Summary
I denne undersøgelse forbedrede vi dataanalyse mulighederne i dart eksperimentet ved at overvåge ændringerne i protein stabiliteten og anslå affiniteten af protein-ligand-interaktioner. Samspillet kan afbildes i to kurver: en proteolytisk kurve og en dosis afhængigheds kurve. Vi har brugt mTOR-Rapamycin interaktion som et eksemplarisk tilfælde.
Abstract
Drug affinitet lydhør Target stabilitet (dart) er en robust metode til påvisning af nye små molekyle protein mål. Det kan bruges til at verificere kendte små molekyle-protein interaktioner og til at finde potentielle protein mål for naturlige produkter. Sammenlignet med andre metoder bruger dart indfødte, umodificerede, små molekyler og er enkel og nem at betjene. I denne undersøgelse forbedrede vi yderligere dataanalyse mulighederne i dart eksperimentet ved at overvåge ændringerne i protein stabiliteten og vurdere affiniteten af protein-ligand-interaktioner. Proteinet-ligand-interaktioner kan afbildes i to kurver: en proteolytisk kurve og en dosis afhængigheds kurve. Vi har brugt mTOR-Rapamycin interaktion som en eksemplarisk sag for etablering af vores protokol. Fra den proteolytiske kurve så vi, at proteolysen af mTOR ved pronasen blev hæmmet af tilstedeværelsen af Rapamycin. Dosis-afhængigheds kurven gjorde det muligt for os at estimere den bindende affinitet af Rapamycin og mTOR. Denne metode er sandsynligvis en kraftfuld og enkel metode til præcist at identificere nye målproteiner og til optimering af Drug Target engagement.
Introduction
Identifikation af små molekyle målproteiner er afgørende for den mekanistiske forståelse og udvikling af potentielle terapeutiske stoffer1,2,3. Affinitets kromatografi, som en klassisk metode til at identificere målproteiner af små molekyler, har givet gode resultater4,5. Men denne metode har begrænsninger, i at kemisk modifikation af små molekyler ofte resulterer i reduceret eller ændret bindende specificitet eller affinitet. For at overvinde disse begrænsninger, er flere nye strategier for nylig blevet udviklet og anvendt til at identificere de små molekyle mål uden kemisk modifikation af de små molekyler. Disse direkte metoder til identifikation af etiket frie små molekyler omfatter Drug affinitet lydhør Target stabilitet (dart)6, stabilitet af proteiner fra oxidations hastigheder (sprox)7, cellulære termisk Shift assay (cetsa)8 ,9og termisk proteom profilering (TPP)10. Disse metoder er meget fordelagtige, fordi de bruger naturlige, umodificerede små molekyler og kun stole på direkte bindende interaktioner for at finde Target proteiner11.
Blandt disse nye metoder, dart er en forholdsvis enkel metode, der nemt kan vedtages af de fleste Labs12,13. DART afhænger af konceptet om, at ligand-bundne proteiner udviser modificeret modtagelighed for Enzymatisk nedbrydning i forhold til ubundne proteiner. Det nye målprotein kan påvises ved undersøgelse af det ændrede bånd i SDS-PAGE gel gennem væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS/MS). Denne tilgang er blevet gennemført med succes for at identificere tidligere ukendte mål for naturlige produkter og narkotika14,15,16,17,18, 19. det er også kraftfuld som et middel til at screene eller validere binding af forbindelser til et bestemt protein20,21. I denne undersøgelse præsenterer vi en forbedring af eksperimentet ved at overvåge ændringerne i protein stabiliteten med små molekyler og identificere protein-ligand bindende tilhørsforhold. Vi bruger mTOR-Rapamycin interaktion som et eksempel for at demonstrere vores tilgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Saml og lyse celler
- Grow 293T celler ved hjælp af Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) med 10% føtal kvægserum, 2 mM glutamin og 1% antibiotika. Inkuber kulturer ved 37 °C under 5% CO2.
Bemærk: cellernes vækst tilstand kan påvirke stabiliteten af efterfølgende eksperimenter. - Udvid cellerne i kulturen, indtil de når 80 \ u201290% sammenløbet.
- Bland 345 μL cellelyse reagens (Se tabel over materialer) med 25 μl 20x proteasehæmmer cocktail, 25 μl 1 M natriumfluorid, 50 μL af 100 mm β-glycerophosphat, 50 μl 50 mm natriumpyrophosphat og 5 ΜL 200 mm natriumorthovanadat. Opbevar lyse bufferen kølet på is.
Bemærk: andre lyse buffere med forskellige rengøringsmidler (f. eks. Triton X-100 eller NP-40) kan bruges med dart, så længe de ikke er denatureret. Membran proteiner eller nukleare proteiner kan ekstraheres ved at tilføje 0,4% Triton X-100 eller 0,4% NP-40 til celle lysatet. - Cellerne vaskes to gange med kold fosfat-bufferet saltvand (PBS).
- Brug en celle skraber til at samle cellerne i en passende mængde cellelyse buffer og overføre de lyserende celler til et 1,5 mL rør.
Bemærk: antallet af celler, der skal bruges til hvert dart eksperiment, varierer, afhængigt af hvor meget protein der kan udvindes fra forskellige cellelinjer. Generelt er proteinkoncentrationen af det anvendte lysat mellem 4 \ u20126 μg/μL. 1 10 cm plade af 293t celler ved 85 \ u201290% konfluency, lyseres med 300 μl lysis buffer typisk resulterer i et lysat med en proteinkoncentration på ~ 5 μg/μl. - Bland lyse stødpude/Lysing celler godt og inkubere røret på is i 10 min.
- Centrifugeglasset centrifugeres ved 18.000 × g i 10 minutter ved 4 °c.
- Supernatanten overføres til et nyt 1,5 mL rør og holdes afkølet på is.
- Udføre en BCA assay til at tilnærme proteinkoncentrationen af lysates.
2. incubate protein lysater med det lille molekyle
- Der opdeles 99 μL af lysaterne i to 1,5 mL rør.
- Lav en startlager koncentration på 10 mM lille molekyle. Når du udfører dart, kan man begynde med en højere koncentration af det lille molekyle (5 \ u201210x EC50 værdi) for at sikre optimal binding.
- Tilsæt enten 1 μL solvens, som det lille molekyle er opløseligt i eller 1 μL små molekyle stamopløsninger til hver alikvot lysat. Inkuber celle lysat med opløsninger til 30 \ u201260 min ved stuetemperatur med rystning.
- På is, fastsætte serielle fortyndinger (1:200, 1:400, 1:800 og 1:1600) af frisk optøet pronasen opløsning i 1x Tnc (for 1 ml 10x Tnc buffer, bland 300 μl ultrarent vand med 100 μl af 5 m natriumchlorid, 100 μl af 1 m calciumklorid og 500 μL af 1 M Tris-HCl, pH 8,0).
- Undersøg en bred vifte af pronasen: protein nøgletal (f. eks. spænder fra 1:100 til 1:2000) for at sikre Observer barhed af den trinvise virkning af pronasen på Target (s).
Bemærk: for at beregne pronasekoncentrationen (eksempel): 5 μg/μL proteinkoncentration x 20 μL prøve = 100 μg protein. For en pronasen: protein ratio på 1:100 vi har brug for 0,5 μg/μL (100 μg ÷ 100 ÷ 2 μL) pronasen opløsning. Dette eksperiment skal muligvis gentages flere gange for at opnå et passende udvalg af pronase: protein nøgletal.
3. Udfør proteolyse
Bemærk: for proteolyse udføres der trin ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet
- Efter inkubation med det lille molekyle opdeles hver alikvot i 20 μL prøver.
- Tilsæt 2 μL af rækken af pronaseopløsninger i hver prøve med bestemte intervaller (hver 30 s). Brug en tilsvarende mængde 1x TNC buffer til at etablere en ufordøjet kontrolprøve.
- Efter 5 \ u201220 min, standse fordøjelsen via tilsætning af 2 μL kold 20x proteasehæmmer cocktail hver 30 s. Bland godt og inkubere på is i 10 min.
- Fortyndede prøver med en passende volumen på 5x SDS-side loading buffer og kog ved 95 °C i 5 min.
- Udfør den næste del af forsøget, eller Opbevar protein prøven ved − 80 °C.
4. kvantificering og analyse
- Efter dart, udføre Coomassie blå farvning i henhold til den tidligere offentliggjorte protokol22.
- De farvede protein bånd bør være meget klare efter at have defartet. Hæld den brugte destain opløsning af og tilsæt frisk 1% eddikesyre opløsning til at dække gelen. Sæt gelen under lyset for at observere båndene med signifikante forskelle mellem grupperne med (prøvegruppe) eller uden (kontrolgruppe) det lille molekyle.
- Skær de to tilsvarende bånd fra gelen med et sterilt instrument, og Udfør straks LC-MS/MS.
Bemærk: LC-MS/MS skal gøres så hurtigt som muligt, fordi proteinerne i gelen vil nedbrydes kontinuerligt. - Fordøje båndene, uddrag peptider og udføre LC-MS/MS analyse23.
- Hvis du vil analysere LC-MS/MS-data, skal du først identificere alle proteinerne i det enkelte bånd. For det andet, bruge peptid Spectrum match (PSM) at repræsentere den overflod af hvert protein.
Bemærk: PSM giver det samlede antal identificerede peptidsekvenser for proteinet, herunder de identificerede redundant. Generelt, hvor ofte et peptid identificeres/sekvenserede kan bruges som en grov vurdering af, hvor rigeligt proteinet er i prøven. Proteiner beriget i prøvegruppen over kontrolgruppen er proteiner af interesse.
- Hvis du vil analysere LC-MS/MS-data, skal du først identificere alle proteinerne i det enkelte bånd. For det andet, bruge peptid Spectrum match (PSM) at repræsentere den overflod af hvert protein.
- Fremskaffe de primære antistoffer fra de valgte proteiner. Udfør Western blot for at kontrollere, at det lille molekyle kan binde direkte til de potentielle mål proteiner24.
- Læg lige store mængder protein i brøndene på en 8% SDS-SIDERS gel sammen med en passende molekylvægt markør. Kør gelen i 30 minutter ved 80 V, og juster derefter spændingen til 120 V og Fortsæt med at køre i 1 \ u20122 h.
- Kvantificere de forskellige målprotein bånd ved hjælp af billedbehandlings-og analyse software (Se tabellen over materialer).
- Analysér dataene, og tegn kurverne.
- Bestemmelse af den proteolytiske kurve for et målprotein
- Pronase: protein ratio er varieret, når der udføres proteolyse. Normaliser data fra billedanalyse ved at tildele de bånd intensitetsværdier, som svarer til de ikke-Ford øjede bånd, til 100%.
- Brug ikke-lineær regressionsanalyse af den statistiske analyse og tegnings software til at afbilde en kurve med normaliserede data for relativ bånd intensitet og pronase: protein nøgletal.
- Først skal du åbne softwaren, vælge den type tabel og graf som XY og tillade 3 replikere værdier i side-by-side under kolonner. Indtast derefter de tilsvarende data i rummet under x og y. Under x, indtaste numrene 0, 1, 2, 3, 4, 5 (som sted indehavere tilsvarende pronase: protein nøgletal).
- Angiv de normaliserede data for relative bånd intensiteter i kolonnen y. Udføre "ikke-lineær regression" og implementere en "dosis-respons-stimulation" ved hjælp af "log (agonist) versus respons — variabel hældning (fire parametre)" ligning.
- Konverter anmærkningerne af X-aksen i kurven til de tilsvarende pronase: protein nøgletal.
- Bestemmelse af dosis afhængigheds kurven for et målprotein
Bemærk: for dosis-afhængigheds analyse er det lille molekyle Molaritet forskellig på tværs af prøver. Det stabile pronase: protein ratio bør oplyses ved analyse af proteolyse data. Pronase: protein ratio, der viste maksimal forskel i målprotein intensitet under den proteolytiske kurve, bør anvendes til dosis afhængigheds forsøget.- Kvantificere de forskellige målprotein bånd ved hjælp af en billedanalyse software. Som i generation af dosis-afhængigheds kurven, normalisere data fra billedanalyse ved at tildele Bandet intensitet værdier svarende til den mindst fordøjet bånd til 100%.
- Anvend den ikke-lineære regressionsanalyse i den statistiske analyse og tegnings softwaren til de normaliserede data. Først skal du åbne softwaren, vælge typen af tabel og graf som XY, og indtaste 3 replikere værdier i side-by-side under kolonner.
- Indtast derefter de tilsvarende data i rummet under x og y. For variablen ' x ', input forskellige koncentrationer af det lille molekyle; ' y ' indeholder de tilsvarende normaliserede data for relativ bånd intensitet.
- Transformér x-værdier ved hjælp af X = log (X). Endelig, ansætte ikke-lineær regression, og gennemføre en dosis-respons stimulation ved hjælp af "log (agonist) versus respons — variabel hældning (fire parametre)" ligning.
- Bestemmelse af den proteolytiske kurve for et målprotein
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimentets flowdiagram er skitseret i figur 1. Resultatet af Coomassie blå farvning er vist i figur 2. Inkubation med det lille molekyle giver beskyttelse mod proteolyse. Tre bands, der synes at være beskyttet af inkubation med Rapamycin over køretøjets kontrol er fundet. De forventede resultater fra proteolytisk kurve eksperiment er vist i figur 3. Som en proof-of-princip, vi undersøgte den godt studeret protein mTOR, som er målet for lægemidlet Rapamycin25. Western blotting illustrerer tilstedeværelsen af mTOR protein ved lav pronase: protein nøgletal og dets reduktion og tab med stigende nøgletal (figur 3A). Proteolyse af mTOR ved pronasen er klart hæmmet af tilstedeværelsen af Rapamycin og tilsætning af Rapamycin genererer en indlysende forskydning i den proteolytiske kurve (figur 3B). For at undersøge virkningerne af Drug koncentration, vi opretholdt en konstant pronase: protein ratio mens varierende koncentrationer af Rapamycin. Som ligand koncentration nærmer sig Target bindende mætning, en øget tilstedeværelse af målprotein observeres. Rapamycin-dosis-afhængigt forbedret niveauet af mTOR, hvilket tyder på den stigende stabilitet af mTOR med Rapamycin behandling (figur 4A). Kvantificering af målprotein bånd intensiteter giver mulighed for repræsentation af Target stabilitet som en funktion af ligand koncentration som eksemplificeret ved kurven i figur 4B. Disse resultater tyder kraftigt på, at mTOR er målet protein af Rapamycin.
Figur 1: skematisk af DART metoden for Drug Target semi-kvantitativ analyse. Celle lysat inkuberet i nærværelse af eller fravær af et lille molekyle, efterfulgt af proteolyse og proteinelektroforese. Beskyttede protein bånd er fjernet og udsat for massespektroskopi. Protein målene er identificeret som de proteiner, der viser øget proteaseresistens i nærværelse af det lille molekyle. Derefter bruges Western-blot til at identificere og semikvantitativt analysere målproteinerne. Data udtrykkes som middel ± standardafvigelse (SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempel på Coomassie blå farvning visualisering af dart med det lille molekyle Rapamycin. Røde prikker flanke de beskyttede bands. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: illustration af den resterende mængde mTOR, der er tilgængelig til påvisning som en funktion af pronase: protein ratio, som anvendes til behandling af 293T celle lysates. (A) beskyttelse af MTOR fra proteolyse ved Rapamycin blev evalueret af Western blot Analysis. B) intensiteten af MTOR-båndene blev kvantificeret ved hjælp af den statistiske analyse og tegnings softwaren. Linjen var udstyret med en fire-parameter logistisk kurve. Data blev indhentet fra de tre uafhængige eksperimenter og blev udtrykt som middelværdien ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: illustration af den mængde stabiliseret mTOR, som er tilgængelig til påvisning ved tilstedeværelse af stigende koncentrationer af Rapamycin. 293t celle lysater blev inkuberet med Rapamycin (0, 1, 10, 100, 1000, 10000 nm) i 1 time, derefter blev celle lysaterne udsat for fordøjelsen ved pronase: protein forholdet på 1:400. A) den stabiliserende virkning af Rapamycin på MTOR blev evalueret af Western blot. B) intensiteten af MTOR-båndene blev kvantificeret ved hjælp af den statistiske analyse og tegnings softwaren. Linjen var udstyret med en fire-parameter logistisk kurve. Data blev indhentet fra de tre uafhængige eksperimenter og blev udtrykt som middelværdien ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DART giver mulighed for identifikation af små molekyle mål ved at udnytte den beskyttende effekt af proteinbinding mod nedbrydning. DART kræver ingen kemisk modifikation eller immobilisering af det lille molekyle26. Dette gør det muligt at bruge små molekyler til at bestemme deres direkte bindende protein mål. Standard vurderingskriterier for den klassiske dart metode omfatter gel farvning, massespektrometri og Western blotting12,13. Den klassiske metodologi nævner også, at disse data kan analyseres kvantitativt, men der findes ikke et sådant eksempel. Her bruger vi principperne i den cellulære termiske Shift assay (CETSA) til semi-kvantitativt analysere data, og opnå parametre svarende til dem, der leveres af CESTA (TM og EC50), hvilket øger nytten af DART analyse8. Den ligand-Target interaktion kan plottet mod pronase: protein ratio til at vise indlysende forskydninger i proteolytiske kurver. Udførelse af proteolyse ved hjælp af forskellige pronasen: protein nøgletal kan hjælpe med at indsnævre koncentrationen af pronasen, der bør anvendes i downstream-eksperimenter. Yderligere, ved hjælp af den optimerede koncentration af pronase, proteolyse udført i nærværelse af forskellige koncentrationer af det lille molekyle kan give en indirekte måling af affiniteten af det lille molekyle med dets målprotein. Desuden giver generering af en dosis-afhængighed kurve mulighed for tilnærmelse af virkningerne på målproteiner afhængig af ligand koncentration. Inkludering af analytisk kapacitet til dosisafhængighed er en kraftig udvidelse af DART metoden; giver en enkel og hurtig tilgang til sondering den terapeutiske mekanisme af små molekyler. Denne gel-baserede tilgang er den nemmeste at implementere. Det kan bruges til high-gennemløb screening for forbindelser, der binder et bestemt protein20,27,28. Derudover kan dart udnyttes til at analysere ægte interaktioner med lav affinitet, fordi vask ikke er inkluderet som et eksperimentelt trin12,26. Sammenlignet med CETSA har dart desuden fordele ved at identificere målene for membran proteiner, da dart giver mulighed for en bedre vurdering af membran proteiner ved brug af milde, stabiliserende rengøringsmidler11.
Eksperimentet har også nogle begrænsninger. For det første, når cellen lysat har en lav overflod af målprotein, kan dart metoden ikke bruges til nemt at visualisere ændringer i proteolyse af målproteinet. Yderligere skridt til at koncentrere disse proteiner er nødvendige for at anvende denne metode. For det andet, vi kun teste Rapamycin/mTOR interaktion. Interaktionen er kendt for at være potent og stabil. Men nogle små molekyler kan binde til deres mål mindre selektivt, eller forbigående, og det er ikke klart, om sådanne små molekyler kan analyseres med denne analyse. For det tredje kan nogle målproteiner være ekstremt følsomme eller resistente over for de anvendte proteaser.
DART assay analyse giver mulighed for identifikation af potentielle protein interaktioner gennem vurdering af proteolytiske kurver genereret på tværs af en række pronase: protein nøgletal i nærværelse af eller fravær af en lille molekyle ligand. Spændende, vores ændringer til standard proceduremæssige skitse af DART analyse fremhæver kapaciteten af denne metode, der skal anvendes i generation af koncentration-respons kurve. Disse output er af særlig nytte i udviklingen af narkotika, hvilket gør det muligt at identificere mekanistisk relevante lægemiddelkoncentrationer. Desuden giver sammenligning af koncentrations-responskurver genereret ved hjælp af uensartede ligander indsigt i de komparative bindende tilhørsforhold for flere ligander af samme mål; en kapacitet potentielt nyttige i forudsigelse af små molekyle effektivitet og raffinement af dosering. Vi håber, at denne demonstration af udvidet analytisk magt dart vil være nyttige i udviklingen, gennemførelsen og forståelsen af små molekyle narkotika, især for ligander og mål vanskeligt at analysere ved hjælp af alternative tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af NIH Research Grants R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484 og et FORSVARS forskningsstipendium W81XWH-16-1-0482.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
- O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
- McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
- Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
- Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
- Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
- Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
- Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
- Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
- Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
- Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
- Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
- Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
- Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
- Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
- Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
- Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
- Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
- Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).
