Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

יחסי למחצה כמותית של התרופה מגיב יציבות היעד (חצים) שיטת לימוד האינטראקציה Rapamycin/mTOR

Published: August 27, 2019 doi: 10.3791/59656
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Department of Orthopaedic Surgery, New York University Medical Center, 2Department of Cell Biology, New York University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

במחקר זה, הצלחנו לשפר את יכולות ניתוח הנתונים של הניסוי חצים על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים והערכת האהדה של ליגוניות חלבונים ואינטראקציות. ניתן להתוות את האינטראקציות לשתי עקומות: עקומת פרוטחרדה ועקומת תלות במינון. השתמשנו באינטראקציה של mTOR-rapamycin כמקרה מופתי.

Abstract

זיקה לסמים יציבות היעד (משחק דארטס) היא שיטה איתנה לזיהוי מטרות מולקולות קטנות של חלבון מולקולה. ניתן להשתמש בו כדי לאמת אינטראקציות קטנות ומולקולות של חלבונים ולמצוא מטרות חלבון פוטנציאליות עבור מוצרים טבעיים. לעומת שיטות אחרות, חצים משתמש יליד, לא שונה, מולקולות קטנות הוא פשוט וקל לתפעול. במחקר זה, אנו משפרים עוד יותר את יכולות ניתוח הנתונים של הניסוי חצים על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים והערכת הזיקה של חלבונים ליגוניים ואינטראקציות. ניתן להתוות את החלבון-ligand אינטראקציות לשתי עקומות: עקומת פרוטחרדה ועקומת תלות במינון. השתמשנו באינטראקציה של mTOR-rapamycin כמקרה מופתי להקמת הפרוטוקול שלנו. מתוך עקומת נגד חרדה ראינו כי פרוטפוליזיס של mTOR על ידי בינוי היה מעוכב על ידי נוכחות של rapamycin. עקומת תלות המינון אפשרה לנו להעריך את הזיקה המחייב של rapamycin ו mTOR. שיטה זו עשויה להיות שיטה רבת עוצמה ופשוטה לזיהוי מדויק של חלבונים ביעד הרומן ולמיטוב האירוסין של מטרת הסמים.

Introduction

זיהוי מולקולה קטנה היעד חלבונים הוא חיוני הבנה מכניסטית ופיתוח של תרופות טיפוליות פוטנציאליות1,2,3. אהדה כרומטוגרפיה, כשיטה קלאסית לזיהוי חלבונים היעד של מולקולות קטנות, הניב תוצאות טובות4,5. עם זאת, שיטה זו יש מגבלות, בשינוי כימי זה של מולקולות קטנות לעתים קרובות גורמת מופחת או שונה ספציפיות הקשירה או אהדה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, כמה אסטרטגיות חדשות פותחו לאחרונה ויישם כדי לזהות את מטרות המולקולה הקטנה ללא שינוי כימי של מולקולות קטנות. אלה שיטות ישירות לזיהוי היעד של מולקולות קטנות ללא תוויות כוללות עמידות בפני התרופה ביציבות היעד (חצים)6, יציבות של חלבונים משיעורי חמצון (sprox)7, הטלפון התרמי משמרת תרמית (cetsa)8 ,9, ו התרמי פרופיל פרוטדום (tpp)10. שיטות אלה הן יתרון מאוד כי הם משתמשים טבעיים, מולקולות קטנות שאינן בשימוש ולהסתמך רק על אינטראקציות כריכה ישירה למצוא חלבונים היעד11.

בין אלה שיטות חדשות, חצים היא מתודולוגיה פשוטה יחסית שיכולה בקלות להיות מאומצת על ידי רוב מעבדות12,13. החצים תלויים במושג כי חלבונים ליגטיים להפגין שונה רגישות השפלה אנזימטית ביחס לחלבונים לא מאוגדים. חלבון היעד החדש יכול להיות מזוהה על ידי בחינת הלהקה שונה ב SDS-דף ג ' ל באמצעות ספקטרומטריה כרומטוגרפיה נוזלית המסה (LC-MS/MS). גישה זו יושמה בהצלחה לזיהוי של מטרות לא ידועות בעבר של מוצרים טבעיים ותרופות14,15,16,17,18 , 19. הוא גם חזק כאמצעי למסך או לאמת קשירה של תרכובות לחלבון מסוים20,21. במחקר זה, אנו מציגים שיפור לניסוי על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים עם מולקולות קטנות וזיהוי ליגולי חלבונים וכריכה. אנו משתמשים באינטראקציה mTOR-rapamycin כדוגמה כדי להדגים את הגישה שלנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. לאסוף ולקבל תאים

  1. לגדל תאים 293T באמצעות מדיום שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% סרום עוברי, 2 מ"מ גלוטמין ו 1% אנטיביוטיקה. תרבות הדגירה ב 37 ° c תחת 5% CO2.
    הערה: מצב הגדילה של התאים עלול להשפיע על היציבות של הניסויים הבאים.
  2. הרחב את התאים בתרבות עד שנגיע ל-80 \ u201290% זרימה.
  3. מערבבים 345 μL של פירוק התא מגיב (לראות את הטבלה של חומרים) עם 25 μl של קוקטייל מעכב הפרוטאז 20x, 25 μl של 1 M נתרן פלואוריד, 50 μl של 100 mM β-glycerophosphate, 50 μl של המלח מילימטר נתרן פירופוספט, ו-5 μl של ה50 מילימטר נתרן. השאר את מאגר הליזה מקורר בקרח.
    הערה: מאגרי הליזה אחרים עם דטרגנטים שונים (לדוגמה, טריטון X-100 או NP-40) יכולים לשמש עם חצים כל עוד הם לא משתמשים. חלבונים ממברנה או חלבונים גרעיניים יכול להיות מופק על ידי הוספת 0.4% טריטון X-100 או 0.4% NP-40 ליפוסט התא.
  4. רוחצים את התאים פעמיים עם תמיסת מלח באגירה קרה (PBS).
  5. השתמש מגרד התא כדי לאסוף את התאים בכמות מתאימה של מאגר פירוק תאים ולהעביר את התאים lysing לתוך צינור 1.5 mL.
    הערה: מספר התאים הדרושים עבור כל ניסוי בחצים ישתנו בהתאם לכמות החלבון שניתן לחלץ מקווי תאים שונים. באופן כללי, ריכוז החלבון של הליפוסט המשמש הוא בין 4 \ u20126 μg/μL. 1 10 ס מ לוחית של תאים 293T ב 85 \ u201290% שליטה, לאחר עם 300 μL של מאגר לליזה בדרך כלל תוצאות ליפוסט עם ריכוז חלבון של ~ 5 μg/μL.
  6. מערבבים את מאגר הליזה/התאים ליסינג גם היטב ומכשלי את השפופרת על הקרח במשך 10 דקות.
  7. צנטריפוגה את הצינור ב 18,000 × g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
  8. העבר את הסופרנטאנט לתוך צינור 1.5 mL חדש ושמור על קרח.
  9. ביצוע שיטת BCA לקירוב ריכוז החלבון של lysates.

2. החלבון ליסביטים עם המולקולה הקטנה

  1. פיצול 99 μL של lysates לשני שפופרות 1.5 mL.
  2. להפוך ריכוז המניה ההתחלתית של 10 מ"מ מולקולה קטנה. בעת ביצוע חצים, אחד יכול להתחיל בריכוז גבוה יותר של המולקולה הקטנה (5 \ u201210x הערך EC50) כדי להבטיח מחייב אופטימלי.
    1. הוסף 1 μl של הממס כי המולקולה הקטנה מסיסים ב או 1 μl של פתרונות מניות קטנים מולקולה כל סדרת מחלקים של ליפוסט. הצינוק הנייד לאחר עם פתרונות עבור 30 \ u201260 min בטמפרטורת החדר עם טלטול.
  3. על הקרח, הקמת מדלל סדרתי (1:200, 1:400, 1:800 ו-1:1600) של פתרון בינוי טרי x TNC (עבור 1 מ ל של מאגר 10x TNC, לערבב 300 μL של מים באולטרסאונד עם 100 μL של 5 M נתרן כלוריד, 100 μL של 1 M סידן כלוריד , ו 500 μL של 1 M טריס-HCl, pH 8.0).
  4. לבחון מגוון רחב של בינוי: יחסי חלבון (למשל, המשתרעים מ-1:100 עד 1:2000) כדי להבטיח את היכולת של השפעת הצעד הנבון על המטרה (ים).
    הערה: כדי לחשב את ריכוזי הצורות (לדוגמה): 5 הריכוז הפרוטאין μg/μL x 20 מדגם μL = 100 μg חלבון. עבור כינוי: החלבון יחס של 1:100 אנחנו צריכים 0.5 μg/μL (100 μg ÷ 100 ÷ 2 μL) הפתרון. ייתכן שיהיה צורך לחזור על ניסוי זה מספר פעמים כדי לקבל מגוון מתאים של בינוי: יחס החלבונים.

