Summary
O objetivo do protocolo é demonstrar as técnicas utilizadas para investigar a doença viral, isolando e quantificando o vírus Zika, de múltiplos órgãos em um camundongo após a infecção.
Abstract
Os métodos apresentados demonstram procedimentos laboratoriais para o isolamento de órgãos de animais infectados pelo vírus Zika e a quantificação da carga viral. O objetivo do procedimento é quantificar os títulos virais em áreas periféricas e do SNC do camundongo em diferentes pontos temporais pós-infecção ou diferentes condições experimentais para identificar fatores virológicos e imunológicos que regulam a infecção pelo vírus Zika. Os procedimentos da isolação do órgão demonstraram permitem a quantificação do ensaio da formação do foco e a avaliação quantitativa do PCR de Titers virais. As técnicas rápidas da isolação do órgão são projetadas para a preservação do Titer do vírus. A quantificação do Titer viral pelo ensaio de conformação de foco permite a avaliação rápida da taxa de transferência do vírus Zika. O benefício do ensaio de formação de foco é a avaliação do vírus infeccioso, a limitação deste ensaio é o potencial para toxicidade de órgãos reduzindo o limite de detecção. A avaliação do Titer viral é combinada com o PCR quantitativo, e usar um número de cópia do genoma viral do controle da cópia do RNA recombinante dentro do órgão é avaliado com baixo limite de deteção. No geral, essas técnicas fornecem um método de alta taxa de transferência rápida e precisa para a análise dos títulos virais da Zika na periferia e no SNC dos animais infectados pelo vírus Zika e podem ser aplicados à avaliação de títulos virais nos órgãos de animais infectados com a maioria dos patogénicos, incluindo o vírus da dengue.
Introduction
O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus pertencente à família Flaviviridae, que inclui importantes patógenos humanos neuroinvasivos, como o vírus Powassan (POWV), o vírus da encefalite japonesa (JEV) e o vírus do Nilo Ocidental (WNV)1. Após seu isolamento e identificação, houve relatos periódicos de infecções humanas de zikv na África e na Ásia2,3,4,5e epidemias dentro da América Central e do Sul (revisada em referência6). Entretanto, não era até recentemente que o ZIKV estêve pensado para causar a doença severa7. Agora há milhares de casos de doença neurológica e defeitos congênitos ligados a infecções por ZIKV. A rápida emergência do ZIKV tem alertado para muitas questões relacionadas com: por que há um aumento na severidade da doença, qual é a resposta imunológica à infecção por ZIKV e existem patologias virais e/ou imunes mediadas ligadas ao aumento da manifestações e defeitos congênitos. Há agora uma pressa para compreender a doença relacionada do sistema nervoso central (CNS) associada com o ZIKV assim como a necessidade de testar ràpida a eficácia dos antivirais e das vacinas de encontro a ZIKV. É contra este pano de fundo que desenvolvemos métodos para a rápida análise dos títulos de ZIKV tanto na periferia como no SNC, utilizando um foco específico de ZIKV formando ensaios (FFA).
Os modelos animais pequenos são importantes para compreender a progressão da doença e para a avaliação adiantada das vacinas, da terapêutica, e dos anti-Virals. Nós estabelecemos modelos animais pequenos para o estudo da doença do arbovírus usando várias tensões do rato para modelar a infecção humana e a proteção de encontro aos micróbios patogénicos virais8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Usando essa experiência prévia, começamos a modificar as técnicas utilizadas para a avaliação do vírus da WNV e da dengue, um Flavivirus relacionado para a avaliação do titer de zikv em ambos os órgãos periféricos, bem como o SNC21,23, as vantagens 24. The destes métodos sobre outros ensaios são: 1) que combinam a habilidade de colher órgãos periféricos e do CNS para a análise; 2) os métodos são adaptáveis para a citometria de fluxo, para medições de respostas imunes inatas e adaptativas, juntamente com títulos virais no mesmo animal no mesmo órgão; 3) a técnica de colheita é adaptável para análise histológica; 4) o ZIKV FFA é um método rápido da taxa de transferência elevada para a análise viral do Titer; e 5) esses métodos podem ser aplicados à avaliação de títulos virais nos órgãos de animais infectados com a maioria dos patógenos25.
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Protocol
Todos os procedimentos do presente estudo estão de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de cuidados e uso de animais da Universidade de St. Louis. A SLU é totalmente credenciada pela Associação de avaliação e credenciamento do laboratório de cuidados com animais internacionais (AAALAC).
1. isolamento de órgãos
Nota: O vírus não é estável à temperatura ambiente (RT), de modo que o número de animais colhidos ao mesmo tempo deve ser planejado cuidadosamente para preservar os títulos virais.
