Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Progettare esperimenti di crescita cellulare automatizzati, ad alta produttività e continui utilizzando eVOLVER

Published: May 19, 2019 doi: 10.3791/59652
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 4, 1,2,5
1Biological Design Center, Boston University, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University, 3Program in Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Boston University, 4Department of Bioengineering, Rice University, 5Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University

Summary

Il Framework eVOLVER consente una coltura microbica continua ad alta produttività con alta risoluzione e controllo dinamico sui parametri sperimentali. Questo protocollo illustra come applicare il sistema per condurre un esperimento di fitness complesso, guidando gli utenti a programmare il controllo automatizzato su molte culture individuali, misurando, raccogliendo e interagendo con i dati sperimentali in tempo reale.

Abstract

I metodi di coltura continua consentono di crescere le cellule in condizioni ambientali controllate quantitativamente e sono quindi ampiamente utili per misurare i fenotipi di fitness e migliorare la nostra comprensione di come i genotipi sono plasmati dalla selezione. Ampi sforzi recenti per sviluppare e applicare i dispositivi di coltura continua di nicchia hanno rivelato i benefici di condurre nuove forme di controllo della coltura cellulare. Ciò include la definizione di pressioni di selezione personalizzate e l'aumento della produttività per gli studi che vanno dall'evoluzione sperimentale a lungo termine a selezioni di librerie a livello di genoma e caratterizzazione del circuito genico sintetico. La piattaforma eVOLVER è stata recentemente sviluppata per soddisfare questa crescente domanda: una piattaforma di cultura continua con un elevato grado di scalabilità, flessibilità e automazione. eVOLVER fornisce una singola piattaforma standardizzata che può essere (ri) configurata e ridimensionata con il minimo sforzo per eseguire molti tipi diversi di esperimenti di selezione della crescita a throughput elevato o multidimensionale. Qui, viene presentato un protocollo per fornire agli utenti del Framework eVOLVER una descrizione per la configurazione del sistema per condurre un esperimento di crescita continua su larga scala. In particolare, il protocollo guida gli utenti su come programmare il sistema per multiplex due pressioni di selezione — temperatura e osmolarità — attraverso molti flaconcini eVOLVER al fine di quantificare i paesaggi di fitness di Saccharomyces cerevisiae mutanti a fine proposito. Mostriamo come il dispositivo può essere configurato sia a livello di programmazione, attraverso il suo software open-source basato sul Web, e fisicamente, organizzando layout fluidico e hardware. Il processo di configurazione fisica del dispositivo, la programmazione della routine di cultura, il monitoraggio e l'interazione con l'esperimento in tempo reale su Internet, i flaconcini di campionamento per l'analisi offline successiva e l'analisi dei dati post-esperimento sono dettagliati. Questo dovrebbe fungere da punto di partenza per i ricercatori in diverse discipline per applicare eVOLVER nella progettazione dei propri esperimenti di crescita cellulare complessi e ad alto rendimento per studiare e manipolare i sistemi biologici.

Introduction

Le tecniche di coltura cellulare continue, sviluppate per la prima volta quasi 70 anni fa1,2, stanno godendo di un recente Revival3,4. Ciò è dovuto a una confluenza di fattori. In primo luogo, lo sviluppo di tecniche ad alto rendimento-omics, che hanno permesso di leggere e generare un gran numero di genotipi5,6, ha creato una domanda concomitante di tecniche sperimentali che facilitano crescita cellulare ben controllata e fenotipizzazione. A tal fine, la cultura continua rappresenta un potente approccio sperimentale per capitalizzare i progressi genomici emergenti. Facilitando le selezioni di crescita/esperimenti sulle popolazioni cellulari in condizioni ambientali controllate con precisione (e dinamiche), la coltura continua fornisce un mezzo per mappare rigorosamente i genotipi ai fenotipi7,8, Caratterizzare quantitativamente ceppi e organismi ingegnerizzati9, e tenere traccia dei cambiamenti genetici adattativi negli studi di evoluzione di laboratorio10,11,12.

In secondo luogo, la recente emersione di tecniche di prototipazione accessibili, come la produzione additiva e gli elementi hardware e software open source, ha consentito a un insieme più ampio di utenti di progettare e costruire le proprie forme economiche di sistemi di coltura continua direttamente in laboratorio. Tutto ciò ha portato a un'entusiasmante gamma di dispositivi fai da te (DIY) che eseguono funzionalità di coltura continua, come Chemostat13, turbidostat14o morbidostat15. Sfortunatamente, pur avendo successo nell'affrontare problemi specifici (di nicchia) per i quali sono stati progettati, queste soluzioni ad hoc generalmente non hanno la capacità di scalare in termini di throughput e/o complessità di progettazione sperimentale.

Il sistema eVOLVER è stato progettato con l'obiettivo di creare un'unica piattaforma in grado di soddisfare le crescenti esigenze sperimentali della cultura continua e abbinare la velocità e la scala delle tecniche genomiche emergenti16 (Figura 1a). il design di eVOLVER implementa i principi comuni che sottendono le tecnologie altamente scalabili di altre discipline17, tra cui impronte standardizzate, componenti modulari e princìpi di progettazione open source. Pertanto, le soluzioni per le nuove applicazioni di nicchia possono essere progettate senza grandi modifiche al sistema. Composto da wetware, hardware, elettronica e software web-based altamente modulari e open-source, eVOLVER è il primo sistema di coltura continua automatizzato che può essere economicamente vantaggioso e facilmente riconfigurabile per eseguire virtualmente qualsiasi tipo di esperimento di crescita ad alto rendimento. Grazie alle Smart Sleeve modulari e programmabili che possiedono tutti i sensori e gli attuatori necessari per controllare le singole colture, eVOLVER consente di scalare in modo univoco sia il throughput sia il controllo individuale delle condizioni di coltura. Inoltre, come piattaforma basata sul Web, eVOLVER scambia dati e informazioni con computer remoti in tempo reale, permettendo il monitoraggio simultaneo di centinaia di culture individuali e perturbazioni della cultura automatizzata attraverso il controllo arbitrariamente definito Algoritmi.

Nel precedente lavoro16, le solide prestazioni di Evolver sono state dimostrate in esperimenti a lungo termine per centinaia di ore di funzionamento, e la sua capacità di coltivare vari organismi, da e . coli e s. cerevisiae a non addomesticati Microbi. Sono state eseguite una serie di esperimenti di selezione della crescita distinti, in cui sono stati applicati gradienti di selezione multidimensionale definiti a livello di programmazione in una serie di condizioni di coltura individuali e i paesaggi cellulari risultanti sono stati Quantificati. Qui, l'obiettivo è quello di fornire agli utenti eVOLVER una descrizione di come utilizzare il sistema per progettare e questi tipi di esperimenti. Come esempio illustrativo, vengono presentati metodi che quantificano il paesaggio fitness dei mutanti di S. cerevisiae attraverso un gradiente ambientale bidimensionale composto da temperatura e stress osmotico. Il protocollo guida gli utenti attraverso la configurazione del Framework eVOLVER per questo esperimento sia a livello di programmazione, nell'utilizzo del software per impostare la torbidità personalizzata e routine di controllo della temperatura per ognuna delle 16 colture continue parallele, e fisicamente, attraverso il layout della fluidica per instradare adeguatamente i media delle diverse concentrazioni di sale. Questo protocollo dovrebbe fungere da Rubrica generale per la configurazione di eVOLVER per eseguire un'ampia gamma di esperimenti di coltura continua automatizzati per diversi studi e discipline.

Protocol

1. preparazione di media, fiale e inoculo

Nota: Questo protocollo presuppone che gli utenti abbiano già calibrato il sistema eVOLVER e stiano utilizzando la configurazione Smart Sleeve descritta nel precedente lavoro16. Le Smart Sleeve sono facilmente ridisegnate o modificate, ma i dettagli di configurazione dei parametri di volume e controllo possono differire per configurazioni alternative.

  1. Il giorno prima dell'esperimento, preparare 2 mL di colture liquide overnight di S. cerevisiae BY4741 ceppi di riferimento ceppo e variante nei media YPD (Lievito peptone destrosio) a 30 ° c in un incubatore agitazione impostato ad almeno 300 rpm
  2. Trasferire i supporti sterili YPD in bottiglie pulite e autoclavate dotate di tubi. In alternativa, i supporti possono essere autoclavati direttamente in bottiglie pre-montate con tubi.
    Nota: Le bottiglie sono in forma con il tubo perforando un foro nel tappo e il tubo di corsa attraverso di esso con connettori per fissarlo in posizione. Vedere la tabella dei materiali.
  3. Aggiungere la barra di agitazione a ogni flaconcino e avvitare un coperchio del flaconcino dotato di cannucce di afflusso e di efflusso. Accertarsi che tutti i componenti siano puliti mediante ispezione visiva.
  4. Posizionare i flaconcini in un rack autoclavabili, coprire con lamina e autoclave su un ciclo di gravità o di vuoto con una fase di sterilizzazione di 20 minuti.

2. impostazione di un esperimento

  1. In tre grandi bicchieri, preparare 500 mL di candeggina al 10%, 200 mL di candeggina al 10% e 300 mL di etanolo al 70%.
  2. Utilizzando gli interruttori sul dispositivo eVOLVER, accendere l'alimentatore da 5 V sull'eVOLVER, attendere 5 s, quindi accendere l'alimentatore da 12 V.
  3. Se si eseguono più flaconcini dalla stessa bottiglia di supporto, collegare più linee di input multimediali con separatori di tubi. I separatori di tubi personalizzati possono essere costruiti con i componenti Luer.
  4. Immergere le linee di input del supporto nel primo becher di candeggina e le linee di efflusso dei supporti nel secondo bicchiere di candeggina. Posizionare l'estremità a valle delle linee di ingresso del supporto nel secondo bicchiere con le linee di efflusso. Collocare le linee di scarto nel carboy di scarto.
  5. Aggiungere 1-2 L di candeggina in un grande carboy vuoto di scarto, che sterilizzerà i rifiuti generati durante l'esperimento. Consultare un coordinatore della sicurezza per garantire il corretto smaltimento dei rifiuti.
  6. Utilizzando il touchscreen su eVOLVER, passare alla sezione di configurazione ed eseguire tutte le pompe per 20 s per riempire le linee fluide con il 10% di candeggina. Durante l'esecuzione, accertarsi mediante ispezione visiva che tutte le linee sono state riempite e che le pompe funzionano normalmente. Lasciare che la candeggina si sieda nelle linee per almeno 30 minuti per sterilizzare.
  7. Eseguire nuovamente le pompe utilizzando l'app touchscreen fino a quando le linee non sono più sommerse, spingendo l'aria attraverso le linee per ottenere il maggior numero di candeggina il più possibile.
  8. Posizionare le linee di ingresso del supporto nel becher di etanolo e ripetere come sopra, riempiendo le linee con etanolo e vampate di aria.
    Nota: Come etanolo uccide rapidamente, non c'è bisogno di aspettare 30 min per la sterilizzazione.
  9. Collegare le linee di ingresso dei supporti ai flaconi dei supporti con i connettori Luer ed eseguire le pompe fino a quando il supporto non attraversa completamente le linee, svuotando l'eventuale etanolo residuo.
  10. Inserire parzialmente i flaconcini sterilizzati nelle Smart Sleeve eVOLVER e agganciare le linee alle posizioni corrette, in base alla codifica dei colori sulle linee. Iniziare collegando le linee di ingresso alla paglia di afflusso breve, e poi le linee di scarto alla paglia lunga efflusso.
    Attenzione: È fondamentale controllare le connessioni allentate o le linee instradate in modo errato. In caso contrario, i sovraccari potrebbero danneggiare la Smart Sleeve.
  11. Eseguire tutte le pompe in incrementi di 10 s per riempire le fiale con i supporti. Assicuratevi che le pompe di efflusso con ispezione visiva rimuovano efficacemente i supporti attraverso le cannucce di efflusso, per evitare i trabalci. Se le cannucce di efflusso non sembrano funzionare in modo efficiente, ispezionare i collegamenti della linea fluidica e la pompa peristaltica. Correggere o sostituire le parti in base alle esigenze.
  12. Spingere i flaconcini verso il basso fino a essere completamente rivestiti dalla Smart Sleeve.
  13. Impostare le condizioni iniziali per i parametri sperimentali utilizzando il touchscreen eVOLVER nella pagina di configurazione interattiva. Per tutti i flaconcini, impostare la temperatura a 30 ° c e mescolare a 10. Questo può essere fatto per tutti i flaconcini contemporaneamente trascinando un dito sul touchscreen per selezionare tutte le fiale.

