Summary
Målet med protokollen er at demonstrere de teknikker, der anvendes til at undersøge virussygdom ved at isolere og kvantificere Zikavirus, fra flere organer i en mus efter infektion.
Abstract
De metoder, der fremlægges, viser laboratorieprocedurer for isolering af organer fra Zikavirus inficerede dyr og kvantificering af virusbelastningen. Formålet med proceduren er at kvantificere virale titre i perifere og CNS-områder af musen på forskellige tidspunkter efter infektion eller under forskellige eksperimentelle betingelser for at identificere virologiske og immunologiske faktorer, der regulerer Zikavirus infektion. De viste organ isolations procedurer muliggør både kvantificering af fokus dannelse og kvantitativ PCR-vurdering af virale titre. De hurtige organ isolering teknikker er designet til bevarelse af virus titer. Viral titer kvantificering af fokus danner assay giver mulighed for hurtig gennemstrømning vurdering af Zikavirus. Fordelen ved den fokus dannende analyse er vurderingen af infektiøs virus, begrænsningen af denne analyse er potentialet for organtoksicitet, der nedsætter detektionsgrænsen. Viral titer vurdering kombineres med kvantitativ PCR, og ved hjælp af en rekombinant RNA kopi kontrol viral genom kopi nummer i organet er vurderet med lav detektionsgrænse. Samlet set giver disse teknikker en nøjagtig hurtig høj gennemløbs metode til analyse af zikaviviral titre i periferien og CNS hos zikavirus inficerede dyr og kan anvendes til vurdering af virale titre i organerne hos dyr, der er inficeret med de fleste patogener, herunder Denguevirus.
Introduction
Zika virus (ZIKV) er en arbovirus, der tilhører Flaviviridae familien, som omfatter vigtige Neuroinvasive humane patogener såsom Powassan virus (POWV), japansk encephalitis virus (JEV), og West Nile virus (WNV)1. Efter isolering og identifikation har der været periodiske rapporter om humane zikv-infektioner i Afrika og Asien2,3,4,5og epidemier i Central-og Sydamerika (gennemgået i reference6). Men, det var først for nylig, at ZIKV blev anset for at forårsage svær sygdom7. Nu er der tusindvis af tilfælde af neurologiske sygdomme og fødselsdefekter forbundet med ZIKV infektioner. Den hurtige opståen af ZIKV har foranlediget mange spørgsmål vedrørende: hvorfor der er en stigning i sygdommens sværhedsgrad, hvad er den immunologiske reaktion på ZIKV infektion og er der virale og/eller immunmedierede patologier forbundet med stigningen i neurologiske manifestationer og fødselsdefekter. Der er nu et kapløb om at forstå det centrale nervesystem (CNS) relaterede sygdom forbundet med ZIKV samt behovet for hurtigt at teste effekten af antivirale lægemidler og vacciner mod ZIKV. Det er på denne baggrund, at vi har udviklet metoder til hurtig analyse af ZIKV titre i både periferien og CNS ved hjælp af en ZIKV-specifikke fokus danner assays (FFA).
Små dyremodeller er vigtige for at forstå sygdomsprogression og for tidlig evaluering af vacciner, terapi og antivirale lægemidler. Vi har etableret små dyremodeller til studiet af arbovirus sygdom ved hjælp af forskellige muse stammer til at modellere menneskelig infektion og beskyttelse mod virale patogener8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Ved hjælp af denne tidligere erfaring, vi begyndte at ændre teknikker, der anvendes til vurdering af wnv og dengue virus, en beslægtet flavivirus til vurdering af zikv titer i begge perifere organer samt CNS21,23, 24. fordelene ved disse metoder frem for andre assays er: 1) at de kombinerer evnen til at høste både perifere og CNS organer til analysen; 2) metoderne er tilpasningsdygtige for strømnings cytometri, for målinger af medfødte og adaptive immunrespons, sammen med virale titre på samme dyr i samme organ; 3) høst teknikken er tilpasningsdygtig til histologisk analyse; 4) ZIKV FFA er en hurtig høj gennemløb metode til viral titer analyse; og 5) disse metoder kan anvendes til vurdering af viral titre i organerne af dyr inficeret med de fleste patogener25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer i denne undersøgelse er i overensstemmelse med de retningslinjer, der er fastsat af St. Louis University Animal Care og use udvalget. SLU er fuldt akkrediteret af foreningen for vurdering og akkreditering af laboratorium Animal Care International (AAALAC).
1. organ isolation
Bemærk: Virusset er ikke stabilt ved stuetemperatur (RT), så antallet af dyr, der høstes på én gang, skal planlægges omhyggeligt for at bevare viral titre.
- Inficere mus ved hjælp af den valgte dosis og rute, baseret på den nødvendige fænotype. For denne protokol, inficere 8-10 uge gamle mandlige og kvindelige type I interferon receptor mangelfuld (Ifnar1-/-) C57BL/6 mus.
- Anesthetize Ifnar1-/- mus med en cocktail af ketamin (90 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg). Test pedal refleks af en fast tå knivspids for at bekræfte anæstesi. Der administreres 1 x 105 fokus dannende enheder (FFU) af zikv i 50 μl SUBKUTANT (SC) via fodpladen.
- Forbered alle de nødvendige materialer til høst dagen før: 2 saks, pincet og 20 mL 70% ethanol (EtOH) i en 50 mL konisk til desinfektion af værktøj.
- Forbered sprøjter og nåle: en 20 mL sprøjte til perfusion, 23 G nåle (ca. 1 pr. bur) og 1 mL sprøjte med 25 G nål (1 pr. 3-5 mus). Før veje rør tilsættes stål perler (i hætte) til 1,5 mL O-ring skruehætte rør (en for hvert organ). Rørene skal være passende til homogenisering.
- Forbered høst dagen de materialer, der er nødvendige for perfusion og organ frysning.
- Fyld en isspand med tøris og 70% EtOH for at lave et isbad. Forbered steril fosfat bufferet saltvand (PBS) under antagelse af, at 25-30 mL pr. mus PBS for hver perfusion er nødvendig 5-10 mL til rygmarven). Få anæstesi, en cocktail af ketamin og Xylazine, og antage 300 μL per mus. Alle materialer og yderligere rør, der kræves til strømnings cytometri osv., skal placeres i en sekundær beholder for at kunne transporteres til dyreanlægget.
- Følg alle nødvendige procedurer for indrejse, herunder donation og doffing af personlige værnemidler under indrejse og udrejse i dyret facilitet.
Forsigtig: Alle procedurer skal udføres i et certificeret biosikkerhedskabinet inden for et laboratorium for biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2). - Indgiv anæstesi, 200-500 μL, intraperitonealt afhængigt af dyrets størrelse og vægt. Hvis du arbejder alene, skal du administrere anæstesi til et dyr ad gangen for at undgå at dræbe dyrene før organhøst.
- Bekræft anæstesi dosis ved at klemme tå med tang til at evaluere pedal refleks. Må ikke fortsætte, medmindre helt ikke reagerer. Brug stifter til at sikre musen til en voks plade. På dette tidspunkt, slukke musen i 70% ethanol for at undgå hårforurening i organhøst procedure
- Terminalt blødning ved hjerte punktering.
- Brug saks og pincet, åbne dyret gennem brysthulen for at udsætte hjertet. Saml blod via hjerte punktering (~ 800 μl), kan dette bruges til flere assays, herunder klinisk kemi, hæmatologi, flow flowcytometri til at detektere antigen specifikke reaktioner, og realtids kvantitativ PCR (QRT-PCR) til analyse af viral kopi nummer.
- Ved viral RNA-analyse ved qRT-PCR opsamles blod i et EDTA-rør, hvis det udvinder fra fuldblod eller i et mikrocentrifuge glas, hvis det udvinder fra serum. (For serum, spin tube ved maksimal hastighed i centrifuge, rum Temp, for 20 min og fjerne serum til et separat rør). Der tilsættes et lineært polyacrylamid som bærer til serumprøven efter endt behandling. RNA kan derefter analyseres eller opbevares ved-80 °C til videre behandling på et senere tidspunkt.
- Fyld 20 mL sprøjten med PBS, ved stuetemperatur (eller 37 °C), og perfuse mus ved at indsætte Butterfly nål i venstre ventrikel. Punktering det rigtige Atrium for at tillade blod og PBS at afslutte. Administrer langsomt PBS, mens du tjekker farven på leveren for at bekræfte, at dyret er fuldstændig perfvant. Leveren bør skifte fra dyb rød til Pink laks farve.
- Hvis du forbereder organer til histologi, lad Butterfly nål på plads og derefter perfuse med 20 mL iskold 4% PARAFORMALDEHYD. Hvis det er tilfældet, er det bekvemt at have sprøjten sluttet til en 3-vejs stophane med begge sprøjter knyttet til den, dreje ventilen til og fra som en skifter mellem PBS og PFA.
- Høst organer i mærkede, vejede rør. For perifere organer, Følg en etableret rækkefølge for høst: leveren, milt, nyrer og lunger.
- Tag kun én lap fra leveren; Det er ligegyldigt, hvilken en, men for alle eksperimenter altid forsøge at tage den samme lap med samme størrelse stykke. Tilsvarende, for nyrer og lunger, tage den samme nyre og lunge. Hvis flowcytometri også skal gennemføres, kan ethvert organ skæres i halve. Opbevar den halve til at blive brugt til cytometri i Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) ved stuetemperatur, indtil høsten er færdig.
- Umiddelbart efter høst, sætte hvert organ i et mærket rør og sted i det tørre isbad. Virus titer reducerer over tid ved stuetemperatur, så mængden af tid, det tager at høste organer er ekstremt vigtigt. Der skal være konsistens mellem mus, så efter sikkerhed, den næste prioritet er hastighed.
Bemærk: Hvis høst organer for viral titers, det er meget nyttigt at have en anden individuel høst hjernen på dette punkt, at bevare viral titers.
- Fjern de resterende organer fra musens kropshulrum for at få adgang til rygsøjlen og kraniet.
- Fjern musen fra brættet og fjerne Pelt, efterfulgt af fjernelsen af arme og ben.
Fjern hovedet af musen med en decapitation, stump eller kirurgisk saks til at høste hjernen ved at skære kraniet med en savtakket LaGrange saks gennem foramen magnum. Derefter skrælle kraniet med pincet og øse hjernen ud med en spatel. - Brug stærk, afrundede saks, fjerne ribbenene og andre knogler omkring rygsøjlen. Derefter skæres over bækken benet, udsætter vertebrale foramen på lænde niveau. Den lille spids af rygmarven bør være synlig på dette punkt.
- Brug en 10 mL sprøjte fyldt med PBS og en 18 G nål til at udvise rygmarven ved at "skylle" ledningen fra lumbal til livmoderhals hvirvelsøjlen over en Petri skål.
- Forsigtigt, Placer den skrå spidsen af nålen inde i vertebrale foramen, undgå overdreven Tryk for at forhindre nålen til at trespassing rygsøjlen. Hold kraftigt for at lægge pres på rygsøjlen og nålen og tryk på sprøjtens stempel for at udvise ledningen. Overføres straks rygmarven i det mærkede rør og placeres i det tørre isbad.
- Fjern musen fra brættet og fjerne Pelt, efterfulgt af fjernelsen af arme og ben.
- Gentag proceduren med alle dyrene, indtil høsten er afsluttet. Placer høst værktøjerne i 70% ethanol mellem dyr. Fokus på konsistens og hurtighed. Længden af tid mellem hver organhøst bør forblive konsistent, således at ikke bias viral titer resultater.
- Når det er færdigt, desinficeres biosikkerheds kabinettet og alt materiale, før det fjernes fra dyreanlægget.
- Fjern hvert rør fra isbadet og veje rørene for at bestemme kroppens vægt. For at bestemme kroppens vægt, trækkes vægten af det tomme rør fra vægten af det organ, der indeholder røret.
Bemærk: På dette tidspunkt kan organer fryses ved-80 °C til yderligere behandling på et senere dato eller organer kan homogeniseret umiddelbart før frysning individuelle aliquoter. Fryse optøning prøver flere gange nedsætter viral titer. Derfor er det vigtigt at gøre samme procedure for alle eksperimenter inden for et enkelt projekt.
2. organ homogenisering
- Forbered 3 mærket, 1,5 mL snap-udjævnede rør for hvert organ, der skal homogeniseret.
- Hvis prøverne ikke homogeniseres umiddelbart efter høsten, fjernes rørene fra-80 °C. Prøverne behøver ikke at blive optøet for at homogenisere.
- Sæt prøverne på is for at holde dem kolde for at minimere viral titer tab. Tilsæt derefter 1 mL kold DMEM indeholdende 5% FB'ER til hvert organ, der indeholder rør.
- Straks slå rør i perle beater i henhold til producentens anvisninger. Homogeniser alle organer med stål perler i et perle-homogenisator instrument. Kontroller for at sikre, at hvert organ er fuldstændig homogeniseret.
- Spin ned orgel rester i mikrofuge ved 12.000 x g i 5 min i en mikrofuge, der er blevet kølet til 8 °c. Returner derefter rørene til isspanden. I biosikkerheds kabinettet, alikvot prøver i rør til nødvendige analyser. Returner derefter rørene til isspanden.
- Til fokus dannende assay, alikvot 500 μl i et mærket rør. Placer derefter rørene i stativet på en isspand. Alikvot 50 μL til et rør til RNA for fluorogen kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR) til måling af det virale genom-kopi nummer.
- Isoler total RNA fra de inficerede dyrs organer ved hjælp af et kommercielt RNA-isolationssæt. Bestem flavivirus viral RNA ved hjælp af primer-sonde sættene, der er specifikke for ZIKV, som genkender unikke sekvenser i hvert flavivirus-genom. Bestem viral kopi nummer ved hjælp af en kopi kontrol plasmid indeholdende en defineret positiv enkelt-snoet RNA genereret in vitro ved hjælp af T7 polymerase indeholdende ZIKV Target sekvenser.
- Den resterende prøve, som er ca. 300 μL, ind i det tredje rør og opbevares ved-80 °C, hvis det er nødvendigt.
Bemærk: Hvis prøverne ikke tidligere var frosne, fryse ved-80 °C. Hvis prøverne tidligere var blevet frosset, fortsættes på den fokus dannende analyse og/eller RNA isolation før standsning.
3. zikavirus fokus danner assay26
Bemærk: Det er vigtigt at inkludere en ingen virus kontrol og en positiv kontrol. Den positive kontrol er en fortyndings serie af en virus bestand med en kendt koncentration. Ikke alle kontroller skal være på samme plade, men da analysen bliver større end 5 plader, skal der tilføjes flere kontroller og spredes ud mellem pladerne. Pas på ikke at ridse enkeltlags med enten pipet spidser eller ved kraftig vask. Flere organer kan Tittes på samme dag eller på forskellige dage. Men et individuelt organ bør ikke Tittes over flere dage, fordi forskellige analysebetingelser kan påvirke viral titer. Det anbefales kraftigt at køre et enkelt organ på en enkelt dag.
- Før analyse dagen forberedes de celler og reagenser, der er nødvendige for den fokus dannende analyse.
- Forbered vækstmedier indeholdende 500 mL DMEM med 5 mL HEPES og 25 mL FBS. Har Vero-World sundhedsorganisationen (WHO) celler vokser i vækstmedier ved 37 °C, 5% CO2 før starten af analysen. Vero-cellerne bør ikke være en høj passage eller nogensinde vokset over 100% konfluency før starten af analysen.
- 500 mL af en 2% methylcellulose opløsning forberedes ved autoklave en 1 L glas medie flaske med 10 g methylcellulose og en stor Stir bar og en separat 1 L glas medie flaske med 500 mL H2O. Hvis det autoklaverede vand er kølet op i mikrobølgeovnen, indtil flasken er varm at røre ved, men ikke koges.
- Hæld forsigtigt varmt/varmt vand i flasken med methylcellulose, mens du er i vævs kulturens hætte. Delvist hætteflasken og rør på kogepladen, indtil methylcellulose er i opløsning (1-4 h). Alikvot 2% methylcellulose opløsning til steril 50 mL konisk slange. 2% methylcellulose kan opbevares ved 4 °C, indtil det er nødvendigt.
- Der fremstilles en 5% PARAFORMALDEHYD opløsning i PBS til fastgørelse af pladerne og opbevares ved 4 °C, indtil det er nødvendigt. Forbered en 1x fokus danner assay vask buffer ved at tilføje 0,05% Triton X-100 til PBS og opbevares på RT. Forbered en 1x FFA farvnings buffer ved at tilføje 1 mg/mL saponin til PBS og opbevares ved 4 °C, indtil det er nødvendigt. Disse kan udarbejdes en-to uger i forvejen.
- Beregn antallet af flad-bund 96 brønd plader, der er nødvendige for analysen, således at hvert organ er belagt i tre eksemplarer. Medtag nok ekstra brønde til positive og negative kontroller.
- Vokse op nok Vero-celler i vækstmedier til at fuldføre analysen designet. Trypsinize Vero-cellerne, og Tæl dem ved at udsætte dem igen ved 1,5 x 105 celler pr. ml i vækstmedier. Plade Vero-celler i 96 godt flad Bundplader ved 3,0 x 104 Vero-WHO-celler/godt i vækstmedier ved at tilføje 200 μl pr. brønd.
- Inkubér pladerne ved 37 °C ved 5% CO2 overnight, Sørg for, at pladerne er niveau i inkubator, så cellerne fordeles ligeligt i brønden.
Bemærk: Hvert laboratorium vokser Vero celler lidt forskelligt; Målet er en 90-95% flydende-enkeltlags i hver brønd på dagen for analysen for zikavirus.
- Fortyndet Zikavirus prøver dagen for analysen. Hvis organ prøverne tidligere er blevet homogeniseret, udtages prøverne fra-80 °C-fryseren, og de kan tø, før Prøverne anbringes på is til analysen.
- På is, Forbered en rund bund 96 brønd plade ved at tilføje 180 μL kold vækstmedier til rækker B gennem H forlader rækken en tom. Tilsæt 150 μL af hver homogeniseret organ prøve til række A af den runde bundplade.
- Forbered serielle 10-fold fortyndinger af hver prøve ved hjælp af en multi-kanal pipette. Prøverne fortyndes i en rund bund 96 brønd plade ved at tilsætte 20 μL prøve til 180 μL vækstmedier, idet der skiftes pipettespidser mellem hver fortynding.
- Forbered fokus formnings pladen ved at fjerne mediet fra den flade bund 96 brønd plade, der dækker Vero-celler. Gør dette umiddelbart før tilsætning af virus prøver for at forhindre, at enkeltlags tørrer ud.
- Tilsæt 100 μL af virus fortyndingen til hver brønd i Vero-pladen. Tilføj prøve ved hjælp af det samme sæt af tips ved at gå fra den laveste til den højeste koncentration. Stenplader side-til-side 2-4 gange at være omhyggelig med ikke at hvirvle.
- Inkubér ved 37 °C, 5% CO2 for 1-2 h. Sørg for, at pladerne er i niveau med inkubatoren. Under inkubationen varme op 2% methylcellulose til RT.
- Fortyndet 2% methylcellulose opløsning i vækstmedier. Fortyndingen skal være i et forhold på ca. 2:1 af 2% methylcellulose til vækstmedier. Hold på værelset Temp, indtil det er tid til at bruge det. Tilsæt 1-2 dråber/brønd (sæt pipet til 125 μL) af methylcellulose: vækstmedier til hver brønd af 96 brønd pladen.
- Incubate 32-40 h ved 37 °C, 5% CO2. Som alles Vero celler vokse lidt anderledes og faktorer, herunder celle konfluency og stamme af Zika virus kan ændre inkubationstiden.
- Ret Vero-cellerne ved hjælp af den fremstillede 5% PARAFORMALDEHYD opløsning.
- Tilsæt 50 μL 5% PARAFORMALDEHYD til hver brønd over toppen af methylcellulose laget i biosikkerheds kabinettet. Inkuber i 60 min ved RT. Fastgøring kan gå natten over ved 4 °C, men dække pladen med parafilm for at reducere fordampning.
- Dump overlay og Media off celler i en bortskaffelse container inde i biosikkerhed kabinet. Vask forsigtigt med PBS, 150 μL/brønd. Fjern PBS fra pladerne, og fjern pladen fra BSL-2.
- Gentag PBS vask 2x tilsætning 150 μL/brønd. Fjern derefter PBS. Tilsæt 150 μL/godt 1x FFA vask buffer og lad sidde for 5-10 min på RT at permeabilize de faste celler.
- Opdage infektion ved hjælp af primære Zika antistof. Forbered det primære antistof 4G2 (D1-4G2-4-15) i en koncentration på 1 mg/mL i FFA farvnings buffer. Forbered nok antistof til hele analysen.
Bemærk: Hold dig væk fra Lab bleer eller andet højfnug absorberende materiale, da fibrene vil have en negativ indvirkning på billeddannelse af Foci.- Fjern FFA vask buffer fra pladerne. Tilsæt 50 μL/godt af det primære antistof i FFA-farvnings bufferen. Forsegl pladerne med parafilm og Inkuber natten over ved 4 °C på en gynge platform. Analysen kan udføres med en inkubation i 2 timer ved RT.
- Visualisere infektionen ved tilsætning af et sekundært HRP konjugeret antistof. Forbered den sekundære ged anti-mus HRP-mærket antistoffer i en koncentration på 1:5000 i FFA farvning buffer. Forbered nok antistof til hele analysen.
- Vask cellerne 3x med FFA vask buffer, fjerne vask buffer ved at svirpe i vasken hver gang. Pletter cellerne med det sekundære antistof i FFA farvnings buffer ved 50 μL/brønd. Incubate 1-2 h hos RT.
- Vask cellerne 3x med FFA vask buffer, fjerne vask buffer ved at svirpe i vasken hver gang. Tilsæt 50 μL/brønd af det Trueblue substrat.
- Se pladerne omhyggeligt, venter 2-15 min, indtil pletter er fuldt defineret og minimal baggrund. Efter pletter er synlige, vask forsigtigt med vand, ved hjælp af en hånd til at beskytte den enkeltlags fra kraften i vandet kører. Tryk på tør på papirhåndklæder (ikke BLEER) og billede så hurtigt som muligt.
- Pletter kan tælles manuelt eller ved hjælp af en automatiseret spot Counter. Hvis det tælles manuelt, kan et dissekting-område bruges til at støtte i visualisering.
- For hver prøve skal du vælge en fortynding med let fremtrædende Foci (f. eks. 20 til 200 pr. brønd) og beregne titer i fokus dannende enheder pr. mL (FFU/ml) ved hjælp af gennemsnittet af dobbelte brønde: FFU/mL = (gennemsnitlig Foci/brønd) × (fortyndingsfaktor) ÷ (mL inoculum).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at evaluere zikv titre ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor Ifnar1-/- mus blev inficeret med zikv (PRVABC59) via subkutan (SC) injektion til fodpuden. Her administration af 1 x 105 FFU af zikv til 8-12 uge gamle Ifnar1-/- mus SC er ikke dødelig, men virussen kan replikere i både periferien og CNS. Denne dosis og rute anvendes til at studere vært patogen immunrespons og patogenicitet. Administration af 1 x 105 FFU af zikv til en 8-12 uge gamle Ifnar1 -/- mus intravenøs (IV) injektion er mellem 80 til 100% dødelig, med dyret bukke under for infektion mellem 8 til 14 dage efter virus injektion. Vi rutinemæssigt bruger denne administration rute til at bestemme effekten af antivirale lægemidler og terapeutiske, samt prækliniske vaccinekandidat test.
Fire 10-12 uger gamle Ifnar1-/- mus blev inficeret med 1 x 105 FFU af zikv SC og spleens, lever, nyrer, rygmarv og hjerner blev høstet fire dage efter infektion med de metoder, der er beskrevet ovenfor (figur 1). Mængden af ZIKV i vævene blev analyseret af fokus dannende assay (FFA) ved brug af Vero-celler i et 96 Well-format som beskrevet ovenfor. Ved hjælp af FFA, væv viral belastning udtrykkes som fokus danner enheder (FFU) per g af væv. Svarende til hvad der blev observeret i en tidligere undersøgelse af zikv infektion af Ifnar1-/- 26, vi så observeres efter et udsnit af virale titre i forskellige organer fire dage efter zikv infektion. Disse resultater viser, at de metoder, der anvendes til organhøst og svag ved fokus dannende assay, kan anvendes til påvisning af titer i både perifere organer og CNS inden for samme dyr. Interessant, vi forventede ikke at se høj viral titre i både periferien og CNS fire dage efter infektion i Ifnar1-/- mus, fordi alle Ifnar1-/- overleve zikv infektion med denne dosis og rute. Vi fortsætter med at undersøge denne observation for at forstå, hvordan zikv kan fortsætte med at replikere i CNS af Ifnar1-/- uden at forårsage dødelighed.
Når du udfører fokus danner assay (FFA), der er flere tekniske fejl en investigator kan gøre, som vil resultere i suboptimale FFA resultater. De mest almindelige fejl er: 1) organtoksicitet; 2) kraftig pipettering; 3) fiber kontaminering; og 4) forkert celle plating tæthed. Vi diskuterer hvert af disse emner nedenfor og illustrerer resultatet i figur 2. En af de mere almindeligt forekommende problemer, der opstår med både FFA og plaque assay er organtoksicitet (figur 2a rød pil). Vi mener, organtoksicitet er drevet af den høje koncentration af intracellulære komponenter frigivet under organ homogenisering. Organtoksicitet varierer baseret på orgel og ses i organer høstet fra ikke-inficerede dyr, med leveren er den mest giftige og milten den mindste. Toksicitet reduceres, da organet er serielt fortyndet på FFA pladen. Toksiciteten ændrer imidlertid analysens følsomhed, hvilket resulterer i en ændring i detektionsgrænsen. Som vist i figur 2a , hvis den virale titer i organet er lavere end toksiciteten, vil FFA ikke være i stand til præcist at registrere de virale titers. Figur 2b illustrerer toksicitet i brønde a1-4, men den virale titer er tilstrækkelig høj til at overvinde organtoksicitet, som det ses i Wells B3 og B4. For at overvinde denne begrænsning i FFA, udfører vi også kvantitativ real-time PCR på orgel titer prøver. I figur 2cillustrerer vi flere almindeligt forekommende tekniske fejl. Kraftig pipettering eller vask kan fjerne enkeltlags (figur 2c, *), hvis dette sker i brønde med Foci, at data vil gå tabt fører til unøjagtige indberetning af titer resultater. Fibre eller hår, der er til stede i Lab bænk absorberende papir kan kontaminere individuelle brønde (figur 2c, $) Dette kan forårsage betydelige fejl, hvis du bruger en automatiseret tælle program. Mens de fleste automatiserede tælle programmer har fiber udelukkelse muligheder, har vi ikke fundet det at være meget effektiv til at udelukke fibre fra analysen. Løsningen på dette er at manuelt tælle brøndene, som kan være meget tidskrævende og ikke er praktisk til analyse af store assays. Celletæthed er et andet spørgsmål, som kan dramatisk påvirke succesen af en fokus danner assay (figur 2D). Hvis cellerne ikke er på den rigtige tæthed i begyndelsen af analysen antallet og størrelsen af pletter vil blive påvirket. Som vist i figur 2D, kolonner 1-3, celler ved ca. 60% konfluency ved starten af analysen sammenlignet med celler belagt på 90% confluency kolonner 4-6 vil dramatisk påvirke fokus danner assay. For at overvinde denne forhindring bør små pilot analyser køres for at optimere celletæthed og fikserings tider, da individuelle laboratorieforhold vil påvirke succesen for analysen.
For undersøgelser, hvor forskellige grupper af inficerede dyr sammenlignes, er den statistiske analyse, der udføres, afhængig af data fordelingen. Enten anvendes parametrisk eller ikke-parametrisk prøvning til vurdering af Statistisk signifikans. For parametriske tests anvendes ANOVA til at detektere den samlede effekt, og individuelle behandlingsgrupper vil blive sammenlignet ved hjælp af Dunns test. Hvis data distributionen ikke opfylder kravene til parametrisk analyse, anvendes ikke-parametriske prøvninger. Kruskal-Wallis-testen bruges til at detektere den samlede behandlingseffekt, og Mann-Whitney U-testen bruges til at udføre parvise sammenligninger. For de resultater, der er til stede her, vi ikke sammenligne dyrene med et andet datasæt høstet på dette tidspunkt, så vi ikke udføre statistisk analyse på det datasæt, der vises.
Figur 1: viral replikation i periferien og CNS. Viral byrde i de perifere og CNS væv efter IFNAR1-/- mus får 1x105 FFU af zikv SC. På dag 4 (n = 4 pr. gruppe) efter infektion organer blev høstet, snap frosset, vejet, og homogeniseret. Niveauer af virus blev kvantificeret ved fokus dannende assay. Detektionsgrænsen er 100-500 FFU/gram baseret på orgel. Data vises som log10 -fokus dannende enhed pr. gram væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: almindeligt forekommende problemer med fokus dannende assay. For alle de fokuserings undersøgelser, der blev påvist, blev virus antigen påvist med en anti-flavivirus MAb, efterfulgt af immunoperoxidasefarvning (lilla). (A) Vero-celler blev dyrket til en 90% konfluency og inficeret med en 10-fold seriel fortynding af supernatanten fra leveren høstet fra en 8 ugers gammel C57BL/6 mus, IV inficeret med 5 x 107 FFU af zikv 4 dage tidligere. Den røde pil indikerer den højeste eller "pæne" koncentration af lever supernatanten, som viser toksiciteten ved denne koncentration. (B) Vero-celler blev dyrket til en 90% konfluency og inficeret med en 10-fold fortynding af supernatanten fra zikv-inficerede nyreceller. I dette tilfælde er prøverne i kolonne 1 og 2 fra en C57BL/6 mus og Col 3 og 4 er fra en Ifnar1-/-. Begge mus var 8 uger gamle inficeret med 1 x 105 FFU af ZIKV IV og ofret 4 dage efter infektion. Svarende til (A) der er en vis toksicitet set ved den højeste koncentration (Row A), men de virale titre observeret i kolonne 3 og 4 overvinde grænsen af detekterings problemer, der gør det muligt at detektere præcise titre. (C) Vero-celler blev belagt. De valgte brønde viser almindeligt tekniske fejl. * Demonstrerer et område, hvor enkeltlags blev fjernet på grund af kraftig pipettering. $ Er placeret over en brønd, hvor en fiber kan ses. D) Vero-celle koncentrationen påvirker analysens følsomhed. I denne plade blev Vero-celler belagt ved 1,0 x 104 celler/godt i kolonne 1-3 og 3,0 x 104 Vero-WHO-celler/godt i kolonne 4-6. Derefter blev pladen inficeret med 10-fold fortyndinger af ZIKV PRVABC59 bestand. De højeste prøver af viral koncentration er i række A og fortyndes ned, og hver række repræsenterer en 10-fold fortynding. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ZIKV infektion kan forårsage en neurologisk sygdom derfor de nuværende dyremodeller til at studere patogenesen, immunrespons og beskyttende effekt af vacciner og antivirale lægemidler skal fokusere på viral kontrol inden for CNS. En af udfordringerne i at fokusere på CNS sygdom er, at det ofte kommer på bekostning af at studere perifer infektion. De organ isolations metoder, der foreslås her, fokuserer på behovet for hurtigt at evaluere ZIKV-infektion i både periferien og CNS med henblik på at vurdere CNS-medieret ZIKV-associeret sygdom og etablere en model for præklinisk testning af antivirale lægemidler, terapeutiske og Vacciner. En ekstra fordel ved denne teknik er, at det også giver mulighed for en høj grad af fleksibilitet, herunder den kombinerede undersøgelse af immunologiske reaktioner på ZIKV eller histologisk analyse af infektion. Denne teknik, er ikke begrænset til blot ZIKV, men kan også anvendes universelt for at studere en række vært-patogen interaktioner, herunder flavivira såsom dengue virus21, orthopoxvira som Monkeypox og ectromelia. De overvejelser og ulemper til denne teknik høst fokus primært på de kapaciteter af experimenter. Da ZIKV ikke er stabilt i længere tid ved stuetemperatur, kan den tid, det tager at høste organer efter perfusion, i høj grad påvirke kvaliteten af resultaterne. For de fleste eksperimenter, som vi har udført, sammenligner vi virale titre fra mus behandlet med to betingelser, så vi fokuserer vores indsats på konsistens af tid mellem orgel høster ikke på hastighed. På denne måde udfører den samme person den samme procedure for hele eksperimentet for at opretholde konsistens. Den anden store overvejelse med denne procedure er sikkerhed, vi har let udført disse metoder med BSL-2 (ZIKV, dengue virus) og BSL-3 (WNV, chikungunya virus) patogener. Det er meget vigtigt at udføre alle procedurer i et rent, velholdt, certificeret biosikkerhedskabinet med desinfektionsmiddel.
En FFA paralleller plaque assay, bortset fra at det bruger peroxidase immun farvning til at identificere Foci af inficerede celler, snarere end plaques. Mit laboratorium samt flere andre laboratorier har nu med succes skiftet til at bruge FFAs til alle vores svag eksperimenter11,14,15,17,26,27 ,28. FFA har flere fordele i forhold til den traditionelle plaque assay: a) FFA er hurtigere, kræver en kortere inkubation i forhold til en plaque assay, b) det er også højere gennemløb, der udføres i 96-brønd plader. 96 brønd plade formatet kan også rumme mindre mængder af udgangsmateriale. Hertil kommer, c) FFA er kompatibel med brugen af en automatiseret plade skive og automatiseret spot counter, i høj grad at reducere arbejdskraft og tid, der kræves for analysen. FFA har flere trin efter infektion, men d) med brug af multikanalpipetter, eller endda en pipette Rings robot, timingen for de fleste af de assay trin efter fiksering er fleksible og analysen kan afbrydes natten over eller længere. Endelig, e) det kan være særligt nyttigt for virusstammer, der ikke danner klare plaques, såsom dengue virus. En ulempe ved FFA er, at det kræver specifikke antistoffer til at opdage virus-inficerede celler, som kan være forvirrende, når de overvejer forskellige virusstammer eller mutant vira. For FFA som med plaque assay tætheden af cellen enkeltlags på tidspunktet for infektion er afgørende for succesen af analysen. Celler bør anvendes ved højere sammenløbet for en FFA i forhold til en plaque assay, på grund af den forkortede tid før fiksering. Som FFA er højere gennemløb, mere omkostningseffektiv og hurtigere end den traditionelle plaque assay det giver mit laboratorium til hurtigt at analysere data for at studere nye smitsomme sygdomme. FFA er mere kumulativt mere omkostningseffektive af flere grunde. Selvom antistoffer er dyrere end neutral rød eller krystalviolet, er vi i stand til at analysere flere prøver pr. plade, hvilket eliminerer omkostningsforskellen. Med hensyn til arbejdsfordeling automatiseret spot optælling og nem dataindtastning for analysegrænser lønomkostninger og evnen til at have en langsigtet billede som en rekord er vanskeligt at kvantificere. Fremtiden for denne analyse kan være at flytte til en fluorescerende-baseret Foci for en udlæser i modsætning til HRP. Kvantitere fluorescerende intensitet sammen med spot nummer vil forlænge nytten af FFA ud over, hvad der i øjeblikket undersøgt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Acknowledgments
Dr. Pinto er finansieret af et frø tilskud fra Saint Louis University School of Medicine og Startup midler fra Saint Louis University School of Medicine. Dr. Brien er finansieret af en K22AI104794 tidlig investigator Award fra NIH NIAID samt et frø Grant fra Saint Louis University School. For alle finansierede individer havde finansieringskilderne ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om offentliggørelse eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18 G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1 cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37 °C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96 well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5 mL eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| Curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose With 4,500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5 mL EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| O-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| One step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| Spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| Straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , Oregon Health & Science University. (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