3. בצע הפרוטפוליזיס

הערה: עבור פרוטפוליזיס, שלבים מתבצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת

  1. בעקבות דגירה עם מולקולה קטנה, לחלק כל סדרת מחלקים ל 20 μl דגימות.
  2. הוסף 2 μL של מגוון הפתרונות הייחודיים בכל מדגם במרווחי זמן ספציפיים (כל 30 s). השתמש בנפח שווה של מאגר TNC של 1x כדי ליצור מדגם בקרה שאינו מתעכל.
  3. לאחר 5 \ u201220 min, להפסיק את העיכול באמצעות תוספת של 2 μL של הצטננות 20x מעכב פרוטאז הקוקטייל כל 30 s. מערבבים היטב ו-דגירה על הקרח 10 דקות.
  4. לדלל דגימות עם נפח מתאים של 5x SDS-עמוד טעינת מאגר ולרתוח ב 95 ° c עבור 5 דקות.
  5. ביצוע החלק הבא של הניסוי או לאחסן את דגימת החלבון ב--80 ° c.

4. בדיקת קוונפיקציה וניתוח

  1. לאחר החצים, לבצע מכתים כחול Coomassie לפי הפרוטוקול שפורסם בעבר22.
  2. להקות החלבון המוכתמת צריכות להיות ברורות מאוד לאחר הדתמת. יוצקים את הפתרון המשמש destain ולהוסיף טריים 1% חומצה אצטית תמיסה כדי לכסות את הג. הניחו את הג מתחת לאור כדי להתבונן בלהקות עם הבדלים משמעותיים בין קבוצות עם (קבוצת לדוגמה) או ללא (קבוצת בקרה) את המולקולה הקטנה.
  3. חותכים את שתי הלהקות המקבילות מהג עם כלי סטרילי ולבצע LC-MS/MS מיד.
    הערה: LC-MS/MS צריך להיעשות בהקדם האפשרי בגלל החלבונים ב ג'ל לבזות ברציפות.
  4. לעכל את הלהקות, לחלץ פפטידים ולבצע LC-MS/MS ניתוח23.
    1. כדי לנתח נתוני LC-MS/MS, הראשון לזהות את כל החלבונים בלהקה בודדים. שנית, להשתמש הספקטרום פפטיד להתאים (PSM) כדי לייצג את השפע של כל חלבון.
      הערה: PSM מספק את המספר הכולל של רצפי פפטיד מזוהה עבור החלבון, כולל אלה יתיר זוהו. באופן כללי, באיזו תכיפות פפטיד מזוהה/רצף יכול לשמש הערכה גסה של כמה שופע החלבון הוא במדגם. חלבונים המועשרת בקבוצת המדגם בקבוצת הביקורת הם חלבונים של עניין.
  5. להשיג את הנוגדנים העיקריים של החלבונים שנבחרו. בצעו את הכתם המערבי כדי לוודא שהמולקולה הקטנה יכולה לאגד ישירות לחלבונים ביעד הפוטנציאלי24.
    1. העמיסו כמויות שוות של חלבון לתוך הבארות של 8% SDS-דף ג'ל, יחד עם סמן המשקל המולקולרי המתאים. הפעל את ג'ל עבור 30 דקות ב 80 V, לאחר מכן להתאים את המתח כדי 120 V ולהמשיך לרוץ עבור 1 \ u20122 h.
  6. לכמת את להקות חלבון היעד השונים באמצעות עיבוד תמונה וניתוח תוכנה (לראות את הטבלה של חומרים).
  7. נתח את הנתונים וצייר את העקומות.
    1. קביעת עקומת פרוטחרדה לחלבון מטרה
      1. היחס בין החלבון הוא מגוון בעת ביצוע הפרוטפוליזיס. נרמל נתונים מניתוח תמונה על-ידי מייחס את ערכי עוצמת הלהקה המתאימים לרצועות הבלתי מעומות ל-100%.
      2. השתמש בניתוח רגרסיה לא לינארית של הניתוח הסטטיסטי ותוכנת הציור כדי להתוות עיקול של נתונים מנורמל לעוצמת הרצועה היחסית והיחס בין החלבונים: יחסי החלבון.
      3. תחילה, פתח את התוכנה, בחר את סוג הטבלה והגרף כ-XY ואפשר 3 לשכפל ערכים בעמודות משנה זה לצד זה. לאחר מכן הזן את הנתונים המתאימים בשטח שמתחת ל-x ו-y. תחת x, להזין את המספרים 0, 1, 2, 3, 4, 5 (כמקום מחזיקי התאים המתאימים: יחסי חלבון).
      4. בעמודה y, הזן את הנתונים המנורמל עבור עוצמות הרצועה היחסיות. בצע "רגרסיה לא לינארית" ויישם "מינון-תגובה-גירוי" באמצעות "יומן (אגוניסט) לעומת תגובה-מדרון משתנה (ארבעה פרמטרים)" משוואה.
      5. המר את הביאורים של ציר ה-X בעקומה ליחסי החלבון המקבילים.
    2. קביעת עקומת התלות במינון לחלבון מטרה
      הערה: לניתוח התלות במינון, המולגינה של המולקולה הקטנה שונה מכל הדגימות. בינוי יציבה: החלבון יחס צריך להיות מידע על ידי ניתוח של נתונים פרוטפוליזיס. כלומר: יחס החלבון שהראה הבדל מקסימאלי בעוצמת החלבון במהלך עקומת פרוטחרדה צריך לשמש לניסוי התלות במינון.
      1. לכמת את להקות חלבון היעד השונים באמצעות תוכנה ניתוח תמונה. כמו ביצירת עקומת התלות במינון, לנרמל נתונים מניתוח תמונה על ידי מייחס את ערכי עוצמת הלהקה המקבילה הלהקה הפחות מתעכל ל 100%.
      2. החלת ניתוח רגרסיה לא לינארית בניתוח הסטטיסטי ותוכנת הציור לנתונים המנורמלות. תחילה, פתח את התוכנה, בחר את סוג הטבלה והגרף כ-XY, והזן 3 שכפול ערכים בעמודות משנה זה לצד זה.
      3. לאחר מכן, הזן את הנתונים המתאימים בשטח שמתחת ל-x ו-y. למשתנה ' x ', יש להזין ריכוזים שונים של המולקולה הקטנה; ' y ' כולל את הנתונים המנורמל המתאימים לעוצמת הרצועה היחסית.
      4. המרה של ערכי x באמצעות X = Log (X). לבסוף, להעסיק רגרסיה לא לינארית, וליישם גירוי במינון תגובה באמצעות "Log (אגוניסט) לעומת תגובה — מדרון משתנה (ארבעה פרמטרים)" משוואה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תרשים הזרימה של הניסוי מתואר באיור 1. התוצאה של כתמים כחולים Coomassie מוצג באיור 2. הדגירה עם המולקולה הקטנה מקנה הגנה מפני פרוטפוליזיס. שלוש להקות שנראות כהגנה על ידי דגירה עם rapamycin על השליטה ברכב נמצאים. התוצאות הצפויות מניסוי עקומת פרוטחרדה מוצגים באיור 3. כהוכחה לעיקרון, בדקנו את החלבון הנלמד mTOR, שהוא המטרה של התרופה rapamycin25. הכתמים המערביים ממחישה את נוכחותו של חלבון mTOR ביחס נמוך: יחסי החלבון וההפחתה וההפסד ביחס הולך וגובר (איור 3א). פרוטפוליזיס של mTOR על ידי הפרואז הוא מעוכב בבירור על ידי נוכחות של rapamycin ותוספת של rapamycin יוצר משמרת ברורה בעקומת פרוטחרדה (איור 3ב). כדי לחקור את ההשפעות של ריכוז התרופה, שמרו על משתנה קבוע: יחס החלבון בעוד ריכוזים שונים של rapamycin. ככל שהליגוהריכוז מתקרבים למטרת הרוויה, הנוכחות המוגברת של חלבון היעד נצפתה. מינון Rapamycin-בהתלהבות הגדילו את רמת mTOR, מציע את היציבות העולה של mTOR עם טיפול Rapamycin (איור 4א). הכמת של כוונות החלבון היעד מאפשר ייצוג של יציבות היעד כפונקציה של ליגציה וריכוז כפי שהוא לדוגמה על ידי עקומת באיור 4ב. תוצאות אלה מרמזות מאוד כי mTOR הוא חלבון היעד של rapamycin.

Figure 1
איור 1: סכמטית של גישת החצים לניתוח מטרת הסמים למחצה כמותי. ליפוסט התא הוא מודמת בנוכחות או העדר של מולקולה קטנה, ואחריו פרוטפוליזיס ואלקטרופורזה בחלבון. להקות חלבון מוגנות מוכמות. ונתונים לספקטרוסקופיית המונים מטרות חלבונים מזוהים כאלה חלבונים המציגים עמידות פרוטאז מוגברת בנוכחות של המולקולה הקטנה. לאחר מכן, האבן המערבית משמשת לזיהוי ולניתוח חצי-כימות של חלבונים היעד. הנתונים מבוטאים כאמצעי של ± סטיית תקן (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דוגמה להדמיה כחולה של Coomassie של חצים עם מולקולה קטנה rapamycin. נקודות אדומות מאגפים. את הלהקות המוגנות אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: איור של הכמות הנותרת של mTOR נגיש לאיתור כפונקציה של בינוי החלבון: יחס החלבונים המשמש לטיפול 293T תא ליסביטים. (א) הגנה על mtor מ פרוטפוליזיס על ידי rapamycin הוערך על ידי ניתוח כתמי אבן מערבית. (ב) האינטנסיביות של מסגרות mtor היתה בשימוש בניתוח הסטטיסטי ובתוכנת הציור. השורה הייתה מצוידת בעקומה לוגיסטית בעלת ארבעה פרמטרים. הנתונים התקבלו משלושת הניסויים העצמאיים והיו מבוטא כממוצע ± SD. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: איור של כמות mTOR מיוצב נגיש לאיתור בנוכחות של ריכוזים גוברת של rapamycin. lysates תא 293T היו מודבטים עם rapamycin (0, 1, 10, 100, 1000, 10000 nM) עבור 1 h, ואז lysates תא היו חשופים לעיכול ב בינוי: החלבון יחס של 1:400. (א) אפקט הייצוב של rapamycin על mtor הוערך על ידי אבן החשופה המערבי. (ב) האינטנסיביות של מסגרות mtor היתה בשימוש בניתוח הסטטיסטי ובתוכנת הציור. השורה הייתה מצוידת בעקומה לוגיסטית בעלת ארבעה פרמטרים. הנתונים התקבלו משלושת הניסויים העצמאיים והיו מבוטא כממוצע ± SD. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חצים מאפשר זיהוי מטרות מולקולה קטנה על ידי ניצול ההשפעה המגנה של כריכת חלבון נגד השפלה. חצים אינו דורש כל שינוי כימי או השתק של המולקולה הקטנה26. זה מאפשר מולקולות קטנות לשמש כדי לקבוע מטרות החלבון המחייב שלהם ישירה. קריטריוני הערכה סטנדרטיים לשיטת החצים הקלאסיים כוללים כתמים ג'ל, ספקטרומטר מסה וכתמים מערביים12,13. המתודולוגיה הקלאסית מוזכרת גם כי ניתן לנתח את הנתונים הללו, אך לא ניתן לקבל דוגמה כזו. כאן, אנו משתמשים בעקרונות של השינוי התרמי הסלולר (CETSA) כדי לנתח למחצה את הנתונים, ולקבל פרמטרים דומים לאלה שסופקו על ידי CETSA (Tm ו EC50) אשר מגדיל את השירות של ניתוח חצים8. ניתן להתוות את האינטראקציה עם המטרה כנגד הפרואז: יחס החלבון כדי להציג שינויים ברורים בעקומות נגד חרדה. ביצוע החוצה פרוטפוליזיס באמצעות בינוי שונים: יחסי החלבון יכול לעזור בצמצום הריכוז של הפרואז כי יש להשתמש בניסויים במורד הזרם. יתר על כן, באמצעות ריכוז אופטימיזציה של ביואז, הפרוטפוליזיס שבוצעו בנוכחות של ריכוזים שונים של המולקולה הקטנה עשויה לספק מידה עקיפה של הזיקה של המולקולה הקטנה עם חלבון היעד שלה. בנוסף, הדור של עקומת תלות במינון מאפשר קירוב של ההשפעות על חלבונים היעד התלויים על ליגט וריכוז. הכללה של קיבולת אנליטית לתלותיות במינון היא הרחבה רבת עוצמה של מתודולוגיה לחיצים; מתן גישה ישירה ומהירה לחטט במנגנון הטיפולי של מולקולות קטנות. הגישה המבוססת על ג'ל היא הקלה ביותר ליישום. ניתן להשתמש בו להקרנה בתפוקה גבוהה עבור תרכובות המאגד חלבון מסוים20,27,28. בנוסף, ניתן לעשות שימוש בחיצים לניתוח אינטראקציות אמיתיות עם זיקה נמוכה, משום שכביסה אינה כלולה כצעד ניסיוני12,26. יתר על כן, לעומת CETSA חצים יש יתרונות בזיהוי המטרות של חלבונים הממברנה כמו חצים מאפשר הערכה טובה יותר של חלבונים הממברנה באמצעות מתון, ייצוב ניקוי11.

לניסוי יש גם כמה מגבלות. ראשית, כאשר התא ליפוסט יש שפע נמוך של חלבון היעד, שיטת חצים לא ניתן להשתמש כדי להמחיש בקלות שינויים ב פרוטפוליזיס של חלבון היעד. צעדים נוספים לריכוז חלבונים אלה נדרשים על מנת להחיל מתודולוגיה זו. שנית, אנחנו רק לבדוק את rapamycin/mTOR אינטראקציה. האינטראקציה ידועה כחזקה ויציבה. עם זאת, כמה מולקולות קטנות יכול לאגד למטרות שלהם פחות סלקטיבי, או מנוכל, וזה לא ברור אם מולקולות קטנות כאלה ניתן לנתח עם האפשרות הזו. שלישית, כמה חלבונים היעד עשוי להיות רגיש מאוד או עמידים הפרוטסים בשימוש.

ניתוח שיטת חצים מאפשר זיהוי של אינטראקציות חלבון פוטנציאליות באמצעות הערכה של עקומות פרוטנוגד חרדה שנוצר על פני מגוון של בחינה: יחסי חלבון בנוכחות או העדר של מולקולה קטנה ligand. באופן מרגש, השינויים שלנו במתאר הפרוצדורלי הסטנדרטי של השימוש בשיטת חצים מדגישים את יכולת השיטה הזאת לשימוש ביצירת עקומת ריכוז. תפוקות אלה הן של כלי מיוחד בפיתוח התרופה, ומאפשר זיהוי של ריכוזי סמים רלוונטיים המכונה. יתרה מזאת, השוואה בין עקומות של תגובה לריכוז המופק באמצעות ליגניות שונות מציעה תובנות לגבי הכריכה השוואתית של מספר ליגניות של אותו יעד; קיבולת העשויה להיות שימושית בחיזוי של יעילות מולקולה קטנה ועידון של מינון. אנו מקווים כי הדגמה זו של הכוח האנליטי המורחב של החצים תהיה שימושית בפיתוח, יישום והבנה של תרופות מולקולה קטנות, במיוחד עבור ליגטים ומטרות קשה לנתח באמצעות גישות חלופיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי מחקר NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, ומענק מחקר של משרד ההגנה W81XWH-16-1-0482.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Dilute to 20X with ultrapure water
293T cell line ATCC CRL-3216 DMEM medium with 10% FBS
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher 23225
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Cell scraper Thermo Fisher 179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution Bio-Rad 1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma-Aldrich D2650
GraphPad Prism GraphPad Software Version 6.0 statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52 image processing and analysis software
M-PER Cell Lysis Reagent Thermo Fisher 78501
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning R21-040-CV
Pronase Roche PRON-RO 10 mg/ml
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium fluoride Sigma-Aldrich S7920
Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich 450243
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich 221368
Trizma base Sigma-Aldrich T1503 adjust to pH 8.0
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
  2. O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
  3. McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
  4. Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
  5. Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
  6. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
  7. Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
  8. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  9. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  10. Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
  11. Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
  12. Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
  13. Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
  14. Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
  15. Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
  16. Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
  17. Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
  18. Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
  19. Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
  20. Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
  21. Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
  22. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  23. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  24. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
  25. Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
  26. Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
  27. Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
  28. Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).

Tags

ביוכימיה סוגיה 150 משחק דארטס חצי כמותי mTOR ראפצין אינטראקציות יעד
יחסי למחצה כמותית של התרופה מגיב יציבות היעד (חצים) שיטת לימוד האינטראקציה Rapamycin/mTOR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, C., Cui, M., Cui, Y.,… More

Zhang, C., Cui, M., Cui, Y., Hettinghouse, A., Liu, C. j. A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction. J. Vis. Exp. (150), e59656, doi:10.3791/59656 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter