Summary

Utforska Sekvensutrymme för att identifiera bindnings platser för regulatoriska RNA-bindande proteiner

Published: August 09, 2019
doi:

Summary

Sekvens specificitet är kritisk för genreglering. Reglerande proteiner som erkänner specifika sekvenser är viktiga för genreglering. Att definiera funktionella bindnings platser för sådana proteiner är ett utmanande biologiskt problem. En iterativ metod för identifiering av en bindnings plats för ett RNA-bindande protein beskrivs här och gäller för alla RNA-bindande proteiner.

Abstract

Gen regleringen spelar en viktig roll i alla celler. Transkriptionella, post-transkriptionella (eller RNA-bearbetning), translationella och posttranslationella steg används för att reglera specifika gener. Sekvens-specifika nukleinsyra-bindande proteiner rikta specifika sekvenser för att kontrollera rumsliga eller temporala genuttryck. Bindnings platserna i nukleinsyror kännetecknas typiskt av mutationell analys. Många proteiner av intresse har dock ingen känd bindnings plats för sådan karakterisering. Här beskriver vi en metod för att identifiera tidigare okända bindnings platser för RNA-bindande proteiner. Det innebär iterativt urval och amplifiering av sekvenser som börjar med en randomiserad sekvens pool. Efter flera omgångar av dessa steg-transkription, bindning och förstärkning-den berikade sekvenser är sekvenserade för att identifiera en önskad bindnings plats (er). Framgången med denna metod övervakas med hjälp av in vitro-bindande analyser. Därefter kan funktionella analyser in vitro och in vivo användas för att bedöma den biologiska relevansen för de valda sekvenserna. Detta tillvägagångssätt möjliggör identifiering och karakterisering av en tidigare okänd bindnings plats (er) för något RNA-bindande protein för vilket ett test för att separera proteinbundna och obundna RNAs finns.

Introduction

I cellbiologi spelar gen regleringen en central roll. Vid ett eller flera steg längs gen uttrycks vägen har gener potential att regleras. Dessa steg inkluderar transkription (initiering, förlängning, och uppsägning) samt skarvning, polyadenylering eller 3 ‘ formation, RNA-export, mRNA översättning, och förfall/lokalisering av primära utskrifter. Vid dessa steg, nukleinsyra-bindande proteiner modulera genreglering. Identifiering av bindningsställen för sådana proteiner är en viktig aspekt av att studera gen kontroll. Mutational analys och fylogenetiska sekvens jämförelse har använts för att upptäcka regulatoriska sekvenser eller proteinbindnings ställen i nukleinsyror, såsom initiativtagare, skarvar platser, polyadenylation element, och translationella signaler1, 2 , 3 , 4.

Pre-mRNA splitsning är ett integrerat steg under genuttryck och reglering. Majoriteten av däggdjurs gener, inklusive de hos människor, har introner. En stor del av dessa utskrifter är alternativt splitsade och producerar flera mRNA-och proteinisoformer från samma gen eller primära avskrift. Dessa isoformer har cellspecifika och utvecklingsmässiga roller i cellbiologi. Den 5 ‘ splice plats, gren-punkt, och polypyrimidine-tarmkanalen/3 ‘ skarvning plats är kritiska skarvar signaler som är föremål för reglering. I negativ reglering, en annars stark skarvar plats är förtryckta, medan i positiv reglering en annars svag skarvar webbplats aktiveras. En kombination av dessa händelser ger en uppsjö av funktionellt distinkta isoformer. RNA-bindande proteiner spelar viktiga roller i dessa alternativa splitsnings händelser.

Många proteiner är kända vars bindnings plats (er) eller RNA-mål återstår att identifiera5,6. Att koppla reglerande proteiner till deras efterföljande biologiska mål eller sekvenser är ofta en komplicerad process. För sådana proteiner är identifieringen av deras målrna eller bindningsställe ett viktigt steg för att definiera deras biologiska funktioner. När en bindnings plats har identifierats kan den karaktäriseras ytterligare med hjälp av standardiserade molekylära och biokemiska analyser.

Den metod som beskrivs här har två fördelar. För det första kan den identifiera en tidigare okänd bindnings plats för ett protein av intresse. För det andra, en extra fördel med detta tillvägagångssätt är att det samtidigt tillåter mättnad mutagenes, som annars skulle vara arbetsintensiva att få jämförbar information om sekvens krav inom bindningsstället. Sålunda, den erbjudande en hurtigare, lättare, och mindre kostbar redskap till identifiera proteinet bindningsställen i RNA. Ursprungligen, detta tillvägagångssätt (Selex eller systematisk utveckling av ligander genom exponentiell berikning) användes för att karakterisera bindningsstället för bakteriofage T4 DNA polymeras (Gene 43 protein), som överlappar med ribosom bindningsstället i sin egen mRNA. Bindnings platsen innehåller en 8-bas loop-sekvens som representerar 65 536 randomiserade varianter för analys7. För det andra användes tillvägagångssättet också självständigt för att visa att specifika bindningsställen eller aptamers för olika färgämnen kan väljas från en pool med cirka 1013 sekvenser8. I själva verket har detta tillvägagångssätt i stor utsträckning använts i många olika sammanhang för att identifiera aptamers (RNA eller DNA-sekvenser) för bindande många ligander, såsom proteiner, små molekyler, och celler, och för katalys9. Som ett exempel, en aptamer kan diskriminera mellan två xantinderivat derivat, koffein och teofyllin, som skiljer sig genom närvaron av en metylgrupp i koffein10. Vi har i stor utsträckning använt denna metod (SELEX eller iterativ urval-amplifiering) för att studera hur RNA-bindande proteiner fungerar i splitsning eller splitsning regel11, som kommer att vara grunden för diskussionen nedan.

Det slumpmässiga biblioteket: vi använde ett slumpmässigt bibliotek med 31 nukleotider. Längden övervägande för det slumpmässiga biblioteket var löst baserat på tanken att den allmänna skarvning faktor U2AF65 binder till en sekvens mellan gren-punkt sekvens och 3 ‘ splice plats. I genomsnitt, avståndet mellan dessa skarvning signaler i metazoer är i intervallet 20 till 40 nukleotider. Ett annat protein kön-dödliga var känd för att binda till en dåligt karaktäriserad reglerande sekvens nära 3 ‘ skarvar plats för sitt mål pre-mRNA, transformator. Således valde vi en slumpmässig region av 31 nukleotider, flankerad av primer bindningsställen med restriktioner enzym platser för att möjliggöra PCR amplifiering och fastsättning av T7 RNA polymeras promotor för in vitro-transkription. Den teoretiska biblioteks storleken eller komplexiteten var 431 eller cirka 1018. Vi använde en liten del av detta bibliotek för att förbereda vår slumpmässiga RNA-pool (~ 1012-1015) för de experiment som beskrivs nedan.

Protocol

Anm.: i figur 1 finns en sammanfattning av de viktigaste stegen i processen för iterativ val-amplifiering (Selex). 1. generering av en slumpmässig Biblioteksmall Syntetisera framåt primer 5 ‘- Gtaatacgactcactatagggtgatcagattctgatcca-3 ‘ och omvänd primer 5 ‘-GcgacGgatccaagcttca-3 ‘ genom kemisk syntes på en DNA-synt.Anmärkning: primers och slumpmässiga bibliotek kan syntetiseras kommersiellt. Syntetisera ett slumpmässigt…

Representative Results

Följande observationer visar en lyckad urvals förstärkning (SELEX). Först analyserade vi pool 0 och de valda sekvenserna för bindning till det protein som används för det iterativa urvals-amplifieringsmetoden. Figur 2 visar att däggdjurs polypyrimidinbindande protein (PTB) visar knappt detekterbar bindning till pool 0-sekvensen men hög affinitet för den valda sekvenspoolen. Det var knappt detekterbar bindning till pool 0 när vi använde ca 300-fald…

Discussion

Nukleinsyra-bindande proteiner är viktiga regulatorer av djur-och växt utveckling. Ett nyckelkrav för SELEX-förfarandet är utvecklingen av ett test som kan användas för att separera proteinbundna och obundna RNA-fraktioner. I princip kan denna analys vara en in vitro-bindande analys, såsom filterbindande analys, gel Mobility Shift-analysen, eller ett matrisbindande test19 för rekombinanta proteiner, renade proteiner eller proteinkomplex. Analysen kan också vara en enzymatisk analys där …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författaren tackar National Institutes of Health för tidigare finansiering.

Materials

Gel Electrophoresis equipment Standard Standard
Glass Plates Standard Standard
Nitrocellulose Millipore HAWP
Nitrocellulose Schleicher & Schuell PROTRAN
polyacrylamide gel solutions Standard Standard
Proteinase K NEB P8107S
Recombinant PTB Laboratory Preparation Not applicable
Reverse Transcriptase NEB M0277S
Vacuum manifold Fisher Scientific XX1002500 Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold Millipore XX2702552 1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films Standard Standard

References

  1. Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
  2. Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
  3. Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3′ end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
  4. Kozak, M. An analysis of 5′-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
  5. Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
  6. Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
  7. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  8. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  9. Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
  10. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  11. Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
  12. Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. , (1989).
  14. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  15. Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
  16. Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
  17. Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
  18. Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
  19. Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
  20. Joyce, G. F. Reflections of a Darwinian Engineer. Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).
  21. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
  22. Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
  23. Szeto, K., et al. RAPID-SELEX for RNA aptamers. PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).
  24. Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
  25. Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
  26. Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
  27. Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
  28. Jijakli, K., et al. The in vitro selection world. Methods. 106, 3-13 (2016).

Play Video

Cite This Article
Singh, R. Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins. J. Vis. Exp. (150), e59635, doi:10.3791/59635 (2019).

View Video