Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para induzir o TBI severo com o modelo fluido lateral da lesão de percussão (FPI) em ratos adultos, machos de Wistar. Também demonstramos o uso de um sistema de telemetria sem fio para coletar gravações contínuas de vídeo-EEG e monitorar as descargas epileptiformes consistentes com a epileptogênese pós-traumática.
Abstract
O modelo de lesão de percussão de fluido lateral (FPI) está bem estabelecido e tem sido utilizado para estudar TBI e epilepsia pós-traumática (tep). No entanto, tem sido relatada uma variabilidade considerável para os parâmetros específicos utilizados em diferentes estudos que empregam esse modelo, dificultando a harmonização e a interpretação dos resultados entre os laboratórios. Por exemplo, a variabilidade tem sido relatada quanto ao tamanho e localização da craniectomia, como o cubo de bloqueio de Luer é colocado em relação à craniectomia, a pressão atmosférica aplicada à dura e a duração do pulso de pressão. Cada um desses parâmetros pode impactar a severidade da lesão, que se correlaciona diretamente com a incidência de tep. Isso tem se manifestado como uma ampla gama de taxas de mortalidade, endireitando os tempos de reflexo e a incidência de convulsões convulsivas relatadas. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para o método que temos usado para ajudar a facilitar a harmonização entre os estudos. Utilizamos o FPI em combinação com um sistema de telemetria EEG sem fio para monitorar continuamente as alterações eletrográficas e detectar a atividade convulsiva. FPI é induzido criando uma craniectomia de 5 milímetros sobre o hemisfério esquerdo, entre o Bregma e o lambda e adjacente ao cume lateral. Um cubo do fechamento de Luer é fixado no crânio sobre a craniectomia. Este Hub é conectado ao dispositivo FPI, e um pulso de pressão de 20 milissegundos é entregado diretamente à dura intacta através da tubulação da pressão conectada ao cubo através de um conector do fechamento da torção. Após a recuperação, os ratos são re-anestesiados para remover o cubo. Cinco 0,5 mm, aço inoxidável EEG eletrodo parafusos são colocados em contato com a dura através do crânio e servem como quatro eletrodos de gravação e um eletrodo de referência. Os fios do elétrodo são recolhidos em um conector do suporte que seja fixado no lugar com cimento de osso. Gravações contínuas de vídeo/EEG são coletadas por até 4 semanas após o TBI.
Introduction
Em um relatório 2015 ao Congress, os centros para o controle de doença relataram que aproximadamente 2,5 milhões povos por o ano sofrem ferimento de cérebro traumático (TBI) nos E.U.1. Estima-se que a TBI cause 20% de Epilepsias sintomáticas e 5% de todas as Epilepsias2,3,4. Além disso, cerca de 20% dos pacientes com TCE desenvolvem epilepsia pós-traumática5. Importante, as apreensões crônicas, periódicas que ocorrem em conseqüência de TBI são frequentemente Pharmacoresistant, aumentando a carga da doença6. Os mecanismos exatos que conduzem à epilepsia borne-traumático (PTE) permanecem obscuros. Entretanto, vários estudos-chave de epidemiologia examinaram a incidência e o risco potencial de desenvolver epilepsia pós-traumática (tep) 2,4,7,8,9 ,10,11. Esses estudos epidemiológicos reforçaram a correlação da severidade da lesão com o risco de epileptogênese.
Métodos atuais que têm sido amplamente utilizados para identificar novas terapias antiepilépticas têm confiado fortemente em modelos que usam quimio-convulsivo ou acenar elétrico para induzir a epilepsia12. Dada a alta incidência de farmacoresistência a fármacos desenvolvidos nesses modelos por pacientes com TCE, podemos supor que as convulsões induzidas por TCE podem ser diferentes das crises de quimioconvulsão ou induzidas por Kindling e podem envolver diferentes vias ou processos de epileptogênese. Portanto, um modelo de TBI pode ser mais adequado para o desenvolvimento de tratamentos que são mais eficazes para prevenir a epileptogênese pós-traumática.
O modelo de lesão por percussão (FPI) de TBI tem sido utilizado há décadas e é um método bem estabelecido para investigar TBI e PTE13,14,15,16,17, 18. no entanto, como revisamos recentemente, há um alto grau de variabilidade nos métodos do FPI relatados nos laboratórios19,20. Essa falta de consistência entre os laboratórios previne a reprodutibilidade dos achados pré-clínicos e torna a interpretação dos resultados um desafio. Consequentemente, foram aplicados maiores juros e esforços no sentido de estabelecer uma maior harmonização para esses tipos de estudos21,22,23,24.