- Infectar camundongos usando a dose escolhida e rota, com base no fenótipo necessário. Para este protocolo, infectar 8-10 semanas de idade masculino e feminino tipo I receptor de interferon deficiente (Ifnar1-/-) C57Bl/6 camundongos.
- Anestesie Ifnar1-/- camundongos com um coquetel de cetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Teste o reflexo do pedal por uma pitada firme do dedo do pé para confirmar a anestesia. Administrar 1 x 105 unidades de conformação de foco (FFU) de zikv em 50 μL por via SUBCUTÂNEA (SC) através do footpad.
- Prepare todos os materiais necessários para a colheita no dia anterior: 2 tesouras, fórceps e 20 mL de etanol a 70% (EtOH) em um 50 mL cônico para desinfecção de ferramentas.
- Prepare seringas e agulhas: uma seringa de 20 mL para perfusão, 23 G agulhas (aproximadamente 1 por gaiola) e 1 mL seringa com 25 G agulha (1 por 3-5 mouse). Antes de pesar os tubos, adicione grânulos de aço (na capa) a 1,5 mL de tubos de rosca de parafuso de anel-O (um para cada órgão). Os tubos precisam ser apropriados para homogeneização.
- Prepare o dia da colheita os materiais necessários para a perfusão e congelamento de órgãos.
- Encha um balde de gelo com gelo seco e 70% EtOH para fazer um banho de gelo. Prepare solução salina tampão fosfato estéril (PBS) assumindo que 25-30 mL por rato de PBS para cada perfusão é necessário 5-10 mL para a medula espinhal). Obter anestesia, um coquetel de cetamina e xilazina, e assumir 300 μL por mouse. Coloc todos os materiais e todos os tubos adicionais exigidos para a citometria do fluxo, etc., em um recipiente secundário para transportar à facilidade animal.
- Siga todos os procedimentos necessários para a entrada, incluindo a colocação e Doffing equipamento de protecção pessoal durante a entrada e saída para a instalação animal.
Atenção: Todos os procedimentos devem ser realizados em um gabinete de biossegurança certificado dentro de uma instalação de laboratório de nível 2 de biossegurança (BSL-2). - Administrar anestesia, 200-500 μL, intraperitonealmente dependendo do tamanho e peso do animal. Se trabalhar sozinho, administrar anestesia para um animal de cada vez para evitar matar os animais antes da colheita de órgãos.
- Confirme a dose de anestesia apertando o dedo do pé com fórceps para avaliar o reflexo do pedal. Não continue a menos que completamente não responsivo. Use pinos para fixar o mouse a uma placa de cera. Neste ponto, apagar o mouse em 70% etanol para evitar a contaminação do cabelo no procedimento de colheita de órgãos
- Hemorragia terminal por punção cardíaca.
- Usando a tesoura e fórceps, abra o animal através da cavidade torácica para expor o coração. Colete sangue através de punção cardíaca (~ 800 μL), isso pode ser usado para ensaios múltiplos, incluindo química clínica, Hematologia, citometria de fluxo para detectar respostas específicas do antígeno, e PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) para a análise do número de cópias virais.
- Para a análise viral do RNA pelo qRT-PCR, colete o sangue em um tubo do EDTA se extraindo do sangue inteiro ou em um tubo do microcentrifugador se extraindo do soro. (Para o soro, o tubo da rotação na velocidade máxima no centrifugador, Temp do quarto, por 20 minutos e remove o soro a um tubo separado). Adicione um poliacrilamida linear como um portador à amostra do soro após o revestimento. O RNA pode então ser analisado ou armazenado em-80 ° c ao processo mais adicional em uma data mais atrasada.
- Encha a seringa de 20 mL com PBS, à temperatura ambiente (ou 37 ° c) e perfuse os ratos inserindo a agulha borboleta no ventrículo esquerdo. Perfure o átrio direito para permitir que o sangue e a PBS saiam. Administre lentamente o PBS ao verificar a cor do fígado para confirmar que o animal está completamente perfused. Fígado deve mudar de vermelho profundo para cor de salmão rosa.
- Se preparando os órgãos para a histologia, deixe a agulha da borboleta no lugar e perfuse então com 20 mL do paraformaldehyde do frio 4% do gelo. Em caso afirmativo, é conveniente ter a seringa conectada a um torneira de 3 vias com ambas as seringas anexadas a ela, girando a válvula on e off como uma alterna entre PBS e PFA.
- Colha órgãos em tubos rotulados e pesados. Para os órgãos periféricos, siga uma ordem estabelecida para a colheita: fígado, baço, rim e pulmões.
