Summary
우리는 생체 고분자의 존재에서 형성되는 탄산 칼슘 결정의 침전 및 특성화를위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
생물 미네랄화는 유기 분자가있는 미네랄의 형성으로, 종종 살아있는 유기체의 기능 적 및 / 또는 구조적 역할과 관련이 있습니다. 그것은 복잡한 과정이므로 간단한, 시험관 내에서, 시스템은 생물 미네랄화 과정에 대한 분리 된 분자의 효과를 이해하는 데 필요합니다. 많은 경우에, 생물 미네랄화는 세포외 매트릭스에 있는 바이오 폴리머에 의해 지시됩니다. 체외에서 방해석의 형태 및 구조에 대한 분리된 생체 고분자의 효과를 평가하기 위해, 우리는 탄산칼슘의 침전을 위한 증기 확산 방법, 특성화를 위한 주사 전자 현미경 및 마이크로 라만, 결정내 바이오폴리머의 양을 측정하기 위한 자외선(UV/Vis) 흡광도. 이 방법에서, 우리는 고체 암모늄 탄산염의 분해에서 유래 기체 암모니아 및 이산화탄소에, 염화 칼슘 용액에 용해 된 고립 된 바이오 폴리머를 노출. 탄산 칼슘의 용해도 생성물이 도달하는 조건에서 탄산 칼슘침전액과 결정이 형성됩니다. 탄산 칼슘은 열역학적 안정성이 다른 다른 다형성을 가지고 있습니다: 비정질 탄산칼슘, 바테라이트, 아라고나이트 및 방해석. 바이오 폴리머가없는 경우, 깨끗한 조건에서 탄산 칼슘은 주로 카보네이트 칼슘의 가장 열역학적으로 안정적인 다형성인 방해석 형태로 존재합니다. 이 방법은 탄산 칼슘 결정의 형태 및 구조에 대한 생체 고분자 첨가제의 영향을 검사합니다. 여기에서, 우리는 칼슘 탄산염 결정의 대형에 세포외 세균성 단백질, TapA의 연구 결과, 프로토콜을 보여줍니다. 특히, 우리는 광학 및 전자 현미경 검사법뿐만 아니라 라만 분광법과 같은 실험 설정 및 특성화 방법에 중점을 둡니다.
Introduction
생물 미네랄화는 유기 분자가있는 미네랄의 형성으로, 종종 살아있는 유기체의 기능 적 및 / 또는 구조적 역할과 관련이 있습니다. 생체 미네랄화는 성게에서 탄산칼슘의 형성과 같이 자성 균1,또는 세포 외의 자석 형성과 같이 세포내일 수 있으며, 콜라겐과 관련된 하이드록시아파티트2 뼈3 치아에 아멜로제닌과 관련된 에나멜의4. 생물 미네랄화는 살아있는 유기체의 많은 매개 변수에 의존하는 복잡한 과정입니다. 따라서, 연구 하에 시스템을 단순화하기 위해서는, 공정에 별도의 구성 요소의 효과를 평가할 필요가있다. 많은 경우에, 생물 미네랄화는 세포 외 생체 고분자의 존재에 의해 유도됩니다. 여기에 제시된 방법의 목적은 다음과 같다: (1) 체외에서 분리된 생체 고분자의 존재 내에서 탄산칼슘 결정을 형성하기 위해, 증기 확산 방법을 사용한다. (2) 탄산 칼슘의 형태와 구조에 대한 생체 고분자의 영향을 연구한다.
유기 첨가제의 존재에서 시험관 내에서 탄산 칼슘을 침전하는 세 가지주요 방법은 5,6을사용한다. 우리가 용액 방법으로 지칭할 첫 번째 방법은 칼슘의 수용성 염 (예를 들어, CaCl2)을 탄산염 (예 : 탄산나트륨)의 수용성 염과 혼합하는 것을 기반으로합니다. 상기 혼합 공정은 여러 가지 방법으로 수행될 수 있다: 다공성 멤브레인7에의해 분리되는 3개의 세포를 가진 반응기 내부. 여기서, 각각의 외부 세포는 수용성 염을 함유하고 중앙 세포는 시험할 첨가제를 함유하는 용액을 함유한다. 칼슘과 탄산염이 외부에서 중간 세포로 확산되어, 칼슘과 탄산염의 농도가 용해도 제품을 초과할 때, Ksp = [Ca 2+][CO3]의 침전을 초래합니다. 2-[. 추가 혼합 방법은 이중 제트 절차8입니다. 이 방법에서, 각각의 가용성 염은 탄산칼슘이 침전되는 첨가제를 함유하는 교반 용액에 별도의 주사기로부터 주입된다. 여기서, 주입 및 따라서 혼합 속도는 혼합이 확산에 의해 제어되는 이전 방법과 대조적으로 잘 제어된다.