Em um esforço para aumentar ainda mais a consistência e a harmonização entre os laboratórios focados no estudo da epileptogênese pós-traumática, fornecemos aqui uma metodologia detalhada de nossa abordagem. Nós temos relatado previamente uma incidência de 60% de apreensões convulsivas dentro de seis semanas após TBI severo20. Nós usamos agora esta aproximação para monitorar ratos que começam o dia da lesão e os seguimos continuamente 24 horas um o dia por até 4 semanas. Nós escolhemos usar um sistema de telemetria sem fio que ofereça diversas vantagens. Primeiro, os ratos são capazes de mover-se livremente sobre sua gaiola, e assim reduz o stress. Segundo uma redução no ruído do sinal como o rato serve como o chão. Além disso, o nosso sistema atual emprega um acelerômetro que detecta o movimento rápido em todos os três aviões (X, Y e Z) e pode ser útil para identificar eventos convulsivos apreensão. Finalmente, o sistema de telemetria sem fio permite um manejo mais fácil de ratos, como injeções Salinas complementares, pesando e conduzindo escores de severidade neurológica, o que é complicado quando os ratos estão presos a uma corda. No entanto, essa abordagem também tem várias limitações. Primeiro, o custo inicial de um sistema para gravar de até oito ratos simultaneamente pode estar na faixa de $60000. Em segundo lugar, a energia é limitada por uma fonte de bateria. Isto exige a monitoração e a recolocação diárias das baterias. O tempo necessário entre as alterações da bateria pode ser influenciado pela taxa de amostragem. No entanto, para uma taxa de amostragem de 1000 Hz, as baterias são normalmente alteradas uma vez por semana. A fonte de alimentação limitada igualmente restringe o sistema à gravação de somente quatro sinais de EEG. Finalmente, o sinal de abandono é limitado, mas ocasionalmente ocorre. Entretanto, esta aproximação fornece um método consistente e de confiança para monitorar o epileptogênese borne-traumático e pode ajudar na identificação de tratamentos terapêuticos novos.
Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados por e seguiram as diretrizes da Universidade em Buffalo institucional cuidados com animais e Comitê de uso.
1. lesão de percussão fluida
- Use um jaleco ou um vestido cirúrgico, máscara cirúrgica, luvas cirúrgicas e cobertura de cabeça e esterilize todas as ferramentas e materiais que contatem o local cirúrgico.
- Anestesiar um 10-12-week-old, macho, rato Wistar (350-400 g) com isoflurano 3% e 1 L/min de oxigênio em uma câmara de indução de tamanho adequado para ratos. Retire o rato da câmara de indução e mova-o para a área de preparação uma vez que esteja inconsciente. Põr a pomada oftálmica estéril em ambos os olhos.
- Raspar o cabelo na cabeça do rato com Clippers elétrica com uma lâmina #40 de pouco acima dos olhos para a base caudal das orelhas para produzir o suficiente campo cirúrgico. Retire qualquer cabelo solto e cortado do local.
- Limpe o local cirúrgico aplicando 2% de esfrega de clorohexidina ao couro cabeludo raspado seguido de 70% de etanol. Comece no centro e mova-se para fora em círculos concêntricos longe do local da incisão. Repita este processo 3 vezes. Aplique Betadine solução para o site da mesma forma e permitiu secar.
- Coloc o rato anestesiado no frame Stereotaxic e mantenha a anestesia em 2-3% Isoflurane-1 L/oxigênio mínimo através do nosecone. Verificar a perda de reflexo de abstinência do membro posterior e perda de reflexo palpebral para garantir que o rato está em um plano cirúrgico de anestesia.
- Monitore a frequência respiratória, frequência cardíaca, temperatura corporal e saturação de oxigênio durante toda a cirurgia. Mantenha a frequência cardíaca entre 300-400 bpm e o SpO2 acima de 90%.
Nota: um oxímetro de pulso anexado a um pé traseiro pode ser usado para fornecer a leitura constante da frequência cardíaca e do SpO2. Uma frequência cardíaca acima de 400 bpm indica que o rato não está suficientemente anestesiado. Uma almofada de aquecimento autorregulação, acoplada a um termômetro rectal, ajustada em 37 ° c, pode ser posicionada o rato durante todo a cirurgia para manter a temperatura de corpo. Um estereomicroscópio com uma fonte de luz em combinação com uma lâmpada de fibra óptica são úteis para visualizar o procedimento. - Use uma agulha de 23 g para injetar 0,5% de cloridrato de bupivacaína intradérmica no couro cabeludo no local da incisão para analgesia local 10-15 minutos antes de fazer uma incisão.
- Faça uma incisão Midline de 1,5-2,5 cm através da pele e músculo do couro cabeludo usando uma lâmina de bisturi #10. Retrair a pele e o músculo para expor o crânio e fornecer um campo cirúrgico desobstruído. Refletir a fáscia subjacente e tecido adiposo longe do osso com cotonetes de algodão estéril.
Nota: uma unidade de cauterização elétrica é útil para alcançar a hemostasia rápida. - Depilar o cume lateral do osso parietal esquerdo usando uma cutela cirúrgica para produzir uma superfície plana lisa de modo que a base do cubo fêmea-fêmea do fechamento de Luer possa descansar nivelado com o crânio.
- Irrigar a superfície do crânio e tecidos circundantes com 2,0 mg/mL de solução de gentamicina em soro fisiológico estéril. Blot solução em excesso com um cotonetes estéreis.
- Aplique 3% de peróxido de hidrogênio no crânio para secar o osso.
Nota: se o osso não estiver suficientemente seco, o cimento dentário não irá aderir correctamente e formar um selo sólido. - Crie um local de craniectomia de 5 mm de diâmetro através do osso parietal esquerdo.
Nota: um bocado do trephine coloc em uma broca de poder unida ao frame stereotactic pode ser útil iniciar o craniectomy. Use uma broca de mão com um trephine do diâmetro de 5 milímetros para terminar lentamente a craniectomia através do osso restante. Quando perto de terminar a craniectomia, gire o trephine no reverso para impedir a ruptura do Mater subjacente do dura. Haverá um afinamento do crânio em torno do perímetro do disco e a aleta do crânio sentir-se-á frouxa quando pressionado levemente. - Retire a aba óssea com a cutícula cirúrgica e o fórceps liso do tecido.
Nota: pode ocorrer algum sangramento, mas a hemostasia pode ser rapidamente alcançada aplicando-se uma pressão suave com cotonetes estéreis. - Use um estereomicroscópio e iluminação para inspecionar visualmente a dura para quaisquer sinais de ruptura. Uma borda fina do osso permanecerá em torno da circunferência do local da craniectomia. Remova delicadamente esta borda com o fórceps liso do tecido que toma o cuidado para não romper o dura.
- Esfregue o crânio com 70% de etanol para remover qualquer poeira óssea e secar o crânio.
- Aplique uma camada fina da colagem do gel do cianoacrilato em torno da borda inferior do cubo do fechamento de Luer e prenda-a ao crânio sobre a craniectomia sem obstruir a abertura. Tenha cuidado para não trazer a cola em contacto com a dura. Além disso, sele o fechamento de Luer no lugar com uma camada fina adicional de colagem em torno da base exterior do cubo.
- Prepare uma pasta de cimento dentário. Aplique o cimento à superfície do crânio ao redor e sobre a base do cubo do fechamento de Luer para fixá-lo no lugar.
- Encha o cubo do fechamento de Luer com uma solução estéril do líquido espinal Cereberal artificial livre do preservativo (CSF) (pH 7,4) usando uma seringa e uma agulha de modo que um bolus convexo do soro fisiológico possa ser visto acima da parte superior da borda.
Nota: a solução manterá o dura húmido enquanto o cimento dental seca assim como sere como uma indicação da integridade do selo. Se o nível da solução cair em tudo, isso é uma indicação de uma fuga no sistema e o fechamento de Luer deve ser removido e substituído. - Uma vez que o cimento dental é curado completamente, interrompa a anestesia do gás e remova o rato do frame Stereotaxic.
- Coloque o rato numa plataforma junto ao dispositivo FPI.
- O dispositivo FPI tem uma ponta curvada do metal que se estende do transdutor de pressão na extremidade do reservatório fluido. Fixe um comprimento de 12 cm da tubulação da pressão à extremidade da ponta curvada com a extremidade oposta que termina em um conector masculino da torção do fechamento de Luer de 2 cm. Prenda o rato ao dispositivo FPI conectando a extremidade fêmea do cubo no crânio do rato ao conector masculino.
Nota: Certifique-se de que a ligação está firmemente protegida e que todas as bolhas de ar foram removidas do sistema. - Coloque o animal em decúbito esternal e repetidamente verificar o retorno do reflexo de abstinência. Assim que o rato recupera o reflexo da retirada mas é sedado ainda, libere o pêndulo do dispositivo de FPI para causar um único pulso de pressão de 20 ms e para induzir ferimento.
Nota: é importante não induzir a lesão enquanto o animal está profundamente anestesiado, pois isso tende a causar aumento da mortalidade devido ao edema pulmonar induzido por neurogenia. Todos os dispositivos mostram variabilidade. No entanto, no dispositivo utilizado para este experimento, uma colocação de ângulo de 17 ° do martelo produz um pulso de pressão atmosférica 2,2-2,3. Animais não feridos, Sham passam por todos os mesmos procedimentos, com exceção do pulso fluido real para a lesão induziu. - Desconecte imediatamente o rato do dispositivo FPI após ferimento, coloc o no recumbency esternal, e forneça o oxigênio suplementar (1 L/min) através de um cone do nariz até que a respiração espontânea retorne. A apneia é uma consequência esperada da lesão. Se necessário, forneça respirs manuais periódicos através de uma máscara da válvula do saco até que o rato comece a respirar espontâneamente no seus próprios.
Nota: normalmente, a apneia dura menos de 2 min. Um aumento rápido transiente na frequência cardíaca (> 500 BPM) é observado imediatamente após a administração do pulso de pressão devido a um estouro da catecolamina. Isto pode ser monitorado com um oxímetro do pulso Unido ao pé do rato e pode serir como um indicador possível que uma lesão severa ocorreu. - Monitore o rato continuamente e registre o tempo de retorno do reflexo de endireitando (deambulação estável em todos os quatro membros).
- A magnitude do pulso de pressão atmosférica para cada rato deve estar dentro de ± 0, 5 atmosferas umas das outras. Confirme que cada um do pulso da pressão produz um sinal liso no osciloscópio com amplitude e duração consistentes.
Nota: um sinal barulhento pode indicar bolhas de ar no sistema que devem ser removidos antes de entregar o pulso de ferimento. Pulsos de pressão atmosférica que produzem uma lesão grave, neste experimento, são aqueles que tipicamente resultam em tempos de endireitando animal de 30-60 min. Esta gama de tempos de endireitando está associada a uma taxa de mortalidade de aproximadamente 40-50%). - Administrar 10 mL de soro fisiológico pré-aquecido por via subcutânea como um cuidado de suporte.
- Retorne o rato a sua gaiola Home e permita que recupere pelo menos 4 h.
Nota: observou-se aumento da mortalidade quando os ratos são colocados imediatamente de volta anestesia.
2. implantação de eletrodos corticais EEG e gravação de vídeo-EEG
- Em 4 h após ferimento, anestesiar o rato como descrito previamente e coloc o de volta no frame stereotactic para remover o cubo do fechamento de Luer e o cimento dental.
Nota: o cubo e o cimento serão facilmente encaixados com pressão moderada. Ao remover o cubo, verific com cuidado para toda a ruptura ou dano ao dura. Imediatly eutanizar qualquer animal com danos à dura. - Aplique uma pequena gota de cloridrato de bupivacaína a 0,5% no crânio em cada um dos locais onde 5 furos piloto devem ser perfurados (ver Figura 1).
- Perfure furos piloto através do crânio com um bocado de broca à mão de 0,1 milímetros.
- Fixe um parafuso do elétrodo do aço inoxidável em cada furo piloto nos seguintes locais: um parafuso de referência é coloc caudal ao lambda sobre o cerebelo. Os eletrodos de gravação são colocados: 1) sobre o hemisfério ipsilateral e rostral para a craniectomia; 2) sobre o hemisfério ipsilateral e caudal para a craniectomia; 3) sobre o hemisfério contralateral e rostral à craniectomia; 4) sobre o hemisfério contralateral e caudal para a craniectomia.
- Esfregue o crânio com 70% de etanol para remover qualquer poeira óssea.
- Cubra o local da craniectomia com uma fina camada de cera óssea estéril para cobrir a dura exposta.
- Conecte uma disposição do elétrodo aos 5 elétrodos de EEG envolvendo a extremidade expor de um fio cor-codificado do elétrodo firmemente em torno de seu parafuso designado do elétrodo do aço inoxidável.
Nota: as extremidades opostas de cada fio do elétrodo são posicionadas em uma posição específica, designada dentro do conector do suporte. - Prepare uma pasta de cimento ósseo.
- Colete os fios do elétrodo em uma bobina debaixo do suporte e fixe os fios e o suporte no lugar com cimento de osso. Segure o pedestal em posição até que o cimento ósseo tenha curado.
Nota: o osso deve ser particularmente seco e vazio de qualquer sangue residual, a fim de alcançar a adesão adequada e evitar a remoção prematura do transmissor. - Prenda o transmissor sem fio com pilhas frescas ao suporte antes de remover o animal do frame stereotactic.
- Coloc o animal em sua gaiola Home e coloc a gaiola na proximidade ao receptor e em vista de uma câmera de vídeo designada. Iniciar gravação de vídeo/EEG.
3. coleção de gravações de vídeo-EEG
- Antes de coletar sinais de EEG, faça uma varredura da freqüência da sala onde os ratos estarão alojados para que a coleção de EEG identifique todas as freqüências de interferência potenciais para impedir a coleção da gravação de EEG com toda a freqüência que tem o ruído de fundo.
- Defina todos os transmissores para frequências específicas que estão livres de interferência.
- Defina a frequência de amostragem e o intervalo de entrada de cada transmissor programável.
Observação: isso pode ser feito usando uma ferramenta inteligente fornecida pelo fabricante do sistema. Os transmissores podem amostrar a uma taxa máxima de 1000 Hz, e uma faixa de entrada máxima de ± 10 mV. Neste experimento, foram analisadas as gravações de EEG entre 0,5 Hz a 30 Hz. Portanto, a taxa de amostragem foi definida em 250 Hz. Normalmente observamos amplitudes inferiores a 1 mV. Portanto, o intervalo de entrada do conjunto foi de ± 2 mV. - Use o software da coleção de EEG fornecido pelo fabricante para gravar continuamente o vídeo-EEG que começa no dia de ferimento que lig cada transmissor sem fio através de uma freqüência original a um receptor específico.
Nota: cada par do receptor do transmissor é capaz de monitorar 4 canaletas monopolar de EEG, e aceleração nos aviões de X, de Y e de Z. Os dados de EEG podem ser gravados em um servidor de armazenamento. Os dados de vídeo devem ser salvos em um dispositivo NAS vinculado ao servidor de armazenamento. O software de análise de EEG sincroniza o vídeo e a gravação de EEG com base no tempo mantido pelo servidor de armazenamento. - Use o software de coleta de vídeo para gravar vídeo de cada rato com sua própria câmera de resolução de 2 MP (1920 x 1080) configurada para gravar em 30 frames/s.
Nota: cada câmera tem sua própria iluminação infravermelha para a coleção video na noite. - Configure o sistema para salvar automaticamente todas as gravações de vídeo e EEG em um servidor de armazenamento a cada 24 h. Os vídeos produzem arquivos bastante grandes.
4. análise de vídeo/EEG
- Sincronize o vídeo com cada gravação de EEG na resolução de 1/10 s. Faça isso usando o software de análise de vídeo/EEG de fabricantes de sistemas que cria um metarquivo com o carimbo da hora exata de ambos os EEG e o vídeo.
- Tela manualmente através de gravações de EEG para identificar os eventos do índice que definem a atividade da apreensão.
- Usando o software de análise de vídeo/EEG e os eventos de índice EEG, crie um arquivo de configuração que use parâmetros-chave (ou seja, potência em bandas de frequência específicas, a proporção de bandas de frequência para a potência total, limiar de aceleração, etc.) para definir as características dos potenciais eventos de apreensão.
- Execute o software de análise de EEG para identificar as regiões potenciais da gravação de EEG que qualificam com base nos parâmetros selecionados no arquivo de configuração.
Nota: o software da análise de EEG permite a deteção automática da apreensão e destaca regiões do interesse nos sinais de EEG e fornece a análise do espectro de poder de FFT através do sinal. - Confirme potenciais convulsões convulsivas usando gravações de vídeo coletadas durante a aquisição, que são sincronizadas com as respectivas gravações de EEG de cada rato.
Representative Results
Com este modelo, nós induzimos TBI severo em ratos adultos, machos, Wistar. as condições que descrevemos aqui, observamos tipicamente taxas de mortalidade de 40-50%, e endireitando os tempos de reflexo de 30-60 min como descrito anteriormente20. Fomos capazes de coletar gravações de vídeo/EEG 24 h/dia começando no dia da lesão. Um diagrama que mostra a posição de quatro elétrodos monopolar de EEG e de um único elétrodo da referência é mostrado em Figura 1a. As imagens que demonstram a localização e a aparência das lesões de TCE esperadas com as condições aqui descritas são mostradas na Figura 1B-D. as condições descritas aqui, observamos consistentemente desaceleração Delta nos primeiros três dias após o TBI. Ratos menos gravemente feridos exibem desaceleração Delta unilateral e intermitente (figuras 2C-D). Em contraste, a desaceleração delta contínua e bilateral é observada após lesões mais graves (Figura 3C-D). Algum grau de desaceleração do Delta foi observado consistentemente em todos os ratos de TBI, mas não foi detectado em nenhum rato de controle simulado (craniectomia apenas) (figuras 2a-b; 3a-b). O abrandamento extensivo do Delta foi observado consistentemente durante os primeiros três dias após ferimento em a maioria de ratos de TBI. Curiosamente, os ratos tipicamente mostram perda de peso pronunciada durante os primeiros três dias após a lesão. As convulsões não convulsivas são ocasionalmente observadas na primeira semana após a TBI (Figura 4 C-D). As apreensões clínicas, apresentando como aglomerados do ponto associados com a criação e a queda assim como o Clônus do antebraço podem ser observadas após o borne de 1 semana TBI (Figura 5C-D). Finalmente, a Figura 6 apresenta imagens representativas da queda de sinal intermitente ocasional e perda de sinal devido à falha da bateria.
Figura 1 . Localização da craniectomia, colocação do eletrodo e lesão. (A) mostra um diagrama esquemático do crânio de rato com os locais da craniectomia (círculo cinzento no hemisfério esquerdo), quatro eletrodos monopolares (pontos pretos; 1, 2, 3, 4) localizado entre o Bregma e lambda e um eletrodo de referência (ponto preto, R) linha mediana colocada, posterior ao lambda; (B) mostra as varreduras pós-morte RM do T2 de coronal com a posição da lesão identificada por um círculo vermelho; (C) mostra um mapa 2-D do córtex onde a localização e o tamanho da lesão são identificados (região azul). (D) mostra uma seção coronal manchada de Nissl com a lesão encaixotada, a lesão é 100x ampliada na imagem à direita. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Delta unilateral, intermitente que retarda coletado no dia de um TBI moderado. (A) mostra um traço de EEG de 90 s de um rato de controle Sham operado, não ferido no dia da cirurgia. Todos os quatro canais são apresentados. Um traço longo de 10 s (retirado da região encaixotado) foi extraído do 3º canal para melhor Visualizar o padrão de EEG basal. Uma seção do EPOC de 2048 MS deste foi selecionada então para ser analisada no FFT correspondente. (B) análise de fft de 2048 MS selecionou EPOC do animal Sham não ferido operado no dia da cirurgia. (C) mostra um traço do EEG de 90 s, que demonstre o teste padrão de abrandamento do Delta intermitente, unilateral de um animal moderada ferido no dia da lesão. Um traço longo de 10 s (tomado da região encaixotado) foi extraído do 3o canal para visualizar melhor o Delta que retarda o teste padrão de EEG. Uma seção do EPOC de 2048 MS deste foi selecionada então para ser analisada no FFT correspondente. (D) análise de fft de 2048 MS selecionou EPOC do animal moderado de TBI no dia da lesão. 90 s traçados de EEG, de cima para baixo são biopotenciais 1, 2, 3, 4, correspondendo a suas posições em torno do local da craniectomia como visto na Figura 1. As marcas verticais cinzentas definem intervalos de 1 s nos traços de EEG. Todos os traços de EEG são mostrados em uma escala de (± 500 μV). Dentro dos gráficos da análise de FFT, a escala de freqüência analisada total era 0.5-30 hertz. Isto foi dividido em 4 bandas de frequências separadas de Delta (amarelo, 0,5-4 Hz), Theta (roxo, 4-8 Hz), Alpha (vermelho, 8-12 Hz) e beta (verde, 12-30 Hz). O gráfico do% (poder) mostrado dentro da análise de FFT diz que a porcentagem da potência total no EPOC analisado vem de cada faixa de freqüência previamente especificada, permitindo uma caracterização matemática mais adicional dos testes padrões da forma de onda de EEG. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Delta bilateral, contínuo que retarda coletado no dia de um TBI severo. (A) mostra um traço de EEG de 90 s de um rato de controle Sham operado, não ferido no dia da cirurgia. Todos os quatro canais são apresentados. Um traço longo de 10 s (retirado da região encaixotado) foi extraído do 3º canal para melhor Visualizar o padrão de EEG basal. Uma seção do EPOC de 2048 MS deste foi selecionada então para ser analisada no FFT correspondente. (B) análise de fft de 2048 MS selecionou EPOC do animal Sham não ferido operado no dia da cirurgia. (C) mostra um traço do EEG de 90 s, que demonstre o teste padrão de abrandamento contínuo, bilateral do Delta de um animal severamente ferido no dia da lesão. Um traço longo de 10 s (tomado da região encaixotado) foi extraído do 3o canal para visualizar melhor o Delta que retarda o teste padrão de EEG. Uma seção do EPOC de 2048 MS deste foi selecionada então para ser analisada no FFT correspondente. (D) a análise de fft de 2048 MS selecionou EPOC do animal severo de TBI no dia da lesão. 90 s traçados de EEG, de cima para baixo são biopotenciais 1, 2, 3, 4, correspondendo a suas posições em torno do local da craniectomia como visto na Figura 1. As marcas verticais cinzentas definem intervalos de 1 s nos traços de EEG. Todos os traços de EEG são mostrados em uma escala de (± 500 μV). Dentro dos gráficos da análise de FFT, a escala de freqüência analisada total era 0.5-30 hertz. Isto foi dividido em 4 bandas de frequências separadas de Delta (amarelo, 0,5-4 Hz), Theta (roxo, 4-8 Hz), Alpha (vermelho, 8-12 Hz) e beta (verde, 12-30 Hz). O gráfico do% (poder) mostrado dentro da análise de FFT diz que a porcentagem da potência total no EPOC analisado vem de cada faixa de freqüência previamente especificada, permitindo uma caracterização matemática mais adicional dos testes padrões da forma de onda de EEG. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . A apreensão eletrográfica nonconvulsive coletou 3 dias de borne severo TBI. (A) mostra um traço do EEG de 90 s de um rato Sham operado, não ferido do controle 3 dias25 após A cirurgia. Todos os quatro canais são apresentados. Um traço longo de 10 s (retirado da região encaixotado) foi extraído do 3º canal para melhor Visualizar o padrão de EEG basal. Uma seção do EPOC de 2048 MS deste foi selecionada então para ser analisada no FFT correspondente. (B) análise de fft de 2048 MS selecionou EPOC do animal Sham não ferido operado no dia três25 após da cirurgia. (C) mostra um traço de 90 s EEG três 25 dias de ferimento severo do borne. Este edifício show, padrão de spiking rápido presente bilateralmente e em todos os 4 canais de coleta. Um traço longo de 10 s (tomado da região encaixotado) foi extraído do 3o canal para visualizar melhor o teste padrão de spiking EEG. Uma seção do EPOC de 2048 MS deste foi selecionada então para ser analisada no FFT correspondente. (D) a análise de fft de 2048 MS selecionou EPOC do animal severo de TBI no dia da lesão. 90 s traçados de EEG, de cima para baixo são biopotenciais 1, 2, 3, 4, correspondendo a suas posições em torno do local da craniectomia como visto na Figura 1. As marcas verticais cinzentas definem intervalos de 1 s nos traços de EEG. Todos os traços de EEG são mostrados em uma escala de (± 500 μV). Dentro dos gráficos da análise de FFT, a escala de freqüência analisada total era 0.5-30 hertz. Isto foi dividido em 4 bandas de frequências separadas de Delta (amarelo, 0,5-4 Hz), Theta (roxo, 4-8 Hz), Alpha (vermelho, 8-12 Hz) e beta (verde, 12-30 Hz). O gráfico do% (poder) mostrado dentro da análise de FFT diz que a porcentagem da potência total no EPOC analisado vem de cada faixa de freqüência previamente especificada, permitindo uma caracterização matemática mais adicional dos testes padrões da forma de onda de EEG. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Apreensão eletrográfica convulsiva coletada 9 dias após TBI. (A) mostra um traço do EEG de 90 s de um rato Sham operado, não ferido do controle nove (9) dias após A cirurgia. Todos os quatro canais são apresentados. Um traço longo de 10 s (retirado da região encaixotado) foi extraído do 3º canal para melhor Visualizar o padrão de EEG basal. Uma seção do EPOC de 2048 MS deste foi selecionada então para ser analisada no FFT correspondente. (B) a análise de fft de 2048 MS selecionou EPOC do animal Sham não-ferido operado no dia nove (9) após da cirurgia. (C) mostra um traço de 90 s EEG nove (9) dias após ferimento severo. Este edifício show, padrão de spiking rápido presente bilateralmente e em todos os 4 canais de coleta. Um traço longo de 10 s (tomado da região encaixotado) foi extraído do 3o canal para visualizar melhor o teste padrão de spiking EEG. Uma seção do EPOC de 2048 MS deste foi selecionada então para ser analisada no FFT correspondente. (D) a análise de fft de 2048 MS selecionou EPOC do animal severo de TBI nove (9) dias de ferimento do borne. 90 s traçados de EEG, de cima para baixo são biopotenciais 1, 2, 3, 4, correspondendo a suas posições em torno do local da craniectomia como visto na Figura 1. As marcas verticais cinzentas definem intervalos de 1 s nos traços de EEG. Todos os traços de EEG são mostrados em uma escala de (± 500 μV). Dentro dos gráficos da análise de FFT, a escala de freqüência analisada total era 0.5-30 hertz. Isto foi dividido em 4 bandas de frequências separadas de Delta (amarelo, 0,5-4 Hz), Theta (roxo, 4-8 Hz), Alpha (vermelho, 8-12 Hz) e beta (verde, 12-30 Hz). O gráfico do% (poder) mostrado dentro da análise de FFT diz que a porcentagem da potência total no EPOC analisado vem de cada faixa de freqüência previamente especificada, permitindo uma caracterização matemática mais adicional dos testes padrões da forma de onda de EEG. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Sinal de queda para fora. Estes são 3 exemplos separados de que a gota do sinal para fora devido às edições do transmissor ou do receptor aparece como na gravação de EEG. (A) este é um exemplo de abandono intermitente do sinal de EEG em uma gravação. (B) este é um exemplo da gota para fora devido à falha da bateria durante a telemetria sem fio contínua aparece como em um traçado de EEG. (C) dentro da região circundada, pode-se ver que quando a qualidade do sinal (QoS) cai de 100 a 0, o traçado de EEG torna-se achatado e estagnado em 0 μV. As marcas verticais cinzentas definem intervalos de 1 s nos traços de EEG. Todos os traços de EEG são mostrados em uma escala de (± 500 μV). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Foi relatada uma variabilidade considerável entre os laboratórios quanto aos parâmetros e métodos específicos utilizados para o modelo FPI TBI 14,26,27,28. Essas inconsistências resultaram em resultados conflitantes e dificultam a harmonização dos esforços e dos resultados entre os laboratórios. Aqui, apresentamos uma metodologia detalhada descrevendo nossa abordagem de gravação contínua e de longo prazo de vídeo/EEG para monitorar a atividade epileptiforme pós-traumática. Várias etapas são críticas para gerar resultados reprodutíveis com o método descrito.
Primeiro, uma vez que a incidência de epilepsia pós-traumática se correlaciona com a severidade da lesão, aplicam-se condições que resultam na TBI mais grave. Especificamente, use uma craniectomia de 5 mm para garantir que uma área suficientemente grande de dura seja exposta. Além, prenda um dispositivo fêmea-fêmea do fechamento de Luer na superfície do crânio, com a abertura coloc diretamente sobre o craniectomy. Isto difere de outros laboratórios que usaram uma craniectomia menor (3 milímetros) e/ou coloc um cubo modificado da agulha dentro do craniectomy, que reduz eficazmente o tamanho da abertura. Ao colocar o bloqueio Luer fora da craniectomia, a abertura de 5mm é mantida. Estes parâmetros específicos impactam a força total aplicada à dura-máter. A pressão atmosférica aplicada à dura-máter também tem um grande impacto na gravidade da lesão observada. Infelizmente, a pressão atmosférica é altamente variável e parece ser dependente do dispositivo. Alguns laboratórios relataram a aplicação de um pulso de pressão de 8-10 ms18. Em contraste, o método descrito aqui resulta em um pulso de pressão de 20 ms. Isso é consistente com outros laboratórios que parecem gerar lesões mais graves 14,28. É evidente que o pulso de pressão de indução de lesão é um parâmetro que mostra uma variabilidade considerável entre os laboratórios e deve ser definido empiricamente. No entanto, a severidade da lesão pode ser determinada com base em uma combinação de taxas de mortalidade (40-50%), tempos reflexos de endireitando (> 30 min)26. Também é fundamental que apenas os animais com dura-máter intacta sejam incluídos no estudo. Além disso, se a craniectomia é oclusada por qualquer cola ou cimento de tal forma que parte da dura abaixo da craniectomia não está exposta à força total do pulso de pressão do fluido, então o animal deve ser eliminado do estudo. Além disso, o excesso de cola o bloqueio Luer pode aderir à dura e removê-lo com a tampa de cimento, mesmo após uma lesão bem sucedida. Finalmente, a forma lisa da curva do pulso da pressão no traço do osciloscópio dá a indicação que não há nenhuma bolhas de ar na câmara fluida e indica que o atuador está movendo-se sem impedância.
A anestesia é outro fator crítico que deve ser controlado. A exposição ao isoflurano deve ser mantida nos níveis mais baixos possíveis para manter um plano cirúrgico de anestesia. Ratos expostos a níveis mais elevados de isoflurano ou para longas durações são mais propensos a desenvolver edema pulmonar induzido por neurogenia. A preparação do crânio representa outro aspecto crítico do método. Particularmente, secar o crânio e remover qualquer poeira óssea ajuda a evitar que os ratos removem o transmissor prematuramente.
A colocação dos parafusos e a conexão dos fios de EEG são obviamente críticas a produzir gravações consistentemente reprodutíveis. É importante que os parafusos não são colocados muito profundamente como para induzir uma lesão no cérebro. O retalho ósseo recuperado da craniectomia de ratos Wistar machos adultos (12 semanas de idade) é consistentemente 2 mm de espessura. Use os parafusos do elétrodo de EEG com um eixo de 2,5 milímetros. É útil usar as pontas do fórceps hemostático do mosquito curvado como um espaçador para assegurar-se de que os parafusos se estendam somente à base do osso e não se projetem no cérebro.
A abordagem aqui apresentada tem algumas limitações. As baterias devem ser alteradas regularmente. A frequência das alterações da bateria depende da taxa de amostragem. As baterias são normalmente alteradas uma vez por semana para uma taxa de amostragem de 1000 Hz. Este período de tempo pode ser estendido reduzindo a taxa de amostragem. O sistema é limitado igualmente à gravação de quatro elétrodos monopolar de EEG. No entanto, isso fornece dois canais por hemisfério e pode diferenciar entre eventos focais e generalizados e pode diferenciar entre as alterações anteriores e posteriores. Apesar destas limitações, esta aproximação fornece um método razoável para conduzir a monitoração contínua do vídeo/EEG e a deteção de mudanças epileptiformes que seguem TBI severo.
O método descrito aqui resulta em apreensões eletrográficas e convulsivas dentro de um mês depois de TBI. Conseqüentemente, esta aproximação fornece um frame de tempo razoável em que para estudar a terapêutica potencial para impedir o epileptogênese que segue o TBI severo. Essa abordagem também fornece um método para investigar os mecanismos moleculares associados à TEP e pode levar à identificação de potenciais biomarcadores que podem ser utilizados para identificar pacientes que estão mais em risco de desenvolver tep.
Disclosures
Chelasea R Richardson é um funcionário da emka Scientific, o fornecedor deste sistema de telemetria sem fio descrito.
Acknowledgments
Agradecemos a Paul Dressel pelo seu inestimável apoio em design gráfico e preparação de figuras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
| 3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
| 4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
| 5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
| Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
| Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
| Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
| Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
| Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
| GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
| Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
| IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
| Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
| IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
| Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
| Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
| Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
| Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
| Povidone-iodine solution | Betadine | ||
| Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
| Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
| Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
| Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
| Synology Assistant | Synology Inc. | ||
| Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
| Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
| Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
| Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
| Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
| Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |
References
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