- Tome apenas um lobo do fígado; Não importa qual deles, mas para todos os experimentos sempre tentam tomar o mesmo lobo com a mesma peça de tamanho. Similarmente, para rins e pulmões, tome o mesmo rim e pulmão. Se a citometria de fluxo também deve ser concluída, qualquer órgão pode ser cortado ao meio. Armazene a metade a ser usada para a citometria no meio do Instituto do Memorial de Roswell Park (RPMI) na temperatura ambiente até que a colheita esteja completa.
- Imediatamente após a colheita, coloque cada órgão em um tubo rotulado e coloque no banho de gelo seco. O Titer do vírus reduz-se sobre o tempo na temperatura ambiente, assim que a quantidade de tempo que toma para colher órgãos é extremamente importante. Deve haver consistência entre os camundongos, então, após a segurança, a próxima prioridade é a velocidade.
Nota: Se a colheita de órgãos para títulos virais, é muito útil ter um segundo indivíduo colher o cérebro neste momento, para preservar os títulos virais.
- Remova os órgãos restantes da cavidade do corpo do rato para obter acesso à coluna vertebral e ao crânio.
- Retire o mouse do tabuleiro e retire o Pelt, seguido pela remoção dos braços e pernas.
Retire a cabeça do mouse com uma tesoura decapitação, Blunt ou cirúrgica para colher o cérebro cortando o crânio com uma tesoura de Lagrange serrilhada através do Magnum forâmen. Em seguida, retire o crânio com fórceps e retire o cérebro com uma espátula. - Usando a tesoura forte, Blunted, remova as costelas e outros ossos que cercam a espinha. Em seguida, corte através do osso pélvico, expondo o forame vertebral no nível lombar. A pequena ponta da medula espinhal deve ser visível neste momento.
- Use uma seringa de 10 mL preenchida com PBS e uma agulha de 18 G para expulsar a medula espinhal por "rubor" do cordão lombar para a coluna cervical sobre um prato de Petri.
- Com cuidado, coloc a ponta chanfrada da agulha dentro do forâmen vertebral, evitando a pressão excessiva para impedir que a agulha trespassar o corpo vertebral. Segure fortemente para exercer pressão sobre o corpo vertebral e a agulha e pressione o êmbolo da seringa para expelir o cordão. Transfira imediatamente a medula espinhal no tubo rotulado e coloque no banho de gelo seco.
- Retire o mouse do tabuleiro e retire o Pelt, seguido pela remoção dos braços e pernas.
- Repita o procedimento com todos os animais até que a colheita esteja terminada. Coloque as ferramentas de colheita no etanol 70% entre os animais. Concentre-se na consistência e velocidade. O período de tempo entre cada colheita de órgão deve permanecer consistente de modo a não viés de resultados do título viral.
- Quando terminar, desinfete o gabinete de biossegurança e todo o material antes de removê-lo da instalação animal.
- Retire cada tubo do banho de gelo e pesar tubos para determinar o peso dos órgãos. Para determinar o peso dos órgãos, subtrair o peso do tubo vazio do peso do órgão que contém o tubo.
Nota: Neste ponto os órgãos podem ser congelados em-80 ° c ao processo mais adicional em uma data mais atrasada ou os órgãos podem Homogeneized imediatamente antes de congelar alíquotas individuais. Congelar amostras de descongelamento várias vezes diminui o título viral. Portanto, é importante fazer o mesmo procedimento para todos os experimentos dentro de um único projeto.
2. homogeneização de órgãos
- Prepare 3 tubos com o rótulo de 1,5 mL para que cada órgão seja homogeneizado.
- Se as amostras não estiverem sendo homogeneizadas imediatamente após a colheita, retire os tubos de-80 ° c. As amostras não precisam ser descongelados para homogeneizar.
- Coloque as amostras no gelo para mantê-los frios para minimizar a perda de Titer viral. Em seguida, adicionar 1 mL de DMEM frio contendo 5% FBS para cada órgão contendo tubo.
- Bata imediatamente os tubos no batedor do grânulo de acordo com as instruções do fabricante. Homogeneize todos os órgãos com grânulos de aço em um instrumento do grânulo-homogeneizador. Verifique para garantir que cada órgão foi completamente homogeneizado.
- Gire para baixo os restos do órgão no microcentrífuga em 12.000 x g por 5 minutos em um microcentrífuga que seja refrigerado a 8 ° c. Em seguida, devolva os tubos para o balde de gelo. No gabinete de biossegurança, as amostras de alíquota em tubos para os ensaios necessários. Em seguida, devolva os tubos para o balde de gelo.
- Para o foco que dá forma ao ensaio, alíquota 500 μL em um tubo etiquetado. Em seguida, coloque os tubos no rack em um balde de gelo. Alíquota 50 μL em um tubo para RNA para RT-PCR quantitativo fluorogénico (qRT-PCR) para medir o número da cópia do genoma viral.
- Isole o RNA total dos órgãos dos animais infectados usando um kit de isolamento de RNA comercial. Determine o RNA viral do Flavivirus usando os jogos da ponta de prova do primer específicos para ZIKV, que reconhece seqüências originais em cada genoma do Flavivirus. Determine o número da cópia viral usando um plasmídeo do controle da cópia que contem um RNA único-encalhado positivo definido gerado in vitro usando o polymerase T7 que contem as seqüências do alvo de ZIKV.
- Aliquot a amostra restante, que é aproximadamente 300 μL, no terceiro tubo e armazene em-80 ° c se necessário.
Nota: Se as amostras não foram congeladas previamente, congele a-80 ° c. Se as amostras tivessem sido previamente congeladas, continue no ensaio de formação de foco e/ou isolamento de RNA antes de parar.
3. ensaio de formação do Zika Virus Focus26
Nota: É importante incluir um controle sem vírus e um controle positivo. O controle positivo é uma série de diluição de um estoque de vírus com uma concentração conhecida. Nem todos os controles precisam estar na mesma placa, mas como o ensaio torna-se maior do que 5 placas, mais controles devem ser adicionados, e espalhar-se entre as placas. Tome cuidado para não arranhar a monocamada com as pontas de Pipet ou por lavagem vigorosa. Vários órgãos podem ser titulados no mesmo dia ou em dias diferentes. Mas um órgão individual não deve ser titulado ao longo de vários dias, porque diferentes condições de ensaio pode impactar o Titer viral. É altamente recomendável executar um órgão individual em um único dia.
- Antes do dia do ensaio, prepare as células e os reagentes necessários para o ensaio de formação de focagem.
- Prepare meios de crescimento contendo 500 mL de DMEM com 5 mL de HEPES e 25 mL de FBS. Tenha as pilhas da organização de saúde do vero-mundo (OMS) que crescem em meios do crescimento em 37 ° c, 5% CO2 antes do começo do ensaio. As células Vero não deve ser uma passagem alta ou nunca cresceu mais de 100% confluência antes do início do ensaio.
- Prepare 500 mL de uma solução de metilcelulose a 2%, autoclavando um frasco de vidro de 1 L com 10 g de metilcelulose e uma grande barra de agitação e uma garrafa de meio de vidro de 1 L separada com 500 mL de H2O. Se a água autoclavada resfriou o reaquecimento no microondas até que a garrafa esteja quente ao toque, mas não fervendo.
- Derrame delicadamente a água morna/quente no frasco do metilcelulose quando na capa da cultura do tecido. Parcialmente Tampe a garrafa e mexa na chapa até que a metilcelulose esteja em solução (1-4 h). Aliquot a solução de metilcelulose a 2% em tubo cônico estéril de 50 mL. a metilcelulose a 2% pode ser armazenada a 4 ° c até ser necessária.
- Prepare uma solução de paraformaldeído a 5% em PBS para fixar as placas e armazenadas a 4 ° c até serem necessárias. Prepare um foco 1x que dá forma ao amortecedor da lavagem do ensaio adicionando 0, 5% Triton X-100 a PBS e armazenado em RT. Prepare um tampão de coloração de 1x FFA adicionando 1 mg/mL de saponina ao PBS e armazenado a 4 ° c até ser necessário. Estes podem ser preparados com uma ou duas semanas de antecedência.
- Calcule o número de placas de poço de fundo plano 96 necessárias para o ensaio de tal forma que cada órgão é banhado em triplicado. Inclua poços adicionais suficientes para controles positivos e negativos.
- Cresça acima bastante pilhas de vero em meios do crescimento para terminar o ensaio projetado. Trypsinize as células Vero e contá-los ressuscite-los em 1,5 x 105 células por ml em meios de crescimento. Células de chapa vero no 96 placas de fundo plano bem em 3,0 x 104 vero-Who células/bem em meios de crescimento, adicionando 200 μl por poço.
- Incubar as placas a 37 ° c a 5% CO2 durante a noite, certifique-se que as placas estão niveladas na incubadora assim que as pilhas são distribuídas ingualmente dentro do poço.
Nota: Cada laboratório cresce células Vero ligeiramente diferente; o alvo é uma monocamada confluente de 90-95% em cada poço no dia do ensaio para o vírus Zika.
- Diluir as amostras de vírus Zika no dia do ensaio. Se as amostras de órgãos tivessem sido previamente homogeneizadas, retire as amostras do congelador-80 ° c e deixe-as descongelar antes de colocar as amostras no gelo para o ensaio.
- No gelo, prepare uma placa de fundo redonda 96 bem adicionando 180 μL de mídia de crescimento frio para as linhas B a H deixando a linha A vazia. Adicionar 150 μL de cada amostra de órgão homogeneizado à linha a da placa inferior redonda.
- Prepare diluições seriadas de 10 vezes de cada amostra, usando uma pipeta multicanal. Diluir amostras em uma placa de fundo redonda 96 bem adicionando 20 μL de amostra em 180 μL de meios de crescimento, alterando as pontas de pipeta entre cada diluição.
- Prepare o foco formando placa, removendo a mídia da placa de fundo plano 96 bem cobrindo células Vero. Faça isso imediatamente antes de adicionar as amostras de vírus para evitar que a monocamada seque.
- Adicionar 100 μL da diluição do vírus a cada poço na placa vero. Adicione a amostra usando o mesmo conjunto de dicas, indo do mais baixo para a concentração mais alta. Placas de rocha lado a lado 2-4 vezes sendo cuidadoso para não girar.
- Incubar a 37 ° c, 5% CO2 para 1-2 h. Certifique-se que as placas estão nivelados dentro da incubadora. Durante a incubação aquecer 2% metilcelulose para RT.
- Diluir 2% solução de metilcelulose em meios de crescimento. A diluição deve estar em uma proporção de aproximadamente 2:1 de metilcelulose a 2% para meios de crescimento. Manter em temperatura ambiente até que seja hora de usá-lo. Adicione 1-2 gotas/poço (ajuste o Pipet a 125 μL) do methylcellulose: meios do crescimento a cada poço da placa do poço 96.
- Incubar 32-40 h a 37 ° c, 5% CO2. Como as células Vero de todos crescem de forma ligeiramente diferente e fatores, incluindo confluência celular e tensão do vírus Zika pode mudar o tempo de incubação.
- Corrija as células Vero usando a solução de paraformaldeído 5% preparada.
- Adicionar 50 μL de paraformaldeído a 5% a cada poço na parte superior da camada de metilcelulose no armário de biossegurança. Incubar por 60 min em RT. A fixação pode ir durante a noite a 4 ° c, mas cubra a placa com parafilm para reduzir a evaporação.
- Despejar sobreposição e mídia fora das células em um recipiente de descarte dentro do gabinete de biossegurança. Lave suavemente com PBS, 150 μL/poço. Retire a PBS das placas e retire a placa do BSL-2.
- Repita a lavagem de PBS 2x que adiciona 150 μL/poço. Em seguida, retire o PBS. Adicionar 150 μL/poço 1x FFA tampão de lavagem e deixe sentar-se por 5-10 min em RT para permeabilizar as células fixas.
- Detecte a infecção usando o anticorpo principal de Zika. Prepare o anticorpo primário 4G2 (D1-4G2-4-15) em uma concentração de 1 mg/mL em FFA mancha tampão. Prepare anticorpos suficientes para todo o ensaio.
Nota: Fique longe de fraldas de laboratório ou outro material absorvente de alto-Lint, pois as fibras irão impactar negativamente a imagem dos focos.- Remover FFA tampão de lavagem das placas. Adicionar 50 μL/poço do anticorpo primário no tampão de coloração FFA. Selar as placas com parafilm e incubar durante a noite a 4 ° c em uma plataforma de balanço. O ensaio pode ser feito com uma incubação para 2 h em RT.
- Visualize a infecção pela adição de um anticorpo conjugado HRP secundário. Prepare o secundário de cabra anti-rato HRP-rotulado anticorpo em uma concentração de 1:5000 em FFA mancha tampão. Prepare anticorpos suficientes para todo o ensaio.
- Lave as células 3x com buffer de lavagem FFA, removendo o tampão de lavagem por flicking no dissipador de cada vez. Manchar as células com o anticorpo secundário em FFA mancha tampão em 50 μL/bem. Incubar 1-2 h em RT.
- Lave as células 3x com buffer de lavagem FFA, removendo o tampão de lavagem por flicking no dissipador de cada vez. Adicionar 50 μL/poço do substrato Trueblue.
- Assista as placas com cuidado, esperando 2-15 min até manchas são totalmente definidos e fundo mínimo. Depois que os pontos são visíveis, lave delicadamente com água, usando uma mão para proteger o monocamada da força da água que funciona. Toque em secar em toalhas de papel (não fraldas) e imagem o mais rapidamente possível.
- Os pontos podem ser contados manualmente ou usando um contador de spot automatizado. Se contado manualmente, um escopo de dissecação pode ser usado para auxiliar na visualização.
- Para cada amostra, selecione uma diluição com focos facilmente distintos (por exemplo, 20 a 200 por poço) e calcule o título em unidades formadoras de foco por mL (FFU/ml), usando a média de poços duplicados: FFU/mL = (média de focos/poço) × (fator de diluição) ÷ (mL de inóculos).
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Representative Results
Para avaliar títulos de zikv usando o protocolo descrito acima Ifnar1-/- os ratos foram contaminados com o zikv (PRVABC59) através da injeção subcutaneous (SC) ao footpad. Aqui, a administração de 1 x 105 FFU de zikv para 8-12 semana de idade Ifnar1-/- MICE SC não é letal, mas o vírus pode replicar na periferia e CNS. Esta dose e rota são usadas para estudar as respostas imunes do patógeno hospedeiro e a patogenicidade. Administração de 1 x 105 FFU de zikv a uma 8-12 semana de idade Ifnar1 -/- mouse intravenoso (IV) injeção está entre 80 a 100% letal, com o animal sucumbir à infecção entre 8 a 14 dias pós-injeção de vírus. Nós usamos rotineiramente esta rota da administração para determinar a eficácia de antivirais e de terapêutica, assim como o teste pré-clínico do candidato da vacina.
Quatro 10-12 semanas de idade Ifnar1-/- camundongos foram infectados com 1 x 105 FFU de zikv SC e baços, fígados, rins, medula espinhal e cérebros foram colhidos quatro dias após a infecção pelos métodos detalhados acima (Figura 1). A quantidade de ZIKV nos tecidos foi ensaiada pelo foco que dá forma ao ensaio (FFA) usando pilhas de vero em um formato do poço 96 como descrito acima. Usando o FFA, a carga viral do tecido é expressa como unidades de formação de foco (FFU) por g de tecido. Similar ao que foi observado em um estudo precedente da infecção de zikv de Ifnar1-/- 26, nós vimos viremia que segue uma amostragem de títulos virais em órgãos diferentes quatro dias de infecção do zikv do borne. Estes resultados indicam que os métodos usados para a colheita do órgão e tittering pelo foco que dá forma ao ensaio podem ser usados para detectar o Titer em ambos os órgãos periféricos e no CNS dentro do mesmo animal. Curiosamente, não esperávamos ver altos títulos virais na periferia e no CNS quatro dias após a infecção no Ifnar1-/- camundongos porque todos os Ifnar1-/- sobreviver infecção zikv com esta dose e rota. Continuamos a explorar esta observação para entender como zikv pode continuar a replicar no CNS de Ifnar1-/- sem causar letalidade.
Ao executar o foco formando ensaio (FFA), existem vários erros técnicos que um investigador pode fazer o que resultará em resultados de FFA suboptimal. Os erros mais comuns são: 1) toxicidade de órgãos; 2) pipetagem vigorosa; 3) contaminação da fibra; e 4) densidade de chapeamento de pilha incorreta. Discutimos cada um desses problemas abaixo e ilustramos o resultado na Figura 2. Um dos problemas mais comuns que ocorre com o FFA e o ensaio de placa é a toxicidade de órgãos (Figura 2a seta vermelha). Nós acreditamos que a toxicidade do órgão é conduzida pela concentração elevada de componentes intracelular liberados durante a homogeneização do órgão. A toxicidade do órgão varia com base no órgão e é observada em órgãos colhidos de animais não infectados, sendo o fígado o mais tóxico e o baço o mínimo. A toxicidade é reduzida à medida que o órgão é diluído em série na placa FFA. No entanto, a toxicidade altera a sensibilidade do ensaio, resultando em uma alteração no limite de detecção. Como mostrado na Figura 2a se o Titer viral no órgão é menor do que a toxicidade, o FFA não será capaz de gravar com precisão os títulos virais. A Figura 2b ilustra a toxicidade nos poços a1-4, mas o Titer viral é suficientemente alto para superar a toxicidade dos órgãos, como observado nos poços B3 e B4. Para superar esta limitação no FFA, nós igualmente executamos o PCR real-time quantitativo em amostras do Titer do órgão. Na Figura 2C, ilustramos vários erros técnicos comuns. Vigorosa pipetagem ou lavagem pode remover a monocamada (Figura 2C, *), se isso ocorrer em poços com focos que os dados serão perdidos levando a relatórios imprecisos de resultados de títulos. Fibras ou pêlos, que estão presentes no laboratório de papel absorvente de bancada pode contaminar poços individuais (Figura 2C, $) isso pode causar erros significativos se usando um programa de contagem automatizada. Enquanto a maioria dos programas de contagem automatizados têm opções de exclusão de fibra, não achamos que seja altamente eficaz em excluir fibras da análise. A solução para isso é a contagem manual dos poços, que pode ser muito demorado e não é prático para a análise de grandes ensaios. A densidade celular é outra questão que pode impactar drasticamente o sucesso de um ensaio de formação de foco (Figura 2D). Se as células não estiverem na densidade direita no início do ensaio, o número e o tamanho das manchas serão afetados. Como mostrado na Figura 2D, as colunas 1-3, as células em aproximadamente 60% confluência no início do ensaio em comparação com as células banhadas em 90% colunas de confluência 4-6 irá impactar drasticamente o foco formando ensaio. Para superar este obstáculo pequenos ensaios piloto deve ser executado para otimizar a densidade celular e tempos de fixação como condições individuais de laboratório irá impactar o sucesso para o ensaio.