CaCO 3을 결정화하는 데 사용되는 두 번째 방법은 기타노 방법 9입니다. 이 방법은 탄산수소/탄산수소 평형(2HCO3- (aq) + Ca2+(aq) 
CaCO3 (들) + CO2(g) + H2(l))를 기초로 한다. 여기서, CO2는 CaCO3를 함유하는 용액내로 고체 형태로 버블링되어, 평형을 왼쪽으로 이동시키고 따라서 탄산칼슘을 용해시한다. 용해되지 않은 탄산칼슘을 여과하고 원하는 첨가제를 중탄산염이 풍부한 용액에 첨가합니다. CO2는 증발할 수 있게 되고, 이에 의해 반응을 오른쪽으로 이동시키고, 첨가제의 존재 속에서 탄산칼슘을 형성한다.
여기서 설명할 탄산칼슘 결정화의 세 번째 방법은 증기 확산 방법10입니다. 이 설정에서, 염화 칼슘용액에 용해된 유기 첨가제는 카보네이트 암모늄 근처의 밀폐된 챔버에 분말 형태로 배치된다. 카보늄 탄산암모늄 분말이 이산화탄소 및 암모니아로 분해되면 칼슘 이온(예: CaCl2)을함유하는 용액으로 확산되고 탄산칼슘이 침전됩니다(그림 1 참조). 탄산 칼슘 결정은 느린 강수 또는 빠른 강수량에 의해 성장할 수 있습니다. 느린 침전을 위해, CaCl2 용액에 첨가제를 함유하는 용액은 카보네이트 암모늄 분말 옆에 있는 건조제에 놓입니다. 프로토콜의 길이로 설명된 빠른 침전에서 첨가제 용액과 탄산암모늄은 모두 다중 웰 플레이트에 더 가깝게 배치됩니다. 느린 침전 방법은 더 적은 핵 센터와 더 큰 결정을 생성하고, 빠른 강수량은 더 많은 핵 센터와 작은 결정을 초래할 것이다.
위에서 설명한 방법은 기술적 복잡성, 제어 수준 및 강수 과정의 속도에 차이가 있습니다. 혼합 방법은 이중 제트 및 3 셀 시스템 모두에 대한 특수 셋업 6이 필요합니다. 혼합 방법에서, 다른 수용성 카운터 이온(예를 들어, Na+Cl-)6의 존재는 불가피한 반면, 기타노 방법에서는 칼슘 및 (비) 탄산염이 용액의 유일한 이온이며 추가적인 이온의 존재를 수반하지 않는다. 카운터 이온(예: Na+Cl-). 또한, 혼합 방법은 상대적으로 큰 양을 필요로하므로 고가의 바이오 폴리머로 작업하기에 적합하지 않습니다. 이중 제트의 장점은 용액 주입속도를 조절할 수 있고 다른 방법에 비해 빠른 공정이라는 점입니다.
키타노 방법과 증기 확산 방법의 장점은 탄산칼슘의 형성이 CaCl2 용액의 CO2 내/아웃확산에 의해 제어되어 더 느린 핵 형성 및 침전 과정을 조사할 수 있다는 것입니다. 11세 , 12.또한, CO2의 확산에 의한 탄산칼슘 형성은 생체 내 석회화과정(13,14,15)과유사할 수 있다. 이 방법에서는 잘 정의되고 분리 된 결정이 형성됩니다16. 마지막으로, 탄산칼슘 형성에 대한 단일 또는 다중 바이오 폴리머의 효과를 테스트할 수 있습니다. 이를 통해 탄산칼슘 형성에 대한 일련의 첨가제 농도의 영향뿐만 아니라 생체 고분자 혼합물에 대한 연구가 모두 통제된 방식으로 수행됩니다. 이 방법은 다양한 농도 및 부피가 첨가제와 함께 사용하기에 적합합니다. 사용되는 최소 부피는 약 50 μL이므로 사용 가능한 생체 고분자의 양이 제한된 경우 이 방법이 유리합니다. 최대 부피는 더 큰 웰 플레이트또는 CaCl 2를 포함하는 플레이트 또는 비커를 삽입할 건조기의 접근성에 따라 달라집니다. 아래에 설명된 방법은 단백질 TapA17로선택된 생체 고분자를 가진 96웰 플레이트에서 작동하도록 최적화되었습니다.
