Summary
Protokolün amacı, enfeksiyon sonrasında faredeki birden fazla organdan Zika virüsünü izole ederek ve ölçerek viral hastalıkları araştırmak için kullanılan teknikleri göstermektir.
Abstract
Sunulan yöntemler, zika virüsü bulaşmış hayvanlardan organların izole edilmesi ve viral yükün ölçülmesi için laboratuvar prosedürlerini göstermektedir. İşlemin amacı, zika virüs enfeksiyonunu düzenleyen virolojik ve immünolojik faktörleri belirlemek için farklı zaman noktalarında veya farklı deneysel koşullar altında farenin periferik ve CNS bölgelerindeki viral titreleri ölçmektir. Organ izolasyon prosedürleri hem odak lama nın hem de viral titrelerin kantitatif PCR değerlendirmesine olanak sağladığını göstermiştir. Hızlı organ izolasyon teknikleri virüs titresinin korunması için tasarlanmıştır. Odak oluşturarak analiz ile viral titreme quantification Zika virüsünün hızlı iş lenme değerlendirmesi için izin verir. Odak oluşturan testin yararı bulaşıcı virüsün değerlendirilmesidir, bu sadenin sınırlandırılması, tespit sınırını azaltan organ toksisitesi potansiyelidir. Viral titre değerlendirmesi kantitatif PCR ile birleştirilir ve organ içinde rekombinant RNA kopya kontrol viral genom kopya numarası kullanılarak algılama düşük sınırı ile değerlendirilir. Genel olarak bu teknikler, Zika virüsü enfekte hayvanların çevre ve CNS'lerinde Zika viral titrelerinin analizi için doğru bir hızlı yüksek iş elde etme yöntemi sağlar ve en çok enfekte olmuş hayvanların organlarındaki viral titrelerin değerlendirilmesinde uygulanabilir. patojenler, Dang virüsü de dahil olmak üzere.
Introduction
Zika virüsü (ZIKV) flaviviridae ailesine ait bir arbovirüstür, Powassan virüsü gibi önemli nöroinvaziv insan patojenleri içeren (POWV), Japon ensefalit virüsü (JEV), ve Batı Nil virüsü (WNV)1. İzolasyon ve tanımlamasının ardından, Afrika ve Asya'dainsan ZIKV enfeksiyonlarının periyodik raporları 2 ,3,4,5, ve Orta ve Güney Amerika'daki salgınhastalıklar ( referans6). Ancak, yakın zamana kadar ZIKV ciddihastalığaneden olduğu düşünüldü 7 değildi . Şimdi zikv enfeksiyonları ile bağlantılı nörolojik hastalık ve doğum kusurları vakaları binlerce vardır. ZIKV'nin hızlı bir şekilde ortaya çıkışı ile ilgili birçok soru yöneltti: neden hastalığın şiddetinde bir artış var, ZIKV enfeksiyonuna immünolojik yanıt nedir ve nörolojik artışa bağlı viral ve/veya immün aracılı patolojiler vardır? belirtileri ve doğum kusurları. Artık ZIKV ile ilişkili merkezi sinir sistemi (CNS) ile ilişkili hastalığı ve antivirallerin ve aşıların ZIKV'e karşı etkinliğini hızla test etme ihtiyacının anlaşılması için acele vardır. Zikv'e özgü odak lama tahlilleri (FFA) kullanarak hem çevre de hem de CNS'de ZIKV titrelerinin hızlı analizi için yöntemler geliştirdiğimiz bu zemine aykırıdır.
Küçük hayvan modelleri hastalığın ilerlemesini anlamak ve aşıların erken değerlendirilmesi için önemlidir, terapötik, ve anti-viral. Biz arbovirüs hastalığı nın çalışması için insan enfeksiyonu ve viral patojenlere karşı koruma modellemek için çeşitli fare suşları kullanarak küçük hayvan modelleri kurduk8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Bu önceki deneyimi kullanarak, wnv ve Dang virüsü, hem periferik organlarda zikv titresinin değerlendirilmesi için ilgili bir flavivirüs değerlendirilmesi için kullanılan teknikleri değiştirmeye başladı hem de CNS21,23, 24- Bu yöntemlerin diğer tahlillere göre avantajları şunlardır: 1) analiz için hem periferik hem de CNS organlarını toplama yeteneğini birleştirdikleri; 2) yöntemleri akış sitometri için uyarlanabilir, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık yanıtları ölçümleri için, aynı organda aynı hayvan üzerinde viral titreler ile birlikte; 3) hasat tekniği histolojik analiz için uyarlanabilir; 4) ZIKV FFA viral titreşme analizi için hızlı bir yüksek iş elde yöntemidir; ve 5) bu yöntemler en patojenler 25 ile enfekte hayvanlarınorganlarında viral titrelerin değerlendirilmesi için uygulanabilir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmanın tüm prosedürleri St. Louis Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygundur. SLU, Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından tamamen akredite edilmiştir.
1. Organ İzole
NOT: Virüs oda sıcaklığında (RT) stabil değildir, bu nedenle bir seferde hasat edilen hayvan sayısı viral titreleri korumak için dikkatlice planlanmalıdır.
- Seçilen doz ve rotayı kullanarak farelere gerekli fenotipten yola uyarlanan bulaştırın. Bu protokol için 8-10 haftalık erkek ve kadın tip I interferon reseptör eksikliği (Ifnar1-/-) C57BL/6 fareleri enfekte edin.
- Ketamin (90 mg/kg) ve Xylazine (10 mg/kg) kokteyli ile Ifnar1-/- fareleri anestezik. Anesteziyi onaylamak için sağlam bir ayak ucutu ile pedal refleksini test edin. 1 x 105 odak şekillendirme ünitelerini (FFU) zikv'in 50 μL subkutan (SC) olarak ayak takımı üzerinden uygulayın.
- Bir gün önce hasat için gerekli tüm malzemeleri hazırlayın: 2 makas, forseps ve 20 mL% 70 etanol (EtOH) bir 50 mL konik alet dezenfeksiyon için.
- Şırınga ve iğneleri hazırlayın: perfüzyon için 20 mL şırınga, 23 G iğne (kafes başına yaklaşık 1) ve 25 G iğneli 1 mL şırınga (3-5 fare başına 1). Tartım tüplerinden önce, 1,5 mL O-ring vidalı kapak tüplerine (her organ için bir tane) çelik boncuk (kaputiçinde) ekleyin. Tüplerhomojenizasyon için uygun olmalıdır.
- Perfüzyon ve organ dondurma için gerekli malzemeleri hasat günü hazırlayın.
- Bir buz banyosu yapmak için kuru buz ve% 70 EtOH ile bir buz kovası doldurun. Her perfüzyon için her perfüzyon için PBS fare başına 25-30 mL omurilik için 5-10 mL gerekli olduğunu varsayarak steril fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. Anestezi, Ketamin ve Xylazine bir kokteyl elde ve fare başına 300 μL varsayalım. Akış sitometrisi, vb. için gerekli olan tüm malzemeleri ve ek tüpleri hayvan tesisine taşınması için ikincil bir konteynere yerleştirin.
- Hayvan tesisine giriş ve çıkış sırasında kişisel koruma ekipmanı takmak ve çıkarmak da dahil olmak üzere giriş için gerekli tüm prosedürleri uygulayın.
DİkKAT: Tüm işlemler, Biyogüvenlik seviyesi 2 laboratuarı (BSL-2) tesisinde sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmalıdır. - Anestezi uygulayın, 200-500 μL, intraperitoneally hayvanın büyüklüğü ne bağlı olarak. Tek başına çalışıyorsanız, organ hasat önce hayvanları öldürmemek için bir seferde bir hayvan anestezi uygulayın.
- Pedal refleksini değerlendirmek için ayak parmaklarını forceps ile sıkıştırarak anestezi dozuna onaylayın. Tamamen yanıt vermemedikçe devam etmeyin. Fareyi balmumu tahtasına sabitlemek için iğneler kullanın. Bu noktada, organ hasat işleminde saç kontaminasyonunu önlemek için fareyi %70 etanol ile tarayın
- Ölümcül kalp delinmesi ile kanama.
- Makas ve forceps kullanarak, kalp ortaya çıkarmak için göğüs boşluğu ile hayvan açın. Kalp delinme yoluyla kan toplamak (~ 800 μL), Bu klinik kimya, hematoloji, akım sitometri antijen spesifik yanıtları tespit etmek ve viral kopya numarası analizi için gerçek zamanlı kantitatif PCR (qRT-PCR) dahil olmak üzere birden fazla tahliller için kullanılabilir.
- qRT-PCR ile viral RNA analizi için, serumdan çıkarılan ise tam kandan veya mikrosantrifüj tüpünden elde edilen bir EDTA tüpünde kan toplayın. (Serum için, santrifüj maksimum hızda tüp spin, oda sıcaklığı, için 20 dk ve ayrı bir tüp için serum kaldırın). Bitirdikten sonra serum örneğine taşıyıcı olarak lineer poliakrilamid ekleyin. RNA daha sonra analiz edilebilir veya daha sonraki bir tarihte daha fazla işlem için -80 °C'de saklanabilir.
- 20 mL şırıngayı oda sıcaklığında (veya 37 °C) PBS ile doldurun ve kelebek iğnesini sol ventriküle yerleştirerek fareleri perfüzyonlayın. Kan ve PBS'nin çıkmasına izin vermek için sağ atriyumu delin. Yavaş yavaş hayvan tamamen perfüzyon olduğunu doğrulamak için karaciğer rengini kontrol ederken PBS uygulayın. Karaciğer koyu kırmızıdan pembe somon rengine dönüşmelidir.
- Organları histolojiye hazırlarken kelebek iğnesini yerinde bırakın ve 20 mL buz soğuklusu %4 paraformaldehit geçirin. Eğer öyleyse, şırınganın her iki şırıngaya bağlı 3 yönlü bir stopcock'a bağlanması, valfin PBS ve PFA arasında tek bir alternatif olarak avejve KAPALI olarak açılması uygundur.
- Organları etiketli, tartılanmış tüplerhalinde toplayın. Periferik organlar için, hasat için belirlenmiş bir sıraizleyin: karaciğer, dalak, böbrek ve akciğerler.