Para estudos quando comparados diferentes grupos de animais infectados, a análise estatística realizada depende da distribuição dos dados. Os testes paramétricos ou não paramétricos são utilizados para avaliar a significância estatística. Para testes paramétricos, a ANOVA é utilizada para detectar o efeito geral, e os grupos de tratamento individuais serão comparados usando o teste de Dunn. Caso a distribuição dos dados não satisfaça exigências para a análise paramétrica, os testes não paramétricos são empregados. O teste de Kruskal-Wallis é usado para detectar o efeito geral do tratamento, e o teste U de Mann-Whitney é usado para realizar comparações par-Wise. Para os resultados aqui presentes não comparamos os animais com um segundo conjunto de dados colhidos neste momento, por isso não realizamos análises estatísticas sobre o conjunto de dados mostrado.
Figura 1: replicação viral na periferia e no SNC. Carga viral nos tecidos periféricos e do SNC após IFNAR1-/- camundongos recebem 1x105 FFU de zikv SC. No 4º dia (n = 4 por grupo) os órgãos pós-infecção foram colhidos, encaixados congelados, pesados e homogeneizados. Os níveis de vírus foram quantificados por ensaio de conformação de foco. O limite de detecção é 100-500 FFU/Gram com base no órgão. Os dados são mostrados como log10 unidade de formação de foco por grama de tecido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: dificuldades comuns com o ensaio de conformação de foco. Para todos os ensaios de formação de foco mostrados o antígeno viral foi detectado com um anti-Flavivirus MAB, seguido pela mancha do imunoperoxidase (roxo). (A) as pilhas de vero foram crescidas a uma confluência de 90% e infected com uma diluição 10-fold de série do sobrenadante do fígado colhido de um rato C57Bl/6 velho de 8 semanas, IV contaminado com 5 x 107 FFU de zikv 4 dias previamente. A seta vermelha indica a concentração mais alta ou "pura" do sobrenadante hepático demonstrando a toxicidade nesta concentração. (B) as células Vero foram cultivadas para uma confluência de 90% e infectadas com uma diluição de 10 vezes de sobrenadante de células renais infectadas pelo zikv. Neste caso, as amostras na coluna 1 e 2 são de um C57BL/6 mouse e col 3 e 4 são de um Ifnar1-/-. Ambos os ratos foram 8 semanas de idade infectados com 1 x 105 FFU de ZIKV IV e sacrificados 4 dias após a infecção. Semelhante a (a) háalguma toxicidade observada na maior concentração (linha a), mas os títulos virais observados na coluna 3 e 4 superar o limite de problemas de detecção, permitindo que os títulos precisos para ser detectado. (C) as células Vero foram chapeadas. Os poços selecionados mostram erros técnicos comuns. O * demonstra uma área onde a monocamada foi removida devido à pipetagem vigorosa. O $ é colocado sobre um poço onde uma fibra pode ser vista. (D) a concentração de células Vero afecta a sensibilidade do ensaio. Nesta placa as pilhas de vero foram chapeadas em 1,0 x 104 pilhas/poço na coluna 1-3 e 3,0 x 104 vero-que pilhas/poço na coluna 4-6. Em seguida, a placa foi infectada com 10 vezes diluições de ZIKV PRVABC59 estoque. As maiores amostras de concentração viral estão na linha A e diluídas, com cada linha representando uma diluição de 10 vezes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A infecção por ZIKV pode causar uma doença neurológica, portanto, os modelos animais atuais para estudar a patogênese, respostas imunes e eficácia protetora de vacinas e antivirais precisam se concentrar no controle viral dentro do SNC. Um dos desafios em focar na doença do SNC é que muitas vezes vem à custa de estudar a infecção periférica. Os métodos de isolamento de órgãos propostos aqui se centram na necessidade de avaliar rapidamente a infecção pelo ZIKV tanto na periferia quanto no SNC, a fim de avaliar a doença associada ao ZIKV mediado pelo SNC e estabelecer um modelo para o teste pré-clínico de antivirais, terapêuticos e Vacinas. Um benefício adicional desta técnica é que ele também permite um alto grau de flexibilidade, incluindo o estudo combinado de respostas imunológicas para ZIKV ou análise histológica de infecção. Esta técnica, não é restrita a apenas ZIKV, mas também pode ser universalmente aplicada para estudar uma série de interações hospedeiro-patógeno, incluindo Flavivirus como o vírus da dengue21, Orthopoxvirus como monkeypox e ectromelia. As considerações e os inconvenientes a esta técnica da colheita focalizam principalmente das capacidades do experimentador. Como ZIKV não é estável por longos períodos de tempo à temperatura ambiente, a quantidade de tempo que leva para