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Protocol
1. 탄산칼슘 결정화
- 제어 준비 및 최적화
- 깨끗한 유리 조각을 준비합니다. 동일한 세척 절차를 사용하여 유리 제품을 청소하십시오.
- 다이아몬드 펜을 사용하여 유리 현미경 슬라이드 조각을 잘라 내어 96 웰 플레이트의 우물에 맞춥습니다.
참고 : 5mm x 5mm 조각은 크게 맞아야합니다. - 유리 조각을 삼중 증류수(TDW)가 있는 비커에 넣고 물이 유리 슬라이드를 덮고 목욕 초음파 처리기에서 10분 동안 초음파 처리합니다.
- 물을 데탕트, 유리 슬라이드를 커버하기 위해 에탄올을 추가하고, 10 분 동안 목욕 초음파 처리에 초음파.
- 슬라이드와 유리 제품을 질소 가스 스트림으로 건조시키고 130W에서 10 분 동안 공기 플라즈마 클리너에 넣습니다.
- 다이아몬드 펜을 사용하여 유리 현미경 슬라이드 조각을 잘라 내어 96 웰 플레이트의 우물에 맞춥습니다.
- 원하는 실험 조건에서 수행된 석회화 실험에 사용되는 CaCl2의 농도를 최적화하여 매끄러운 면이 있는 방해석 결정이 풍부한 샘플을 달성합니다(적어도 적은 수의 바테라이트가 없는 경우) 결정)을 참조하십시오.
- 암모늄 카보네이트 분말96 웰 플레이트의 모서리에 우물을 채우고 알루미늄 호일을 사용하여 플레이트를 밀봉; 파라핀 필름으로 호일을 덮습니다. 질소 가스를 사용하여 잔류 암모늄 탄산염을 청소하십시오.
주의 : 탄산 암모늄은 코와 폐를 자극합니다. 연기 후드 내부에서만 사용하십시오. - 0.5 M CaCl 2의재고 솔루션을 준비합니다. 이 스톡 솔루션은 멀티 웰 플레이트에서 CaCl2 용액의 농도의 그라데이션을 준비하는 데 사용됩니다.
참고: 10mL 스톡 솔루션은 전체 실험에 충분합니다. - 이전에 잘라낸 유리 조각을 다섯 개의 다른 우물에 놓습니다. 중심에 가장 가까운 웰을 사용합니다.
- CaCl2 용액16의100 μL로 유리 조각을 잘 베어링 각을 채웁니다. TDW와 0.5 M CaCl 2(스톡)를 혼합하여 상이한 웰에서 CaCl2의 증가된 농도 구배를 달성합니다. 다른 크기의 웰 플레이트가 사용되는 경우, 별도의 방해석 결정을 달성하기 위해 CaCl 2의 농도를 조정하십시오 (단계 1.1.2.10, 토론 섹션 참조).
참고: 별도의 웰에서 10, 20, 30, 40, 50 mM 농도의 증가하는 CaCl2 그라데이션이 이 프로토콜에 사용됩니다. 농도 범위 또는 테스트 된 농도수를 늘리려면 추가 우물을 사용하십시오. - 바늘로 탄산 암모늄을 포함하는 각 우물의 덮개를 3 배 천공하십시오.
- 뚜껑을 다시 넣고 파라핀 필름으로 테두리를 밀봉하고 20 시간 동안 인큐베이터에서 18 °C로 유지하십시오.
- 배양 후, 연기 후드 내부에 조심스럽게 뚜껑을 열고 루프와 물 / 공기 인터페이스에서 형성 된 결정을 제거합니다.
- 트위저를 사용하여 유리 조각을 이중 증류수(DDW)가 들어있는 비커로 옮니다. 비커에서 샘플을 제거하고 양면 테이프를 사용하여 유리 조각을 페트리 접시 바닥에 고정시다.
- 티슈 와이프로 슬라이드의 테두리를 만지는 과도한 물을 말리십시오. 페트리 접시를 덮고 24 시간 동안 건조기에 놓습니다.
