Summary
In deze studie hebben we de mogelijkheden voor gegevensanalyse van het DARTS experiment verbeterd door de veranderingen in de eiwit stabiliteit te monitoren en de affiniteit van eiwit-ligand interacties te schatten. De interacties kunnen in twee krommen worden uitgezet: een Proteolytische curve en een Dosisafhankelijkheid. We hebben mTOR-rapamycine interactie gebruikt als een voorbeeldige zaak.
Abstract
Drug Affinity responsieve doel stabiliteit (DARTS) is een robuuste methode voor de detectie van nieuwe kleine molecuul eiwit targets. Het kan worden gebruikt om bekende kleine molecuul-eiwit interacties te controleren en om potentiële eiwit doelen voor natuurlijke producten te vinden. In vergelijking met andere methodes gebruikt DARTS native, ongewijzigde, kleine moleculen en is eenvoudig en eenvoudig te bedienen. In deze studie hebben we de mogelijkheden voor gegevensanalyse van het DARTS experiment verder verbeterd door de veranderingen in de eiwit stabiliteit te monitoren en de affiniteit van eiwit-ligand interacties te schatten. De eiwit-ligand interacties kunnen in twee krommen worden uitgezet: een Proteolytische curve en een dosis-afhankings curve. We hebben de interactie mTOR-rapamycine gebruikt als een voorbeeldige Case voor de totstandkoming van ons protocol. Uit de Proteolytische curve zagen we dat de proteolyse van mTOR door pronase werd geremd door de aanwezigheid van rapamycine. De dosis-afhankelijkheids curve stelde ons in staat om de bindingsaffiniteit van rapamycine en mTOR te schatten. Deze methode is waarschijnlijk een krachtige en eenvoudige methode voor het nauwkeurig identificeren van nieuwe doel eiwitten en voor de optimalisatie van de betrokkenheid van het doel van de drug.
Introduction
Identificeren van kleine molecule doelwit eiwitten is essentieel voor het mechanistische begrip en de ontwikkeling van potentiële therapeutische geneesmiddelen1,2,3. Affiniteits chromatografie, als een klassieke methode voor het identificeren van de doel eiwitten van kleine moleculen, heeft goede resultaten opgeleverd4,5. Echter, deze methode heeft beperkingen, in die chemische modificatie van kleine moleculen resulteert vaak in verminderde of veranderde bindende specificiteit of affiniteit. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn onlangs verschillende nieuwe strategieën ontwikkeld en toegepast om de kleine molecuul doelen te identificeren zonder chemische modificatie van de kleine moleculen. Deze directe methoden voor de identificatie van het label vrij kleine moleculen omvatten responsieve doel stabiliteit (DARTS)6, stabiliteit van eiwitten uit oxidatiemiddelen (sprox)7, cellulaire thermische verschuiving assay (cetsa)8 ,9, en thermische Proteoom profilering (TPP)10. Deze methoden zijn zeer voordelig omdat ze natuurlijke, ongewijzigde kleine moleculen gebruiken en alleen op directe bindende interacties vertrouwen om doel eiwitten11te vinden.
Onder deze nieuwe methoden, darts is een relatief eenvoudige methodologie die gemakkelijk kan worden overgenomen door de meeste Labs12,13. DARTS is afhankelijk van het concept dat ligand-gebonden eiwitten een gemodificeerde gevoeligheid voor enzymatische afbraak ten opzichte van ongebonden eiwitten aantonen. Het nieuwe doeleiwit kan worden gedetecteerd door onderzoek van de veranderde band in SDS-PAGE gel door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS/MS). Deze aanpak is met succes geïmplementeerd voor de identificatie van eerder onbekende doelwitten van natuurlijke producten en geneesmiddelen14,15,16,17,18, 19. het is ook krachtig als middel om te schermen of te valideren binding van verbindingen met een specifiek eiwit20,21. In deze studie presenteren we een verbetering van het experiment door het monitoren van de veranderingen in de eiwit stabiliteit met kleine moleculen en het identificeren van eiwit-ligand bindende verwantschappen. We gebruiken mTOR-rapamycine interactie als voorbeeld om onze aanpak te demonstreren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Verzamel en lyse cellen
- Groeien 293T cellen met behulp van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum, 2 mM glutamine en 1% antibiotica. Incuberen culturen bij 37 °C onder 5% CO2.
Opmerking: de groei toestand van de cellen kan de stabiliteit van volgende experimenten beïnvloeden. - Vouw cellen in cultuur tot 80 \ u201290% samenvloeiing bereikt.
- Meng 345 μL cellysisreagens (Zie de tabel met materialen) met 25 μl van een cocktail van 20 x proteaseremmers, 25 μl Natriumfluoride van 1 M, 50 μl van 100 mm β-glycerine fosfaat, 50 μl 50 mm natrium pyrofosfaat en 5 μl 200 mm natrium orthovanadaat. Houd de lysisbuffer gekoeld op ijs.
Opmerking: andere lysisbuffers met verschillende detergenten (bijv. Triton X-100 of NP-40) kunnen met DARTS worden gebruikt zolang ze niet denaturering zijn. Membraan eiwitten of nucleaire eiwitten kunnen worden geëxtraheerd door 0,4% Triton X-100 of 0,4% NP-40 toe te voegen aan het cellysaat. - Was de cellen tweemaal met Cold fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Gebruik een celscraper om de cellen in een geschikte hoeveelheid cellysisbuffer te verzamelen en breng de lyserende cellen over in een tube van 1,5 mL.
Opmerking: het aantal cellen dat nodig is voor elk DARTS experiment varieert afhankelijk van hoeveel eiwitten uit verschillende cellijnen kunnen worden geëxtraheerd. In het algemeen is de eiwitconcentratie van het gebruikte lysaat tussen 4 \ u20126 μg/μL. 1 10 cm plaat van 293T cellen bij 85 \ u201290% confluency, gelyseerd met 300 μL lysisbuffer resulteert meestal in een lysaat met een eiwitconcentratie van ~ 5 μg/μL. - Meng de lysisbuffer/lyserende cellen goed en inbroed de buis op ijs gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer de buis bij 18.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
- Breng het supernatant over in een nieuwe buis van 1,5 mL en houd gekoeld op ijs.
- Voer een BCA-test uit om de eiwitconcentratie van lysaten te benaderen.
2. incuberen eiwithoudende lysaten met de kleine molecule
- Verdeel 99 μL van de lysaten in twee buisjes van 1,5 mL.
- Maak een beginvoorraad concentratie van 10 mM klein molecuul. Bij het uitvoeren van DARTS kan men beginnen met een hogere concentratie van het kleine molecuul (5 \ u201210x de EC50-waarde) om een optimale binding te garanderen.
- Voeg 1 μL oplosmiddel toe dat het kleine molecuul oplosbaar is in of 1 μL kleine molecuul voorraadoplossingen voor elk aliquot lysaat. Incuberen cellysaat met de oplossingen voor 30 \ u201260 min bij kamertemperatuur met schudden.
- Op ijs, seriële verdunningen (1:200, 1:400, 1:800 en 1:1600) van de vers ontdooide pronase-oplossing in 1x TNC (voor 1 mL 10x TNC-buffer, Meng 300 μL ultrapuur water met 100 μL van 5 M natriumchloride, 100 μL van 1 M calciumchloride en 500 μL van 1 M Tris-HCl, pH 8,0).
- Bestudeer een breed scala aan pronase: eiwit verhoudingen (bijvoorbeeld van 1:100 tot 1:2000) om de observabiliteit van het Step-Wise effect van pronase op doel (en) te garanderen.