a colheita de órgãos após a perfusão pode afetar significativamente a qualidade dos resultados. Para a maioria dos experimentos que realizamos, comparamos títulos virais de camundongos tratados com duas condições, por isso focamos nossos esforços na consistência do tempo entre as colheitas de órgãos não em velocidade. Desta forma, a mesma pessoa executa o mesmo procedimento para todo o experimento para manter a consistência. A outra consideração principal com este procedimento é segurança, nós executamos prontamente estes métodos com o BSL-2 (vírus de ZIKV, de dengue) e de BSL-3 (WNV, vírus de chikungunya) patógenos. É muito importante para executar todos os procedimentos em um limpo, bem conservado, gabinete de biossegurança certificada com desinfetante.
Um FFA iguala o ensaio da placa, exceto que usa a imunocoloração da peroxidase para identificar focos de pilhas contaminadas, um pouco do que placas. Meu laboratório, bem como vários outros laboratórios já mudaram com sucesso para usar FFAs para todas as nossas experiências de tittering11,14,15,17,26,27 ,28. O FFA tem vantagens múltiplas sobre o ensaio tradicional da chapa: a) o FFA é mais rápido, exigindo uma incubação mais curta comparado a um ensaio da chapa, b) é igualmente mais elevado-débito, sendo executado em placas 96-well. O formato da placa do poço 96 pode igualmente acomodar volumes menores do material de partida. Além, c) o FFA é compatível com o uso de uma arruela automatizada da placa e de um contador de ponto automatizado, reduzindo extremamente o trabalho e o tempo exigidos para o ensaio. O FFA tem mais passos após a infecção, mas d) com o uso de pipets multicanal, ou mesmo um robô de pipetagem, o timing para a maioria das etapas do ensaio após a fixação são flexíveis e o ensaio pode ser pausado durante a noite ou por mais tempo. Finalmente, e) pode ser especialmente útil para cepas de vírus que não formam placas claras, como o vírus da dengue. Uma desvantagem do FFA é que ele requer anticorpos específicos para detectar células infectadas pelo vírus, que podem ser confundimento ao considerar diversas cepas de vírus ou vírus mutantes. Para o FFA como com o ensaio da chapa a densidade do monocamada da pilha na altura da infecção é crítica para o sucesso do ensaio. As células devem ser usadas em maior confluência para um FFA em comparação com um ensaio de placa, devido ao encurtamento do tempo antes da fixação. Como o FFA é maior taxa de transferência, mais rentável e mais rápido do que o teste de placa tradicional que permite que o meu laboratório para analisar rapidamente os dados para o estudo de doenças infecciosas emergentes. O FFA é mais cumulativamente mais rentável por várias razões. Embora os anticorpos sejam mais caros do que o vermelho neutro ou violeta de cristal, nós podemos analisar mais amostras por a placa que elimina a diferença de custo. Em termos de alocação de mão de obra automatizada de contagem de pontos e fácil entrada de dados para análise limita os custos trabalhistas e a capacidade de ter uma imagem de longo prazo como um registro é difícil de quantificar. O futuro deste ensaio pode ser mover-se para um focos fluorescente-baseados para um leitura ao contrário do HRP. Quantitating a intensidade fluorescente junto com o número de ponto ampliará a utilidade do FFA além do que é estudado atualmente.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
O Dr. pinto é financiado por uma bolsa de sementes da faculdade de medicina da Universidade de Saint Louis e fundos de arranque da faculdade de medicina da Universidade de Saint Louis. O Dr. Brien é financiado por um K22AI104794 prêmio de investigador precoce do NIH NIAID, bem como uma concessão de sementes da escola Saint Louis University. Para todos os indivíduos financiados, os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18 G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1 cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37 °C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96 well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5 mL eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| Curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose With 4,500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5 mL EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| O-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| One step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| Spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| Straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
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