- 입체 경 (3.5 배율) 및 / 또는 직립 광학 현미경 (10x-40x 배율)로 유리 조각에 형성 된 결정을 관찰하십시오. 대조군 해결책이 깨끗한 경우에, 마롬히드질 결정 (가장 가능성이 있는 방해석)는 광학 현미경으로 관찰될 것입니다 (그림2A).
- 마름모꼴 결정 이외에, 대조군구 결정 (가장 가능성이 vaterite, 그림 2B)을 포함하거나 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지가 매끄러운 얼굴이 아닌 거친 마름모꼴 결정을 보여주는 경우 ( 그림 3 A,B) 결정화 프로토콜을 반복하여 세척 단계(1.1.1)가 올바르게 수행되었는지 확인합니다. 또한, 전용 우물 이외의 플레이트에 있는 영역에 탄산 암모늄이 없다는 것을 더 잘 관리하십시오. 그렇지 않으면 다음 단계로 계속합니다.
- 암모늄 카보네이트 분말96 웰 플레이트의 모서리에 우물을 채우고 알루미늄 호일을 사용하여 플레이트를 밀봉; 파라핀 필름으로 호일을 덮습니다. 질소 가스를 사용하여 잔류 암모늄 탄산염을 청소하십시오.
- 깨끗한 유리 조각을 준비합니다. 동일한 세척 절차를 사용하여 유리 제품을 청소하십시오.
- 첨가제의 존재에 결정화
- 첨가제의 결정화에 대한 효과를 연구하기 위해,첨가제를 함유하는 다중 웰 플레이트(다른 웰), 첨가제를 없는 제어 CaCl2 용액, 및 첨가제를 함유한 CaCl2 용액을 설정한다. 실험을 위해 섹션 1.1.2에 있는 CaCl2의 최적 농도를 사용하십시오.
참고: 아래 프로토콜은 이전 연구16에서보고된 것과 같은 최적의 조건을 사용합니다. - 1.1.2.2 단계를 반복합니다.
- 1.1.2.1단계에서 설명한 바와 같이 암모늄 카르보네이트 분말을 플레이트의 모서리에 놓는다.
- 강수량이 발생하는 각 우물에서 섹션 1.1.1에 설명된 대로 잘라서 세척한 유리 조각을 놓습니다.
- 제어 웰을 준비하기 위해, 제어 웰에 TDW의 파이펫 90 μL. 컨트롤을 포함하여 각 웰의 복제를 하나 이상 준비합니다. 사용되는 첨가물이 버퍼 용액에 있는 경우 TDW 물 대신 90 μL의 버퍼를 피펫합니다.
- 첨가제 함유 웰을 준비한다. 첨가제 용액의 90 μL을 물에 첨가하여 1.2.5 단계를 반복합니다. 첨가제는 완충액(TDW 대신)에 있는 경우, 원하는 최종 농도를 충족시키기 위해 버퍼로 첨가제의 농도를 미리 조정한다. 총 부피를 90 μL 유지; 먼저 첨가제를 첨가한 다음 버퍼를 피펫합니다.
참고: 100 mM NaCl에서 단백질 TapA의 최종 농도가 100 mM NaCl, 25 mM Tris pH 8.0 완충액16이 프로토콜에서 사용된다. - 0.5 M CaCl2 스톡 용액의 10 μL을 추가 (단계 1.2.2에서 제조) 대조군 및 첨가제 함유 웰 모두에 50 mM CaCl2의 최종 농도에 도달한다.
- 1.1.2.5-1.1.2.9 단계를 반복합니다.
- 첨가제의 결정화에 대한 효과를 연구하기 위해,첨가제를 함유하는 다중 웰 플레이트(다른 웰), 첨가제를 없는 제어 CaCl2 용액, 및 첨가제를 함유한 CaCl2 용액을 설정한다. 실험을 위해 섹션 1.1.2에 있는 CaCl2의 최적 농도를 사용하십시오.
2. 탄산칼슘 결정의 특성화
- 주사 전자 현미경으로, 광학 현미경에 의해 얻어진 것보다 더 높은 해상도로 첨가제의 존재에서 형성된 탄산 칼슘 결정을 관찰하십시오 (단계 1.1.2.10 참조).
- 양면 카본 테이프로 알루미늄 스텁에 크리스탈이 들어있는 유리 조각을 장착합니다.
- 40-50s에 대한 Au / Pd의 층으로 코트.
- 5 kV 가속 전압에서 이미지를 수집합니다.
참고: 그림 3A는 적절한 대조군 실험에서 형성된 탄산칼슘 결정의 대표적인 SEM 이미지를 보여주고, 그림 4는 단백질 TapA의 존재 상태에서 형성된 탄산칼슘 결정의 대표적인 이미지를 보여줍니다. .
- 마이크로 라만 분광법을 수행하여 형성된 탄산 칼슘 다형성을 결정합니다. 마이크로 라만은 전체 분말이 아닌 단결정에서 라만 스펙트럼을 수집 할 수 있습니다.
- 현미경의 20배 목표를 사용하여 관심 있는 결정을 선택합니다.
- 514 nm 아르곤 레이저를 사용하여 100-3200 cm-1의 범위에서 라만 스펙트럼을 수집합니다.
참고: 그림 5는 방해석(A)과 바테라이트(B)의 대표적인 스펙트럼을 보여줍니다. 아라고국민의 스펙트럼에 대한 참조18을참조하십시오.
-
CaCO3 침전물에서 첨가제의 질량 백분율 정량화
- 사용된 첨가제의 소멸 계수(θ)를 확인/측정합니다. 단백질의 소멸 계수는 온라인 서버19에의해 주어질 수 있다. 소멸 계수를 알 수 없는 경우 서로 다른 농도에서 첨가제의 흡광도를 측정하고 흡광도 대 농도를 플롯하고 곡선의 경사에서 소멸 계수를 계산합니다.
- 결정이 형성된 유리 조각을 계량하는 것이 바람직하게는 마이크로 밸런스를 사용한다.
- 유리에서 1.2 mL의 0.1 M 아세트산 용액으로 결정을 스크랩하고, 소용돌이 및 샘플을 초음파 처리합니다. 샘플을 실온에서 24시간 동안 보관하십시오.
주의: 아세트산은 피부나 눈에 닿을 때 매우 위험합니다. 주의해서 취급하고 규정에 따라 폐기하십시오. - 크리스탈을 긁어 낸 후 유리 슬라이드의 무게를 측정합니다.
- 용액의 UV/vis 흡광도(A) 스펙트럼을 측정합니다. 첨가제가 단백질인 경우, 280 nm에서 흡광도를 측정하고 맥주 램버트 방정식을 사용하여 농도 (C)를계산하십시오.
여기서 l은 큐벳 내부의 광학 경로입니다. - 2.3.5에 있는 농도(C)와 사용된 부피(V = 1.2 mL)를 사용하여 결정에 첨가제의 질량(m)을 계산합니다. 농도가 mg/mL인 경우 C ● V = m방정식을 사용합니다.
- 농도가 mol /L인 경우 C ● V = n을 적용하는 두더지 (n)를 계산하십시오. 그런 다음 분자량(Mw)을 사용하여 첨가제의 질량(m)을 계산합니다(m = n ● Mw).
- 방정식을 사용하여 결정에 첨가제의 중량 비율을 계산합니다:
m은 첨가제의 질량이고 Δms는 유리에서 폐기된 탄산칼슘 결정의 질량입니다. 조각.
m은 첨가제의 질량이고 Δms는 유리에서 폐기된 탄산칼슘 결정의 질량입니다. 조각.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
도 1에 도시된 실험 설정의 개략적 설정. 간략하게, 확산 방법은 96 웰 플레이트에서 탄산 칼슘 결정을 형성하고 탄산 칼슘 결정의 형태와 구조에 바이오 폴리머의 효과를 테스트하기 위해 사용된다. 이러한 실험에서 탄산암모늄은 암모니아및 CO2로분해되어 탄산칼슘 용액으로 확산되어 탄산칼슘 결정의 형성을 초래합니다(그림1 및 그림2).
바이오 폴리머의 효과는 첨가제의 유무에 관계없이 형성된 탄산칼슘 결정의 비교에 의해 평가된다. 첨가제를 첨가하기 전에 최적화된 탄산칼슘 농도를 선택하고 솔루션 및 유리 제품의 청결도를 테스트합니다. 그림 2 A는 뚜렷한 마름모꼴 탄산 칼슘 결정이 형성되는 대조군 실험의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 이러한 결정은 가장 가능성이 방해석입니다(그림 5참조). 솔루션 이나 플라스틱 또는 유리 제품이 제대로 세척되지 않은 경우 구형 결정이 형성됩니다 (그림2B,빨간색 원으로 표시), 마름모꼴 방해석 결정 뿐만 아니라. 구형 결정은 가장 가능성이 높은 바테라이트입니다(그림 5참조). 적절한 조건의 사용에 대한 추가 표시는, 대조군 실험에서 방해석 면의 부드러움이다. 그림3과 같이 SEM을 통해 관찰할 수 있습니다. 그림 3 A는 매끄러운 방해석 면으로 적절한 제어를 보여 주지만 그림 3B는 단계로 구성된 면이 있는 방해석 결정을 보여줍니다. 이곳의 구형 결정은 바테라이트입니다. 결정 형태에 첨가제의 효과가 명확하도록 제어 결정은 분리되고 매끄러운 면이 필요합니다.
탄산 칼슘의 형태에 바이오 폴리머의 효과를 입증하기 위해, 우리는 여기에 단백질 TapA를 사용했습니다. 도 4는 용액 내의 TapA의 존재에 형성된 탄산칼슘의 결정을 나타낸다. 결정은 제어 결정과 구별됩니다. 그들은 여러 방해석 미세 결정으로 구성된 복잡한 구형 탄산 칼슘 어셈블리를 형성합니다 (그림 5의 라만 스펙트럼 참조). 결정의 구조를 특성화하는 한 가지 방법은 라만 분광법입니다. 도 5는 전형적인 방해석(도5A)및 바테라이트(도5B)의 전형적 스펙트럼을 나타내고, 성공(A) 및 실패한(B) 대조군 실험으로부터 가져온 것이다. 일반적인 흡광도피크(20)는 100-400cm-1(격자 모드), 피크는 ~710cm -1(CO32-의대칭 굽힘) 및 ~1090cm-1(CO3의 대칭 스트레칭) 범위입니다. 2-). 바테라이트21의가장 분명한 특징인 ~1080cm-1에서 라만 시프트의 분할을 주목하십시오. 아라고국민의 전체 스펙트럼에 대한 참조22를 참조하십시오. TapA의 존재에서 형성된 결정의 라만 스펙트럼은 방해석의 스펙트럼과 유사하다(도5A). 단일 탄산칼슘 다형성의 단일 스펙트럼에 해당하지 않는 추가 피크가 나타나는 경우, 또는 그 조합의 조합, 그들은 단계 1.1.2.8에서 철저하게 세척되지 않은 염화 칼슘의 과잉에 기인 할 수있다.
프로토콜의 마지막 섹션에서, 우리는 내부 또는 탄산 칼슘 결정에서 유기 함량의 비율 (중량 / 무게)을 측정했습니다. 결정체를 아세트산에 용해시키고 생체 중합체를 용액 내로 방출하였습니다. 바이오 폴리머가 특성 흡광도 스펙트럼을 가지고있는 경우 용액의 농도를 결정할 수 있습니다. 아로마 측기포함 단백질의 경우, 여기서 TapA의 사례 연구에서와 같이, 280 nm에서의 흡광도가 사용된다. 산에서 결정의 용해 후 측정된 TapA의 흡광도 스펙트럼은 대조군 스펙트럼(첨가제 없이 산용 탄산칼슘 결정; 검정)과 함께 도 6(녹색)에 나타내고 있다. 맥주-램버트의 법칙(단계 2.3.5 참조)을 사용하여 29,700M-1 cm-1의소멸 계수를 사용하여, 우리는 TapA의 질량 퍼센트가 1.8% ± 0.2%였다는 것을 발견하였다. 바이오 폴리머가 낮은 pH에서 응집되지 않을 때 산에서 결정 용해 후 용액의 흡광도를 측정하는 것이 가능하다. 첨가제를 함유하는 용액의 흡광도의 null 신호는 그 응집을 나타낸다. 이 경우, 열 중력 분석(TGA)과 같은 다른 분석 방법을 사용하여 결정 내부에 존재하는 첨가제의 질량을 추정할 수 있습니다.
그림 1 : 탄산칼슘 결정의 형성을 위한 빠른 증기 확산 방법에 대한 개략적 설명. 칼슘 함유 수용성 염(예를 들어, 염화칼슘)은 탄산암모늄 분말 근처에 놓입니다. 여기서 우리는 96 웰 플레이트에 두 개의 우물을 보여줍니다. 플레이트는 밀봉되고, 암모니아와 이산화탄소로 분해된 암모늄은 칼슘 함유 로 잘 확산되어 탄산칼슘 결정의 침전을 초래한다(여기에 방해석 결정의 SEM 이미지에 의해 도시됨). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 탄산칼슘 결정의 광학 현미경 이미지. 깨끗한 대조군에는 마름모꼴 결정 (A)이 특징인 주로방해석이 포함되어 있습니다. 대조군 샘플에 구형 결정(예: 적색 원으로 표시된 결정)(B)을 포함하는 경우, 섹션 1.1.1에서 제안된 대로 클리닝 프로토콜을 반복한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 두 가지 제어 실험에서 형성된 탄산칼슘 결정의 전자 현미경 현미경 스캔. (A) 주로 마름모꼴 결정 (방해석)을 포함하는 샘플의 이미지. (B) 가장 아마 vaterite입니다 깨진 방해석 면과 구형 결정 샘플의 현미경. 이 경우 제어 실험을 반복해야 합니다. 이 그림은 아줄레이 외16에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 단백질 TapA의 존재에 형성된 방해석 결정의 SEM 이미지. 축척 막대는 각각50 μm(A) 및 10 μm(B)을 나타냅니다. 이 그림은 아줄레이 외16에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 탄산칼슘의 2개의 다형화의 라만스펙트럼. (A) 방해석. (B) 바테라이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : TapA(녹색)와 완충액(100mMM NaCl, 25mMTris pH 8.0, 블랙)의 UV/vis 흡광도 스펙트럼. 흡광도는 탄산칼슘 결정에서 TapA의 농도를 계산하기 위해 사용되었으며, 산에서의 용해에 따라 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 방법은 유기 첨가제의 존재 에서 탄산 칼슘 결정을 형성하고 생체 외에서 탄산 칼슘 결정의 형태 및 구조에 대한 유기 생체 고분자의 효과를 평가하는 것을 목표로합니다. 상기 방법은 대조군 실험에서 형성된 방해석 결정에 유기 첨가제의 존재에 형성된 결정의 비교에 기초한다. 우리는 탄산 칼슘 결정을 형성하는 확산 방법을 사용하는 방법, 광학 및 전자 현미경을 사용하여 자신의 형태를 특성화하는 방법, 라만 분광법을 사용하여 자신의 구조를 특성화하는 방법, 유기 함량을 결정하는 방법을 보여 주었다 (중량/중량 백분율)
우리는 우리가 세균성 세포 외 단백질의 효력을 평가하기 위하여 이용된 프로토콜을 기술했습니다, TapA, 칼슘 탄산칼슘의 형태 그리고 구조에, 그러나 프로토콜은 생물학적으로 정제되거나 합성되는 그밖 폴리머에 소모될 수 있습니다. 단일 생체 고분자의 효과 이외에, 이 방법은 탄산 칼슘 침전에 미치는 영향에서 상이한 중합체 간의 상호성을 평가하기 위해 바이오 폴리머의 혼합물과 함께 사용될 수 있다. 우리는 실험 적 세트를 96 웰 플레이트로 제한했습니다. 그러나 탄산칼슘 용액이 탄산암모늄 공급원(즉, 용액 및 분말이 밀폐된 용기에 배치됨)으로부터 물리적으로 분리되는 다른 모든 설정이 가능합니다. 사용되는 일반적인 용기는 멀티 웰 플레이트 및 10-50 mM의 전형적인 농도 범위가 96 웰 플레이트10,16,23으로실험 설정에 사용됩니다. 밀봉 된 비커 또는 데시케이드기도 사용할 수 있습니다.
이 방법은 사용하기 쉽고 생체 중합 첨가제의 낮은 농도 및 낮은 부량과 호환됩니다. 멀티 웰 플레이트에서 작업하면 하나의 멀티 웰 플레이트 실험에서 동시에 여러 파라미터를 스크리닝할 수 있습니다. 이 방법은 탄산암모늄 분말의 위치에 대하여 탄산칼슘 웰의 상대적 위치에 민감할 수 있다. 따라서, 항상 멀티 웰 플레이트에서 동일한 위치에서 웰을 사용하고 또한 웰의 위치를 변경하는 것이 결과에 영향을 미치지 않는지 확인하기 위해주의를 기울여야한다. 일반적으로 실험이 이루어지는 우물과 탄산암모늄 분말 사이의 충분한 거리를 사용하여 결과를 재현할 수 있습니다. 또한, 섹션 1.1.2에 기재된 바와 같이 대조군 실험에서 별도의 결정이 형성되도록 CaCl2 용액의 농도를 조정하는 것이 중요하다. 첨가제의 농도는 또한 효과가 관찰되지 않는 최소 농도를 초과하도록 최적화되어야 합니다. 이 방법은 첨가제의 농도에 매우 민감하다는 점에 유의하십시오. 상이한 첨가제 농도는 탄산칼슘 결정(24)의 형태 및구조에 상이한 효과를 유도할 수 있다.
이 방법의 한 가지 주요 제한사항은 암모니아와 CO2가 모두 염화칼슘 시험 용액으로 확산되어 실험 전반에 걸쳐 pH의 제어가 불량하다는 것입니다. 암모니아의 확산의 결과로, 용액의 pH가 증가 (암모니아가 암모늄이 될 때), 평형 방정식 5에 도시 된 바와 같이,6 ((NH4)2CO 3(들) → 2NH 3(g) + CO2(g) + H 2개 O(l), NH3 (aq) + H2O (l) → NH4+(aq) + OH-(aq), Ca 2++2 (aq) + 2OH-(aq) CaCO3 (들) + H2O (l)및 탄산 칼슘의 형성을 선호합니다.
소개에 설명된 추가 방법에 비해 이 방법은 기술적으로 간단합니다. 느린 침전 과정으로 인해 투명 멀티 웰 기술로부터 의 흡광도 또는 산란 기술을 사용하여 실시간으로 결정 성장을 따를 수 있습니다. 또한, 결정 성장의 역학을 따르기 위해, 또한 우리의 연구에서 수행된 바와 같이 20시간 후가 아닌 다른 시점에서 결정 형태와 구조를 조사할 수 있다. 이 방법은 마그네슘, 바륨 및 탄산 카드뮴과 같은 충분히 작은 Ksp를 베어링 탄산염의 다른 염의 침전을 연구하기 위해 확장 될 수있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자들은 리아 아다디 교수, 조나단 에레즈 교수, 야엘 폴리티 박사에게 유익한 토론에 감사드립니다. 이 연구는 이스라엘 과학 재단 (ISF)에 의해 지원되었습니다, 부여 1150/14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Gadot | 64-19-7 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 506-87-6 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 10035-04-8 | |
| Ethanol Absolute | Gadot | 64-17-5 | |
| Micro-Raman | Renishaw | inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 90i model | |
| Nis elements Br software | Nikon | For microscope imaging | |
| Scanning Electron Microscope | ThermoFisher Scientific | FEI Sirion microscope | |
| Spectrophotometer | JASCO | V-670 model | |
| Sputter coater | Polaron | SC7640 model |
References
- Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190 (4212), 377-379 (1975).
- Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase. Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).
- Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. Journal of Structural Biology. 183 (2), 258-269 (2013).
- Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. Biomineralization: from nature to application. 12, John Wiley & Sons. (2008).
- Nielsen, M. H., Lee, J. R. I. Methods in Enzymology. De Yoreo, J. J. 532, Academic Press. 209-224 (2013).
- Page, M. G., Cölfen, H. Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly. Crystal Growth & Design. 6 (8), 1915-1920 (2006).
- Wang, H., Huang, W., Han, Y. Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate. Particuology. 11 (3), 301-308 (2013).
- Sedlák, M., Antonietti, M., Cölfen, H. Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals. Macromolecular Chemistry and Physics. 199 (2), 247-254 (1998).
- Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. Pure aragonite synthesis. Journal of Geophysical Research. 67 (12), 4873-4874 (1962).
- Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization. CrystEngComm. 9 (12), 1171-1177 (2007).
- Gehrke, N., Cölfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment. Crystal Growth & Design. 5 (4), 1317-1319 (2005).
- Rudloff, J., et al. Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3. Macromolecular Chemistry and Physics. 203 (4), 627-635 (2002).
- Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon. Nature. 246, 527 (1973).
- Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. Geochemical Perspectives on Coral Mineralization. Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54 (1), 151-187 (2003).
- Erez, J. Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons. Nature. 273, 199 (1978).
- Azulay, D. N., et al. Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals. Crystal Growth & Design. 18 (9), 5582-5591 (2018).
- Abbasi, R., et al. The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein. ChemBioChem. , (2018).
- Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118 (3), 753-757 (1997).
- Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer. 571-607 (2005).
- Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure. Journal of Raman Spectroscopy. 37 (9), 892-899 (2006).
- Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications. Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).
- Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 478-491 (2002).
- Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension. Polymer Journal. 42, 583 (2010).
- Magnabosco, G., et al. Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies. CrystEngComm. 20 (30), 4221-4224 (2018).
