Summary
Het evolver Framework maakt een continue microbiële cultuur met hoge resolutie en dynamische controle over experimentele parameters mogelijk. Dit protocol laat zien hoe het systeem toe te passen om een complex fitness-experiment, begeleiden gebruikers op de programmering geautomatiseerde controle over vele individuele culturen, meten, verzamelen en interactie met experimentele gegevens in real-time.
Abstract
Door de continue kweekmethoden kunnen cellen worden geteeld onder kwantitatief gecontroleerde omgevingsomstandigheden, en zijn ze dus in grote mate nuttig voor het meten van fitness fenotypen en het verbeteren van ons inzicht in hoe genotypes worden gevormd door selectie. Uitgebreide recente inspanningen om te ontwikkelen en toe te passen niche continue cultuur apparaten hebben onthuld de voordelen van het uitvoeren van nieuwe vormen van cel cultuur controle. Dit omvat het definiëren van aangepaste selectie druk en toenemende doorvoersnelheid voor studies, variërend van lange termijn experimentele evolutie tot genoom-brede bibliotheek selecties en synthetische genen circuit karakterisering. Het evolver platform is recentelijk ontwikkeld om aan deze groeiende vraag te voldoen: een continu cultuur platform met een hoge mate van schaalbaarheid, flexibiliteit en automatisering. Evolver biedt een enkel standaard platform dat kan worden (her)-geconfigureerd en geschaald met een minimale inspanning om veel verschillende soorten van high-throughput of multi-dimensionale groei selectie experimenten uit te voeren. Hier wordt een protocol gepresenteerd om gebruikers van het evolver Framework een beschrijving te bieden voor het configureren van het systeem om een aangepast, grootschalig continu groei experiment uit te voeren. Concreet, het protocol begeleidt gebruikers over hoe het systeem te programmeren om multiplex twee selectie druk-temperatuur en osmolariteit-over vele evolver flacons om fitness landschappen van Saccharomyces cerevisiae mutanten te kwantificeren in fine Resolutie. We laten zien hoe het apparaat kan worden geconfigureerd, zowel programmatisch, via de open-source web-gebaseerde software, en fysiek, door het regelen van vloeiende en hardware lay-outs. Het proces van het fysiek opzetten van het apparaat, de programmering van de cultuur routine, monitoring en interactie met het experiment in real-time via het Internet, bemonstering flacons voor de daaropvolgende offline analyse, en post experiment data-analyse zijn gedetailleerd. Dit moet dienen als uitgangspunt voor onderzoekers in verschillende disciplines toe te passen evolver in het ontwerp van hun eigen complexe en high-throughput cel groei experimenten te bestuderen en te manipuleren biologische systemen.
Introduction
Continue cel cultuurtechnieken, voor het eerst ontwikkeld bijna 70 jaar geleden1,2, genieten van een recente Revival3,4. Dit is te wijten aan een samenvloeiing van factoren. Ten eerste heeft de ontwikkeling van hoge doorvoer omics technieken, die het mogelijk hebben gemaakt om grote aantallen genotypen te lezen en te genereren, een gelijktijdige vraag naar experimentele technieken gecreëerd die goed gecontroleerde celgroei en fenotype. Om dit te beëindigen, continue cultuur is een krachtige experimentele aanpak om te profiteren van opkomende genomic voorschotten. Door het faciliteren van groei selecties/experimenten op cellulaire populaties in nauwkeurig gecontroleerde (en dynamische) milieuomstandigheden biedt continue cultuur een middel om genotypen op een rigoureuze wijze toe te kaarten aan fenotypes7,8, kwantitatief karakteriseren gemanipuleerde stammen en organismen9, en spoor adaptieve genetische veranderingen in laboratorium evolutie studies10,11,12.
Ten tweede, de recente opkomst van toegankelijke prototyping technieken, zoals additief productie en open-source hardware en software-elementen, heeft een bredere set van gebruikers in staat te ontwerpen en bouwen hun eigen kosteneffectieve vormen van continue cultuursystemen direct in het laboratorium. Dit alles heeft geleid tot een spannende reeks van doe-het-zelf (DIY) apparaten die continue cultuur functionaliteiten, zoals de chemostaat13, turbidostat14, of morbidostat15uit te voeren. Helaas, hoewel succesvol in het aanpakken van specifieke (niche) problemen waarvoor ze werden ontworpen, deze ad hoc oplossingen over het algemeen niet de mogelijkheid om schaal in throughput en/of experimentele ontwerpcomplexiteit.
Het evolver systeem werd ontworpen met het doel om één enkel platform te creëren dat de groeiende experimentele behoeften van ononderbroken cultuur kan aanpassen en de snelheid en de schaal van opkomende genomic technieken aanpassen16 (Figuur 1a). Evolver ontwerp implementeert gemeenschappelijke principes ten grondslag liggen aan zeer schaalbare technologieën uit andere disciplines17, met inbegrip van gestandaardiseerde Footprints, modulaire componenten, en open-source Design Principles. Zo kunnen oplossingen voor nieuwe niche-toepassingen worden ontworpen zonder grote wijzigingen aan het systeem. Bestaande uit zeer modulaire en open-source wetware, hardware, elektronica, en web-based software, evolver is de eerste geautomatiseerde continue cultuursysteem dat kan worden kosten-effectief en gemakkelijk opnieuw geconfigureerd voor het uitvoeren van vrijwel elk type High-throughput groei experiment. Door middel van modulaire en programmeerbare slimme mouwen die alle sensoren en actuatoren die nodig zijn om individuele culturen controle huis, evolver uniek maakt schaalvergroting van zowel de doorvoer en individuele controle van de cultuur voorwaarden. Bovendien, als een web-based platform, evolver uitwisseling van gegevens en informatie met externe computers in real-time, waardoor gelijktijdige monitoring van honderden individuele culturen en geautomatiseerde cultuur verstoringen door middel van willekeurig gedefinieerde controle Algoritmen.
In het vorige werk16, werd de robuuste prestaties van evolver aangetoond in experimenten op lange termijn over honderden uren van verrichting, en zijn capaciteit om diverse organismen, van E. coli en s. cerevisiae aan undomesticed te cultiveren Microben. Een reeks van verschillende groei selectie experimenten werden uitgevoerd, waarbij programmatisch gedefinieerde multi-dimensionale selectie gradiënten werden toegepast in een array van individuele cultuuromstandigheden en de daaruit voortvloeiende cellulaire fitness landschappen werden Gekwantificeerde. Hier, het doel is om ontwikkel gebruikers te voorzien van een beschrijving van hoe het systeem te gebruiken om het ontwerp en dit soort experimenten. Als een illustratief voorbeeld, methoden kwantificeren van de fitness-landschap van S. cerevisiae mutanten over een twee-dimensionale omgevings gradiënt bestaat uit temperatuur en osmotische stress worden gepresenteerd. Het protocol begeleidt gebruikers via het configureren van de evolver kader voor dit experiment zowel programmatisch, in het gebruik van de software om aangepaste troebelheid en temperatuur controle routines ingesteld voor elk van 16 parallelle continue culturen, en fysiek, door de microfluïdica lay-out om de juiste route media van verschillende zoutconcentraties. Dit protocol dient als algemene rubriek voor het configureren van evolver om een breed scala van geautomatiseerde continue cultuur experimenten uit te voeren voor diverse studies en disciplines.
Protocol
1. het voorbereiden van media, flacons, en entmateriaal
Opmerking: Dit protocol veronderstelt dat gebruikers al het evolver systeem hebben gekalibreerd en gebruik maken van de Smart Sleeve configuratie beschreven in Prior werk16. De slimme kokers worden gemakkelijk opnieuw ontworpen of worden gewijzigd, maar de opstellings Details van volume en controleparameters kunnen voor alternatieve configuraties verschillen.
- De dag voor het experiment, bereid 2 mL 's nachts vloeibare culturen van S. cerevisiae BY4741 referentiestam en variant stammen in YPD media (Gist pepton dextrose) bij 30 ° c in een schudden incubator ingesteld op ten minste 300 toerental
- Breng steriele YPD media over in schone, gesteriliseerde flessen met een slang. Alternatief, kunnen de MediaDirect in flessen worden gesteriliseerd die vooraf met buizen worden gepast.
Opmerking: Flessen zijn geschikt met slangen door het boren van een gat in de dop en het uitvoeren van buizen door het met connectoren om het te beveiligen op zijn plaats. Zie de lijst van materialen. - Voeg roerstaaf aan elke flacon en schroef op een flacon deksel uitgerust met instroom en Efflux rietjes. Zorg ervoor dat alle onderdelen schoon zijn door visuele inspectie.
- Plaats flacons in een autoclaveerbaar Rack, dek af met folie, en autoclaaf op een zwaartekracht of vacuüm cyclus met een 20-min sterilisatie stap.
2. een experiment opzetten
- In drie grote bekers, bereiden 500 mL van 10% bleekmiddel, 200 mL van 10% bleekmiddel, en 300 mL van 70% ethanol.
- Met behulp van de schakelopties op de evolver apparaat, zet de 5 V voeding op de evolver, wacht tot 5 s, zet dan de 12 V voeding.
- Als het runnen van verscheidene flacons van de zelfde media fles, sluit veelvoudige media input lijnen met buizenstelsel splitters aan. Custom tubing splitters kunnen worden geconstrueerd met Luer componenten.
- Dompel de media input lijnen in de eerste bleekwater beker, en de media Efflux lijnen in de tweede Bleach beker. Plaats het downstream-uiteinde van de media-invoer lijnen in de tweede beker met de Efflux lijnen. Plaats afval lijnen in afval carboy.
- Voeg 1-2 liter bleekmiddel in grote lege afval carboy, die zal steriliseren afval gegenereerd tijdens het experiment. Overleg met een veiligheidscoördinator om te zorgen voor een goede afvoer van afval.
- Met behulp van het touchscreen op de evolver, navigeer naar de Setup-sectie, en voer alle pompen voor 20 s om vloeiende lijnen te vullen met 10% bleekmiddel. Tijdens het hardlopen, zorgen door visuele inspectie dat alle lijnen zijn gevuld en dat de pompen normaal werken. Laat bleekwater te zitten in de lijnen voor ten minste 30 min te steriliseren.
- Run pompen weer met behulp van de touchscreen app tot lijnen zijn niet langer ondergedompeld, duwen lucht door de lijnen om zo veel van het bleekmiddel uit mogelijk te maken.
- Plaats media input lijnen in de ethanol beker en herhaal zoals hierboven, het vullen van de lijnen met ethanol en blozen met lucht.
Opmerking: Als ethanol doodt snel, is er geen noodzaak om te wachten 30 minuten voor sterilisatie. - Bevestig de media input lijnen aan de media flessen met de Luer-connectoren en voer de pompen totdat de media volledig loopt door de lijnen, het spoelen van alle resterende ethanol.
- Gedeeltelijk invoegen gesteriliseerde flacons in de evolver slimme mouwen en haak de lijnen naar de juiste posities, volgens de kleurcodering op de lijnen. Begin met het aanbrengen van input lijnen aan de korte instroom stro, en dan afval lijnen aan de lange Efflux stro.
Let op: Het is essentieel om te controleren op losse verbindingen of verkeerd gerouteerd lijnen. Niet te doen zal leiden tot overlopen en mogelijk schade aan de slimme mouw. - Voer alle pompen in 10 s stappen om de flacons te vullen met de media. Zorgen door visuele inspectie Efflux pompen zijn efficiënt verwijderen van de media door de Efflux stropen, om overlopen te voorkomen. Als de Efflux stropen lijken niet efficiënt te functioneren, Inspecteer de vloeibare lijnverbindingen en de peristaltische pomp. Corrigeer of vervangonderdelen als dat nodig is.
- Duw flacons naar beneden tot volledig ingekapseld door de slimme mouw.
- Stel de initiële voorwaarden voor experimentele parameters met behulp van de evolver touchscreen op de interactieve Setup pagina. Voor alle flacons, zet de temperatuur op 30 ° c en de Roer tot 10. Dit kan worden gedaan voor alle flacons in een keer door het slepen van een vinger over het touchscreen om alle van de flacons te selecteren.
3. het configureren van evolver software en programmering algoritmische cultuur routines
- Navigeer in het dashboard evolver op een computer naar de pagina experiment beheer. Selecteer het basis experiment in het deelvenster experiment Navigator of een bestaand experiment als uitgangspunt en klik op kloon nieuw.
Opmerking: Het is mogelijk om experimenten van andere groepen te gebruiken door de GitHub link te plakken naar de repo waar de experimentele definitie wordt opgeslagen in de experiment Manager. - Geef de experiment naam en het evolver-apparaat op waarop het experiment wordt uitgevoerd. Zorg ervoor dat de gewenste kalibratie-instellingen zijn geselecteerd door deze velden op de pagina te wijzigen.
- Gebruik de flacon selector en parameter definitie ruiten om experimentele voorwaarden in te stellen. Bijvoorbeeld, om de temperatuur voor flacons 0-4 tot 30 ° c, selecteert u de flacons in de flacon selector, stel de parameter definitie op 30, en klik op set. Herhaal dit voor OD om een bovenste en onderste drempel voor elke flacon in te stellen.
- Nadat de experimentele parameterdefinities zijn voltooid, slaat u het experiment op door op Opslaan te klikken en op starten om te lopen.
4. initiëren van experiment en monitoring in real-time
- Zodra het experiment aan de gang is, navigeert u naar het real-time gegevens paneel in het interactieve dashboard. Voor elke flacon, controleer dan of OD waarden zijn bedrijf op nul, en dat de temperaturen op of vordert naar geprogrammeerde niveaus door te bladeren door de grafieken.
- Ter voorbereiding van entmateriaal, meet de OD van nachtelijke culturen, bereken de gewenste voudige verdunning uitgaande van een flacon volume van 25 mL, en pipet berekend volume van entmateriaal in flacons via de bemonsterings haven. Bijvoorbeeld, om te komen tot een gewenste start OD van ongeveer 0,05 in de cultuur flacon van nachtelijke culturen die op OD 2,0, 625 l van cellen moeten worden toegevoegd aan elke flacon.
- Controleer de grafieken op het dashboard om te zien dat de OD grafieken dienovereenkomstig zijn bijgewerkt. Een verhoging aan dichtbij de gewenste beginnende OD zou in de grafieken moeten worden gezien.
- Volg de verschillende gegevenstypen (zoals OD, temperatuur, groeipercentage, generaties en mediaverbruik) gedurende het experiment door te bladeren door de overeenkomstige grafieken in het dashboard. Deze waarden kunnen experimentele beslissingen door de gebruiker (bijv. Schedule Timepoints) of zelfs gebruikt in functies om geautomatiseerde feedback uit te voeren.
- Als u media flessen mid-experiment wilt vervangen, moet u het experiment in het deelvenster experiment beheer onderbreken om te voorkomen dat er pomp gebeurtenissen optreden. Draai de media lijn snel los van de lege fles en sluit deze aan op de nieuwe fles. Vermijd het aanraken van de uiteinden van de slang om verontreiniging te voorkomen. Hervat het experiment in de experiment Manager.
5. bemonstering van gistcellen uit evolver flacons
- Bereid een Cycloheximide oplossing voor om de eiwitsynthese te remmen en gistcellen voor flow Cytometry analyse vast te stellen. Voeg in een conische buis van 15 mL 12 mL PBS en 12 l van 20 mg/mL Cycloheximide en Vortex voor 5 s toe.
- Met behulp van een multichannel Pipet, hoeveelheid 100 l in elk goed van een 96-goed ronde bodemplaat.
- Wikkel de plaat in aluminiumfolie te blokkeren licht en houden bij 4 ° c tot nodig is.
- Voor het monster, Pipetteer door de bemonsterings poort op het flacon deksel met uitgebreide lengte 200 l tips.
- Pipetteer 100 l van een injectieflacon in een put in de bevestigingsplaat, Meng 2-3x door op en neer te pipetteren, herstel dan in folie en breng de plaat terug tot 4 °C.
6. experiment breken en opruimen
- Bereid 1 L van 10% Bleach en 2 500 mL DI water oplossingen voor in grote bekers.
- Stop het experiment door de opdracht stop te verzenden in het deelvenster experiment beheer. De gegevens worden nog steeds opgeslagen in de Cloud-database, en kunnen nog steeds later worden weergegeven in de real-time gegevens paneel van het dashboard, of gedownload voor offline analyse.
- Verwijder flacons van slimme mouwen en plaats ze in een autoclaaf rek om overflows te voorkomen in de daaropvolgende stappen.
- Schroef de media input lijnen van de media flessen en plaats ze in het bekerglas van 10% bleekmiddel. Run pompen van de evolver User Interface als in de Setup te steriliseren lijnen en flacons.
- Koppellijnen uit flacons en dompel lijnen in DI water. Run pompen te spoelen alle bleekmiddel uit het systeem eerst met DI water, dan met lucht.
- Schakel evolver uit door eerst de 12 V voeding uit te schakelen, 5 s te wachten en vervolgens de 5 V voeding uit te zetten.
- Soak roer staven en doppen in 10% bleekmiddel, dan spoelen met DI water. Zorg ervoor dat de instroom en Efflux stropen van elke dop spoelen door het uitvoeren van DI water door hen heen. Scrub flacons met behulp van reageerbuis borstel als film heeft gevormd op de muren.
- Afvalstoffen adequaat verwijderen en afvalcontainers grondig afspoelen.
Let op: Afvalcontainers zal bevatten een mengsel van 10% bleekmiddel, gesteriliseerd cel cultuur afval, en sporen van ethanol. Raadpleeg een veiligheidscoördinator voor een goede afhandeling en verwijdering.
7. kwantificeren Fitness met behulp van flow Cytometry analyse van de fractionele populaties
- Analyseer verzamelde steekproeven van sectie 5 gebruikend een stroom cytometer die met het aangewezen fluorescentie kanaal en de Detectors wordt uitgerust16.
- Verwerven van ten minste 10.000 evenementen per monster, en poort voor intacte cellen met behulp van de voorwaartse en zijkant Scatter data.
- Poort op basis van het juiste fluorescentie kanaal (bijv. GFP) om de fractionele verdeling van elke populatie te bepalen.
- Op een computer, gegevens opslaan op de gewenste locatie van de experiment Manager pagina door te klikken op de "export" knop.
- Van de evolver gegevensbestanden, bepalen het aantal generaties voltooid door elke timepoint voor elke flacon. In de evolver-code, generaties worden berekend door eerst het segmenteren van de OD-gegevens tussen elke verdunning evenement, dan is elk segment is geschikt met een fundamentele
exponentiële van de vorm aan elk segment, waardoor r, de groeisnelheid16. Het aantal generaties over een periode wordt vervolgens berekend aan de hand van de volgende formule:
- Plot de log-ratio van de geëtiketteerde en ongelabelde populaties uit de flow Cytometry data VS Generation nummer van de bovenstaande berekeningen op het moment monsters werden genomen. Identificeer de lineaire regio en past de helling volgens de volgende vergelijking. Deze helling wordt vaak gedefinieerd als de concurrerende fitness18,19.
exponentiële van de vorm aan elk segment, waardoor r, de groeisnelheid16. Het aantal generaties over een periode wordt vervolgens berekend aan de hand van de volgende formule:
Representative Results
Het hier beschreven protocol werd gebruikt om fitness kaarten te construeren voor genetische varianten van S. cerevisiae over een twee-dimensionale stress gradiënt van temperatuur en zoutgehalte. Specifiek, voor elke variant variëteit, gebruikten we evolver om paarsgewijs wedstrijd experimenten uit te voeren tegen een fluorescerend gelabelde referentiestam (S. cerevisiae strain BY4741 met een geïntegreerde constitutieve mNeonGreen Reporter) in 16 verschillende combinaties van deze spanningen (Figuur 1). Voor varianten werden twee knock-out stammen geselecteerd elk voorspelde gevoelig te zijn voor een van de stress voorwaarde assen: ΔPRX1 waarvan is gemeld dat fitness gebreken in hoge temperaturen hebben20 en ΔPBS2 met fitness gebreken bij hoge zoute concentraties21. Als controle variant werd een ongelabelde wild-type BY4741 stam gebruikt, die naar verwachting op dezelfde wijze zou presteren als de referentiestam. In totaal werden deze 3 72-uur competitie experimenten uitgevoerd gelijktijdig in 48 flacons over drie evolver (16-flacon) apparaten die allemaal vanaf een enkele computer.
Het interactieve dashboard evolver wordt gebruikt om te navigeren in de grote hoeveelheid gegevens die tijdens elk experiment wordt gegenereerd (Figuur 2a). Representatieve OD sporen over alle 16 flacons van een enkele evolver apparaat worden weergegeven in Figuur 2b. Elk spoor toont een karakteristiek zaagtand patroon van het turbidostat controlealgoritme, dat feedback op OD gebruikt om verdunningen teweeg te brengen en culturen in een smalle dichtheids waaier (0.2-0.3 in dit geval) te handhaven. OD en temperatuur gegevens worden continu gemeten, gestreamd naar de Cloud-enabled database, en bijgewerkt in real-time in de evolver Interactive dashboard. Van continu gestreamde gegevens, hogere-orde metrieken (bijv. groeipercentage, cumulatieve generaties) kunnen worden berekend en uitgezet in het dashboard (figuur 2c) en zelfs gebruikt als feedback parameters in verschillende selectie schema's (bijv. morbidostat).
Voor het genereren van fitness kaarten, meten we de snelheid waarmee de referentiestam overconcurreert de variant stam door de integratie van zowel flow Cytometry metingen en groei van de evolutie gegevens. Specifiek, worden de bevolkings fracties berekend als logboek-verhouding van variant spanning over verwijzingsspanning gebruikend Stroom Cytometry gegevens van elk timepoint steekproef. Voor elke cultuur en tijdpunt, is het verstreken aantal generaties geïnterpoleerd van evolver groeicijfers gegevens in elke verdunning periode. Het plotten van de log-ratio's tegen generaties, kwalitatieve verschillen tussen de voorwaarden beginnen te ontstaan (Figuur 3a). Om de geschiktheid te berekenen, past een helling door het lineaire gedeelte van elk perceel18,19, dat een kwantitatieve geschiktheids waarde (met zowel teken als tarief) oplevert die beschrijft hoe de variant spanning tegen de verwijzingsspanning concurreert ( Figuur 3B). In dit experiment, negatieve conditie waarden geven aan dat de variant stam wordt overconcurreerd door de referentiestam. Het construeren van Heatmaps van alle geschiktheids berekeningen laat visualisatie van het twee-dimensionale geschiktheids landschap toe, onthullend subtiele kwantitatieve verschillen in prestaties tussen spanningen en voorwaarden (figuur 3c).
Uit de fitness Heatmaps, zien we dat elke variant stam vertoont fitness gebreken die zich manifesteren op verschillende manieren. ΔPRX1 is vooral gevoelig voor hoge temperaturen, maar zout stress lijkt te hebben een additief effect, het verhogen van de fitness defect. Omgekeerd, ΔPBS2 toont fitness gebreken in de eerste plaats in reactie op hoge zoutconcentraties, met minimale verschillen langs de temperatuur as. Deze resultaten markeren het nut van hoge-resolutie selectie experimenten in het bijzonder voor het ontcijferen van interacties van meerdere milieu-stressoren, die zou kunnen hebben additief, synergetische of epistatic effecten.
Ten slotte is het belangrijk op te merken dat in sommige gevallen, met name voor ernstige stressomstandigheden, fitness berekeningen kan leiden tot overdreven of scheef resultaten. Bijvoorbeeld, ΔPBS2 blijkt een steile positieve helling in de 39 °c/1 M NaCl toestand ten opzichte van de referentie-stam (Figuur 3a) te tonen. Dit wordt toegeschreven aan een slechte groei van beide stammen, die wordt weerspiegeld in het wild type gegevens en beperkt het nut van deze specifieke metriek in deze voorwaarde. Een ontoereikend aantal generaties resulteert in 1) slechte scheiding van Timepoints die interfereert met helling fitting, en 2) gevoeligheid voor stochastische effecten die voortkomen uit vertragings fase. Hoewel we niet verkozen om dit te doen in deze studie, de real-time groei gegevens verzameld door evolver tijdens het experiment had kunnen worden gebruikt om de beslissing om het experiment uit te breiden en het verzamelen van extra Timepoints voor deze aandoening met weinig inspanning te informeren. Bij vervolgexperimenten kunnen ook start ratio's worden gemoduleerd om de lengte van het lineaire gebied uit te breiden voordat de verzadiging optreedt.
Figuur 1: overzicht van het evolver Framework en experimenteel ontwerp. (A) evolver is een geautomatiseerd, ononderbroken cultuur platform dat multiparameter controle van cultuurvoorwaarden toestaat. Het platform bestaat uit slimme mouwen, die het huis van de sensoren en actuatoren voor het controleren van de cultuur voorwaarden, een peristaltische pomp array voor stromende media en afval in en uit de culturen, een touchscreen voor de interactie handmatig met het apparaat, en een computer gebruikt voor de interactie met de Cloud-infrastructuur waar de gegevens van het platform wordt gestreamd. (B) evolver kan worden geconfigureerd op meerdere manieren: fysiek, via cel-en media-ingangen, en programmatisch door het aanpassen van de algoritmen controle slimme mouw cultuur flacon modules. Dit kan worden gebruikt voor het programma multidimensionale selectie/milieu gradiënten bij hoge-resolutie, met uitgangen bestaande uit fysiek verzamelde cellen op bepaalde tijdstippen en real-time streaming van cultuur gegevens. (C) het configureren van evolver om een groei fitness experiment te voeren over een twee-dimensionale selectie gradiënt, samengesteld uit temperatuur en osmotische stress. Evolver cultuur flacons werden gezaaid met gelijke proporties van een referentie-en variant gist stam. Een turbidostat routine werd geprogrammeerd om alle culturen in exponentiële fase in een bepaald OD-venster (OD 0.2-0.3) te handhaven. Temperatuur en media voorwaarden werden gevarieerd over de Smart Sleeve array te vormen twee onafhankelijke stress gradiënten. Base media is samengesteld uit YPD (2% glucose) + 100 µ g/mL carbenicilline + 25 µ g/mL chlooramfenicol als voorzorgsmaatregel tegen bacteriële besmetting. De media samenstellingen werden gevarieerd door supplementaire NaCl toe te voegen aan 0 M, 0,6 M, 0,8 M, of 1,0 M. flacon temperaturen werden geprogrammeerd om een van de vier waarden: 30 ° c, 35 ° c, 37 ° c, of 39 ° c. Dvoorbeelden van ruwe output voor cultuur od en bevolkings fracties uit drie geteste omstandigheden. De wedstrijd experiment werd gehandhaafd voor 72 h, bemonstering op 24 uur en vervolgens elke 12 uur tot de afsluiting van het experiment. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: evolver real-time data analyse dashboard. (A) evolver gegevens worden verwerkt en in real time gestreamd via Cloud-based software naar een interactief dashboard. Via het dashboard, kunnen gebruikers definiëren en initiëren hun eigen cultuur routines op een aangesloten evolver, monitor momenteel lopende experimenten in alle evolver eenheden, en variëren experimentele omstandigheden handmatig op een individuele flacon of een set van flacons indien nodig. (B) od sporen voor elke flacon over de matrix van de voorwaarden getest voor de gehele duur van het experiment. Traces kunnen worden bekeken in real-time om ervoor te zorgen experiment wordt uitgevoerd als gewenst en gebruikt post-experiment voor verdere analyse. (C) de groeicijfers en de generaties van de cel kunnen van od sporen op de vlieg worden berekend om experiment vooruitgang te volgen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Bouw van fitness oppervlakken. (A) cel populatie fracties natuurlijke log (variant stam/referentiestam) uitgezet tegen de generaties van de cel. Kleur geeft de temperatuur van de selectie, terwijl streepjes onderscheiden zoutconcentraties. (B) om relatieve geschiktheid van de variant aan de verwijzingsspanning te kwantificeren, wordt een geschiktheids metriek afgeleid uit de snelheid waarmee de cellulaire bevolkings Fractie over generaties verandert. Deze metriek wordt berekend uit het lineaire gebied van de cellulaire breuk percelen met een minimum van drie punten. (C) de relatieve geschiktheids metriek worden getoond in een Heatmap om een geschiktheids oppervlakte over de milieu spannings gradiënten te construeren. De hoogste juiste hoek voorwaarde (39 °C/1.0 M NaCl) voor het wilde type en ΔPBS2 zijn niet inbegrepen in deze analyse aangezien de culturen door ontoereikende generaties gingen (Zie representatieve resultaten). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
De selectie van de groei is een onontbeerlijk hulpmiddel in biologie, die globaal wordt gebruikt om fenotypische verschillen tussen cellulaire bevolking te produceren en te kenmerken. Terwijl de partij culturen de selectie van de groei op een beperkte manier toelaten, breiden de ononderbroken cultuurtechnieken dramatisch de graad van controle en voorspelbaarheid van deze experimenten uit, door nauwkeurige regelgeving over de vorm en de dynamica van selectie uit te oefenen om te produceren herhaalbare, kwantitatieve resultaten22. Continue cultuur is aangewend om de selectie voor High-Diversity libraries20,23,24,25te controleren en geavanceerde adaptieve regimes te implementeren in experimentele en geregisseerde evolutie11,12,26,27. Continue cultuur maakt het ook mogelijk nauwkeurige karakterisering van cellen in een array van kwantitatief gecontroleerde omstandigheden beter te begrijpen complexe genetische systemen en optimaliseren van gemanipuleerde bioproductie stammen9,14 , 28.
Nochtans, is er geen universeel protocol voor ononderbroken cultuur, aangezien de subtiele veranderingen in de selectieve voorwaarden tot dramatische veranderingen in biologische resultaten4,29,30kunnen leiden. Experimenters moeten kunnen kiezen tussen selectie regimes en experimentele protocollen en apparatuur dienovereenkomstig aan te passen. Naast het aanbieden van een keuze tussen controle parameters, zouden dergelijke systemen idealiter worden verfijnd genoeg om zelfstandig meerdere parameters gelijktijdig te beheren in zeer parallelle experimenten die nodig zijn om de interactie te ontcijferen ingangen in complexe biologische systemen (bijv. epistasis). Evolver richt deze uitdaging door gebruikers in staat te stellen willekeurig programma feedback controle tussen cultuur voorwaarden en vloeiende functies met het oog op zeer gespecialiseerde milieu-niches te specificeren.
Om beperkingen in de huidige opstelling te overwinnen en controleparameters uit te breiden of te veranderen, kon de slimme koker gemakkelijk worden herontworpen om nieuwe sensoren of actuators toe te voegen. Bovendien, het verminderen van flacon volume zou verminderen media-uitgaven, die kunnen worden significant in continue cultuur. Terwijl het huidige ontwerp de meting en de controle van temperatuur, cultuur agitatie, lichte inductie, troebelheid, en microfluïdica toelaat, moeten andere parameters extern door bemonstering van de flacons worden gemeten. Het huidige werk omvat het opnemen van de capaciteit om enzymatische activiteit via Luciferase te controleren en opgeloste zuurstof en pH direct in evolver culturen te regelen. Bovendien, hoewel niet aangetoond in dit werk, kan evolver interface met nieuwe millifluidic multiplexing apparaten16 die putten uit de beginselen van grootschalige integratie (afkomstig van elektronica en goedgekeurd door microfluidics) om goedkoop mogelijk complexere vloeiende behandeling (bijv. Multiplexed vloeibare ingangen, flacon-naar-flacon transfers). Deze wetware modules kunnen worden ontworpen en volledig vervaardigd in het lab, zodat gebruikers vloeistoffen route door programmatisch bediening van verschillende combinaties van kleppen in geautomatiseerde vloeibare routines. Dit staat gebruikers toe om de stijve vloeibare ontwerpen te overwinnen die traditioneel in ononderbroken cultuur worden gebruikt, maar ook om vloeibare capaciteiten aan hoge productie met een kleiner aantal dure controleelementen (b.v. peristaltische pompen) te schalen. Ten slotte, hopen wij om een autosampling platform op te nemen dat deze millifluidics en DIY componenten zal gebruiken, die de beperking van hand interactie tijdens langere en grotere experimenten overwinnen waar de bemonstering culturen omslachtig zouden zijn.
Naast fysieke aanpassingen aan het platform, opent de web-based software nieuwe graden van vrijheid door gebruikers toe te staan om aangepaste evolver manuscripten te schrijven, te bewerken en te delen, die volledig geautomatiseerde, feedback-toegelaten cultuurprogramma's produceren (b.v., turbidostat). Gebruikers kunnen programmatisch over parameter bereik vegen in subtiele variaties op hetzelfde selectie schema of besturingsalgoritmen in nieuwe combinaties aansluiten om een willekeurig aantal geavanceerde selectie schema's op te geven. Bovendien is de mogelijkheid om gemakkelijk te monitoren culturen in real-time transformeert de manier waarop experimenten worden uitgevoerd. Met real-time monitoring, kunnen gebruikers 1) controleren op consistentie tussen runs, een kritieke functie voor bioproductie toepassingen en high-throughput experimenten, en 2) in te grijpen tijdens experimenten, indien nodig, om problemen op te lossen uitdagende stammen die vertonen slechte groei of biofilm vorming, of diagnose van gebruikersfouten (bijv. verontreiniging). Ten slotte, met meerdere datastromen worden verzameld en geïnterpreteerd in real-time voor elke individuele cultuur, evolver genereert een hoge dichtheid van de gegevens, die kunnen vergemakkelijken machine learning benaderingen voor nieuwe downstream-analyse.
Beyond aangetoond gebruik voor fitness karakterisering, bibliotheek selectie, en laboratorium evolutie, zien we een aantal aanverwante gebieden als rijp voor de uitvoering in evolver met geïntegreerde microfluïdica. evolver experimenten met microbiome monsters kunnen testen Gemeenschap stabiliteit in gecontroleerde omgevingen31,32, verkennen microbiota samenstelling met behulp van culturomics technieken33, of dynamisch mix soorten om ondervragen ecologische dynamiek van de kolonisatie of invasie34,35. Tal van methoden voor continue gerichte evolutie van biomoleculen kan gemakkelijk worden geïmplementeerd op het apparaat en26,36,37, sterk toenemende toegankelijkheid en throughput van deze systemen. De capaciteit om het kweken van voorwaarden zoals media samenstelling, temperatuur, en spanningen in een dynamische, hoge productie aard te optimaliseren kan helpen in optimaliserings inspanningen voor industriële biomanufacturing toepassingen9. We hebben verder voor ogen verticaal integreren evolver met andere analysetechnieken zoals microscopie en flow Cytometry in een closed loop mode, het verstrekken van een volledig geautomatiseerd systeem voor groei en analyse van cellulaire culturen op zowel enkele cel en de bevolking Niveaus. Bovendien, met een aantal hardware modificaties aan de slimme mouw, zoals het verzegelen van het schip en het controleren van het gas-gehalte, kan evolver mogelijk worden aangepast aan de groei van een breder scala van soorten cellen, zoals schorsing zoogdiercellen te ondersteunen. Het is ook haalbaar om het gehele kader in een anaërobe kamer voor de anaërobe cultuur van de cel te plaatsen. Vooruitblikkend, streven wij ernaar om onze software Framework te bouwen in een gecentraliseerde Cloud-infrastructuur en geloven dat dit zou gebruikers in staat stellen om eenvoudig te configureren, analyseren en delen van hun gegevens op afstand, zonder fysiek aanwezig te zijn in het lab. De Cloud-infrastructuur, die als curator fungeert, leent zich ook voor grootschalige meta-analyses in experimenten. We verwachten dat evolver en deze toekomstige voorschotten zal sterk uitbreiden van de reikwijdte van mogelijke groei selectie experimenten door het vergemakkelijken van automatisering en innovatie in continue cultuur.
Disclosures
De auteurs, Brandon G. Wong en Ahmad S. Khalil, zijn mede-oprichters van Fynch Bioscience Inc, die het evolver platform gebruikt in dit artikel ontwikkelt.
Acknowledgments
Wij danken B. Stafford voor zijn hulp in het ontwerp van het systeem, en H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. pipe, en A. Cavale voor hulp bij de bouw van het systeem. Wij erkennen de electronica design Facility (EDF), engineering Product Innovation Center (EPIC), en de software & Application Innovation Lab (SAIL) bij het Hariri Institute for computing aan de Boston University voor hun diensten. Dit werk werd ondersteund door een NSF CAREer Award (MCB-1350949 tot Ask), en de HR0011-15-C-0091 en HR0011-18-2-0014 (aan Ask). Ask erkent ook de financiering van de nieuwe innovator van de NIH-directeur Award (1DP2AI131083-01), de "de" "de" D16AP00142, en NSF expedities in Computing (1522074).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Gallon Plastic Hedpack with cap | Midwest Brewing and Winemaking Supplies | 45-56Y8-E2FR | For waste collection |
| a-D(+)-Glucose | Chem-Impex | 00805 | For YPD Medium |
| Attune NxT Autosampler | Thermo Fisher | Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher | Used to determine population fractions via single cell fluoresence | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-0 | For YPD Medium |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648250 | For YPD Medium |
| Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature | McMaster- Carr | 5121K731 | For media input branching |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | For YPD Medium |
| CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 | Fisher Scientific | 50371500 | For Sterilization of fluidic lines |
| Custom eVOLVER vial lid | FynchBio | Lid has ports for sampling and fluidic input/output | |
| Cycloheximide | Fisher Scientific | ICN10018301 | For flow cytometry sampling plates |
| Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | For sterilization of fluidic lines |
| eVOLVER Unit | FynchBio | ||
| Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-420 | For vial sampling |
| Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars | Fisher Scientific | 14-513-57 | Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm |
| Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap | Fisher Scientific | FB8002000 | Must be fitted with tubing |
| High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD | McMaster- Carr | 51135K73 | For media bottles |
| Mac Mini | Apple | For running the experiment/collecting data | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP243820 | For flow cytometry sampling plates |
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K141 | For media bottles |
| Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K144 | For media bottles |
| Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K291 | For media bottles |
| Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K294 | For media bottles |
| SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN | Chemglass | CG-4910-04 | Culture vials |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fsher Scientific | S271-3 | For YPD Medium |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | For measuring OD600 of overnight cell cultures | |
| Vial Only, Sample, 40 mL, Clear, 28 mm x95 mm, GPI 24-400 | Chemglass | CG-4902-08 | Culture vials |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | For YPD Medium |
References
- Monod, J. The Growth of Bacterial Cultures. Annual Review of Microbiology. , (1949).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 36 (12), 708-719 (1950).
- Bull, A. T. The renaissance of continuous culture in the post-genomics age. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 37 (10), 993-1021 (2010).
- Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
- Lang, G. I., et al. Pervasive genetic hitchhiking and clonal interference in forty evolving yeast populations. Nature. 500 (7464), 571-574 (2013).
- Maddamsetti, R., et al. Adaptation, Clonal Interference, and Frequency-Dependent Interactions in a Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. Genetics. 200 (2), 619-631 (2015).
- Ishii, N., et al. Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations. Science. 316 (5824), 593-597 (2007).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of Growth Rate, Cell Cycle, Stress Response, and Metabolic Activity in Yeast. Molecular Biology of the Cell. 19 (1), 352-367 (2008).
- Moser, F., et al. Genetic circuit performance under conditions relevant for industrial bioreactors. ACS Synthetic Biology. 1 (11), 555-564 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nature Genetics. 40 (12), 1499-1504 (2008).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. -B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44 (1), 101-105 (2011).
- Hope, E. A., Amorosi, C. J., Miller, A. W., Dang, K., Heil, C. S., Dunham, M. J. Experimental Evolution Reveals Favored Adaptive Routes to Cell Aggregation in Yeast. Genetics. 206 (2), 1153-1167 (2017).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. Journal of Visualized Experiments. (72), 2-7 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. 4 (1), 32-38 (2015).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
- Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
- Bondi, A. B. Characteristics of scalability and their impact on performance. Proceedings of the Second International Workshop on Software and Performance - WOSP ’00. , 195-203 (2000).
- Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology. Journal of Visualized Experiments. (80), e50168 (2013).
- Sanchez, M. R., et al. Differential paralog divergence modulates genome evolution across yeast species. PLOS Genetics. 13 (2), e1006585 (2017).
- Gibney, P. A., Lu, C., Caudy, A. A., Hess, D. C., Botstein, D. Yeast metabolic and signaling genes are required for heat-shock survival and have little overlap with the heat-induced genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), E4393-E4402 (2013).
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418 (6896), 387-391 (2002).
- Piper, M. D. W., et al. Reproducibility of oligonucleotide microarray transcriptome analyses. An interlaboratory comparison using chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 277 (40), 37001-37008 (2002).
- Badarinarayana, V., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature Biotechnology. 19 (11), 1060-1065 (2001).
- Dai, J., Hyland, E. M., Yuan, D. S., Huang, H., Bader, J. S., Boeke, J. D. Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile. Library of Synthetic Histone H3 and H4. 134 (6), 1066-1078 (2008).
- McGeachy, A. M., Meacham, Z. A., Ingolia, N. An Accessible Continuous-Culture Turbidostat for Pooled Analysis of Complex Libraries. bioRxiv. , 450536 (2018).
- Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
- Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nature Chemical Biology. 10 (3), 216-222 (2014).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (May), 12546 (2016).
- Wenger, J. W., Piotrowski, J., Nagarajan, S., Chiotti, K., Sherlock, G., Rosenzweig, F. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genetics. 7 (8), e1002202 (2011).
- Yona, A. H., et al. Chromosomal duplication is a transient evolutionary solution to stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 21010-21015 (2012).
- Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3, 42 (2015).
- Goldford, J. E., et al. Emergent simplicity in microbial community assembly. Science. 361 (6401), 469-474 (2018).
- Lagier, J. -C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. Culturing the human microbiota and culturomics. Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).
- Fukami, T. Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).
- Friedman, J., Gore, J. Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations. Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).
- Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. M., Schmitz, A., Alper, H. S. In vivo continuous evolution of genes and pathways in yeast. Nature Communications. 7, 13051 (2016).
- Ravikumar, A., et al. Scalable, Continuous Evolution of Genes at Mutation Rates above Genomic Error Thresholds. Cell. 175, (2018).
