Her præsenterer vi en protokol, der beskriver en strømlinet metode til effektiv generering af plasmider, der udtrykker både CRISPR-enzymet og tilhørende enkelt guide RNA (sgRNAs). Co-transfektion af pattedyrceller med denne sgRNA/ CRISPR vektor og en dobbelt luciferase reporter vektor, der undersøger dobbelt-streng pause reparation giver mulighed for evaluering af knockout effektivitet.
Selvom det er meget effektivt, kræver en ændring af et genomisk sted ved CRISPR-enzymet, at der på forhånd er skabt et sgRNA, der er unikt for målstederne. Dette arbejde beskriver de vigtigste trin, der fører til konstruktion af effektive sgRNA-vektorer ved hjælp af en strategi, der gør det muligt for en effektiv detektion af de positive kolonier ved PCR forud for DNA sekventering. Da effektiv genomredigering ved hjælp af CRISPR-systemet kræver et yderst effektivt sgRNA, er det nødvendigt med et forvalg af kandidatsgRNA-mål for at spare tid og kræfter. En dobbelt luciferase reporter system er blevet udviklet til at evaluere knockout effektivitet ved at undersøge dobbelt-strand pause reparation via enkelt streng glødning. Her bruger vi dette reportersystem til at opfange det foretrukne xCas9/sgRNA-mål fra kandidatsgRNA-vektorer til specifik genredigering. Den protokol, der er skitseret, vil give en foretrukken sgRNA/CRISPR enzymvektor om 10 dage (begyndende med passende designede oligonukleotider).
CRISPR sgRNA’erne omfatter en 20-nukleotidsekvens (protospaceren), som supplerer den genomiske målsekvens1,2. Selv om crispr/cas-systemet er meget effektivt, kræver det, at der oprettes en vektor, der bæreret effektivt sgRNA, der er unikt for målsted(-2). Dette papir beskriver de vigtigste trin i generationen af denne sgRNA vektor.
For vellykket genomredigering ved hjælp af CRISPR/Cas-systemet er brugen af højeffektive sgRNA’er en afgørendeforudsætning 3,4,5. Da konstruerede nukleaser, der anvendes i genomredigering, manifesterer forskellige effektivitetsgevinster ved forskellige målrettede loci1, er det nødvendigt med en forhåndsudvælgelse af kandidatsgRNA-mål for at spare tid ogindsats 6,7,8,9. En dobbelt luciferase reporter system er blevet udviklet til at evaluere knockout effektivitet ved at undersøge dobbelt-streng pause reparation via enkelt streng glødning3,10. Her bruger vi dette reportersystem til at vælge et foretrukket CRISPR sgRNA-mål fra forskellige kandidatsgRNA-vektorer designet til specifik genredigering. Protokollen, der er anført her, er blevet implementeret i vores gruppe og samarbejdende laboratorier i de sidste par år for at generere og evaluere CRISPR sgRNAs.
Følgende protokol opsummerer, hvordan man designer egnet sgRNA via netværkssoftware. Når de egnede sgRNAs er valgt, beskriver vi de forskellige trin for at opnå de nødvendige oligonukleotider samt tilgangen til indsættelse af de parrede oligonukleotider i pX330-xCas9-ekspressionsvektoren. Vi præsenterer også en metode til at samle sgRNA-udtryk og dobbelt luciferase reporter vektorer baseret på ligation af disse sekvenser i en præedigested udtryk vektor (trin 2-10, Figur 1A). Endelig beskriver vi, hvordan man analyserer DNA-skæreeffektiviteten for hver af sgRNAs (trin 11-12).
De sgRNA vektor kloning procedurer, vi har beskrevet her letter effektiv produktion af sgRNAs, med de fleste af de omkostninger, der stammer fra oligonucleotid bestilling og vektor sekventering. Mens den skitserede metode er designet til at give brugerne mulighed for at generere sgRNA’er til brug med CRISPR/Cas9, kan protokollen nemt tilpasses til brug med Cas9 orthologues eller andre RNA-styrede endonucleaser såsom Cpf1, der indfører mindre ændringer af vektorens rygrad og oligonukleotid overhængende sekvenser.
…The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev finansieret af First Class Grassland Science Discipline Program of Shandong Province (Kina), National Natural Science Foundation of China (31301936, 31572383), Den Særlige Fond for Agrovidenskabelig Forskning i offentlighedens interesse (201403071), National risikovurdering stort specialprojekt for kvalitet og sikkerhed i forbindelse med mejeriprodukter (GJFP201800804) og projekter baseret på Qingdao People’s Livelihood Science and Technology (19-6-1-68-nsh 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |