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Biochemistry

Un test de stabilité cible sensible à l'affinité semi-quantitative des médicaments (DARTS) pour étudier l'interaction Rapamycin/mTOR

Published: August 27, 2019 doi: 10.3791/59656
* These authors contributed equally

Summary

Dans cette étude, nous avons amélioré les capacités d'analyse de données de l'expérience DARTS en surveillant les changements dans la stabilité des protéines et en estimant l'affinité des interactions protéines-ligands. Les interactions peuvent être tracées en deux courbes : une courbe protéolytique et une courbe dose-dépendance. Nous avons utilisé l'interaction mTOR-rapamycine comme un cas exemplaire.

Abstract

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) est une méthode robuste pour la détection de nouvelles cibles protéiques à petites molécules. Il peut être utilisé pour vérifier les interactions molécules-protéines connues et pour trouver des cibles protéiques potentielles pour les produits naturels. Comparé à d'autres méthodes, DARTS utilise des molécules indigènes, non modifiées, petites et est simple et facile à utiliser. Dans cette étude, nous avons encore amélioré les capacités d'analyse de données de l'expérience DARTS en surveillant les changements dans la stabilité des protéines et en estimant l'affinité des interactions protéines-ligands. Les interactions protéines-ligands peuvent être tracées en deux courbes : une courbe protéolytique et une courbe dose-dépendance. Nous avons utilisé l'interaction mTOR-rapamycine comme un cas exemplaire pour l'établissement de notre protocole. De la courbe protéolytique nous avons vu que la protéolyse du mTOR par pronase a été inhibée par la présence de rapamycine. La courbe dose-dépendance nous a permis d'estimer l'affinité contraignante de la rapamycine et du mTOR. Cette méthode est susceptible d'être une méthode puissante et simple pour identifier avec précision les nouvelles protéines cibles et pour l'optimisation de l'engagement cible médicamenteux.

Introduction

L'identification des petites molécules cibles des protéines est essentielle à la compréhension mécaniste et au développement de médicaments thérapeutiques potentiels1,2,3. La chromatographie d'affinité, comme méthode classique pour identifier les protéines cibles des petites molécules, a donné de bons résultats4,5. Cependant, cette méthode a des limites, en ce que la modification chimique de petites molécules entraîne souvent une spécificité ou une affinité de liaison réduite ou altérée. Pour surmonter ces limitations, plusieurs nouvelles stratégies ont récemment été développées et appliquées pour identifier les cibles de petites molécules sans modification chimique des petites molécules. Ces méthodes directes pour l'identification ciblée des petites molécules sans étiquette comprennent la stabilité de la cible sensible à l'affinité médicamenteuses (DARTS)6, stabilité des protéines des taux d'oxydation (SPROX)7, analyse thermique cellulaire (CETSA)8 ,9, et profilage protéome thermique (TPP)10. Ces méthodes sont très avantageuses parce qu'elles utilisent de petites molécules naturelles et non modifiées et ne reposent que sur des interactions de liaison directes pour trouver des protéines cibles11.

Parmi ces nouvelles méthodes, DARTS est une méthodologie relativement simple qui peut facilement être adoptée par la plupart des laboratoires12,13. DARTS dépend du concept que les protéines ligand-liées démontrent la susceptibilité modifiée à la dégradation enzymatique par rapport aux protéines non liées. La nouvelle protéine cible peut être détectée par l'examen de la bande modifiée dans le gel SDS-PAGE par spectrométrie de masse de chromatographie liquide (LC-MS/MS). Cette approche a été mise en œuvre avec succès pour l'identification de cibles jusque-là inconnues de produits naturels et de médicaments14,15,16,17,18, 19. Il est également puissant comme moyen de filtrer ou de valider la liaison des composés à une protéine spécifique20,21. Dans cette étude, nous présentons une amélioration à l'expérience en surveillant les changements dans la stabilité des protéines avec de petites molécules et en identifiant les affinités de liaison protéine-ligand. Nous utilisons l'interaction mTOR-rapamycine comme exemple pour démontrer notre approche.

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Protocol

1. Recueillir et lyser les cellules

  1. Cultivez 293T cellules à l'aide du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal, 2 mM de glutamine et 1% d'antibiotiques. Incuber les cultures à 37 oC sous 5 % co2.
    REMARQUE : L'état de croissance des cellules peut affecter la stabilité des expériences ultérieures.
  2. Élargir les cellules en culture jusqu'à atteindre 80'u201290% confluence.
  3. Mélanger 345 l de réactif de lyse cellulaire (voir le tableau des matériaux)avec 25 l de cocktail inhibiteur de la protéase 20x, 25 oL de 1 M de fluorure de sodium, 50 oL de 100 mM de glycérophosphate, 50 oL de 50 mM de pyrophosphate de sodium et 5 l d'orthovanadate de sodium de 200 mL. Gardez le tampon de lyse au frais sur la glace.
    REMARQUE : D'autres tampons de lyse avec divers détergents (p. ex., Triton X-100 ou NP-40) peuvent être utilisés avec dARTS tant qu'ils ne dénaturent pas. Les protéines membranaires ou les protéines nucléaires peuvent être extraites en ajoutant 0,4 % de Triton X-100 ou 0,4 % de NP-40 au lysate cellulaire.
  4. Laver les cellules deux fois avec du salin tamponné par le phosphate froid (PBS).
  5. Utilisez un grattoir cellulaire pour recueillir les cellules dans une quantité appropriée de tampon de lyse cellulaire et transférer les cellules lysing dans un tube de 1,5 ml.
    REMARQUE : Le nombre de cellules nécessaires pour chaque expérience DARTS variera en fonction de la quantité de protéines pouvant être extraites de différentes lignées cellulaires. En général, la concentration en protéines du lysate utilisé se situe entre 4'u20126 'g/L. Une plaque de 10 cm de cellules 293T à 85'u201290% de confluence, lysée avec 300 'L de tampon de lyse se traduit généralement par un lysate avec une concentration de protéines de 5 'g/L.
  6. Mélanger bien les cellules tampon/lysing de lyse et incuber le tube sur la glace pendant 10 min.
  7. Centrifuger le tube à 18 000 g pour 10 min à 4 oC.
  8. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 ml et garder au frais sur la glace.
  9. Effectuez un bcA pour approximer la concentration protéique des lysates.

2. Incubate protéine lysates avec la petite molécule

  1. Diviser 99 l de lysates en deux tubes de 1,5 ml.
  2. Faire une concentration de stock de départ de 10 mM petite molécule. Lors de l'exécution de DARTS, on peut commencer par une concentration plus élevée de la petite molécule (5-u201210x la valeur EC50) pour assurer une liaison optimale.
    1. Ajouter soit 1 l de solvant que la petite molécule est soluble dans ou 1 l de solutions de stock de petites molécules à chaque aliquot de lysate. Incuber la cellule lysate avec les solutions pour 30'u201260 min à température ambiante avec secousses.
  3. Sur la glace, établir des dilutions en série (1:200, 1:400, 1:800 et 1:1600) de solution de pronase fraîchement décongelée dans 1x TNC (Pour 1 mL de tampon 10x TNC, mélanger 300 l d'eau ultrapure avec 100 l de chlorure de sodium de 5 M, 100 oL de chlorure de calcium 1 M , et 500 l de 1 M Tris-HCl, pH 8.0).
  4. Examiner une large gamme de rapports pronase:protein (p. ex., s'étendant de 1:100 à 1:2000) pour garantir l'observabilité de l'effet step-wise de la pronase sur les cibles.
    REMARQUE : Pour calculer les concentrations de pronase (exemple) : 5 concentrations de protéines de l'homme x 20 degrés L, 100 g de protéines. Pour un rapport pronase:protein de 1:100, nous avons besoin d'une solution de pronase de 0,5 g/L (100 g et 100 et 2 l). Cette expérience peut devoir être répétée plusieurs fois pour obtenir une gamme appropriée de rapports pronase:protein.

3. Effectuer une protéolyse

REMARQUE : Pour la protéolyse, les étapes sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire

  1. Après l'incubation avec la petite molécule, diviser chaque aliquot en 20 échantillons de L.
  2. Ajouter 2 L de la gamme de solutions pronase dans chaque échantillon à intervalles spécifiques (tous les 30 s). Utilisez un volume égal de tampon 1x TNC pour établir un échantillon de contrôle non digéré.
  3. Après 5'u201220 min, arrêter la digestion par l'ajout de 2 'L de froid 20x cocktail inhibiteur de protéase tous les 30 s. Bien mélanger et incuber sur la glace pendant 10 min.
  4. Diluer les échantillons avec le volume approprié de tampon de chargement SDS-PAGE de 5 x et faire bouillir à 95 oC pendant 5 min.
  5. Effectuer la partie suivante de l'expérience ou stocker l'échantillon de protéines à 80 oC.

4. Quantification et analyse

  1. Après DARTS, effectuer coomassie coloration bleue selon le protocole précédemment publié22.
  2. Les bandes de protéines tachées doivent être très claires après le destaining. Verser la solution de déstain utilisée et ajouter la solution fraîche d'acide acétique de 1 % pour couvrir le gel. Mettez le gel sous la lumière pour observer les bandes avec des différences significatives entre les groupes avec (groupe d'échantillon) ou sans (groupe témoin) la petite molécule.
  3. Couper les deux bandes correspondantes du gel avec un instrument stérile et effectuer LC-MS/MS immédiatement.
    REMARQUE : LC-MS/MS doit être fait dès que possible parce que les protéines dans le gel se dégradent continuellement.
  4. Digles les bandes, extraire les peptides et effectuer l'analyse LC-MS/MS23.
    1. Pour analyser les données LC-MS/MS, identifiez d'abord toutes les protéines de la bande. Deuxièmement, utiliser le spectre peptidique (PSM) pour représenter l'abondance de chaque protéine.
      REMARQUE : Les MSP fournissent le nombre total de séquences de peptides identifiées pour la protéine, y compris celles identifiées de façon redondante. En général, la fréquence à laquelle un peptide est identifié/séquencé peut être utilisée comme une estimation approximative de l'abondance de la protéine dans l'échantillon. Les protéines enrichies dans le groupe témoin sur le groupe témoin sont des protéines d'intérêt.
  5. Procurez-vous les anticorps primaires des protéines sélectionnées. Effectuer la tache occidentale pour vérifier que la petite molécule peut se lier directement aux protéines cibles potentielles24.
    1. Chargez des quantités égales de protéines dans les puits d'un gel SDS-PAGE de 8 %, ainsi qu'un marqueur de poids moléculaire approprié. Exécuter le gel pendant 30 min à 80 V, puis ajuster la tension à 120 V et continuer à fonctionner pendant 1'u20122 h.
  6. Quantifier les différentes bandes protéiques cibles à l'aide d'un logiciel de traitement et d'analyse d'images (voir le Tableau des matériaux).
  7. Analysez les données et dessinez les courbes.
    1. Détermination de la courbe protéolytique pour une protéine cible
      1. Le rapport pronase:protein est varié lors de la protéolyse. Normaliser les données de l'analyse d'images en attribuant à 100 % les valeurs d'intensité de la bande correspondant aux bandes non digérées.
      2. Utilisez l'analyse non linéaire de la régression de l'analyse statistique et du logiciel de dessin pour tracer une courbe de données normalisées pour l'intensité relative de la bande et les ratios pronase:protein.
      3. Tout d'abord, ouvrez le logiciel, sélectionnez le type de table et le graphique comme XY et autorisez 3 valeurs de repli dans les sous-colonnes côte à côte. Entrez ensuite les données correspondantes dans l'espace sous x et y. Sous x, entrez les nombres 0, 1, 2, 3, 4, 5 (en tant que détenteurs de place correspondant pronase:protein ratios).
      4. Dans la colonne y, entrez les données normalisées pour les intensités relatives de bande. Effectuer la « régression non linéaire » et implémenter une équation « Dose-response-Stimulation » à l'aide de l'équation « Log (agoniste) versus response—Variable slope (quatre paramètres) ».
      5. Convertir les annotations de l'axe X dans la courbe aux rapports pronase:protein correspondants.
    2. Détermination de la courbe dose-dépendance pour une protéine cible
      REMARQUE : Pour l'analyse dose-dépendance, la molarité de la petite molécule est différente d'un échantillon à l'autre. Le rapport stable pronase:protein devrait être informé par l'analyse des données de protéolyse. Le rapport pronase/protéine qui a montré la différence maximale dans l'intensité de protéine cible pendant la courbe protéolytique devrait être employé pour l'expérience dose-dépendance.
      1. Quantifier les différentes bandes protéiques cibles à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images. Comme dans la génération de la courbe dose-dépendance, normaliser les données de l'analyse d'image en attribuant les valeurs d'intensité de bande correspondant à la bande la moins digérée à 100%.
      2. Appliquer l'analyse de régression non linéaire dans le logiciel d'analyse statistique et de dessin aux données normalisées. Tout d'abord, ouvrez le logiciel, sélectionnez le type de table et de graphique comme XY, et entrez 3 valeurs de répétition dans les sous-colonnes côte à côte.
      3. Ensuite, entrez les données correspondantes dans l'espace ci-dessous x et y. Pour la variable «x», entrez différentes concentrations de la petite molécule; 'y' comprend les données normalisées correspondantes pour l'intensité relative de la bande.
      4. Transformez les valeurs x à l'aide de X et Log(X). Enfin, utilisez la régression non linéaire et mettez en œuvre une stimulation dose-réponse à l'aide de l'équation « Log (agoniste) versus response—Variable slope (quatre paramètres) ».

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Representative Results

Le graphique de débit de l'expérience est décrit à la figure 1. Le résultat de la coloration bleue de Coomassie est montré dans la figure 2. L'incubation avec la petite molécule confère une protection contre la protéolyse. Trois bandes qui semblent être protégées par l'incubation avec de la rapamycine sur le contrôle du véhicule sont trouvées. Les résultats attendus de l'expérience de la courbe protéolytique sont présentés à la figure 3. Comme preuve de principe, nous avons examiné le mTOR de protéine bien étudié, qui est la cible pour la rapamycine de drogue25. Le ballonnement occidental illustre la présence de protéines mTOR à faible teneur en pronase:protéines et sa réduction et sa perte avec des ratios croissants (Figure 3A). La protéolyse du mTOR par pronase est clairement inhibée par la présence de rapamycine et l'ajout de rapamycine génère un changement évident dans la courbe protéolytique (Figure 3B). Pour étudier des effets de la concentration de drogue, nous avons maintenu un rapport constant de pronase:protein tout en variant des concentrations de rapamycine. À mesure que la concentration de ligands s'approche de la saturation de liaison cible, on observe une présence accrue de protéines cibles. La dose de rapamycine a augmenté le niveau de mTOR, suggérant la stabilité croissante du mTOR avec le traitement de rapamycine (figure 4A). La quantification de l'intensité de la bande de protéines cibles permet la représentation de la stabilité de la cible en fonction de la concentration de ligands, comme en témoigne la courbe de la figure 4B. Ces résultats suggèrent fortement que le mTOR est la protéine cible de la rapamycine.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de l'approche DARTS pour l'analyse semi-quantitative des cibles médicamenteuses. Le lysate cellulaire est incubé en présence ou en absence d'une petite molécule, suivi d'une protéolyse et d'une électrophorèse protéique. Les bandes protéiques protégées sont excisées et soumises à une spectroscopie de masse. Les cibles protéiques sont identifiées comme étant les protéines qui présentent une résistance accrue à la protéase en présence de la petite molécule. Ensuite, western-blot est utilisé pour identifier et analyser semi-quantitativement les protéines cibles. Les données sont exprimées comme des moyens - déviation standard (SD). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Exemple de visualisation de coloration bleue de Coomassie de DARTS avec la petite molécule rapamycine. Des points rouges flanquent les bandes protégées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Illustration de la quantité restante de mTOR accessible à la détection en fonction du rapport pronase:protein utilisé pour le traitement des lysates des cellules 293T. (A) La protection du mTOR contre la protéolyse par la rapamycine a été évaluée par l'analyse de tache occidentale. (B) L'intensité des bandes mTOR a été quantifiée à l'aide du logiciel d'analyse statistique et de dessin. La ligne était équipée d'une courbe logistique à quatre paramètres. Les données ont été obtenues à partir des trois expériences indépendantes et ont été exprimées comme moyen - SD. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Illustration de la quantité de mTOR stabilisé accessible à la détection en présence de concentrations croissantes de rapamycine. 293T lysates de cellules ont été incubés avec la rapamycine (0, 1, 10, 100, 1000, 10000 nM) pendant 1 h, puis les lysates cellulaires ont été soumis à la digestion au rapport pronase:protéine de 1:400. (A) L'effet de stabilisation de la rapamycine sur le mTOR a été évalué par tache occidentale. (B) L'intensité des bandes mTOR a été quantifiée à l'aide du logiciel d'analyse statistique et de dessin. La ligne était équipée d'une courbe logistique à quatre paramètres. Les données ont été obtenues à partir des trois expériences indépendantes et ont été exprimées comme moyen - SD. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

DARTS permet d'identifier les cibles de petites molécules en exploitant l'effet protecteur de la liaison protéique contre la dégradation. DARTS ne nécessite aucune modification chimique ou immobilisation de la petite molécule26. Cela permet d'utiliser de petites molécules pour déterminer leurs cibles protéiques de liaison directe. Les critères d'évaluation standard pour la méthode Classique DARTS incluent la coloration de gel, la spectrométrie de masse et le ballonnement occidental12,13. La méthodologie classique mentionne également que ces données peuvent être analysées quantitativement, mais aucun exemple de ce genre n'est fourni. Ici, nous utilisons les principes de l'analyse thermique cellulaire (CETSA) pour analyser les données de façon semi-quantitative, et d'obtenir des paramètres similaires à ceux fournis par CESTA (Tm et EC50) qui augmente l'utilité de l'analyse DARTS8. L'interaction ligand-cible peut être tracée contre le rapport pronase:protein pour afficher des changements évidents dans les courbes protéolytiques. L'exécution de la protéolyse à l'aide de différents rapports pronase/protéines peut aider à réduire la concentration de pronase qui devrait être utilisée dans les expériences en aval. En outre, en utilisant la concentration optimisée de pronase, la protéolyse réalisée en présence de différentes concentrations de la petite molécule peut fournir une mesure indirecte de l'affinité de la petite molécule avec sa protéine cible. En outre, la génération d'une courbe dose-dépendance permet d'approximation des effets sur les protéines cibles dépendantes de la concentration de ligands. L'inclusion de la capacité analytique pour la dose-dépendance est une expansion puissante de la méthodologie DARTS; offrant une approche simple et rapide pour sonder le mécanisme thérapeutique des petites molécules. Cette approche à base de gel est la plus facile à mettre en œuvre. Il peut être utilisé pour le dépistage à haut débit pour les composés qui lient une protéine spécifique20,27,28. En outre, DARTS peut être utilisé pour analyser les interactions vraies avec une faible affinité, parce que le lavage n'est pas inclus comme une étape expérimentale12,26. En outre, par rapport à CETSA, DARTS a des avantages dans l'identification des cibles des protéines membranaires que DARTS permet une meilleure évaluation des protéines membranaires grâce à l'utilisation de doux, stabilisant sétergents11.

L'expérience a également quelques limites. Tout d'abord, lorsque le lysate cellulaire a une faible abondance de protéines cibles, la méthode DARTS ne peut pas être utilisée pour visualiser facilement les altérations de la protéolyse de la protéine cible. Des mesures supplémentaires pour concentrer ces protéines sont nécessaires afin d'appliquer cette méthodologie. Deuxièmement, nous ne testons que la rapamycine/mTOR interaction. L'interaction est connue pour être puissante et stable. Cependant, certaines petites molécules peuvent se lier à leurs cibles de façon moins sélective, ou transitoire, et il n'est pas clair si ces petites molécules peuvent être analysées avec cet analyse. Troisièmement, certaines protéines cibles peuvent être extrêmement sensibles ou résistantes aux protéases utilisées.

L'analyse d'analyse DARTS permet d'identifier les interactions protéiques potentielles par l'évaluation des courbes protéolytiques générées à travers une gamme de rapports pronase:protein en présence ou en absence d'une petite molécule ligand. De façon passionnante, nos modifications au plan de procédure standard de l'assay DARTS mettent en évidence la capacité de cette méthode à utiliser dans la génération de la courbe concentration-réponse. Ces extrants sont d'une utilité particulière dans le développement de médicaments, permettant d'identifier les concentrations de médicaments d'une pertinence mécaniste. En outre, la comparaison des courbes concentration-réponse générées à l'aide de ligands disparates donne un aperçu des affinités de liaison comparatives pour plusieurs ligands d'une même cible; une capacité potentiellement utile dans la prédiction de l'efficacité des petites molécules et le raffinement du dosage. Nous espérons que cette démonstration de la puissance analytique élargie de DARTS sera utile dans le développement, la mise en œuvre et la compréhension des médicaments à petites molécules, en particulier pour les ligands et les cibles difficiles à analyser à l'aide d'approches alternatives.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus en partie par les subventions de recherche des NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, et une subvention de recherche du MINISTÈRE W81XWH-16-1-0482.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Dilute to 20X with ultrapure water
293T cell line ATCC CRL-3216 DMEM medium with 10% FBS
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher 23225
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Cell scraper Thermo Fisher 179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution Bio-Rad 1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma-Aldrich D2650
GraphPad Prism GraphPad Software Version 6.0 statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52 image processing and analysis software
M-PER Cell Lysis Reagent Thermo Fisher 78501
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning R21-040-CV
Pronase Roche PRON-RO 10 mg/ml
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium fluoride Sigma-Aldrich S7920
Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich 450243
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich 221368
Trizma base Sigma-Aldrich T1503 adjust to pH 8.0
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

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References

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Zhang, C., Cui, M., Cui, Y., Hettinghouse, A., Liu, C. j. A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction. J. Vis. Exp. (150), e59656, doi:10.3791/59656 (2019).

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