Summary

Opførelse af CRISPR Plasmids og påvisning af Knockout Effektivitet i pattedyrceller gennem en Dobbelt Luciferase Reporter System

Published: December 05, 2020
doi:

Summary

Her præsenterer vi en protokol, der beskriver en strømlinet metode til effektiv generering af plasmider, der udtrykker både CRISPR-enzymet og tilhørende enkelt guide RNA (sgRNAs). Co-transfektion af pattedyrceller med denne sgRNA/ CRISPR vektor og en dobbelt luciferase reporter vektor, der undersøger dobbelt-streng pause reparation giver mulighed for evaluering af knockout effektivitet.

Abstract

Selvom det er meget effektivt, kræver en ændring af et genomisk sted ved CRISPR-enzymet, at der på forhånd er skabt et sgRNA, der er unikt for målstederne. Dette arbejde beskriver de vigtigste trin, der fører til konstruktion af effektive sgRNA-vektorer ved hjælp af en strategi, der gør det muligt for en effektiv detektion af de positive kolonier ved PCR forud for DNA sekventering. Da effektiv genomredigering ved hjælp af CRISPR-systemet kræver et yderst effektivt sgRNA, er det nødvendigt med et forvalg af kandidatsgRNA-mål for at spare tid og kræfter. En dobbelt luciferase reporter system er blevet udviklet til at evaluere knockout effektivitet ved at undersøge dobbelt-strand pause reparation via enkelt streng glødning. Her bruger vi dette reportersystem til at opfange det foretrukne xCas9/sgRNA-mål fra kandidatsgRNA-vektorer til specifik genredigering. Den protokol, der er skitseret, vil give en foretrukken sgRNA/CRISPR enzymvektor om 10 dage (begyndende med passende designede oligonukleotider).

Introduction

CRISPR sgRNA’erne omfatter en 20-nukleotidsekvens (protospaceren), som supplerer den genomiske målsekvens1,2. Selv om crispr/cas-systemet er meget effektivt, kræver det, at der oprettes en vektor, der bæreret effektivt sgRNA, der er unikt for målsted(-2). Dette papir beskriver de vigtigste trin i generationen af denne sgRNA vektor.

For vellykket genomredigering ved hjælp af CRISPR/Cas-systemet er brugen af højeffektive sgRNA’er en afgørendeforudsætning 3,4,5. Da konstruerede nukleaser, der anvendes i genomredigering, manifesterer forskellige effektivitetsgevinster ved forskellige målrettede loci1, er det nødvendigt med en forhåndsudvælgelse af kandidatsgRNA-mål for at spare tid ogindsats 6,7,8,9. En dobbelt luciferase reporter system er blevet udviklet til at evaluere knockout effektivitet ved at undersøge dobbelt-streng pause reparation via enkelt streng glødning3,10. Her bruger vi dette reportersystem til at vælge et foretrukket CRISPR sgRNA-mål fra forskellige kandidatsgRNA-vektorer designet til specifik genredigering. Protokollen, der er anført her, er blevet implementeret i vores gruppe og samarbejdende laboratorier i de sidste par år for at generere og evaluere CRISPR sgRNAs.

Følgende protokol opsummerer, hvordan man designer egnet sgRNA via netværkssoftware. Når de egnede sgRNAs er valgt, beskriver vi de forskellige trin for at opnå de nødvendige oligonukleotider samt tilgangen til indsættelse af de parrede oligonukleotider i pX330-xCas9-ekspressionsvektoren. Vi præsenterer også en metode til at samle sgRNA-udtryk og dobbelt luciferase reporter vektorer baseret på ligation af disse sekvenser i en præedigested udtryk vektor (trin 2-10, Figur 1A). Endelig beskriver vi, hvordan man analyserer DNA-skæreeffektiviteten for hver af sgRNAs (trin 11-12).

Protocol

1. sgRNA oligonucleotid design Design sgRNAs ved hjælp af online værktøjer såsom Cas-Designer online værktøj (http://www.rgenome.net/cas-designer/). PAM-sekvensen er vigtig baseret på, at Cas9 anvendes. For xCas9 er de relevante PAM-sekvenser NG, og det tidligere henviste Cas-Designer onlineværktøj kan generere xCas9 relevante sgRNAs. Brug sgRNA-designværktøjer, der omfatter algoritmer til on- og off-target forudsigelse (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)<s…

Representative Results

De metoder, der er skitseret i denne protokol er til opførelse af sgRNA og xCas9 udtryksvektorer og derefter til optimering screening af sgRNA oligos med relativt højere gen målretning effektivitet. Her viser vi et repræsentativt eksempel på 3 sgRNA-mål til får 2. kr. SgRNA og xCas9 udtrykke vektorer kan bygges ved at predigesting vektoren rygrad (Figur 2) efterfulgt af ligating det i en række korte dobbelt-streng DNA fragmenter gennem glødende oligo par. De positive koloni…

Discussion

De sgRNA vektor kloning procedurer, vi har beskrevet her letter effektiv produktion af sgRNAs, med de fleste af de omkostninger, der stammer fra oligonucleotid bestilling og vektor sekventering. Mens den skitserede metode er designet til at give brugerne mulighed for at generere sgRNA’er til brug med CRISPR/Cas9, kan protokollen nemt tilpasses til brug med Cas9 orthologues eller andre RNA-styrede endonucleaser såsom Cpf1, der indfører mindre ændringer af vektorens rygrad og oligonukleotid overhængende sekvenser.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette projekt blev finansieret af First Class Grassland Science Discipline Program of Shandong Province (Kina), National Natural Science Foundation of China (31301936, 31572383), Den Særlige Fond for Agrovidenskabelig Forskning i offentlighedens interesse (201403071), National risikovurdering stort specialprojekt for kvalitet og sikkerhed i forbindelse med mejeriprodukter (GJFP201800804) og projekter baseret på Qingdao People’s Livelihood Science and Technology (19-6-1-68-nsh 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).

Materials

A new generation of full touch screen gradient PCR instrument LongGene A200 Target gene amplification
AscI restriction enzymes New England Biolabs R0558V Cutting target vectors
BbsI restriction enzyme New England Biolabs R0539S Cutting target vectors
Clean workbench AIRTECH SW-CJ-2FD/VS-1300L-U A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment
DH5α Competent Cells TaKaRa K613 Plasmid vector transformation
Dual-Luciferas Reporter Assay System Promega E1910 Dual-luciferas reporter assay
Electric thermostatic water bath Sanfa Scientific Instruments DK-S24 Heating reagent by constant temperature in water bath
Electrophoresis Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. DYY-6C Control voltage, current, etc.
Eppendorf Reference 2 Eppendorf China Ltd. Reference 2 Accurately draw and transfer traces of liquid
Gel imaging analyzer Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. WD-9413B For the analysis of electrophoresis gel images
GloMax 20/20 Luminometer Promega E5311 Detect dual luciferase activity
High speed refrigerated centrifuge BMH sigma 3K15 Nucleic acid extraction and purification
Intelligent biochemical incubator Sanfa Scientific Instruments SHP-160 Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment
LB Broth Agar Sangon Biotech A507003-0250 For the cultivation of E.coli
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit Thermo Fisher L3000015 DNA Transfection
SalI restriction enzymes New England Biolabs R3138V Cutting target vectors
SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit Sangon Biotech B518131-0050 Recycling DNA fragments
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit Sangon Biotech B518191-0100 Extraction of plasmid DNA
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202V Link DNA fragment
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 TaKaRa 9761 DNA purification
Vertical pressure steam sterilizer JIBIMED LS-50LD High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment
Water bath thermostat Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. SHZ-82 Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.

References

  1. Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).
  2. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  3. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
  4. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  5. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  6. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
  7. Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).
  8. Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
  9. Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
  10. Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair. Cell. 142 (4), 646 (2010).
  11. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  12. Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
  13. Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
  14. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  15. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  16. Ruan, J., et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs. Scientific Reports. 5, 14253 (2015).
  17. Li, K., et al. An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. , (2012).
  18. Li, H., et al. Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels. Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).
  19. Li, H., et al. A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. , (2015).

Play Video

Cite This Article
Li, H., Qin, H., Zhang, N., Zhao, J., Xin, J., Perez-Campo, F. M., Liu, H. Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System. J. Vis. Exp. (166), e59639, doi:10.3791/59639 (2020).

View Video