3. configurazione del software eVOLVER e programmazione delle routine di coltura algoritmica

  1. Nel dashboard eVOLVER in un computer, passare alla pagina Gestione esperimento. Seleziona l'esperimento di base nel pannello del navigatore dell'esperimento o un esperimento esistente come punto di partenza e fai clic su clone nuovo.
    Nota: È possibile utilizzare gli esperimenti di altri gruppi incollando il collegamento GitHub al repository in cui la definizione sperimentale viene salvata nel gestore dell'esperimento.
  2. Specificare il nome dell'esperimento e il dispositivo eVOLVER su cui verrà eseguito l'esperimento. Accertarsi che le impostazioni di calibrazione desiderate siano state selezionate modificando questi campi nella pagina.
  3. Utilizzare il selettore del flaconcino e i riquadri di definizione dei parametri per impostare le condizioni sperimentali. Ad esempio, per impostare la temperatura per i flaconcini 0-4 a 30 ° c, selezionare i flaconcini nel selettore del flaconcino, impostare la definizione del parametro su 30 e fare clic su imposta. Ripetere questo per OD per impostare una soglia superiore e inferiore per ogni flaconcino.
  4. Dopo aver completato le definizioni dei parametri sperimentali, salvare l'esperimento facendo clic su Salva e su Avvia per eseguire.

4. avvio di esperimenti e monitoraggio in tempo reale

  1. Una volta che l'esperimento è in corso, passare al pannello dati in tempo reale nel dashboard interattivo. Per ogni flaconcino, verificare che i valori OD siano trattenenti a zero e che le temperature siano o progrestiano verso livelli programmati navigando attraverso i grafici.
  2. Per preparare l'inoculo, misurare l'OD delle colture notturne, calcolare la diluizione della piega desiderata assumendo un volume del flaconcino di 25 mL e pipettare il volume calcolato di inoculo in flaconcini attraverso la porta di campionamento. Ad esempio, per raggiungere un OD iniziale desiderato di circa 0,05 nel flaconcino di coltura da colture notturne che sono a 2,0 OD, 625 μL di cellule devono essere aggiunte a ciascun flaconcino.
  3. Controllare i grafici sul cruscotto per vedere che i grafici OD sono stati aggiornati di conseguenza. Un aumento a vicino all'OD iniziale desiderato dovrebbe essere visto nei grafici.
  4. Traccia diversi tipi di dati (ad esempio OD, temperatura, tasso di crescita, generazioni e consumo multimediale) durante l'esperimento sfogliando i grafici corrispondenti nel dashboard. Questi valori possono informare l'utente delle decisioni sperimentali (ad esempio i timepoint di programmazione) o anche utilizzati nelle funzioni per eseguire un feedback automatizzato.
  5. Per sostituire l'esperimento Mid delle bottiglie multimediali, metti in pausa l'esperimento nel pannello di gestione dell'esperimento per evitare che si verifichino eventi della pompa. Svitare rapidamente la linea di supporto dal flacone vuoto e collegarlo alla nuova bottiglia. Evitare di toccare le estremità del tubo per evitare contaminazioni. Riprendere l'esperimento nel gestore dell'esperimento.

5. campionamento di cellule di lievito da fiale eVOLVER

  1. Preparare una soluzione di cicloesimmide per inibire la sintesi proteica e fissare le cellule di lievito per l'analisi della citometria di flusso. In un tubo conico da 15 mL, aggiungere 12 mL di PBS e 12 μL di 20 mg/mL di cicloesimmide e Vortex per 5 s.
  2. Utilizzando una pipetta multicanale, aliquota 100 μL in ogni pozzetto di una piastra inferiore rotonda 96-bene.
  3. Avvolgere la piastra in foglio di alluminio per bloccare la luce e mantenere a 4 ° c fino a quando necessario.
  4. Per il campionamento, pipettare attraverso la porta di campionamento sul coperchio del flaconcino utilizzando una lunghezza estesa di 200 μL di puntali.
  5. Pipettare 100 μL da un flaconcino in un pozzo nella piastra di fissaggio, mescolando 2-3x pipettando su e giù, quindi riprendersi in lamina e riportare la piastra a 4 ° c.

6. esperimento abbattere e ripulire

  1. Preparare 1 L di candeggina al 10% e 2 500 mL DI soluzioni di acqua in grandi Becher.
  2. Arrestare l'esperimento inviando il comando di arresto nel pannello di gestione dell'esperimento. I dati sono ancora archiviati nel database abilitato per il cloud e possono ancora essere visualizzati in un secondo momento nel pannello dati in tempo reale del dashboard o scaricati per l'analisi offline.
  3. Rimuovere i flaconcini da Smart Sleeve e metterli in un rack autoclave per evitare i sovraccarici nei passaggi successivi.
  4. Svitare le linee di ingresso del supporto dai flaconi dei supporti e metterli nel bicchiere del 10% di candeggina. Eseguire le pompe dall'interfaccia utente eVOLVER come nella configurazione per sterilizzare le linee e i flaconcini.
  5. Scollegare le linee dai flaconcini e dalle linee di immergere in acqua di. Eseguire le pompe per sciacquare tutta la candeggina fuori dal sistema prima con l'acqua DI, poi con l'aria.
  6. Spegnere eVOLVER spegnendo prima l'alimentazione a 12 V, aspettando 5 s, quindi spegnendo l'alimentazione a 5 V.
  7. Immergere le barrette e i tappi nel 10% di candeggina, quindi risciacquare con acqua DI. Assicurarsi di sciacquare le cannucce di afflusso e di efflusso di ogni tappo eseguendo l'acqua DI attraverso DI essi. Strofinare i flaconcini usando la spazzola provetta se la pellicola si è formata sulle pareti.
  8. Smaltire adeguatamente i rifiuti e risciacquare accuratamente i contenitori dei rifiuti.
    Attenzione: I contenitori di rifiuti contengono una miscela di 10% di candeggina, rifiuti di colture cellulari sterilizzate e tracce di etanolo. Consultare un coordinatore della sicurezza per una corretta manipolazione e smaltimento.

7. quantificare l'idoneità utilizzando l'analisi della citometria a flusso delle popolazioni frazionali

  1. Analizzare i campioni raccolti dalla sezione 5 utilizzando un citometro a flusso dotato del canale di fluorescenza e dei rivelatori appropriati16.
  2. Acquisisci almeno 10.000 eventi per campione e porta per le celle integre utilizzando i dati a dispersione diretta e laterale.
  3. Cancello basato sul canale di fluorescenza appropriato (ad esempio GFP) per determinare la distribuzione frazionata di ogni popolazione.
  4. In un computer, Salva i dati nella posizione desiderata dalla pagina Gestione esperimenti facendo clic sul pulsante "Esporta".
  5. Dai file di dati eVOLVER, determinare il numero di generazioni completate da ogni punto temporale per ogni flaconcino. Nel codice eVOLVER, le generazioni vengono calcolate prima segmentando i dati OD tra ogni evento di diluizione, quindi ogni segmento è in forma con un esponenziale di base del Equation 1 modulo per ogni segmento, producendo r, il tasso di crescita16. Il numero di generazioni in un periodo di tempo viene quindi calcolato utilizzando la seguente formula:
    Equation 2
  6. Tracciare il rapporto di log delle popolazioni etichettate e senza etichetta dai dati di citometria di flusso vs numero di generazione dai calcoli di cui sopra al momento in cui sono stati prelevati i campioni. Identificare la regione lineare e adattare la pendenza in base alla seguente equazione. Questa pendenza è comunemente definita come il fitness competitivo18,19.
    Equation 3

Representative Results

Il protocollo qui descritto è stato utilizzato per costruire mappe di fitness per le varianti genetiche di S. cerevisiae attraverso un gradiente di stress bidimensionale di temperatura e salinità. In particolare, per ogni ceppo variante, abbiamo usato eVOLVER per condurre esperimenti di competizione pairwise contro un ceppo di riferimento con etichetta fluorescente (S. cerevisiae Strain BY4741 con un reporter mNeonGreen costituente integrato) in 16 diversi combinazioni di queste sollecitazioni (Figura 1). Per le varianti, sono stati selezionati due ceppi Knockout ciascuno stimato per essere sensibile a uno degli assi di condizione di sollecitazione: Δprx1 che è stato segnalato per avere difetti di idoneità in alte temperature20 e δpbs2 con difetti di idoneità ad alta concentrazioni di sale21. Come variante di controllo, è stato utilizzato un ceppo Wild-Type BY4741 senza etichetta, che dovrebbe eseguire in modo analogo al ceppo di riferimento. In totale, questi esperimenti di competizione di 3 72 ore sono stati condotti simultaneamente in 48 fiale in tre dispositivi eVOLVER (16 flaconcini) tutti eseguiti da un singolo computer.

Il dashboard interattivo eVOLVER viene utilizzato per esplorare la grande quantità di dati generati durante ogni esperimento (Figura 2a). Le tracce di OD rappresentativi su tutti i 16 flaconcini di un singolo dispositivo eVOLVER sono mostrate nella Figura 2B. Ogni traccia Mostra un caratteristico modello a dente di sega dall'algoritmo di controllo turbidostat, che utilizza il feedback su OD per innescare diluizioni e mantenere le colture in un intervallo di densità ristretto (0.2-0.3 in questo caso). I dati di OD e di temperatura vengono misurati continuamente, trasmessi al database abilitato per il cloud e aggiornati in tempo reale nella dashboard interattiva eVOLVER. Dai dati in continuo streaming, le metriche di ordine superiore (ad esempio, il tasso di crescita, le generazioni cumulative) possono essere calcolate e tracciate nel cruscotto (Figura 2C) e persino utilizzate come parametri di feedback in diversi schemi di selezione (ad esempio, morbidostat).

