Sekvens specificitet är kritisk för genreglering. Reglerande proteiner som erkänner specifika sekvenser är viktiga för genreglering. Att definiera funktionella bindnings platser för sådana proteiner är ett utmanande biologiskt problem. En iterativ metod för identifiering av en bindnings plats för ett RNA-bindande protein beskrivs här och gäller för alla RNA-bindande proteiner.
Gen regleringen spelar en viktig roll i alla celler. Transkriptionella, post-transkriptionella (eller RNA-bearbetning), translationella och posttranslationella steg används för att reglera specifika gener. Sekvens-specifika nukleinsyra-bindande proteiner rikta specifika sekvenser för att kontrollera rumsliga eller temporala genuttryck. Bindnings platserna i nukleinsyror kännetecknas typiskt av mutationell analys. Många proteiner av intresse har dock ingen känd bindnings plats för sådan karakterisering. Här beskriver vi en metod för att identifiera tidigare okända bindnings platser för RNA-bindande proteiner. Det innebär iterativt urval och amplifiering av sekvenser som börjar med en randomiserad sekvens pool. Efter flera omgångar av dessa steg-transkription, bindning och förstärkning-den berikade sekvenser är sekvenserade för att identifiera en önskad bindnings plats (er). Framgången med denna metod övervakas med hjälp av in vitro-bindande analyser. Därefter kan funktionella analyser in vitro och in vivo användas för att bedöma den biologiska relevansen för de valda sekvenserna. Detta tillvägagångssätt möjliggör identifiering och karakterisering av en tidigare okänd bindnings plats (er) för något RNA-bindande protein för vilket ett test för att separera proteinbundna och obundna RNAs finns.
I cellbiologi spelar gen regleringen en central roll. Vid ett eller flera steg längs gen uttrycks vägen har gener potential att regleras. Dessa steg inkluderar transkription (initiering, förlängning, och uppsägning) samt skarvning, polyadenylering eller 3 ‘ formation, RNA-export, mRNA översättning, och förfall/lokalisering av primära utskrifter. Vid dessa steg, nukleinsyra-bindande proteiner modulera genreglering. Identifiering av bindningsställen för sådana proteiner är en viktig aspekt av att studera gen kontroll. Mutational analys och fylogenetiska sekvens jämförelse har använts för att upptäcka regulatoriska sekvenser eller proteinbindnings ställen i nukleinsyror, såsom initiativtagare, skarvar platser, polyadenylation element, och translationella signaler1, 2 , 3 , 4.
Pre-mRNA splitsning är ett integrerat steg under genuttryck och reglering. Majoriteten av däggdjurs gener, inklusive de hos människor, har introner. En stor del av dessa utskrifter är alternativt splitsade och producerar flera mRNA-och proteinisoformer från samma gen eller primära avskrift. Dessa isoformer har cellspecifika och utvecklingsmässiga roller i cellbiologi. Den 5 ‘ splice plats, gren-punkt, och polypyrimidine-tarmkanalen/3 ‘ skarvning plats är kritiska skarvar signaler som är föremål för reglering. I negativ reglering, en annars stark skarvar plats är förtryckta, medan i positiv reglering en annars svag skarvar webbplats aktiveras. En kombination av dessa händelser ger en uppsjö av funktionellt distinkta isoformer. RNA-bindande proteiner spelar viktiga roller i dessa alternativa splitsnings händelser.
Många proteiner är kända vars bindnings plats (er) eller RNA-mål återstår att identifiera5,6. Att koppla reglerande proteiner till deras efterföljande biologiska mål eller sekvenser är ofta en komplicerad process. För sådana proteiner är identifieringen av deras målrna eller bindningsställe ett viktigt steg för att definiera deras biologiska funktioner. När en bindnings plats har identifierats kan den karaktäriseras ytterligare med hjälp av standardiserade molekylära och biokemiska analyser.
Den metod som beskrivs här har två fördelar. För det första kan den identifiera en tidigare okänd bindnings plats för ett protein av intresse. För det andra, en extra fördel med detta tillvägagångssätt är att det samtidigt tillåter mättnad mutagenes, som annars skulle vara arbetsintensiva att få jämförbar information om sekvens krav inom bindningsstället. Sålunda, den erbjudande en hurtigare, lättare, och mindre kostbar redskap till identifiera proteinet bindningsställen i RNA. Ursprungligen, detta tillvägagångssätt (Selex eller systematisk utveckling av ligander genom exponentiell berikning) användes för att karakterisera bindningsstället för bakteriofage T4 DNA polymeras (Gene 43 protein), som överlappar med ribosom bindningsstället i sin egen mRNA. Bindnings platsen innehåller en 8-bas loop-sekvens som representerar 65 536 randomiserade varianter för analys7. För det andra användes tillvägagångssättet också självständigt för att visa att specifika bindningsställen eller aptamers för olika färgämnen kan väljas från en pool med cirka 1013 sekvenser8. I själva verket har detta tillvägagångssätt i stor utsträckning använts i många olika sammanhang för att identifiera aptamers (RNA eller DNA-sekvenser) för bindande många ligander, såsom proteiner, små molekyler, och celler, och för katalys9. Som ett exempel, en aptamer kan diskriminera mellan två xantinderivat derivat, koffein och teofyllin, som skiljer sig genom närvaron av en metylgrupp i koffein10. Vi har i stor utsträckning använt denna metod (SELEX eller iterativ urval-amplifiering) för att studera hur RNA-bindande proteiner fungerar i splitsning eller splitsning regel11, som kommer att vara grunden för diskussionen nedan.
Det slumpmässiga biblioteket: vi använde ett slumpmässigt bibliotek med 31 nukleotider. Längden övervägande för det slumpmässiga biblioteket var löst baserat på tanken att den allmänna skarvning faktor U2AF65 binder till en sekvens mellan gren-punkt sekvens och 3 ‘ splice plats. I genomsnitt, avståndet mellan dessa skarvning signaler i metazoer är i intervallet 20 till 40 nukleotider. Ett annat protein kön-dödliga var känd för att binda till en dåligt karaktäriserad reglerande sekvens nära 3 ‘ skarvar plats för sitt mål pre-mRNA, transformator. Således valde vi en slumpmässig region av 31 nukleotider, flankerad av primer bindningsställen med restriktioner enzym platser för att möjliggöra PCR amplifiering och fastsättning av T7 RNA polymeras promotor för in vitro-transkription. Den teoretiska biblioteks storleken eller komplexiteten var 431 eller cirka 1018. Vi använde en liten del av detta bibliotek för att förbereda vår slumpmässiga RNA-pool (~ 1012-1015) för de experiment som beskrivs nedan.
Nukleinsyra-bindande proteiner är viktiga regulatorer av djur-och växt utveckling. Ett nyckelkrav för SELEX-förfarandet är utvecklingen av ett test som kan användas för att separera proteinbundna och obundna RNA-fraktioner. I princip kan denna analys vara en in vitro-bindande analys, såsom filterbindande analys, gel Mobility Shift-analysen, eller ett matrisbindande test19 för rekombinanta proteiner, renade proteiner eller proteinkomplex. Analysen kan också vara en enzymatisk analys där …
The authors have nothing to disclose.
Författaren tackar National Institutes of Health för tidigare finansiering.
Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
Glass Plates | Standard | Standard | |
Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
Proteinase K | NEB | P8107S | |
Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
X-ray films | Standard | Standard |