- Karaciğerden sadece bir lob alın; hangisi olduğu önemli değildir, ama tüm deneyler için her zaman aynı boyutta parça ile aynı lob almaya çalışın. Benzer şekilde, böbrekler ve akciğerler için, aynı böbrek ve akciğer almak. Akış sitometrisi de tamamlanacaksa, herhangi bir organ ikiye ayrılabilir. Roswell Park Memorial Institute orta (RPMI) hasat tamamlanana kadar oda sıcaklığında sitometri için kullanılacak yarısı saklayın.
- Hasattan hemen sonra, her organı etiketli bir tüpe koyun ve kuru buz banyosuna koyun. Virüs titreği oda sıcaklığında zaman içinde azalır, bu nedenle organların hasat için gereken zaman miktarı son derece önemlidir. Fareler arasında tutarlılık olmalı, bu yüzden güvenlikten sonra, bir sonraki öncelik hızdır.
NOT: Viral titreler için organ toplama ise, viral titreleri korumak için, bu noktada ikinci bir bireysel hasat beyin için çok yararlıdır.
- Omurga ve kafatası erişim elde etmek için fare vücut boşluğundan kalan organları çıkarın.
- Tahtadan fareyi çıkarın ve pelt çıkarın, kol lar ve bacaklar kaldırılması takip.
Bir decapitation, künt veya cerrahi makas ile farenin başını çıkarın foramen magnum ile tırtıklı LaGrange makas ile kafatası keserek beyin hasat. Sonra, forceps ile kafatası soyma ve bir spatula ile beyin dışarı kepçe. - Güçlü, körelmiş makas kullanarak, kaburga ve omurga çevreleyen diğer kemikleri çıkarın. Sonra, pelvik kemik boyunca kesilmiş, lomber düzeyde vertebraformen açığa. Omuriliğin küçük ucu bu noktada görülmelidir.
- PBS ile dolu 10 mL şırınga ve 18 G iğne kullanarak bir Petri kabının üzerinde kordonu lomberden servikal omurgaya "temizleyerek" omuriliği dışarı atabilirsiniz.
- Dikkatle, vertebraforamen içine iğne nin yontma ucu yerleştirin, omur gövdesi izinsiz girmek için iğne önlemek için aşırı basınç kaçınarak. Vertebral vücut ve iğne üzerinde baskı uygulamak için güçlü tutun ve kordon uçıkarmak için şırınga piston basın. Hemen etiketli tüp ve kuru buz banyosu yer omurilik transfer.
- Tahtadan fareyi çıkarın ve pelt çıkarın, kol lar ve bacaklar kaldırılması takip.
- Hasat tamamlanana kadar tüm hayvanlarla işlemi tekrarlayın. Hayvanlar arasında% 70 etanol hasat araçları yerleştirin. Tutarlılık ve hıza odaklanın. Her organ hasat arasındaki süre böylece önyargı viral titre sonuçları değil tutarlı kalmalıdır.
- Bittiğinde, biyogüvenlik kabinini ve tüm malzemeleri hayvan tesisinden çıkarmadan önce dezenfekte edin.
- Buz banyosundan her tüp çıkarın ve organların ağırlığını belirlemek için tüpler tartmak. Organların ağırlığını belirlemek için, boş tüpün ağırlığını tüp içeren organın ağırlığından çıkarın.
NOT: Bu noktada organlar -80 °C'de dondurularak daha sonraki bir tarihte işlenebilir veya organlar tek tek donmadan hemen önce homojenleştirilebilir. Çözülme örnekleri birden çok kez viral titreşme azalır. Bu nedenle, tek bir projedeki tüm denemeler için aynı yordamı yapmak önemlidir.
2. Organ Homojenizasyonu
- Her organın homojenleştirilmesi için 3 etiketli, 1,5 mL snap-kapaklı tüp hazırlayın.
- Numuneler hasattan hemen sonra homojenize edilmiyorsa, tüpleri -80 °C'den çıkarın. Homojenize etmek için örneklerin çözülmesi gerekmez.
- Viral titre kaybını en aza indirmek için onları soğuk tutmak için buz üzerinde örnekleri koyun. Daha sonra, tüp içeren her organa %5 FBS içeren 1 mL soğuk DMEM ekleyin.
- Hemen üreticinin talimatlarına göre boncuk çırpıcı tüpler yendi. Boncuk-homogenizer aletinde tüm organları çelik boncuklarla homojenize edin. Her organın tamamen homojenleştirildiğini kontrol edin.
- 8 °C'ye kadar soğutulmuş bir mikrofuge 5 dakika için 12.000 x g mikrofuge organ enkaz aşağı spin. Sonra tüpleri buz kovasına geri ver. Biyogüvenlik kabininde, gerekli tahliller için tüpler içine aliquot örnekleri. Sonra tüpleri buz kovasına geri ver.
- Odak oluşturma çıktısı için, etiketli bir tüp içine 500 μL aliquot. Sonra bir buz kovası üzerinde raftüpleryerleştirin. Aliquot 50 μL viral genom kopya numarasını ölçmek için florojenik kantitatif RT-PCR (qRT-PCR) için RNA için bir tüp içine.
- Ticari bir RNA izolasyon kiti kullanarak enfekte hayvanların organlarından toplam RNA izole. Her flavivirüs genomunda benzersiz dizileri tanıyan ZIKV'e özgü astar sonda setlerini kullanarak flavivirus viral RNA'yı belirleyin. ZIKV hedef dizilerini içeren T7 polimeraz kullanılarak in vitro olarak oluşturulan tanımlanmış pozitif tek telli RNA içeren bir kopya kontrol plazmidi kullanarak viral kopya numarasını belirleyin.
- Yaklaşık 300 μL olan kalan numuneyi üçüncü tüpe aktarın ve gerekirse -80 °C'de saklayın.
NOT: Numuneler daha önce dondurulmamışsa -80 °C'de donun. Numuneler daha önce dondurulmuşsa, durdurmadan öncetest ve/veya RNA yalıtımı oluşturan odaklamaya devam edin.
3. Zika Virüs Odak Oluşturma Testi26
NOT: Bu bir virüs kontrolü ve pozitif kontrol dahil etmek önemlidir. Pozitif kontrol bilinen bir konsantrasyon ile bir virüs stok seyreltme serisidir. Tüm kontrollerin aynı plaka üzerinde olması gerekmez, ancak titreşme 5 plakadan daha büyük hale geldikçe, daha fazla kontrol eklenmeli ve plakalar arasında yayılmalıdır. Boru uçları veya güçlü yıkama ile monolayer çizik değil dikkat edin. Birden fazla organ aynı gün veya farklı günlerde titreşebilir. Ama farklı test koşulları viral titreyi etkileyebilir, çünkü bireysel bir organ birden fazla gün içinde titretli olmamalıdır. Tek bir organın tek bir günde çalıştırılması şiddetle tavsiye edilir.
- Tgörünüşe göre, odak noktası için gerekli hücreleri ve reaktifleri hazırlayın.
- 5 mL HEPES ve 25 mL FBS ile 500 mL DMEM içeren büyüme ortamı hazırlayın. Vero-Dünya Sağlık Örgütü (WHO) hücreleri 37 °C, 5% CO2 olarak büyüme medya büyüme hücreleri için daha önce tsur. Vero hücreleri yüksek bir geçit olmamalı veya hiç üzerinde büyüdü 100% birleştirme önce tetkik başlamadan önce.
- 10 g metilselüloz ve büyük bir karıştırma çubuğu ve 500 mL H2O ile ayrı bir 1 L cam ortam şişesi ile 1 L cam ortam şişesi otomatikkleyerek %2'lik bir metilselüloz çözeltisinin 500 mL'sini hazırlayın. Otoklavlı su, şişe dokunmak için sıcak olana kadar mikrodalga yeniden ısıtılmış ise, ama kaynama değil.
- Yavaşça doku kültürü başlık iken metilselüloz şişesi içine sıcak / sıcak su dökün. Kısmen kap şişe ve metilselüloz çözeltisi (1-4 saat) olana kadar ocak üzerinde karıştırın. Aliquot steril 50 mL konik tüp içine% 2 metilselüloz çözeltisi. %2 Metilselüloz ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklanabilir.
- Plakaları sabitlemek için PBS'de %5'lik bir Paraformaldehit çözeltisi hazırlayın ve ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın. PBS'ye %0,05 Triton X-100 ekleyerek ve RT'de depolanan 1x odak yıkama tamponu hazırlayın. Bunlar bir-iki hafta önceden hazırlanabilir.
- Her organ triplicate plakalı olduğu gibi tsay için gerekli düz alt 96 iyi plakaların sayısını hesaplayın. Pozitif ve negatif denetimler için yeterli ek kuyular ekleyin.
- Tasarlanmış tsay tamamlamak için büyüme medya yeterli Vero hücreleri büyümek. Vero hücrelerini trypnizie ve büyüme ortamlarında mL başına 1,5 x 105 hücre de yeniden sayaonları saymak. 3.0 x 104 Vero-WHO hücrelerinde/iyi büyüme ortamlarında 96 iyi düz alt plakadaki Plaka Vero hücreleri kuyu başına 200 μL ekleyerek.
- Bir gecede %5 CO2 ile 37°C'de kuluçka plakaları, hücrelerin kuyu içinde eşit olarak dağıtılması için plakaların kuvözde eşit olduğundan emin olun.
NOT: Her laboratuvar Vero hücrelerini biraz farklı yetiştirir; hedef, Zika virüsünün teşrinin olduğu gün her kuyuda %90-95'lik bir tek katmanlı dır.
- Seyreltik Zika virüsü test günü örnekleri. Organ örnekleri daha önce homojenleştirilmiş olsaydı, -80 °C'lik dondurucudan numuneleri çıkarın ve numuneleri test için buza koymadan önce erimelerine izin verin.
- Buz üzerinde, B'den H'ye kadar olan a sırasını boş bırakarak 180 μL soğuk büyüme ortamı ekleyerek yuvarlak bir alt 96 kuyu plakası hazırlayın. Yuvarlak alt plakanın A satırına her homojenize organ örneğinden 150 μL ekleyin.
- Çok kanallı pipet kullanarak her numunenin seri 10 kat seyreltmelerini hazırlayın. 180 μL'lik büyüme ortamına 20 μL numune ekleyerek, numuneleri yuvarlak bir alt 96 kuyu plakasında seyreltin ve her seyreltme arasındaki pipet uçlarını değiştirin.
- Vero hücrelerini kaplayan düz alt 96 kuyu plakasından ortamı çıkararak odak şekillendirme plakasını hazırlayın. Monolayer'ın kurumasını önlemek için virüs örneklerini eklemeden hemen önce bunu yapın.
- Vero plakasındaki her kuyuya 100 μL virüs seyreltme ekleyin. En düşükten en yüksek konsantrasyona giderek aynı ipuçları kümesini kullanarak örnek ekleyin. Kaya plakaları yan yana 2-4 kez girdap yapmamaya dikkat etmek.
- 37 °C'de kuluçka, 1-2 saat için %5 CO2. Kuluçka sırasında RT% 2 metilselüloz ısınmak.
- Büyüme ortamlarında %2 metilselüloz çözeltisini seyreltin. Seyreltme büyüme ortamına yaklaşık 2:1% 2 metilselüloz oranında olmalıdır. Kullanma zamanı olana kadar oda sıcaklığında tutun. Metilselülozun 1-2 damla/kuyuekleyin (pipet'i 125°L'ye ayarlayın: 96 kuyu plakasının her bir kuyusuna büyüme ortamı.
- Kuluçka 32-40 saat 37 °C, %5 CO2. Herkesin Vero hücreleri biraz farklı büyüdükçe ve hücre birleşimi ve Zika virüsü nün türü gibi faktörler kuluçka süresini değiştirebilir.
- Hazırlanan %5 paraformaldehit çözeltisini kullanarak Vero hücrelerini düzeltin.
- Biyogüvenlik kabinindeki metilselüloz tabakasının üst kısmındaki her kuyuya %5 paraformaldehit ekleyin. RT'de 60 dakika kuluçka. Sabitleme 4 °C'de bir gecede gidebilir, ancak buharlaşmayı azaltmak için plakayı parafilm ile kaplar.
- Bindirme ve medya yıkın hücreleri biyogüvenlik kabini içinde bir bertaraf konteyner içine. PBS, 150 μL/iyi ile hafifçe yıkayın. PBS'yi plakalardan çıkarın ve plakayı BSL-2'den çıkarın.
- PBS yıkamayı 150 μL/kuyu ekleyerek 2x tekrarlayın. Sonra PBS kaldırın. 150 μL/well FFA yıkama tamponu ekleyin ve sabit hücreleri permeabilize etmek için RT'de 5-10 dakika oturun.
- Primer Zika antikorunu kullanarak enfeksiyonu sapta. FFA boyama tamponunda 1 mg/mL konsantrasyonda primer antikor 4G2 (D1-4G2-4-15) hazırlayın. Tüm teşekkat için yeterli antikor hazırlayın.
NOT: Lifler foci görüntüleme olumsuz etkileyeceğinden laboratuvar bezi veya diğer yüksek tiftik emici malzeme uzak durun.- FFA yıkama tamponu tabaklardan çıkarın. FFA boyama tamponuna primer antikordan 50 μL/kuyu ekleyin. Plakaları parafilm ile kapatın ve gece boyunca 4 °C'de sallanan bir platformda kuluçkaya yatırın. Tsur, RT'de 2 saat kuluçka ile yapılabilir.
- İkincil HRP konjuge antikor ilavesi ile enfeksiyonu görselleştirin. FFA boyama tampon1:5.000 konsantrasyonda ikincil Keçi anti-fare HRP etiketli antikor hazırlayın. Tüm teşekkat için yeterli antikor hazırlayın.
- Hücreleri FFA yıkama tamponu ile 3kat yıkayın, her seferinde lavaboya girerek yıkama tamponunu temizler. Hücreleri FFA boyama tamponundaki ikincil antikorla 50 μL/iyi de lekelendirin. RT'de 1-2 saat kuluçka.
- Hücreleri FFA yıkama tamponu ile 3kat yıkayın, her seferinde lavaboya girerek yıkama tamponunu temizler. Trueblue Substrat'ın 50 μL/iyi kısmını ekleyin.
- Noktalar tam olarak tanımlanmış ve en az arka plan olana kadar 2-15 dk bekleyerek plakaları dikkatlice izleyin. Lekeler görünür olduktan sonra, akan suyun kuvvetinden monolayer kalkan bir el kullanarak, su ile yavaşça yıkayın. Kağıt havlular (NOT BEZLER) ve görüntü en kısa sürede kuru dokunun.
- Noktalar el ile veya otomatik bir nokta sayacı kullanılarak sayılabilir. El ile sayılırsa, görselleştirmeye yardımcı olmak için bir kesme kapsamı kullanılabilir.
