Summary

Construction de plasmides CRISPR et détection de l’efficacité des knockouts dans les cellules mammifères grâce à un système de double luciferase reporter

Published: December 05, 2020
doi:

Summary

Ici, nous présentons un protocole décrivant une méthode rationalisée pour la génération efficace de plasmides exprimant à la fois l’enzyme CRISPR et l’ARN guide unique associé (SGARN). La co-transfection des cellules mammifères avec ce vecteur sgRNA/CRISPR et un double vecteur de reporter luciferase qui examine la réparation de rupture à double brin permet d’évaluer l’efficacité des KNOCKOUT.

Abstract

Bien que très efficace, la modification d’un site génomique par l’enzyme CRISPR nécessite la génération d’un sgRNA unique au site cible(s) à l’avance. Ces travaux décrivent les étapes clés menant à la construction de vecteurs sgRNA efficaces à l’aide d’une stratégie qui permet la détection efficace des colonies positives par PCR avant le séquençage de l’ADN. Étant donné que l’édition efficace du génome à l’aide du système CRISPR nécessite un SGRNA hautement efficace, une présélection des cibles sgRNA candidats est nécessaire pour gagner du temps et des efforts. Un système double de journaliste de luciferase a été développé pour évaluer l’efficacité de KO en examinant la réparation de rupture de double brin par annealing simple brin. Ici, nous utilisons ce système de reporter pour ramasser la cible préférée xCas9/sgRNA à partir des vecteurs candidats sgRNA pour l’édition génétique spécifique. Le protocole décrit fournira un vecteur d’enzyme sgRNA/CRISPR préféré en 10 jours (en commençant par des oligonucléotides convenablement conçus).

Introduction

Les SGARN CRISPR comprennent une séquence de 20 nucléotides (le protospacer), qui est complémentaire à la séquencecible génomique 1,2. Bien que très efficace, la capacité du système CRISPR/Cas à modifier un site génomique donné nécessite la génération d’un vecteur porteur d’un SGRNA efficace unique au site cible(s)2. Cet article décrit les étapes clés de la génération de ce vecteur sgRNA.

Pour réussir l’édition du génome à l’aide du système CRISPR/Cas, l’utilisation de sgARN hautement efficaces est une condition préalable cruciale3,4,5. Étant donné que les nucléases modifiées utilisées dans l’édition du génome manifestent diverses efficacités à différents loci1ciblés, une présélection des cibles sgRNA candidats est nécessaire afin de gagner du temps et des efforts6,7,8,9. Un système double de journaliste de luciferase a été développé pour évaluer l’efficacité de KO en examinant la réparation de rupture de double brin par l’intermédiaire de l’annealingsimple de brin 3,10. Ici, nous utilisons ce système de reporter pour choisir une cible crispr sgRNA préférée parmi différents vecteurs candidats sgRNA conçus pour l’édition de gènes spécifiques. Le protocole indiqué ici a été mis en œuvre dans notre groupe et les laboratoires collaborateurs au cours des dernières années pour générer et évaluer crispr sgRNAs.

Le protocole suivant résume comment concevoir sgRNA approprié par le biais de logiciels réseau. Une fois que les sgARN appropriés sont sélectionnés, nous décrivons les différentes étapes pour obtenir les oligonucléotides requis ainsi que l’approche pour insérer les oligonucléotides appariés dans le vecteur d’expression pX330-xCas9. Nous présentons également une méthode pour assembler des vecteurs de reporter sgRNA-expressing et double luciferase basés sur la ligature de ces séquences dans un vecteur d’expression prédigesté (étapes 2-10, figure 1A). Enfin, nous décrivons comment analyser l’efficacité de coupe de l’ADN pour chacun des SGARN (étapes 11-12).

Protocol

1. conception d’oligonucléotide de sgRNA Concevoir des sgARN à l’aide d’outils en ligne tels que l’outil en ligne Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). La séquence PAM est importante en fonction du Cas9 utilisé. Pour xCas9, les séquences PAM pertinentes sont NG et l’ancien outil en ligne Cas-Designer référé peut générer xCas9 sgRNAs pertinents. Utilisez des outils de conception sgRNA qui englobent des algorithmes pour la prédiction sur et hors cible (http://www.broadi…

Representative Results

Les méthodes décrites dans ce protocole sont pour la construction de vecteurs d’expression sgRNA et xCas9, puis pour le dépistage d’optimisation des oligos sgRNA avec des efficacités de ciblage génétique relativement plus élevées. Ici, nous affichons un exemple représentatif de 3 cibles sgRNA pour les moutons DKK2 exon 1. SgRNA et xCas9 exprimant des vecteurs peuvent être construits en prédigestant l’épine dorsale vectorielle (Figure 2) suivie par ligating dans une…

Discussion

Les procédures de clonage vectoriel sgRNA que nous avons décrites ici facilitent la production efficace de sgARN, avec la plupart des coûts dérivés de la commande d’oligonucléotide et du séquençage vectoriel. Alors que la méthode décrite est conçue pour permettre aux utilisateurs de générer des sgARN pour une utilisation avec CRISPR/Cas9, le protocole peut facilement être adapté pour une utilisation avec des orthologues Cas9 ou d’autres endonucleases guidés par l’ARN tels que Cpf1, introduisant des …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce projet a été financé par le Programme de discipline scientifique des prairies de première classe de la province du Shandong (Chine), la National Natural Science Foundation of China (31301936, 31572383), le Fonds spécial pour la recherche agro-scientifique dans l’intérêt public (201403071), l’évaluation nationale des risques d’un grand projet spécial de qualité et de sécurité des produits laitiers (GJFP201800804) et les projets de Qingdao People’s Livelihood Science and Technology (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).

Materials

A new generation of full touch screen gradient PCR instrument LongGene A200 Target gene amplification
AscI restriction enzymes New England Biolabs R0558V Cutting target vectors
BbsI restriction enzyme New England Biolabs R0539S Cutting target vectors
Clean workbench AIRTECH SW-CJ-2FD/VS-1300L-U A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment
DH5α Competent Cells TaKaRa K613 Plasmid vector transformation
Dual-Luciferas Reporter Assay System Promega E1910 Dual-luciferas reporter assay
Electric thermostatic water bath Sanfa Scientific Instruments DK-S24 Heating reagent by constant temperature in water bath
Electrophoresis Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. DYY-6C Control voltage, current, etc.
Eppendorf Reference 2 Eppendorf China Ltd. Reference 2 Accurately draw and transfer traces of liquid
Gel imaging analyzer Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. WD-9413B For the analysis of electrophoresis gel images
GloMax 20/20 Luminometer Promega E5311 Detect dual luciferase activity
High speed refrigerated centrifuge BMH sigma 3K15 Nucleic acid extraction and purification
Intelligent biochemical incubator Sanfa Scientific Instruments SHP-160 Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment
LB Broth Agar Sangon Biotech A507003-0250 For the cultivation of E.coli
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit Thermo Fisher L3000015 DNA Transfection
SalI restriction enzymes New England Biolabs R3138V Cutting target vectors
SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit Sangon Biotech B518131-0050 Recycling DNA fragments
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit Sangon Biotech B518191-0100 Extraction of plasmid DNA
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202V Link DNA fragment
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 TaKaRa 9761 DNA purification
Vertical pressure steam sterilizer JIBIMED LS-50LD High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment
Water bath thermostat Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. SHZ-82 Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.

References

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Cite This Article
Li, H., Qin, H., Zhang, N., Zhao, J., Xin, J., Perez-Campo, F. M., Liu, H. Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System. J. Vis. Exp. (166), e59639, doi:10.3791/59639 (2020).

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