 297 ± 4,9 | 300 ± 3,9 | 308 ± 4,9 | 313 ± 2,7 |
| % ændring | 1% | 4% | 5% | |
| p=0,36 | p=0,04 | p=0,003 | ||
| STT, mm | 15,2 ± 0,9 | 9,3 ± 1,6 | 12,9 ± 1,6 | 7,4 ± 1,1 |
| % ændring | -39% | -15% | -51% | |
| p=0,17 | p=0,13 | p=0,008 | ||
| Der blev foretaget sammenligninger med baseline. | ||||
Tabel 2: Virkningen af gentagne Con A-injektioner i ILG på varigheden af DED.
Discussion
Kaniner er meget attraktive for studiet af DED. Deres hornhinde og bindehinde har et overfladeareal tættere på mennesker i forhold til mus og rotter; deres supplement af narkotika metaboliserende enzymer såsom esteraser, og histologi af deres lacrimal kirtler svarer til mennesker, og deres øjne er store nok til informative farmakokinetiske undersøgelser. Sammenlignet med svin og aber, som de deler lignende funktioner, koster de mindre, og deres eksperimentelle manipulation er lettere. Hvis mekanistiske undersøgelser overvejes, er en relativ ulempe ved kaninen sammenlignet med mus, at der findes færre reagenser (f.eks. monoklonale antistoffer). På den anden side er kaninen langt bedre end mus til farmakokinetiske undersøgelser og biodistributionundersøgelser, fordi individuelle væv let dissekeres og af tilstrækkelig størrelse til analysearbejde, så man undgår "prøvepooling".
En kritisk generel parameter er kaninernes akklimatiseringsperiode. Dyrene sendes fra leverandøren under forhold, der ofte ikke sikrer et transportmiljø af passende temperatur eller fugtighed. Nogle dyr har måske allerede udviklet tørre øjne ved ankomsten. En to-ugers periode med akklimatisering anbefales. Lige så vigtigt er nøje opmærksomhed på fugtighed og temperatur i det rum, hvor undersøgelsen kaniner er anbragt i vivarium. Afvigelser i begge forhold kan fremkalde store variationer i deres øjenstatus. Har back-up luftfugtere og affugtere ved hånden. Hvis det centrale system svigter, skal du handle hurtigt for at genoprette den omgivende luftfugtighed ved hjælp af reserveudstyret. Husk på, at en sådan uheldig udvikling er mere almindelig i sommermånederne. De tre mest kritiske skridt, dog for en vellykket overtalelse AFDE hos kaniner er: 1) den dygtige brug af amerikanske billeddannelse til at identificere ILG og til at lede og bekræfte injektion af Con A; 2) sikring af injektion af både ILG og de to dele af SLG og 3) pålideligt og reproducerbart at sige parametrene for DED.
Udvikling af de krævede eksperimentelle færdigheder er ikke trivielt, men bør ikke afskrække nogen seriøs efterforsker. Forvent, at indlæringskurven skal udfyldes inden for fem gentagelser. Et amerikansk billedbehandlingssystem af rimelig kvalitet er afgørende. Anerkendelse af anatomiske kendetegn ved USA er vigtig, derfor bør investigator gennemgå kanin anatomi. Den fremragende beskrivelse af kanin anatomi af Davis25,en klassiker, kan være uhyre nyttigt. Også huske på variationen i størrelsen af ILG. Konsekvensen af dette er, at succesen med Con A altid skal bekræftes med opfølgning billeddannelse. Variationer i reaktionen på Con A i en gruppe af kaniner skyldes oftest injektionsteknikken (mislykket eller delvis vellykket injektion) eller ignorerer kapaciteten af resterende lacrimal kirtelvæv til at kompensere med overproduktion af tårer. For dem, der ønsker at mestre injektion steknik, indsprøjtning methylenblåt efterfulgt af hurtig anatomisk dissektion kan være nyttigt; visualisering opnås, hvis den når den lacrimal kirtel eller spild på tilstødende væv. Til dato, denne injektion metode er blevet udført over 270 gange af forfatterne uden en enkelt komplikation.
At sige de fem parametre for DED præsenteret ovenfor kan være lige så vanskelig som er deres beslutsomhed i klinisk praksis. Selv om døgnrytmevariationer endnu ikke er formelt dokumenteret i nogen af dem, er der nok baggrundsbeviser for sådanne fænomener i øjet28, at de bør assayed på samme tidspunkt af dagen (± 1 time), især når gentagne analyser skal udføres og sammenlignes med hinanden. Konsekvens i udførelsen af disse analyser er afgørende. Der kræves et hold på to. Fire eller flere efterforskere i samme rum, der deltager i assays kan være forstyrrende, da nogle skridt kræver streng timing. Passende fotografisk dokumentation af høj kvalitet, hvor det er angivet, er vigtig.
Denne model er velegnet til lægemiddeludviklingsundersøgelser. Beherskelse af dyremodellen og analyseteknikkerne sikrede fremragende reproducerbarhed19 af effektivitets- og sikkerhedsundersøgelser.
Dette er en kraftfuld eksperimentel tilgang, fordi det eliminerer den forvirrende variabilitet af tidligere modeller, har strømlinet dyremodellen og i det væsentlige standardiseret at sige de fem parametre for DED. Den vellykkede anvendelse af denne model til studiet af en kandidat terapeutisk middel har bekræftet sin praktiske nytte som en informativ dyremodel for en sygdom i desperat behov for nye midler og en dybere forståelse af sin patogenese.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser undtagen FOR BR, der har en egenkapital position i Medicon Pharmaceuticals, Inc. og Apis Therapeutics, LLC; og LH, en ansat hos Medicon Pharmaceuticals, Inc. med en egenkapitalposition i Apis Therapeutics, LLC.
Acknowledgments
Alle dyreforsøg blev afsluttet i overensstemmelse med og overholdelse af alle relevante lovgivningsmæssige og institutionelle retningslinjer. Alle undersøgelser blev godkendt af Institutional Review Board of Stony Brook University og udført i overensstemmelse med ARVO-erklæringen for anvendelse af dyr i oftalmologiske og visionsforskning.
Disse undersøgelser blev delvist støttet af et tilskud til målrettede forskningsmuligheder fra Stony Brook University School of Medicine (Grant Number 1149271-1-82502) og et forskningstilskud fra Medicon Pharmaceuticals, Inc., Setauket, NY. Forfatterne takker Michele McTernan for redaktionel støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm macro lens | Canon EF 100mm f/2.8L IS USM | 3554B002 | |
| 26 gauge needles (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305115 | Needles for injecting ConA into the lacrimal glands |
| 27 gauge needles (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305921 | Needles for injecting ConA into the lacrimal glands |
| Aceproinj (acepromazine) | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NDC11695-0079-8 | 0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation |
| Anesthesia vaporizer | VetEquip, Pleasanton, CA | Item #911103 | |
| Bishop Harmon Forceps | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E1500-C | Tissue forceps |
| Caliper | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E-2404 | Caliper used to measure length of needle during ConA injection |
| Concanavalin A | Sigma, St. Louis, MO | C2010 | Make 5mg/ml in PBS for injection into rabbit lacrimal glands |
| DSLR camera | Canon EOS 7D DSLR | 3814B004 | Digital single lens reflex camera |
| fluorescein | AKRON, Lake Forest, IL | NDC17478-253 | Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT |
| Isoflurane | Henry Schein, Melville, NY | 29405 | |
| Lactoferrin ELISA kit | MyBiosource, San Diego, CA | MBS032049 | Measure tear lactoferrin level |
| lidocaine | Sigma, St. Louis, MO | L5647 | 1% in PBS for anesthesia agent |
| macro/ring flash | Canon Macro Ring Lite MR-14EXII | 9389B002AA | |
| Osmolarity tips | TearLab Corp., San Diego, CA | #100003 REV R | Measure tear osmolarity |
| PBS (phosphate buffered saline) | Mediatech, Inc. Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Rabbit, New Zealand White or Dutch Belted (as described in text) | Charles River Labs, Waltham, MA | 2-3 kg | Research animals |
| Rose Bengal | Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO | NDC51801-004-40 | 1% in PBS, stain the ocular surface |
| Schirmer strips | Eaglevision, Katena products. Denville, NJ | AX13613 | Measure tear production |
| Surgical Loupes +1.50 | Designs for Vision, Bohemia, NY | Specialty item | Provide magnificantion of ocular surface while observing tear break up and performing Concanavalin A injections. |
| TearLab Osmometer | TearLab Corp., San Diego, CA | Model #200000W REV A | Measure tear osmolarity |
| Ultrasound probe | VisualSonics Toronto, Ont | MX 550 S | Untrasonography-guide Con A injection for inferior lacrimal gland |
References
- Paulsen, A. J., et al. Dry eye in the Beaver Dam Offspring Study: prevalence, risk factors, and health-related quality of life. American Journal of Ophthalmology. 157 (4), 799-806 (2014).
- Vehof, J., Kozareva, D., Hysi, P. G., Hammond, C. J. Prevalence and risk factors of dry eye disease in a British female cohort. British Journal of Ophthalmology. 98 (12), 1712-1717 (2014).
- Tan, L. L., Morgan, P., Cai, Z. Q., Straughan, R. A. Prevalence of and risk factors for symptomatic dry eye disease in Singapore. Clinical and Experimental Optometry. 98 (1), 45-53 (2015).
- Craig, J. P., et al. TFOS DEWS II Report Executive Summary. The Ocular Surface. 15 (4), 802-812 (2017).
- Baudouin, C., et al. Clinical impact of inflammation in dry eye disease: proceedings of the ODISSEY group meeting. Acta Ophthalmologica (Copenhagen). 96 (2), 111-119 (2018).
- Calonge, M., et al. Dry eye disease as an inflammatory disorder. Ocular Immunology and Inflammation. 18 (4), 244-253 (2010).
- Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. The Pathophysiology of Dry Eye Disease: What We Know and Future Directions for Research. Ophthalmology. 124 (11S), S4-S13 (2017).
- Buckley, R. J. Assessment and management of dry eye disease. Eye (London, England). 32 (2), 200-203 (2018).
- Clayton, J. A. Dry Eye. New England Journal of Medicine. 378 (23), 2212-2223 (2018).
- Barabino, S. Animal models of dry eye. Archivos de la Sociedad Española de Oftalmología. 80 (12), 695-696 (2005).
- Stern, M. E., Pflugfelder, S. C. What We Have Learned From Animal Models of Dry Eye. International Ophthalmology Clinics. 57 (2), 109-118 (2017).
- Chen, Z. Y., Liang, Q. F., Yu, G. Y. Establishment of a rabbit model for keratoconjunctivitis sicca. Cornea. 30 (9), 1024-1029 (2011).
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Gray, K. L. A new rabbit model for keratoconjunctivitis sicca. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (2), 225-228 (1987).
- Guo, Z., et al. Autologous lacrimal-lymphoid mixed-cell reactions induce dacryoadenitis in rabbits. Experimenal Eye Research. 71 (1), 23-31 (2000).
- Burgalassi, S., Panichi, L., Chetoni, P., Saettone, M. F., Boldrini, E. Development of a simple dry eye model in the albino rabbit and evaluation of some tear substitutes. Ophthalmic Research. 31 (3), 229-235 (1999).
- Xiong, C., et al. A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (5), 1850-1856 (2008).
- Heymann, F., Hamesch, K., Weiskirchen, R., Tacke, F. The concanavalin A model of acute hepatitis in mice. Lab Animal. 49 (1 Suppl), 12-20 (2015).
- Nagelhout, T. J., Gamache, D. A., Roberts, L., Brady, M. T., Yanni, J. M. Preservation of tear film integrity and inhibition of corneal injury by dexamethasone in a rabbit model of lacrimal gland inflammation-induced dry eye. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 21 (2), 139-148 (2005).
- Honkanen, R. A., Huang, L., Xie, G., Rigas, B. Phosphosulindac is efficacious in an improved concanavalin A-based rabbit model of chronic dry eye disease. Translational Research. 198, 58-72 (2018).
- Huang, L., et al. The novel phospho-non-steroidal anti-inflammatory drugs, OXT-328, MDC-22 and MDC-917, inhibit adjuvant-induced arthritis in rats. British Journal of Pharmacology. 162 (7), 1521-1533 (2011).
- Mattheolabakis, G., et al. Topically applied phospho-sulindac hydrogel is efficacious and safe in the treatment of experimental arthritis in rats. Pharmaceutical Research. 30 (6), 1471-1482 (2013).
- Osmalek, T., Froelich, A., Tasarek, S. Application of gellan gum in pharmacy and medicine. International Journal of Pharmaceutics. 466 (1-2), 328-340 (2014).
- Lemp, M. A. Report of the National Eye Institute/Industry workshop on Clinical Trials in Dry Eyes. Contact Lens Association of Ophthalmologists Journal. 21 (4), 221-232 (1995).
- Dal Piaz, F., Braca, A., Belisario, M. A., De Tommasi, N. Thioredoxin system modulation by plant and fungal secondary metabolites. Current Medicinal Chemistry. 17 (5), 479-494 (2010).
- Davis, F. A. The Anatomy and Histology of the Eye and Orbit of the Rabbit. Transactions of the American Ophthalmological Society. 27, 402-441 (1929).
- Lima, L., Lange, R. R., Turner-Giannico, A., Montiani-Ferreira, F. Evaluation of standardized endodontic paper point tear test in New Zealand white rabbits and comparison between corneal sensitivity followed tear tests. Veterinary Ophthalmology. 18 (Suppl 1), 119-124 (2015).
- Zheng, W., et al. Therapeutic efficacy of fibroblast growth factor 10 in a rabbit model of dry eye. Mol Med Report. 12 (5), 7344-7350 (2015).
- Wiechmann, A. F., Summers, J. A. Circadian rhythms in the eye: the physiological significance of melatonin receptors in ocular tissues. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (2), 137-160 (2008).