- Her örnek için, kolayca ayırt edilebilir foci (örneğin, kuyu başına 200-200) ile bir seyreltme seçin ve yinelenen kuyuların ortalamasını kullanarak mL başına odak oluşturan birimler (FFU/ml) titresini hesaplayın: FFU/mL = (ortalama foci/kuyu) × (seyreltme faktörü) ÷ (mL inoculum).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak ZIKV titrelerini değerlendirmek için Ifnar1-/- farelerayak altına deri altı (SC) enjeksiyonu ile ZIKV (PRVABC59) ile enfekte olmuşlardır. Burada, 8-12 haftalık Ifnar1-/- fareler SC zikv 1 x 105 FFU uygulanması öldürücü değildir ama virüs hem çevre ve CNS çoğalabilir. Bu doz ve rota konak patojen immün yanıtları ve patojenite çalışma için kullanılır. 8-12 haftalık Ifnar1 -/- fare intravenöz (IV) enjeksiyonuna 1 x 105 FFU zikv uygulanması %80 ila 100 arasında ölümcüldür ve hayvan 8 ila 14 gün arasında virüs enjeksiyonu sonrası enfeksiyona yenik düşer. Biz rutin antiviral ve terapötik etkinliğini belirlemek için bu yönetim rotasını kullanmak, yanı sıra preklinik aşı aday test.
Dört adet 10-12 haftalık Ifnar1-/- farelere 1 x 105 FFU ZIKV SC ve dalak, karaciğer, böbrek, omurilik ve beyin enfekte olmuş, yukarıda açıklanan yöntemlerle enfeksiyon sonrası dört gün hasat edilmiştir (Şekil1). Dokularda ZIKV miktarı yukarıda açıklandığı gibi 96 iyi formatta Vero hücreleri kullanılarak odak oluşturma tsay (FFA) tarafından kontrol edildi. FFA kullanılarak doku viral yükü, doku başına g başına odak oluşturan birimler (FFU) olarak ifade edilir. Ifnar1-/- 26'nınZIKV enfeksiyonu nun daha önceki bir çalışmasında gözlenene benzer şekilde, ZIKV enfeksiyonundan dört gün sonra farklı organlardaki viral titreörneklemesi sonrasında viremi gördük. Bu sonuçlar, odak oluşturma tahmı ile organ hasadı ve tittering için kullanılan yöntemlerin hem periferik organlarda hem de aynı hayvanın içindeki CNS'deki titreyi tespit etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. İlginçtir ki, ifnar1 ve tüm Ifnar1-/- zikv enfeksiyonu bu doz ve rota ile hayatta çünkü ifnar1-/- farelerde hem çevre hem de CNS dört gün sonrası enfeksiyon yüksek viral titreme görmek için beklemiyorduk. ZikV'in ifnar1 CNS'de ölümcüllük lere neden olmadan nasıl çoğalmaya devam edebileceğini anlamak için bu gözlemi araştırmaya devam ediyoruz.
Odak taht (FFA) oluştururken, bir araştırmacı nın yapabileceğiniz birden fazla teknik hata vardır ve bu da optimal olmayan FFA sonuçlarına neden olacaktır. En sık yapılan hatalar şunlardır: 1) organ toksisitesi; 2) güçlü pipetleme; 3) lif kontaminasyonu; ve 4) yanlış hücre kaplama yoğunluğu. Aşağıdaki bu konuların her birini tartışıyor ve sonucu Şekil2'de gösteriyoruz. Hem FFA hem de plak tözünün ortaya çıkan en yaygın sorunlarından biri organ toksisitesidir (Şekil2A kırmızı ok). Organ toksisitesinin, organ homojenizasyonu sırasında salınan hücre içi bileşenlerin yüksek konsantrasyonundan kaynaklandığına inanıyoruz. Organ toksisitesi organa göre değişir ve enfekte edilmemiş hayvanlardan alınan organlarda görülür, karaciğer en toksik ve dalak en az olmak. Organ FFA plakaüzerinde seri seyreltilmiş olarak toksisite azalır. Ancak, toksisite algılama sınırında bir değişiklik ile sonuçlanan titrenin hassasiyetini değiştirir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, organdaki viral titre toksisite toksisiteden daha düşükse FFA viral titreleri doğru bir şekilde kaydedemeyecektir. Şekil 2B, a1-4 kuyularında toksisiteyi göstermektedir, ancak viral titre b3 ve b4 kuyularında görüldüğü gibi organ toksisitesinin üstesinden gelmek için yeterince yüksektir. FFA bu sınırlamayı aşmak için, biz de organ titre örnekleri üzerinde kantitatif gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin. Şekil2C'de, birkaç yaygın teknik hata gösteriyoruz. Güçlü pipetleme veya yıkama monolayer kaldırabilirsiniz (Şekil2C, *), Bu odak ile kuyularda oluşursa bu veri titreştirme yanlış raporlama yol kaybolur. Laboratuvar tezgahı emici kağıtmevcut lifler veya kıllar, bireysel kuyuları kontamine edebilir (Şekil2C, $) Otomatik bir sayma programı kullanıyorsanız bu önemli hatalara neden olabilir. En otomatik sayma programları lif dışlama seçenekleri olsa da, biz analiz lifleri hariç son derece etkili olarak bulamadık. Bunun çözümü, çok zaman alan ve büyük tahlillerin analizi için pratik olmayan kuyuları elle saymaktır. Hücre yoğunluğu, bir odak noktasının başarısını önemli ölçüde etkilenebilen bir diğer konudur (Şekil 2D). Eğer hücreler tsedanın başında doğru yoğunlukta değilse lekelerin sayısı ve boyutu etkilenir. Şekil2D'de gösterildiği gibi, sütun 1-3, tetkikin başlangıcında yaklaşık %60 biriken hücreler, %90'lık birleşim sütunları 4-6'da kaplanmış hücrelerle karşılaştırıldığında, odak oluşturma tetkikini önemli ölçüde etkileyecektir. Bu engeli aşmak için küçük pilot testleri bireysel laboratuvar koşulları tahlil için başarı yı etkileyecek gibi hücre yoğunluğu ve fiksasyon süreleri optimize etmek için çalıştırılmalıdır.
Farklı enfekte hayvan gruplarının karşılaştırıldığında yapılan çalışmalarda yapılan istatistiksel analiz, verilerin dağılımına bağlıdır. Ya, parametrik veya nonparametrik testler istatistiksel anlamlılık değerlendirmek için kullanılır. Parametrik testler için, ANOVA genel etkisini saptamak için kullanılır ve bireysel tedavi grupları Dunn testi kullanılarak karşılaştırılacaktır. Verilerin dağıtımının parametrik analiz gereksinimlerini karşılamaması durumunda parametrik olmayan testler kullanılır. Kruskal-Wallis testi genel tedavi etkisini saptamak için kullanılır ve Mann-Whitney U testi çift-wise karşılaştırmalar gerçekleştirmek için kullanılır. Burada mevcut sonuçlar için biz gösterilen veri seti üzerinde istatistiksel analiz yapmadı bu yüzden bu zaman noktasında hasat ikinci bir veri seti ile hayvanları karşılaştırmak vermedi.
Şekil 1: Çevre ve CNS viral çoğaltma. IFNAR1-/- farelerden sonra periferik ve CNS dokularında viral yük 1x105 FFU ZIKV SC verilir. 4. günde (grup başına n = 4) enfeksiyon sonrası organlar hasat edildi, donduruldu, tartıldı ve homojenize edildi. Virüs seviyeleri odak testi oluşturarak ölçüldü. Algılama sınırı organa dayalı 100-500 FFU/gramdır. Veriler, doku gramı başına Log10 odak oluşturma birimi olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Odak oluşturan teşrinile ilgili ortak güçlükler. Viral antijen gösterilen tüm odak için bir anti-flavivirus MAb ile tespit edildi, immünperoksidaz boyama takip (mor). (A) Vero hücreleri % 90 biraraya geldi ve 8 haftalık C57BL/6 fareden alınan karaciğerden 10 kat seri seyreltme ile enfekte edildi, IV 4 gün önce 5 x 107 FFU ZIKV ile enfekte edildi. Kırmızı ok bu konsantrasyonda toksisite gösteren karaciğer supernatant en yüksek veya "düzgün" konsantrasyongösterir. (B) Vero hücreleri %90'lık bir kesişme ile büyüdü ve ZIKV enfekte böbrek hücrelerinden 10 kat süpernatant seyreltme ile enfekte edildi. Bu durumda sütun 1 ve 2'deki örnekler C57BL/6 fareden, col 3 ve 4 ise Ifnar1-/-. Her iki fare de 8 haftalıkken ZIKV IV'ün 1 x 105 FFU'su enfekte olmuş ve enfeksiyon sonrası 4 gün kurban edilebilmektedir. Benzer(A) en yüksek konsantrasyonda görülen bazı toksisite (satır a) ancak sütun 3 ve 4 gözlenen viral titreler doğru titreleri tespit edilmesine olanak sağlayan algılama sorunları sınırının üstesinden. (C) Vero hücreleri kaplandı. Seçilen kuyular sık karşılaşılan teknik hataları gösterir. * tek katmanlı güçlü pipetleme nedeniyle kaldırıldı bir alanı gösterir. $ bir lif görülebilir bir kuyu üzerine yerleştirilir. (D) Vero hücre konsantrasyonu, tetkik lerin hassasiyetini etkiler. Bu tabakada Vero hücreleri 1-3 ve 3.0 x 104 Vero-WHO hücreleri/kuyusi 4-6 sütununda 1.0 x 104 hücre/kuyu şeklinde kaplandı. Sonra plaka ZIKV PRVABC59 stok 10 kat seyreltme ile enfekte oldu. En yüksek viral konsantrasyon örnekleri A satırında dır ve seyreltilir, her satır 10 kat seyreltme temsil eden. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ZIKV enfeksiyonu nörolojik bir hastalığa neden olabilir bu nedenle mevcut hayvan modellerinin patogenezi, immün yanıtları ve aşıların ve antivirallerin koruyucu etkinliğini incelemesi cns içinde viral kontrole odaklanması gerekir. CNS hastalığına odaklanmanın zorluklarından biri de genellikle periferik enfeksiyonu nitreşme pahasına gelmesidir. Burada önerilen organ izolasyon yöntemleri, CNS aracılı ZIKV ilişkili hastalığı değerlendirmek ve antivirallerin preklinik test için bir model oluşturmak için hem çevre hem de CNS'deki ZIKV enfeksiyonunu hızla değerlendirme gereğine odaklanmaktadır. Aşı. Bu tekniğin bir yararı da, zikv immünolojik yanıtların kombine çalışma veya enfeksiyonun histolojik analizi de dahil olmak üzere, esneklik yüksek derecede sağlar olmasıdır. Bu teknik, sadece ZIKV ile sınırlı değildir, aynı zamanda evrensel olarak dang virüsü21gibi flaviviruses, monkeypox ve ectromelia gibi ortopedik virüsler de dahil olmak üzere konak-patojen etkileşimleri, bir dizi çalışma için uygulanabilir. Bu hasat tekniğinin göz önünde bulundurulması ve sakıncaları ağırlıklı olarak deneycinin yeteneklerine odaklanMalıdır. ZIKV oda sıcaklığında uzun süre stabil olmadığı için, perfüzyon sonrası organların hasat edilmesi için gereken süre sonuçların kalitesini önemli ölçüde etkileyebilir. Yaptığımız deneylerin çoğunda, iki koşulla tedavi edilen farelerin viral titrelerini karşılaştırıyoruz, bu yüzden çabalarımızı organ hasadı arasındaki zaman tutarlılığına odaklanıyoruz. Bu şekilde aynı kişi tutarlılık korumak için tüm deneme için aynı yordamı gerçekleştirir. Bu prosedür ile diğer önemli husus güvenlik, biz kolayca BSL-2 (ZIKV, Dang virüsü) ve BSL-3 (WNV, Chikungunya virüs) patojenleri ile bu yöntemleri yaptık. Tüm prosedürleri temiz, bakımlı, sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde dezenfektan ile gerçekleştirmek çok önemlidir.
Bir FFA plak tofarı paralel, bu enfekte hücrelerin foci tanımlamak için peroksidaz immünostaining kullanır dışında, plaklar yerine. Benim laboratuvar yanı sıra birden fazla diğer laboratuvarlar şimdi başarıyla tüm tittering deneyler11,14,15,17,26,27 için FFAs kullanarak geçti ,28. FFA geleneksel plak tsay üzerinde birden fazla avantajı vardır: a) FFA daha hızlı, bir plak teşbit göre daha kısa bir kuluçka gerektiren, b) aynı zamanda daha yüksek iş itimat, 96-iyi plakalar yapılmaktadır. 96 iyi plaka biçimi de başlangıç malzemesi küçük hacimlerde barındırabilir. Buna ek olarak, c) FFA büyük ölçüde işçilik ve çalışma için gerekli zamanı azaltarak, otomatik bir plaka yıkıcı ve otomatik nokta sayacı kullanımı ile uyumludur. FFA enfeksiyon dan sonra daha fazla adım vardır, ama d) çok kanallı pipetler, hatta bir pipetleme robot kullanımı ile, fiksasyon sonrası hesaplama adımları çoğu için zamanlama esnek ve titrek bir gecede veya daha uzun süre duraklatılmış olabilir. Son olarak, e) özellikle dang virüsü gibi açık plaklar oluşturmayan virüs suşları için yararlı olabilir. FFA bir dezavantajı çeşitli virüs suşları veya mutant virüsler ilerlerken şaşırtıcı olabilir virüs enfekte hücreleri tespit etmek için özel antikorlar gerektirir olmasıdır. FFA için plak titretisi ile enfeksiyon sırasında hücre monolayer yoğunluğu olarak, titrenin başarısı için önemlidir. Hücreler bir FFA için daha yüksek bir kesişme de bir plak tsay ile karşılaştırıldığında kullanılmalıdır, fiksasyon önce zaman kısaltılmış uzunluğu nedeniyle. FFA daha yüksek iş kaynağı, daha uygun maliyetli ve daha hızlı geleneksel plak testi daha hızlı olduğu gibi benim laboratuvar hızla gelişmekte olan bulaşıcı hastalıklar çalışma için veri analiz sağlar. FFA daha kümülatif olarak daha maliyet çeşitli nedenlerle etkin. Antikorlar nötr kırmızı veya kristal mordaha pahalı olmasına rağmen, biz maliyet farkı ortadan kaldırır plaka başına daha fazla örnek analiz edebiliyoruz. İşgücü tahsisi açısından otomatik nokta sayma ve analiz için kolay veri girişi, işçilik maliyetlerini sınırlar ve bir kayıt olarak uzun vadeli bir görüntüye sahip olma yeteneğini ölçmek zordur. Bu testin geleceği HRP aksine bir okuma için floresan tabanlı odak taşımak için olabilir. Spot sayısı ile birlikte floresan yoğunluğunu ölçmek FFA'nın yararını şu anda çalışılanın ötesine genişletecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Dr. Pinto, Saint Louis Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden bir tohum bağışı ve Saint Louis Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden başlangıç fonları ile finanse edilmektedir. Dr. Brien, NIH NIAID'in K22AI104794 erken araştırmacı ödülü ve Saint Louis Üniversitesi Okulu'ndan bir tohum hibesi ile finanse edilmektedir. Finanse edilen tüm bireyler için fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18 G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1 cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37 °C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96 well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5 mL eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| Curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose With 4,500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5 mL EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| O-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| One step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| Spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| Straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , Oregon Health & Science University. (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
