Summary
ここでは、成人、オスのウィスターラットにおける横液パーカッション傷害(FPI)モデルを有する重篤なTBIを誘導するプロトコルを提示する。また、ワイヤレステレメトリシステムを使用して、連続的なビデオEEG記録を収集し、外傷後てんかん形成と一致するてんかんの排出を監視する方法も示しています。
Abstract
横液パーカッション傷害(FPI)モデルは十分に確立され、TBIおよび外傷後てんかん(PTE)の研究に使用されている。しかし、このモデルを採用した異なる研究で使用される特定のパラメータに対してかなりの変動性が報告されており、実験室間での結果の調和と解釈が困難です。例えば、頭蓋切除術の大きさと位置、ルアーロックハブが頭蓋切除術に対してどのように配置されるかについて、硬膜に加える大気圧および圧力パルスの持続時間に関する変動性が報告されている。これらのパラメータのそれぞれは、PTEの発生率と直接相関する傷害の重症度に影響を与える可能性があります。これは、死亡率の広い範囲として明らかにされています, 右反射時間と報告された痙攣発作の発生.ここでは、研究間の調和を促進するために使用した方法の詳細なプロトコルを提供します。FPIを無線EEGテレメトリシステムと組み合わせて、電極の変化を継続的に監視し、発作活動を検出しました。 FPIは、ブレグマとラムダの間、および横尾根に隣接する左半球上に5mmの頭蓋切除術を作成することによって誘導される。ルアーロックハブは頭蓋切除術の頭蓋骨に固定されています。このハブはFPIデバイスに接続され、20ミリ秒の圧力パルスは、ツイストロックコネクタを介してハブに接続された圧力チューブを介して無傷のデュラに直接送達されます。回復後、ラットはハブを取り除くために再麻酔される。5つの0.5 mm、ステンレス鋼のEEGの電極ねじは頭蓋骨を通して硬膜と接触して置かれ、4つの記録電極および1つの参照電極として役立つ。電極ワイヤーは骨セメントとの場所に固定される台座のコネクターに集まる。連続ビデオ/脳波録画は、TBI後最大4週間収集されます。
Introduction
2015年の議会への報告書では、米国疾病対策センターは、米国1で年間約250万人が外傷性脳損傷(TBI)に罹患していると報告している。TBIは、全てんかんの20%、全てんかんの5%を引き起こすと推定されています2,3,4 .さらに、TBI患者の約20%が外傷後てんかん5を発症する。重要なことに、TBIの結果として起こる慢性、再発性発作は、しばしば薬剤耐性であり、疾患6の負担を増加させる。外傷後てんかん(PTE)につながる正確なメカニズムは不明のままである。しかし、いくつかの主要な疫学研究は、外傷後てんかん(PTE)2、4、7、8、9を発症する発生率と潜在的なリスクを調べました、10、11.これらの疫学研究は、それぞれてんかん形成のリスクと傷害重症度の相関を強化した。
新しい抗てんかん療法を同定するために広く使用されている現在の方法は、てんかんを誘発するために化学痙攣薬または電気的キンドリングを使用するモデルに大きく依存している12。TBI患者がこれらのモデルで開発した薬物に対する薬物耐性の高い発生率を考えると、我々は、TBI誘発性発作が化学腫瘍または薬物誘発性発作とは異なり、異なる経路またはプロセスを伴う可能性があると仮定する。てんかん形成。したがって、TBIモデルは、外傷後てんかん形成を防ぐためにより効果的な治療法の開発に適している可能性があります。
TBIの流体パーカッション傷害(FPI)モデルは何十年も使用されており、TBIとPTE 13、14、15、16、17の両方を調査するための確立された方法です。18.しかし、我々は最近レビューしたように、実験室19、20全体で報告されたFPI法の変動度が高い。この実験室間の一貫性の欠如は、前臨床所見の再現性を妨げ、結果の解釈を困難にする。その結果、これらの研究21、22、23、24の研究のためのより大きな調和の確立に向けて、関心と努力が高まっています。
外傷後てんかん形成の研究に焦点を当てた研究室間の一貫性と調和をさらに高めるために、我々のアプローチの詳細な方法論をここで提供する。我々は以前に重度のTBI20の後6週間以内に痙攣発作の60%の発生率を報告した。私たちは今、このアプローチを使用して、傷害の日を始めるラットを監視し、継続的に4週間まで24時間彼らに従います。私たちは、いくつかの利点を与える無線テレメトリシステムを使用することを選択しました。まず、ラットはケージの中を自由に動き回ることができるので、ストレスを軽減します。第二に、ラットが地面として機能するように信号ノイズの低減。さらに、現在のシステムは、3つの平面(X、Y、Z)すべてで急速な動きを検出する加速度計を採用しており、痙攣発作を特定するのに役立ちます。最後に、無線テレメトリシステムは、ラットがテザーに取り付けられているときに複雑である、補足生理生理生理生理的注射、計量および実施神経重症度スコアなどのラットの管理を容易にします。ただし、この方法にはいくつかの制限もあります。まず、最大8匹のラットを同時に記録するシステムの初期コストは、60,000ドルの範囲にすることができます。第二に、電力はバッテリソースによって制限されます。これには、毎日の監視と電池の交換が必要です。バッテリの変更に必要な時間は、サンプリング レートの影響を受ける可能性があります。ただし、1000 Hz のサンプリング レートの場合、通常、バッテリは週に 1 回交換されます。限られた電源はまた4つのEEG信号からの記録にシステムを制限する。最後に、信号のドロップアウトは制限されますが、時折発生します。しかし、このアプローチは、外傷後てんかんを監視するための一貫した信頼性の高い方法を提供し、新しい治療治療の同定に役立てることができます。
Protocol
すべての手順は、バッファロー機関動物ケアと使用委員会で大学のガイドラインによって承認され、従われました.
1. 流体パーカッション傷害
- ラボコートまたは外科ガウン、外科用マスク、外科手袋、ヘッドカバーを着用し、手術部位に接触するすべての工具および材料を殺菌する。
- 10-12週齢の雄、ウィスターラット(350-400g)を3%のイソルランと1L/min酸素をラットに適したサイズの誘導室で麻酔する。誘導室からラットを取り出し、意識不明になったら準備領域に移動します。無菌の眼のオトレットを両目に入れてください。
- 目のすぐ上から耳の高い方まで#40刃で電気切りくずでラットの頭の毛を剃り、十分な外科手術場を作り出します。サイトから緩く切り取られたヘアを削除します。
- 剃った頭皮に2%クロロキキシジンスクラブを適用し、その後70%エタノールを適用して外科部位をきれいにします。中心から始めて、切開部位から離れた同心円で外側に移動します。このプロセスを 3 回繰り返します。同じ方法でサイトにベタジン溶液を適用し、乾燥させました。
- 麻酔ラットを立体フレームに入れ、2~3%のイソフルーラン-1 L/min酸素をノセコーンで維持します。ラットが麻酔の外科面にあることを確認するために、後肢の離脱反射とパルペブラル反射の損失の損失を確認してください。
- 手術中の呼吸数、心拍数、体温、酸素飽和度を監視します。300~400 bpmの心拍数を維持し、SpO2は90%以上を維持します。
注:後ろ足に取り付けられたパルスオキシメータを使用して、心拍数とSpO2の定数読み出しを提供することができます。400 bpmを超える心拍数は、ラットが十分に麻酔されていないことを示す。直腸温度計に結合された自己調節の温暖化パッドは、37 °Cに設定され、体温を維持するために手術を通してラットの下に置くことができる。光ファイバーランプと組み合わせた光源を備えた立体顕微鏡は、手順を視覚化するのに役立ちます。 - 23gの針を使用して、局所鎮痛のための切開部位の頭皮に0.5%のブピバケーヌ塩酸塩を皮内に注入し、切開を行う10~15分前に使用します。
- #10メスブレードを使用して頭皮の皮膚と筋肉を通して1.5〜2.5センチメートルの中線切開を行います。頭蓋骨を露出し、明確な外科場を提供するために皮膚と筋肉を引き込みます。下層の筋膜と脂肪組織を無菌綿棒で骨から離して反射します。
注:電気焼灼装置は速い間待熱を達成するために有用である。 - 外科用キュレットを使用して左頭頂骨の横尾根を剃り、滑らかな平らな表面を作り出し、女性-女性のLuerロックハブのベースが頭蓋骨と一緒に洗い流すことができるようにします。
- 無菌生理生理中の2.0 mg/mLゲンタマイシン溶液で頭蓋骨表面および周囲の組織を灌漑する。無菌綿棒で余分な溶液をブロット。
- 頭蓋骨に3%の過酸化水素を塗布し、骨を乾燥させます。
注:骨が十分に乾燥していない場合、歯科用セメントは適切に付着せず、固体シールを形成します。 - 左頭頂部骨を通して直径5mmの頭蓋切除部位を作成します。
注:定位フレームに取り付けられたパワードリルに入れられたトレフィンビットは、頭蓋切除術を開始するのに役立ちます。5mmの直径トレフィンを持つハンドドリルを使用して、残りの骨を通して頭蓋骨切除術をゆっくりと仕上げます。頭蓋切除術を完了する近くに、基礎となるデュラ母性の破裂を防ぐためにトレフィンを逆に回転させます。ディスクの周囲に頭蓋骨の薄化があり、軽く押すと頭蓋骨のフラップが緩く感じられます。 - 外科キュレットと滑らかなティッシュ鉗子で骨のフラップを取り除く。
注:いくつかの出血が発生する可能性がありますが、無菌綿棒で穏やかな圧力を加えることによって無血症を迅速に達成することができます。 - 立体顕微鏡と照明を使用して、破裂の兆候がないか目視で硬膜を検査します。 骨の細い縁は、頭蓋切除部位の周囲に残ります。 滑らかなティッシュ鉗子でこの縁を穏やかに取除き、硬膜を破裂しないように注意してください。
- 70%のエタノールで頭蓋骨を洗い、骨のほこりを取り除き、頭蓋骨を乾燥させます。
- Luerロックハブの下端の周りにシアノクリレートゲル接着剤の薄い層を適用し、開口部を妨げることなく頭蓋骨の上に頭蓋骨に固定します。接着剤を硬膜に接触させないように注意してください。さらに、ハブの外側のベースの周りに接着剤の追加の薄い層で所定の位置にLuerロックをシールします。
- 歯科用セメントのスラリーを準備します。スカルの表面にセメントを塗布し、ルアーロックハブのベースを越えて固定します。
- シリンジと針を使用して無菌防腐フリー人工脳脊髄液(CSF)溶液(pH 7.4)を使用してLuerロックハブを充填し、生理食塩水の凸状のボーラスがリムの上部に見られるようにします。
注:この溶液は、歯科用セメントが乾燥するにつれて硬膜を湿らせるだけでなく、シールの完全性を示す役割を果たします。ソリューション・レベルがまったく低下した場合、これはシステム内のリークを示すものであり、Luer ロックを取り外して交換する必要があります。 - 歯科用セメントが完全に硬化したら、ガス麻酔を中止し、ラットを立体フレームから取り除きます。
- FPI デバイスの横のプラットフォームにラットを配置します。
- FPI装置に液体の貯蔵所の端の圧力のトランスデューサから伸びる曲げられた金属先端がある。2cmの雄Luerロックツイストコネクタで終端を持つ反対側の端で、曲がった先端の端に圧力チューブの12 cmの長さを固定します。ラットの頭蓋骨のハブのメスの端をオスのコネクタに接続して、ラットをFPIデバイスに固定します。
注: 接続がしっかりと固定され、すべての気泡がシステムから取り外されていることを確認します。 - 動物を厳しい回復に置き、引き出し反射のリターンを繰り返しチェックします。ラットが撤退反射を取り戻すとすぐに、まだ鎮静され、FPIデバイスの振り子を放出して、単一の20ミリ秒の圧力パルスを引き起こし、傷害を誘発する。
注:これは神経原性誘発性肺水腫による死亡率の増加を引き起こす傾向があるため、動物が深く麻酔されている間、傷害を誘発しないことが重要です。すべてのデバイスは変動性を示します。しかし、この実験に使用される装置では、ハンマーの17°角度の配置は2.2 - 2.3大気圧パルスを生成します。無傷の、偽の動物は、傷害を誘発する実際の流体パルスを除いて、同じ手順のすべてを受けます。 - 損傷後すぐにFPI装置からラットを切断し、胸骨の再債務に置き、自発的な呼吸が戻るまで鼻コーンを介して補足酸素(1 L/min)を提供する。無呼吸は怪我の予想される結果である。必要に応じて、ラットが自発的に呼吸し始めるまで、バッグバルブマスクを介して定期的に手動呼吸を提供します。
注:通常、無呼吸は2分未満続く。心拍数の一時的な急激な上昇(>500 bpm)は、カテコールアミンバーストによる圧力パルスの投与直後に観察される。これは、ラットの足に取り付けられたパルスオキシメータで監視することができ、重度の傷害が発生したことを可能な指標として役立つことができます。 - ラットを連続的に監視し、右反射(4つの四肢すべてに安定したアンブレーション)の復帰時刻を記録します。
- 各ラットの大気圧パルスの大きさは、互いに±0.05の大気内にある必要があります。各圧力パルスがオシロスコープ上で一貫した振幅と持続時間を持つ滑らかな信号を生成することを確認します。
注: ノイズの多い信号は、損傷パルスを送受信する前に取り外す必要があるシステム内の気泡を示している可能性があります。重度の損傷を引き起こす大気圧パルスは、この実験において、通常、30〜60分の動物の右回を生じるものである。権利時間のこの範囲は、約40〜50%の死亡率に関連付けられています。 - 支持ケアとして、10mLの予備温めた生理食生を皮下に投与する。
- ラットをホームケージに戻し、少なくとも4時間回復できるようにします。
注:ラットが麻酔下に直ちに戻るとき、死亡率の増加が観察されている。
2. 皮質EEG電極の注入とビデオ脳波記録
- 損傷後4時間で、前述のようにラットを麻酔し、ルアーロックハブと歯科セメントを取り外すために立体フレームに戻します。
注:ハブとセメントは、適度な圧力で簡単にスナップオフします。ハブを取り外す際は、デュラの破裂や損傷がないか注意深く確認してください。即死的に硬膜に損傷を与える任意の動物を安楽死させる。 - 5つのパイロット穴を掘削する各場所の頭蓋骨に0.5%のブピバケイン塩酸塩を小さなドロップを適用します(図1参照)。
- 手持ちの0.1mmドリルビットで頭蓋骨を通してパイロット穴をドリルします。
- 次の場所の各パイロット穴にステンレス鋼の電極ネジを固定します:参照ねじは小脳の上にラムダにコーダに置かれています。記録電極が配置される:1)頭蓋切除術に半球の横およびrostralの上に置かれる;2)頭蓋切除術に半球のイプシラテラルとコーダルの上に;3)頭蓋切除術に対する半球の反対方および骨動脈の上に;4)頭蓋切除術に対する半球の反対方および動行きの上に。
- 骨のほこりを取り除くために70%のエタノールで頭蓋骨を洗い、します。
- 開出した硬膜を覆うために無菌骨ワックスの薄い層で頭蓋切除部位をカバーします。
- 指定されたステンレス鋼の電極ねじの周りに色分けされた電極ワイヤーの露出した端をしっかりと包むことによって5つのEEG電極に電極配列を接続する。
注:各電極ワイヤの反対側の端は、台座コネクタ内の特定の指定された位置に配置されます。 - 骨セメントのスラリーを準備します。
- 電極ワイヤーを台座の下のコイルに集め、ワイヤーと台座を骨セメントで固定します。骨セメントが治るまで台座を所定の位置に持ちなさい。
注:骨は、適切な接着を達成し、送信機の早期除去を防ぐために、任意の残留血液の特に乾燥し、空洞でなければなりません。 - 動物を立体フレームから取り外す前に、新鮮な電池でワイヤレス送信機を台座に取り付けます。
- 動物を自宅のケージに入れ、受話器の近く、指定されたビデオカメラの視点でケージを置きます。ビデオ/脳波記録を開始します。
3. ビデオEEG記録のコレクション
- 脳波信号を収集する前に、ラットがEEGコレクションのために収容される部屋の周波数スイープを行い、バックグラウンドノイズを持つ周波数でEEG記録の収集を防止するために、潜在的な干渉周波数を特定します。
- すべての送信機を、干渉のない特定の周波数に設定します。
- 各プログラマブル送信機のサンプリング周波数と入力範囲を設定します。
注: これは、システムの製造元が提供するスマート ツールを使用して行うことができます。トランスミッタは、最大レート1000 Hz、最大入力範囲±10 mVでサンプリングできます。本実験では、0.5Hz~30Hzの脳波記録を解析した。したがって、サンプルレートは250Hzに設定された。通常、1 mV 未満の振幅を観察します。したがって、設定された入力範囲は±2 mVであった。 - メーカーが提供するEEG収集ソフトウェアを使用して、特定の受信機に固有の周波数を介して各無線送信機をリンクする損傷の日からビデオEEGを継続的に記録します。
注:各送信機受信機ペアは、4つの単極EEGチャンネルを監視し、X、Y、Z平面の加速度を監視することができます。EEG データはストレージ サーバーに書き込むことができます。ビデオ データは、ストレージ サーバーにリンクされた NAS デバイスに保存する必要があります。EEG分析ソフトウェアは、ストレージサーバが維持する時間に基づいてビデオとEEG記録を同期します。 - ビデオコレクションソフトウェアを使用して、30フレーム/秒で記録するように構成された独自の2 MP解像度カメラ(1920 x 1080)を使用して、各ラットのビデオを記録します。
注:各カメラには、夜間のビデオコレクション用の独自の赤外線イルミネーションがあります。 - すべてのビデオおよび EEG 録画を 24 時間ごとにストレージ サーバーに自動的に保存するようにシステムを構成します。ビデオはかなり大きなファイルを生成します。
4. ビデオ/脳波解析
- 1/10 s解像度で各EEG記録とビデオを同期させます。これを行うには、システムメーカーのビデオ/EEG解析ソフトウェアを使用して、EEGとビデオの両方の正確な時間のスタンプを持つメタファイルを作成します。
- 発作活動を定義するインデックスイベントを識別するために、EEG記録を通じて手動でスクリーニングします。
- ビデオ/EEG解析ソフトウェアとインデックスEEGイベントを使用して、主要なパラメータ(すなわち、特定の周波数帯域の電力、総電力に対する周波数帯域の比率、加速度閾値など)を使用して特性を定義する構成ファイルを作成します。潜在的な発作イベントの。
- EEG 解析ソフトウェアを実行して、構成ファイルで選択したパラメータに基づいて、適格な EEG 記録の潜在的な領域を特定します。
注:脳波分析ソフトウェアは、自動発作検出を可能にし、EEG信号に関心のある領域を強調表示し、信号全体のFFTパワースペクトル解析を提供します。 - 取得中に収集されたビデオ録画を使用して、各ラットのそれぞれの脳波記録と同期して、潜在的な痙攣発作を確認します。
Representative Results
このモデルでは、成人、男性、ウィスターラットに重度のTBIを誘導した。ここで説明する条件の下では、通常、40~50%の死亡率、および前述の20分の正しい反射時間を30~60分で観察します。怪我の日から24時間/日のビデオ/脳波記録を収集することができました。4つの単極EEG電極と単一の基準電極の位置を示す図を図1Aに示す。ここに記載されている条件で予想されるTBI病変の位置と外観を示す画像を図1B-Dに示す。ここで説明する条件の下で、我々は一貫してTBI後の最初の3日以内にデルタ減速を観察します。より重傷を負ったラットは、一方的で断続的なデルタ減速を示す(図2C-D)。対照的に、連続的な、両側デルタ減速は、より重度の傷害の後に観察される(図3C-D)。ある程度のデルタ減速はすべてのTBIラットで一貫して観察されたが、いかなるシャム作動(頭蓋切除術のみ)対照ラットにおいても検出されなかった(図2A-B;3A-B)。広範なデルタ減速は、ほとんどのTBIラットの傷害後の最初の3日間に一貫して観察された。興味深いことに、ラットは通常、傷害後の最初の3日間に顕著な体重減少を示す。非けいれん発作は、TBI(図4 C-D)の後の最初の週内に時折観察される。臨床発作は、前腕クローナスと同様に飼育および落下に関連するスパイククラスターとして提示し、TBI後1週間後に観察することができる(図5C-D)。最後に、図 6は、バッテリ障害による時折断続的な信号のドロップアウトと信号の損失の代表的な画像を示しています。
図 1.頭蓋切除術、電極の配置、および病変の位置。(A)は、頭蓋骨切除術(左半球の灰色の円)、ブレグマとラムダの間に位置する4つの単極電極(黒い点;1,2,3,4)と参照電極(黒点、R)の位置を持つラットの頭蓋骨の概略図を示しています。中間線、ラムダの後部に配置されます。(B)は、赤い円で識別された病変の位置を伴う冠状死後T2 MRIスキャンを示す。(C)は、病変の位置と大きさが同定される皮質の2-Dマップ(青色領域)を示す。(D)は、病変をボックス化したニスル染色冠冠冠部を示し、病変は右の画像で100倍拡大される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.中程度のTBIの日に収集された一方的な、断続的なデルタ減速。(A)は、手術当日に手術を受けた無傷のコントロールラットからの90s EEGトレースを示す。4 つのチャネルすべてが表示されます。ベースラインEEGパターンをより良く視覚化するために、第3チャネルから10sの長いトレース(箱入り領域から採取)を抽出した。次いで、この2048ミリ秒のEPOCセクションを選択し、対応するFFTで分析する。(B) 2048ミリ秒のFFT分析は、手術当日に無傷のシャム手術動物からEPOCを選択した。(C)は、90s EEGトレースを示し、傷害の日に中等度の損傷を受けた動物の断続的な、一方的なデルタ減速パターンを示す。10sの長いトレース(箱入り領域から採取)を3番目のチャネルから抽出し、デルタ減速EEGパターンをより良く視覚化した。次いで、この2048ミリ秒のEPOCセクションを選択し、対応するFFTで分析する。(D) 2048ミリ秒のFFT分析は、傷害の日に中等度のTBI動物からEPOCを選択した。90 s EEG トレースは、上から下に、生体電位 1、2、3、4、図1に見られるように頭蓋切除部位周辺の位置に対応する。灰色の垂直マークは、EEG トレース上の 1 秒間隔を定義します。すべてのEEGトレースは(±500 μV)のスケールで示されます。 FFT分析グラフでは、全体的な分析周波数範囲は0.5~30Hzであった。これはさらにデルタ(黄色、0.5-4 Hz)、シータ(パープル、4-8 Hz)、アルファ(赤、8-12 Hz)、およびベータ(緑、12-30 Hz)の4つの別々の周波数帯域に分割されました。 FFT解析に示す%(パワー)グラフは、分析されたEPOCの総電力の割合が、以前に指定された各周波数帯域から来ているかを示し、脳波形パターンのさらに数学的特徴付けを可能にします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.二国間、連続デルタ減速は、重度のTBIの日に収集された。(A)は、手術当日に手術を受けた無傷のコントロールラットからの90s EEGトレースを示す。4 つのチャネルすべてが表示されます。 ベースラインEEGパターンをより良く視覚化するために、第3チャネルから10sの長いトレース(箱入り領域から採取)を抽出した。次いで、この2048ミリ秒のEPOCセクションを選択し、対応するFFTで分析する。(B) 2048ミリ秒のFFT分析は、手術当日に無傷のシャム手術動物からEPOCを選択した。(C)は、90s EEGトレースを示し、傷害の日に重傷を負った動物の連続的な、両側デルタ減速パターンを示す。 10sの長いトレース(箱入り領域から採取)を3番目のチャネルから抽出し、デルタ減速EEGパターンをより良く視覚化した。次いで、この2048ミリ秒のEPOCセクションを選択し、対応するFFTで分析する。(D) 2048ミリ秒のFFT分析は、傷害の日に重度のTBI動物からEPOCを選択した。90 s EEG トレースは、上から下に、生体電位 1、2、3、4、図1に見られるように頭蓋切除部位周辺の位置に対応する。灰色の垂直マークは、EEG トレース上の 1 秒間隔を定義します。すべてのEEGトレースは(±500 μV)のスケールで示されます。 FFT分析グラフでは、全体的な分析周波数範囲は0.5~30Hzであった。 これはさらにデルタ(黄色、0.5-4 Hz)、シータ(パープル、4-8 Hz)、アルファ(赤、8-12 Hz)、およびベータ(緑、12-30 Hz)の4つの別々の周波数帯域に分割されました。FFT解析に示す%(パワー)グラフは、分析されたEPOCの総電力の割合が、以前に指定された各周波数帯域から来ているかを示し、脳波形パターンのさらに数学的特徴付けを可能にします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.非けいれん性電極発作は重篤なTBI後3日目に採取した。(A)は、手術後3日目25日目に手術を受けた、無傷のコントロールラットからの90s EEGトレースを示す。4 つのチャネルすべてが表示されます。ベースラインEEGパターンをより良く視覚化するために、第3チャネルから10sの長いトレース(箱入り領域から採取)を抽出した。次いで、この2048ミリ秒のEPOCセクションを選択し、対応するFFTで分析する。(B) 2048ミリ秒のFFT分析は、手術後3日目の25日目に無傷のシャム手術動物からEPOCを選択した。(C)は、重傷後25日後に90s EEGトレースを示す。 このショーの建物は、両側に存在し、すべての4つの収集チャネルにわたって、高速スパイクパターン。 スパイクEEGパターンをより良く視覚化するために、第3チャネルから10sの長いトレース(箱入り領域から採取)を抽出した。次いで、この2048ミリ秒のEPOCセクションを選択し、対応するFFTで分析する。(D) 2048ミリ秒のFFT分析は、傷害の日に重度のTBI動物からEPOCを選択した。 90 s EEG トレースは、上から下に、生体電位 1、2、3、4、図1に見られるように頭蓋切除部位周辺の位置に対応する。灰色の垂直マークは、EEG トレース上の 1 秒間隔を定義します。すべてのEEGトレースは(±500 μV)のスケールで示されます。 FFT分析グラフでは、全体的な分析周波数範囲は0.5~30Hzであった。 これはさらにデルタ(黄色、0.5-4 Hz)、シータ(パープル、4-8 Hz)、アルファ(赤、8-12 Hz)、およびベータ(緑、12-30 Hz)の4つの別々の周波数帯域に分割されました。 FFT解析に示す%(パワー)グラフは、分析されたEPOCの総電力の割合が、以前に指定された各周波数帯域から来ているかを示し、脳波形パターンのさらに数学的特徴付けを可能にします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.痙攣性電極発作はTBI後9日目に採取した。(A)は、手術後9日目に手術を受けた、無傷のコントロールラットからの90s EEGトレースを示す。4 つのチャネルすべてが表示されます。ベースラインEEGパターンをより良く視覚化するために、第3チャネルから10sの長いトレース(箱入り領域から採取)を抽出した。次いで、この2048ミリ秒のEPOCセクションを選択し、対応するFFTで分析する。(B) 2048ミリ秒のFFT分析は、手術後9日目(9)に無傷のシャム手術動物からEPOCを選択した。(C)は、90s EEGトレース9(9)日後に重傷を負った後を示す。このショーの建物は、両側に存在し、すべての4つの収集チャネルにわたって、高速スパイクパターン。スパイクEEGパターンをより良く視覚化するために、第3チャネルから10sの長いトレース(箱入り領域から採取)を抽出した。 次いで、この2048ミリ秒のEPOCセクションを選択し、対応するFFTで分析する。(D)2048ミリ秒のFFT分析は、重症TBI動物9日(9)日損傷後からEPOCを選択した。90 s EEG トレースは、上から下に、生体電位 1、2、3、4、図1に見られるように頭蓋切除部位周辺の位置に対応する。灰色の垂直マークは、EEG トレース上の 1 秒間隔を定義します。すべてのEEGトレースは(±500 μV)のスケールで示されます。FFT分析グラフでは、全体的な分析周波数範囲は0.5~30Hzであった。これはさらにデルタ(黄色、0.5-4 Hz)、シータ(パープル、4-8 Hz)、アルファ(赤、8-12 Hz)、およびベータ(緑、12-30 Hz)の4つの別々の周波数帯域に分割されました。 FFT解析に示す%(Power)グラフは、解析されたEPOCの総電力の割合が、以前に指定された各周波数帯域から来ているかを示し、脳波形パターンのさらに数学的特徴付けを可能にします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.信号が消えるこれらは、送信機または受信機の問題がEEG記録のように表示される信号の3つの別々の例です。(A) これは、記録上のEEG信号の断続的なドロップアウトの例です。 (B) これは、連続的なワイヤレステレメトリが EEG トレースのように表示される場合にバッテリ障害によるドロップアウトの例です。 (C) 円領域内では、信号品質(QoS)が100から0に低下すると、脳波トレースが平坦化し、0 μVで停滞することが分かります。 灰色の垂直マークは、EEG トレース上の 1 秒間隔を定義します。すべてのEEGトレースは(±500 μV)のスケールで示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
FPITBIモデル14、26、27、28に使用される特定のパラメータと方法に関する実験室間でかなりの変動が報告されている。これらの不整合により、結果が競合し、ラボ間の作業と結果の調和が困難になっています。ここでは、外傷後てんかん活性を監視するためのビデオ/EEGの長期連続記録に対する我々のアプローチを説明する詳細な方法論を提示した。説明した方法で再現可能な結果を生成するには、多くの手順が重要です。
まず、外傷後てんかんの発生率が傷害重症度と相関することを考えると、最も重篤なTBIをもたらす条件を適用する。具体的には、5 mm 頭蓋切除術を使用して、十分に広い面積の硬膜が露出していることを確認します。さらに、頭蓋骨の表面に女性-女性のLuerロック装置を固定し、開口部は頭蓋切除術の上に直接置かれる。これは、より小さい頭蓋切除術(3 mm)を使用した他の実験室とは異なり、または針ハブを頭蓋切除術の中に置き、開口部のサイズを効果的に小さくします。頭蓋切除術の外側にLuerロックを置くことによって、5mmの開口部は維持される。これらの特定のパラメータは、dura に適用される全体的な力に影響します。硬膜に加える大気圧はまた、観察された傷害の重症度に大きな影響を与える。残念ながら、大気圧は非常に変動し、デバイスに依存しているように見えます。いくつかのラボは、8 - 10ミリ秒18の圧力パルスを適用すると報告しています.これに関して、ここで説明する方法は、20ミリ秒の圧力パルスをもたらす。これは、より重度の傷害を生成するように見える他のラボと一致しています14,28.損傷誘発圧力パルスは、ラボ間のかなりの変動性を示すパラメータであり、経験的に定義されなければならないことは明らかです。しかし、傷害の重症度は、死亡率(40〜50%)、右反射時間(>30分)26の組み合わせに基づいて決定され得る。また、無傷のデュラを持つ動物だけが研究に含まれることも重要です。さらに、頭蓋切除術が頭蓋切除術の下の硬膜の一部が流体圧力パルスの完全な力にさらされないように、頭蓋切除術が任意の接着剤またはセメントによって閉塞されている場合、動物は研究から排除されるべきである。 また、Luerロックの下の余分な接着剤は、デュラに付着し、成功した傷害の後でもセメントキャップでそれを取り除くことができます。 最後に、オシロスコープトレース上の圧力パルス曲線の滑らかな形状は、流体チャンバに気泡がないことを示し、プランジャーがインピーダンスなしで動いていることを示します。
麻酔は、制御しなければならないもう一つの重要な要因です。イソファラン暴露は、麻酔の外科面を維持するために可能な限り低いレベルに保たれるべきである。イソルランの高いレベルまたは長期間のラットは、神経原性誘発性肺水腫を発症する可能性が高い。頭蓋骨の調製は、方法の別の重要な側面を表す。特に、頭蓋骨を乾燥させ、骨のほこりを取り除くことは、ラットが送信機を早期に取り外すことを防ぐのに役立ちます。
ネジの配置とEEGワイヤの接続は、一貫して再現可能な記録を生成するために明らかに重要です。ネジは、脳に病変を誘発するように深く配置されていないことが重要です。成人(12週齢)の頭蓋切除術から回復した骨フラップは、一貫して2mmの厚さである。2.5 mm シャフト付きの EEG 電極ネジを使用します。曲がった蚊の止血鉗子の先端をスペーサーとして使用して、ネジが骨の底部まで伸び、脳に突き出ないようにすることが役立ちます。
ここで説明する方法にはいくつかの制限があります。電池は定期的に交換する必要があります。バッテリの変更頻度は、サンプリングレートによって異なります。通常、バッテリは 1000 Hz のサンプリング レートで週に 1 回交換されます。この時間枠は、サンプリングレートを減らすことによって拡張することができます。システムはまた4つの単極EEG電極からの記録に限られる。ただし、これは半球ごとに 2 つのチャネルを提供し、焦点イベントと一般化されたイベントを区別し、前部と後部の変化を区別できます。これらの制限にもかかわらず、このアプローチは、重度のTBIに続くてんかんの変化の連続的なビデオ/脳波モニタリングおよび検出を行うための合理的な方法を提供する。
ここで説明する方法は、TBI後1ヶ月以内に電機および痙攣発作の両方をもたらす。したがって、このアプローチは、重度のTBIに続くてんかん形成を予防するための潜在的な治療法を研究する合理的な時間枠を提供する。このアプローチはまた、PTEに関連する分子メカニズムを調査する方法を提供し、PTEを発症するリスクが最も高い患者を特定するために使用できる潜在的なバイオマーカーの同定につながる可能性があります。
Disclosures
Chelasea R リチャードソンは emka Scientific の従業員です。
Acknowledgments
私たちは、グラフィカルなデザインとフィギュアの準備における彼の貴重なサポートのためにポール・ドレッセルに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
| 3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
| 4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
| 5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
| Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
| Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
| Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
| Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
| Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
| GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
| Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
| IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
| Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
| IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
| Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
| Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
| Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
| Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
| Povidone-iodine solution | Betadine | ||
| Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
| Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
| Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
| Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
| Synology Assistant | Synology Inc. | ||
| Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
| Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
| Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
| Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
| Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
| Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |
References
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