NB: om de pronase concentraties te berekenen (voorbeeld): 5 μg/μL eiwitconcentratie x 20 μL monster = 100 μg eiwit. Voor een pronase: eiwit ratio van 1:100 hebben we 0,5 μg/μL (100 μg ÷ 100 ÷ 2 μL) oplossing nodig. Dit experiment moet mogelijk meerdere malen worden herhaald om een geschikt bereik van pronase te verkrijgen: eiwit verhoudingen.
3. proteolyse uitvoeren
Opmerking: voor proteolyse worden de stappen bij kamertemperatuur uitgevoerd, tenzij anders vermeld
- Verdeel elk aliquot na incubatie met het kleine molecuul in 20 μL monsters.
- Voeg met specifieke intervallen (elke 30 s) 2 μL van het bereik van de pronase-oplossingen in elk monster toe. Gebruik een gelijk volume van 1x TNC-buffer om een niet-verteerd controlemonster vast te stellen.
- Na 5 \ u201220 min, stoppen met de spijsvertering via toevoeging van 2 μL koude 20x proteaseremmers cocktail elke 30 s. Meng goed en incuberen op ijs gedurende 10 minuten.
- Verdun monsters met het juiste volume van 5x SDS-PAGE laad buffer en kook gedurende 5 minuten bij 95 °C.
- Voer het volgende deel van het experiment uit of bewaar het eiwit monster bij − 80 °C.
4. kwantificering en analyse
- Voer na het DARTEN Coomassie Blue-kleuring uit volgens het eerder gepubliceerde protocol22.
- De gebrandschilderd eiwit bands moeten zeer duidelijk na ontkleuring. Giet de gebruikte laat oplossing en voeg verse 1% azijnzuur oplossing toe om de gel te bedekken. Plaats de gel onder het licht om de banden te observeren met significante verschillen tussen groepen met (monstergroep) of zonder (controlegroep) de kleine molecule.
- Snijd de twee corresponderende banden uit de gel met een steriel instrument en voer LC-MS/MS onmiddellijk uit.
Opmerking: LC-MS/MS moet zo snel mogelijk worden gedaan, omdat de eiwitten in de gel continu afnemen. - Verdubbel de bands, extract peptiden en voer LC-MS/MS-analyse23uit.
- Om LC-MS/MS-gegevens te analyseren, moet u eerst alle eiwitten in de individuele band identificeren. Ten tweede, gebruik Peptide spectrum match (PSM) om de overvloed van elk eiwit te vertegenwoordigen.
Opmerking: het PSM biedt het totale aantal geïdentificeerde peptide sequenties voor het eiwit, met inbegrip van die redundant geïdentificeerd. In het algemeen, hoe vaak een peptide wordt geïdentificeerd/gesequenced kan worden gebruikt als een ruwe schatting van hoe overvloedig het eiwit in het monster. Eiwitten die zijn verrijkt in de monstergroep over de controlegroep zijn eiwitten van belang.
- Om LC-MS/MS-gegevens te analyseren, moet u eerst alle eiwitten in de individuele band identificeren. Ten tweede, gebruik Peptide spectrum match (PSM) om de overvloed van elk eiwit te vertegenwoordigen.
- De primaire antilichamen van de geselecteerde eiwitten aanschaffen. Voer Western Blot uit om te controleren of het kleine molecuul direct kan binden aan de potentiële doel eiwitten24.
- Laad gelijke hoeveelheden eiwitten in de putjes van een 8% SDS-PAGE gel, samen met een geschikte moleculair gewicht marker. Voer de gel gedurende 30 minuten uit op 80 V, stel de spanning in op 120 V en ga verder met 1 \ u20122 h.
- Kwantificeer de verschillende doel proteïne-bands met behulp van beeldverwerkings-en analyse software (Zie de tabel met materialen).
- Analyseer de gegevens en teken de curven.
- Bepaling van de Proteolytische curve voor een doel proteïne
- De pronase: eiwit verhouding is gevarieerd bij het uitvoeren van proteolyse. Normaliseer gegevens uit beeldanalyse door de band intensiteitswaarden te schrijven die overeenkomen met de niet-verteerde banden tot 100%.
- Gebruik niet-lineaire regressieanalyse van de statistische analyse en tekensoftware om een curve van genormaliseerde gegevens te tekenen voor de relatieve band intensiteit en pronase: eiwit verhoudingen.
- Open eerst de software, selecteer het type tabel en grafiek als XY en laat 3 waarden repliceren in Side-by-side subkolommen. Voer vervolgens de corresponderende gegevens in de ruimte onder x en y in. Onder x, voer de getallen 0, 1, 2, 3, 4, 5 (als plaats houders overeenkomstige pronase: eiwit verhoudingen).
- Voer in de kolom y de genormaliseerde gegevens voor relatieve band intensiteiten in. Voer "niet-lineaire regressie" uit en implementeer een "dosis-respons-stimulatie" met behulp van de vergelijking "log (agonist) versus respons — variabele helling (vier parameters)".
- Converteer de annotaties van de X-as in de curve naar de corresponderende pronase: eiwit verhoudingen.
- Bepaling van de dosis-afhankelijkheid curve voor een doel proteïne
Opmerking: voor de dosis-afhankelijkheid analyse, de molariteit van het kleine molecuul is verschafeld over monsters. De stabiele pronase: eiwit verhouding moet worden geïnformeerd door analyse van de proteolyse gegevens. De pronase: eiwit ratio die gedurende de Proteolytische curve een maximaal verschil in doel proteïne-intensiteit vertoonde, moet worden gebruikt voor het dosis-afhankelijkheid experiment.- Kwantificeer de verschillende doel proteïne-bands met behulp van een beeldanalyse software. Als in de generatie van de curve van de dosis-afhankelijkheid, normaliseren van gegevens uit beeldanalyse door het toeschrijven van de band intensiteit waarden overeenkomt met de minst verteerde band tot 100%.
- De niet-lineaire regressieanalyse in de statistische analyse en tekensoftware toepassen op de genormaliseerde gegevens. Open eerst de software, selecteer het type tabel en grafiek als XY, en voer 3 repliceer-waarden in naast elkaar subkolommen.
- Voer vervolgens de corresponderende gegevens in de ruimte onder x en y in. Voor de variabele ' x ', input verschillende concentraties van de kleine molecule; ' y ' bevat de corresponderende genormaliseerde gegevens voor de relatieve band intensiteit.
- Transformeer x-waarden met behulp van X = log (X). Gebruik ten slotte niet-lineaire regressie en implementeer een dosis-respons stimulatie met behulp van de vergelijking ' log (agonist) versus respons — variabele helling (vier parameters) '.
- Bepaling van de Proteolytische curve voor een doel proteïne
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het stroomschema van het experiment wordt beschreven in Figuur 1. Het resultaat van Coomassie Blue-kleuring wordt weergegeven in Figuur 2. Incubatie met het kleine molecuul verleent bescherming tegen proteolyse. Drie bands die lijken te worden beschermd door incubatie met rapamycine over de controle van het voertuig worden gevonden. De verwachte resultaten van het Proteolytische curve-experiment worden weergegeven in Figuur 3. Als bewijs van principe onderzochten we de goed bestudeerde proteïne mTOR, die het doelwit is voor de drug rapamycine25. Western blotting illustreert de aanwezigheid van mTOR-eiwitten bij lage pronase: eiwit verhoudingen en de vermindering en het verlies met toenemende verhoudingen (Figuur 3A). Proteolyse van mTOR door pronase wordt duidelijk geremd door de aanwezigheid van rapamycine en de toevoeging van rapamycine genereert een duidelijke verschuiving in de Proteolytische curve (Figuur 3B). Om de effecten van geneesmiddelconcentratie te onderzoeken, hielden we een constante pronase: eiwit ratio terwijl verschillende concentraties van rapamycine. Aangezien ligand-concentratie nadert target binding verzadiging, een verhoogde aanwezigheid van doeleiwit wordt waargenomen. De dosis van rapamycine verbeterde de mate van mTOR, wat duidt op de stijgende stabiliteit van mTOR met de behandeling met rapamycine (Figuur 4A). Kwantificering van de beoogde proteïne-band intensiteiten maakt de weergave van de doel stabiliteit mogelijk als een functie van ligand concentratie zoals geïllustreerd door de curve in Figuur 4B. Deze resultaten suggereren sterk dat mTOR het doelwit eiwit van rapamycine is.
Figuur 1: schematische voorstelling van de darts benadering voor de semi-kwantitatieve analyse van de drug doelstelling. Cellysaat wordt geïnineerd in de aanwezigheid of afwezigheid van een klein molecuul, gevolgd door proteolyse en eiwit elektroforese. Beschermde proteïne banden worden uitge-en onderworpen aan massa spectroscopie. Eiwit doelen worden geïdentificeerd als die eiwitten die verhoogde protease resistentie weergeven in de aanwezigheid van de kleine molecule. Vervolgens wordt Western-Blot gebruikt om de doel eiwitten te identificeren en halfkwantitatief te analyseren. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden ± standaarddeviatie (SD). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: voorbeeld van Coomassie Blue kleuring visualisatie van Darts met de kleine molecule rapamycine. Rode stippen flankeren de beschermde banden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: afbeelding van de resterende hoeveelheid mTOR toegankelijk voor detectie als een functie van de pronase: eiwit verhouding gebruikt voor de behandeling van 293T cel lysaten. A) de bescherming van mtor tegen proteolyse door rapamycine werd geëvalueerd door de Western Blot-analyse. B) de intensiteit van de mtor-banden werd gekwantificeerd met behulp van de statistische analyse-en tekensoftware. De lijn werd voorzien van een vier-parameter logistieke curve. De gegevens werden verkregen uit de drie onafhankelijke experimenten en werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: afbeelding van de hoeveelheid gestabiliseerde mTOR die toegankelijk is voor detectie in aanwezigheid van toenemende concentraties van rapamycine. 293T celllysates werden geïngimeerd met rapamycine (0, 1, 10, 100, 1000, 10000 nM) gedurende 1 uur, waarna de celllysates werden onderworpen aan de spijsvertering bij de pronase: eiwit ratio van 1:400. A) het stabilisatie-effect van rapamycine op mtor is geëvalueerd door Western Blot. B) de intensiteit van de mtor-banden werd gekwantificeerd met behulp van de statistische analyse-en tekensoftware. De lijn werd voorzien van een vier-parameter logistieke curve. De gegevens werden verkregen uit de drie onafhankelijke experimenten en werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DARTS maakt het mogelijk om kleine molecuul doelen te identificeren door het beschermende effect van eiwitbinding tegen afbraak te benutten. DARTS vereist geen chemische modificatie of immobilisatie van het kleine molecuul26. Hierdoor kunnen kleine moleculen worden gebruikt om hun directe bindende eiwit doelen te bepalen. Standaard beoordelingscriteria voor de klassieke Darts methode zijn onder meer gelkleuring, massaspectrometrie en Western blotting12,13. De klassieke methodologie vermeldt ook dat deze gegevens kwantitatief kunnen worden geanalyseerd, maar er is geen dergelijk voorbeeld beschikbaar. Hier gebruiken we de principes van de cellulaire thermische verschuiving assay (CETSA) om de gegevens semi-kwantitatief te analyseren en parameters te verkrijgen die vergelijkbaar zijn met die van CESTA (TM en EC50), wat het nut van DARTS Analysis8verhoogt. De ligand – doel interactie kan worden uitgezet tegen pronase: eiwit ratio om duidelijke verschuivingen in Proteolytische curven weer te geven. Het uitvoeren van proteolyse met behulp van verschillende pronase: eiwit ratio's kunnen helpen bij het verkleinen van de concentratie van pronase die moet worden gebruikt in downstreamexperimenten. Door de geoptimaliseerde concentratie van pronase te gebruiken, kan de proteolyse die in aanwezigheid van verschillende concentraties van het kleine molecuul wordt uitgevoerd, een indirecte maatstaf vormen voor de affiniteit van het kleine molecuul met zijn doel proteïne. Bovendien, generatie van een dosis-afhankelijkheid curve zorgt voor de onderlinge aanpassing van de effecten op doel eiwitten afhankelijk van ligand concentratie. Opname van analytische capaciteit voor Dosisafhankelijkheid is een krachtige uitbreiding van de DARTS methodologie; het bieden van een eenvoudige en snelle aanpak om het therapeutische mechanisme van kleine moleculen te scannen. Deze op gel gebaseerde aanpak is het gemakkelijkst te implementeren. Het kan worden gebruikt voor screening met hoge doorvoer voor verbindingen die een specifiek eiwit binden20,27,28. Bovendien kan Darts worden gebruikt voor het analyseren van echte interacties met lage affiniteit, omdat wassen niet is opgenomen als een experimentele stap12,26. Bovendien heeft DARTS, vergeleken met CETSA, voordelen bij het identificeren van de doelstellingen van membraan proteïnen, omdat DARTS een betere beoordeling van membraan eiwitten mogelijk maken door middel van milde, stabiliserende detergenten11.
Het experiment heeft ook enkele beperkingen. Ten eerste, wanneer het cellysaat een lage overvloed aan doel eiwitten heeft, kan de DARTS methode niet worden gebruikt om gemakkelijk veranderingen in de proteolyse van het doeleiwit te visualiseren. Extra stappen om deze eiwitten te concentreren zijn nodig om deze methodologie toe te passen. Ten tweede, we alleen testen rapamycine/mTOR interactie. De interactie is bekend om zijn krachtig en stabiel. Echter, sommige kleine moleculen kunnen binden aan hun doelen minder selectief, of transiently, en het is niet duidelijk of dergelijke kleine moleculen kunnen worden geanalyseerd met deze test. Ten derde kunnen sommige doel eiwitten extreem gevoelig of resistent zijn tegen de gebruikte proteasen.
DARTS assay analyse maakt identificatie mogelijk van potentiële eiwit interacties door middel van beoordeling van Proteolytische curven gegenereerd over een bereik van pronase: eiwit verhoudingen in de aanwezigheid of afwezigheid van een kleine molecule ligand. Onze wijzigingen in de standaard procedurele omtrek van de DARTS test accentueren de capaciteit van deze methode om te worden gebruikt bij het genereren van concentratie-responscurve. Deze uitgangen zijn van speciaal nut in de ontwikkeling van de drug, waardoor identificatie van mechanistisch relevante drug concentraties. Bovendien biedt vergelijking van concentratie-respons curves die met verschillende liganden worden gegenereerd, inzicht in de vergelijkende bindende affiniteiten voor verschillende liganden van hetzelfde doel; een capaciteit mogelijk nuttig bij de voorspelling van kleine molecuul werkzaamheid en verfijning van de dosering. We hopen dat deze demonstratie van uitgebreide analytische kracht van DARTS nuttig zal zijn bij de ontwikkeling, implementatie en het begrip van kleine molecuul medicijnen, met name voor liganden en doelen die moeilijk te analyseren zijn met behulp van alternatieve benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd deels gesteund door NIH Research Grants R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, en een DOD Research Grant W81XWH-16-1-0482.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
- O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
- McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
- Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
- Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
- Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
- Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
- Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
- Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
- Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
- Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
- Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
- Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
- Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
- Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
- Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
- Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
- Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
- Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).