Per generare mappe di fitness, misuriamo la velocità con cui il ceppo di riferimento supera la deformazione della variante incorporando sia le misurazioni della citometria di flusso che i dati di crescita eVOLVER. In particolare, le frazioni di popolazione vengono calcolate come rapporto di log della deformazione di variante rispetto alla deformazione di riferimento utilizzando i dati di citometria a flusso da ciascun campione di tempo. Per ogni lingua e punto temporale, il numero di generazioni trascorso viene interpolato dai dati del tasso di crescita eVOLVER in ogni periodo di diluizione. Tracciando i rapporti di log rispetto alle generazioni, iniziano a emergere differenze qualitative tra le condizioni (Figura 3A). Per calcolare il fitness, una pendenza è adatta attraverso la porzione lineare di ogni trama18,19, ottenendo un valore di idoneità quantitativa (con segno e tasso) che descrive come il ceppo variante compete contro il ceppo di riferimento ( Figura 3B). In questo esperimento, i valori di idoneità negativa indicano che il ceppo variante è superato dal ceppo di riferimento. La costruzione di mappe termiche da tutti i calcoli di idoneità consente la visualizzazione del paesaggio di fitness bidimensionale, rivelando sottili differenze quantitative nelle prestazioni tra ceppi e condizioni (Figura 3C).

Dalle mappe termiche di fitness, vediamo che ogni ceppo variante presenta difetti di idoneità che si manifestano in modi diversi. Δprx1 è principalmente sensibile alle alte temperature, ma lo stress da sale sembra avere un effetto additivo, aumentando il difetto di idoneità. Al contrario, Δpbs2 Mostra difetti di idoneità principalmente in risposta a concentrazioni elevate di sale, con minime differenze lungo l'asse della temperatura. Questi risultati evidenziano l'utilità di esperimenti di selezione ad alta risoluzione in particolare per decifrare le interazioni di più fattori di stress ambientali, che potrebbero avere effetti additivi, sinergici o epistatici.

Infine, è importante notare che in alcuni casi, in particolare per le condizioni di stress gravi, calcoli di idoneità possono portare a risultati esagerati o distorti. Ad esempio, Δpbs2 sembra mostrare una pendenza positiva ripida nella condizione nacl di 39 ° c/1 M rispetto alla deformazione di riferimento (Figura 3A). Questo è attribuito alla scarsa crescita di entrambi i ceppi, che si riflette nei dati di tipo selvaggio e limita l'utilità di questa particolare metrica in questa condizione. Un numero insufficiente di generazioni provoca 1) scarsa separazione dei timepoint che interferisce con il raccordo inclinato e 2) sensibilità agli effetti stocastici originati dalla fase di lag. Anche se non abbiamo scelto di farlo in questo studio, i dati di crescita in tempo reale raccolti da eVOLVER durante l'esperimento avrebbero potuto essere utilizzati per informare la decisione di estendere l'esperimento e raccogliere ulteriori timepoint per questa condizione con poco sforzo. Negli esperimenti di follow-up, i rapporti iniziali potrebbero anche essere modulati per estendere la lunghezza della regione lineare prima che si verifichi la saturazione.


Figure 1
Figura 1: Panoramica del Framework eVOLVER e della progettazione sperimentale. (A) Evolver è una piattaforma di coltura automatizzata e continua che consente il controllo multiparametrico delle condizioni di coltura. La piattaforma è costituita da Smart Sleeve, che casa i sensori e gli attuatori per il controllo delle condizioni di coltura, un array di pompe peristaltiche per fluidi fluenti e rifiuti dentro e fuori le culture, un touchscreen per interagire manualmente con il dispositivo, e un computer utilizzato per interagire con l'infrastruttura cloud in cui vengono trasmessi i dati della piattaforma. (B) Evolver può essere configurato in diversi modi: fisicamente, attraverso gli ingressi cellulari e multimediali, e a livello di programmazione regolando gli algoritmi che controllano i moduli del flaconcino di coltura Smart Sleeve. Questo può essere utilizzato per programmare la selezione multidimensionale/gradienti ambientali ad alta risoluzione, con output costituiti da celle raccolte fisicamente a punti temporali definiti e streaming in tempo reale di dati di coltura. (C) configurazione di Evolver per condurre un esperimento di fitness di crescita attraverso un gradiente di selezione bidimensionale, composto di temperatura e stress osmotico. i flaconcini di coltura eVOLVER sono stati seminati con uguali proporzioni di un ceppo di lievito di riferimento e variante. Una routine turbidostat è stata programmata per mantenere tutte le culture in fase esponenziale in una finestra definita OD (OD 0.2-0.3). Le condizioni di temperatura e media sono state variate nell'array Smart Sleeve per formare due gradienti di sollecitazione indipendenti. I supporti di base erano composti da YPD (2% glucosio) + 100 μg/mL di carbenicillina + 25 μg/mL di cloramfenicolo come precauzione contro la contaminazione batterica. Composizioni multimediali sono stati variati aggiungendo NaCl supplementare a 0 M, 0,6 M, 0,8 M, o 1,0 M. le temperature del flaconcino sono state programmate a uno dei quattro valori: 30 ° c, 35 ° c, 37 ° c o 39 ° c. D) esempi di produzione grezza per la cultura od e frazioni di popolazione da tre condizioni testate. L'esperimento di competizione è stato mantenuto per 72 h, campionamento a 24 ore e successivamente ogni 12 h fino alla conclusione dell'esperimento. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 2
Figura 2: dashboard di analisi dei dati in tempo reale eVOLVER. (A) i dati Evolver vengono elaborati e trasmessi in tempo reale tramite software basato su cloud a un dashboard interattivo. Attraverso il cruscotto, gli utenti possono definire e avviare le proprie routine di cultura su un eVOLVER connesso, monitorare gli esperimenti attualmente in esecuzione su tutte le unità eVOLVER e variare le condizioni sperimentali manualmente su un singolo flaconcino o set di flaconcini, se necessario. B) tracce od per ogni flaconcino attraverso la matrice di condizioni testate per l'intera durata dell'esperimento. Le tracce possono essere visualizzate in tempo reale per garantire che l'esperimento sia in esecuzione come desiderato e utilizzato dopo l'esperimento per ulteriori analisi. (C) i tassi di crescita e le generazioni cellulari possono essere calcolate dalle tracce od al volo per tenere traccia dei progressi degli esperimenti. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 3
Figura 3: Costruzione di superfici di fitness. (A) frazioni di popolazione di cellule registro naturale (ceppo variante/ceppo di riferimento) tracciata contro le generazioni cellulari. Il colore indica la temperatura di selezione mentre i trattini distinguono le concentrazioni di sale. (B) per quantificare l'idoneità relativa della variante al ceppo di riferimento, una metrica di idoneità è derivata dalla velocità alla quale la frazione della popolazione cellulare cambia nel corso delle generazioni. Questa metrica viene calcolata dall'area lineare dei grafici delle frazioni cellulari utilizzando un minimo di tre punti. (C) le metriche relative al fitness sono visualizzate in una mappa di calore per costruire una superficie di fitness sui gradienti di stress ambientale. Le condizioni dell'angolo superiore destro (39 ° c/1,0 M NaCl) per il tipo selvaggio e Δpbs2 non sono incluse in questa analisi poiché le colture hanno attraversato generazioni insufficienti (vedere risultati rappresentativi). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Discussion

La selezione della crescita è uno strumento indispensabile nella biologia, ampiamente utilizzato per generare e caratterizzare le differenze fenotipiche tra le popolazioni cellulari. Mentre le colture batch consentono la selezione della crescita in modo limitato, le tecniche di coltura continua espandono drasticamente il grado di controllo e la prevedibilità di questi esperimenti, esercitando una regolazione precisa sulla forma e la dinamica della selezione per generare risultati quantitativi e ripetibili22. La cultura continua è stata impiegata per controllare rigorosamente la selezione per le biblioteche ad alta diversità20,23,24,25e per implementare sofisticati regimi adattativi in esperimenti e evoluzione diretta11,12,26,27. La cultura continua consente inoltre una caratterizzazione precisa delle cellule attraverso una serie di condizioni quantitativamente controllate per comprendere meglio i sistemi genetici complessi e ottimizzare i ceppi di bioproduzione ingegnerizzati9,14 , a 28.

Tuttavia, non esiste un protocollo universale per la cultura continua, poiché le sottili modifiche alle condizioni selettive possono portare a cambiamenti drammatici nei risultati biologici4,29,30. Gli sperimentatori devono essere in grado di scegliere tra regimi di selezione e adattare i protocolli e le apparecchiature sperimentali di conseguenza. Oltre a offrire una scelta tra i parametri di controllo, tali sistemi sarebbero idealmente abbastanza sofisticati da gestire autonomamente diversi parametri simultaneamente in esperimenti altamente paralleli che sono necessari per decifrare gli input interagenti in complessi sistemi biologici (ad es. Epistis). eVOLVER affronta questa sfida consentendo agli utenti di programmare arbitrariamente il controllo del feedback tra le condizioni di coltura e le funzioni fluidiche per specificare nicchie ambientali altamente specializzate.

Per superare le limitazioni nella configurazione corrente ed espandere o modificare i parametri di controllo, la Smart Sleeve potrebbe essere facilmente ridisegnata per aggiungere nuovi sensori o attuatori. Inoltre, ridurre il volume del flaconcino diminuirebbe le spese dei media, che possono essere significative nella cultura continua. Mentre il design attuale consente la misurazione e il controllo della temperatura, agitazione della cultura, induzione della luce, torbidità, e fluidica, altri parametri devono essere misurati esternamente mediante campionamento dai flaconcini. Il lavoro attuale include l'incorporazione della capacità di monitorare l'attività enzimatica tramite luciferasi e regolare l'ossigeno disciolto e il pH direttamente nelle colture eVOLVER. Inoltre, sebbene non sia stato dimostrato in questo lavoro, eVOLVER può interfacciarsi con nuovi dispositivi di multiplexing millifluidico16 che attingano ai principi dell'integrazione su larga scala (provenienti dall'elettronica e adottati dalla microfluidica) al fine di una gestione fluidica più complessa (ad es. ingressi fluidici multiplexed, trasferimenti da flaconcino a flaconcino). Questi moduli "Wetware" possono essere progettati e fabbricati completamente in laboratorio, permettendo agli utenti di instradare i fluidi a livello di programmazione, attuando diverse combinazioni di valvole in routine fluidiche automatizzate. Ciò consente agli utenti di superare i rigidi disegni fluidici tradizionalmente utilizzati nella cultura continua, ma anche di scalare le capacità fluidiche ad alta produttività con un minor numero di costosi elementi di controllo (ad esempio pompe peristaltiche). Infine, speriamo di incorporare una piattaforma di autocampionamento che utilizzerà questi componenti di millifluidics e DIY, superando la limitazione dell'interazione manuale durante esperimenti più lunghi e più grandi in cui le colture di campionamento sarebbero ingombranti.

Oltre alle modifiche fisiche alla piattaforma, il software basato sul Web apre nuovi gradi di libertà consentendo agli utenti di scrivere, modificare e condividere script eVOLVER personalizzati, generando programmi di cultura completamente automatizzati e abilitati al feedback (ad esempio, turbidostat). Gli utenti possono effettuare lo sweep a livello di codice tra intervalli di parametri in variazioni sottili sullo stesso schema di selezione o connettere algoritmi di controllo in nuove combinazioni per specificare un numero qualsiasi di schemi di selezione sofisticati. Inoltre, la capacità di monitorare facilmente le culture in tempo reale trasforma il modo in cui vengono condotti gli esperimenti. Con il monitoraggio in tempo reale, gli utenti possono 1) verificare la coerenza tra le esecuzioni, una caratteristica critica per le applicazioni di bioproduzione e gli esperimenti ad alto throughput, e 2) intervenire durante gli esperimenti, se necessario, per risolvere i ceppi impegnativi che mostrano scarsa crescita o formazione di biofilm, o diagnosticare errori degli utenti (ad es. contaminazione). Infine, con più flussi di dati raccolti e interpretati in tempo reale per ogni singola cultura, eVOLVER genera un'alta densità di dati, che può facilitare gli approcci di apprendimento automatico per nuove analisi downstream.

Oltre agli usi dimostrati per la caratterizzazione del fitness, la selezione della libreria e l'evoluzione del laboratorio, vediamo una serie di campi correlati maturi per l'implementazione in eVOLVER con la fluidica integrata. gli esperimenti Evolver con i campioni del microbioma potrebbero valutare la stabilità della Comunità in ambienti controllati31,32, esplorare la composizione del microbiota utilizzando tecniche di culturomics33, o mescolare dinamicamente le specie per interrogare le dinamiche ecologiche della colonizzazione o dell'invasione34,35. Numerosi metodi per l'evoluzione continua diretta delle biomolecole potrebbero essere facilmente implementati sul dispositivo e26,36,37, aumentando notevolmente l'accessibilità e la produttività di questi sistemi. La capacità di ottimizzare le condizioni di crescita come la composizione dei media, la temperatura e i ceppi in una natura dinamica e ad alta produttività può aiutare negli sforzi di ottimizzazione per le applicazioni di Biomanufacturing industriali9. Abbiamo ulteriormente immaginare l'integrazione verticale di eVOLVER con altre tecniche di analisi come la microscopia e la citometria a flusso in una moda a circuito chiuso, fornendo un sistema completamente automatizzato per la crescita e l'analisi delle colture cellulari sia a singola cellula che a popolazione Livelli. Inoltre, con alcune modifiche hardware alla Smart Sleeve come la sigillatura del recipiente e il controllo del contenuto di gas, eVOLVER potrebbe potenzialmente essere adattato per sostenere la crescita di una gamma più ampia di tipi di cellule, come le cellule di mammifero sospensione. È anche possibile collocare l'intero quadro in una camera anaerobica per la coltura cellulare anaerobica. Guardando al futuro, miriamo a costruire il nostro framework software in un'infrastruttura cloud centralizzata e crediamo che questo consentirebbe agli utenti di configurare facilmente, analizzare e condividere i propri dati in remoto senza bisogno di essere fisicamente presenti in laboratorio. Funzionando come curatore dei dati, l'infrastruttura cloud si presterebbe anche a meta-analisi su larga scala attraverso esperimenti. Prevediamo che eVOLVER e questi futuri progressi amplieranno notevolmente l'ambito di possibili esperimenti di selezione della crescita facilitando l'automazione e l'innovazione nella cultura continua.

Disclosures

Gli autori, Brandon G. Wong e Ahmad S. Khalil, sono co-fondatori di Fynch Bioscience Inc., che sviluppa la piattaforma eVOLVER utilizzata in questo articolo.

Acknowledgments

Ringraziamo B. Stafford per la sua assistenza nella progettazione del sistema, e H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. pipe, e A. cavale per l'aiuto nella costruzione del sistema. Riconosciamo l'Electronics Design Facility (EDF), il centro di innovazione dei prodotti ingegneristici (EPIC) e il software & Application Innovation Lab (SAIL) presso l'Hariri Institute for Computing presso l'Università di Boston per i loro servizi. Questo lavoro è stato sostenuto da un NSF CAREER Award (MCB-1350949 a A.S.K.), e DARPA concede HR0011-15-C-0091 e HR0011-18-2-0014 (a A.S.K.). A.S.K. riconosce anche il finanziamento del nuovo Innovator Award di NIH Director (1DP2AI131083-01), del DARPA Young Faculty Award (D16AP00142) e della NSF Expeditions in Computing (CCF-1522074).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 Gallon Plastic Hedpack with cap Midwest Brewing and Winemaking Supplies 45-56Y8-E2FR For waste collection
a-D(+)-Glucose Chem-Impex 00805 For YPD Medium
Attune NxT Autosampler Thermo Fisher Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate
Attune NxT Flow Cytometer Thermo Fisher Used to determine population fractions via single cell fluoresence
Bacto Peptone Fisher Scientific DF0118-07-0 For YPD Medium
Carbenicillin Fisher Scientific BP2648250 For YPD Medium
Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature McMaster- Carr 5121K731 For media input branching
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 For YPD Medium
CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 Fisher Scientific 50371500 For Sterilization of fluidic lines
Custom eVOLVER vial lid FynchBio Lid has ports for sampling and fluidic input/output
Cycloheximide Fisher Scientific ICN10018301 For flow cytometry sampling plates
Ethanol, Anhydrous (Histological) Fisher Scientific A405P-4 For sterilization of fluidic lines
eVOLVER Unit FynchBio
Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) Fisher Scientific 02-681-420 For vial sampling
Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars Fisher Scientific 14-513-57 Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm
Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap Fisher Scientific FB8002000 Must be fitted with tubing
High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD McMaster- Carr 51135K73 For media bottles
Mac Mini Apple For running the experiment/collecting data
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP243820 For flow cytometry sampling plates
Pipettes Eppendorf
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K141 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K144 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K291 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K294 For media bottles
SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN Chemglass CG-4910-04 Culture vials
Sodium Chloride (NaCl) Fsher Scientific S271-3 For YPD Medium
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices For measuring OD600 of overnight cell cultures
Vial Only, Sample, 40 mL, Clear, 28 mm x95 mm, GPI 24-400 Chemglass CG-4902-08 Culture vials
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-500 For YPD Medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monod, J. The Growth of Bacterial Cultures. Annual Review of Microbiology. , (1949).
  2. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 36 (12), 708-719 (1950).
  3. Bull, A. T. The renaissance of continuous culture in the post-genomics age. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 37 (10), 993-1021 (2010).
  4. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  5. Lang, G. I., et al. Pervasive genetic hitchhiking and clonal interference in forty evolving yeast populations. Nature. 500 (7464), 571-574 (2013).
  6. Maddamsetti, R., et al. Adaptation, Clonal Interference, and Frequency-Dependent Interactions in a Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. Genetics. 200 (2), 619-631 (2015).
  7. Ishii, N., et al. Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations. Science. 316 (5824), 593-597 (2007).
  8. Brauer, M. J., et al. Coordination of Growth Rate, Cell Cycle, Stress Response, and Metabolic Activity in Yeast. Molecular Biology of the Cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  9. Moser, F., et al. Genetic circuit performance under conditions relevant for industrial bioreactors. ACS Synthetic Biology. 1 (11), 555-564 (2012).
  10. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nature Genetics. 40 (12), 1499-1504 (2008).
  11. Toprak, E., Veres, A., Michel, J. -B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44 (1), 101-105 (2011).
  12. Hope, E. A., Amorosi, C. J., Miller, A. W., Dang, K., Heil, C. S., Dunham, M. J. Experimental Evolution Reveals Favored Adaptive Routes to Cell Aggregation in Yeast. Genetics. 206 (2), 1153-1167 (2017).
  13. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. Journal of Visualized Experiments. (72), 2-7 (2013).
  14. Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. 4 (1), 32-38 (2015).
  15. Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
  16. Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
  17. Bondi, A. B. Characteristics of scalability and their impact on performance. Proceedings of the Second International Workshop on Software and Performance - WOSP ’00. , 195-203 (2000).
  18. Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology. Journal of Visualized Experiments. (80), e50168 (2013).
  19. Sanchez, M. R., et al. Differential paralog divergence modulates genome evolution across yeast species. PLOS Genetics. 13 (2), e1006585 (2017).
  20. Gibney, P. A., Lu, C., Caudy, A. A., Hess, D. C., Botstein, D. Yeast metabolic and signaling genes are required for heat-shock survival and have little overlap with the heat-induced genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), E4393-E4402 (2013).
  21. Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418 (6896), 387-391 (2002).
  22. Piper, M. D. W., et al. Reproducibility of oligonucleotide microarray transcriptome analyses. An interlaboratory comparison using chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 277 (40), 37001-37008 (2002).
  23. Badarinarayana, V., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature Biotechnology. 19 (11), 1060-1065 (2001).
  24. Dai, J., Hyland, E. M., Yuan, D. S., Huang, H., Bader, J. S., Boeke, J. D. Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile. Library of Synthetic Histone H3 and H4. 134 (6), 1066-1078 (2008).
  25. McGeachy, A. M., Meacham, Z. A., Ingolia, N. An Accessible Continuous-Culture Turbidostat for Pooled Analysis of Complex Libraries. bioRxiv. , 450536 (2018).
  26. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  27. Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nature Chemical Biology. 10 (3), 216-222 (2014).
  28. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (May), 12546 (2016).
  29. Wenger, J. W., Piotrowski, J., Nagarajan, S., Chiotti, K., Sherlock, G., Rosenzweig, F. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genetics. 7 (8), e1002202 (2011).
  30. Yona, A. H., et al. Chromosomal duplication is a transient evolutionary solution to stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 21010-21015 (2012).
  31. Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3, 42 (2015).
  32. Goldford, J. E., et al. Emergent simplicity in microbial community assembly. Science. 361 (6401), 469-474 (2018).
  33. Lagier, J. -C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. Culturing the human microbiota and culturomics. Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).
  34. Fukami, T. Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).
  35. Friedman, J., Gore, J. Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations. Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).
  36. Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. M., Schmitz, A., Alper, H. S. In vivo continuous evolution of genes and pathways in yeast. Nature Communications. 7, 13051 (2016).
  37. Ravikumar, A., et al. Scalable, Continuous Evolution of Genes at Mutation Rates above Genomic Error Thresholds. Cell. 175, (2018).

Tags

Genetica problema 147 eVOLVER cultura continua popolazioni microbiche automazione del laboratorio selezione della crescita evoluzione sperimentale paesaggio fitness biologia dei sistemi
Progettare esperimenti di crescita cellulare automatizzati, ad alta produttività e continui utilizzando eVOLVER
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heins, Z. J., Mancuso, C. P.,… More

Heins, Z. J., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Wong, B. G., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER. J. Vis. Exp. (147), e59652, doi:10.3791/59652 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter