Summary
In questo studio, abbiamo migliorato le capacità di analisi dei dati dell'esperimento DARTS monitorando i cambiamenti nella stabilità delle proteine e stimando l'affinità delle interazioni proteina-ligando. Le interazioni possono essere tracciate in due curve: una curva proteolitica e una curva di dipendenza da dose. Abbiamo usato l'interazione mTOR-rapamycin come caso esemplare.
Abstract
Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) è un metodo robusto per rilevare nuovi bersagli proteici di piccole molecole. Può essere utilizzato per verificare le interazioni noto piccole molecole-proteine e per trovare potenziali bersagli proteici per i prodotti naturali. Rispetto ad altri metodi, i DARS utilizzano molecole native, non modificate, piccole ed è semplice e facile da usare. In questo studio, abbiamo ulteriormente migliorato le capacità di analisi dei dati dell'esperimento DARTS monitorando i cambiamenti nella stabilità delle proteine e stimando l'affinità delle interazioni proteina-ligando. Le interazioni proteina-ligando possono essere tracciate in due curve: una curva proteolitica e una curva dose-dipendenza. Abbiamo usato l'interazione mTOR-rapamycin come caso esemplare per l'istituzione del nostro protocollo. Dalla curva proteolitica abbiamo visto che la proteolisi di mTOR da pronase è stata inibita dalla presenza di raamicina. La curva dose-dipendenza ci ha permesso di stimare l'affinità vincolante di rapamicina e mTOR. Questo metodo è probabilmente un metodo potente e semplice per identificare con precisione nuove proteine bersaglio e per l'ottimizzazione del coinvolgimento del bersaglio farmacologico.
Introduction
Identificare le proteine bersaglio di piccole molecole è essenziale per la comprensione meccanicistica e lo sviluppo di potenziali farmaci terapeutici1,2,3. La cromatografia di affinità, come metodo classico per identificare le proteine bersaglio di piccole molecole, ha prodotto buoni risultati4,5. Tuttavia, questo metodo ha delle limitazioni, in quanto la modifica chimica di piccole molecole spesso si traduce in una specificità o affinità di legame ridotta o alterata. Per superare questi limiti, sono state recentemente sviluppate e applicate diverse nuove strategie per identificare i piccoli bersagli molecolari senza modificachimica delle piccole molecole. Questi metodi diretti per l'identificazione di piccoli obiettivi di piccole molecole prive di etichette includono la stabilità del bersaglio reattiva di affinità farmacologica (DARTS)6, stabilità delle proteine dai tassi di ossidazione (SPROX)7, il saggio cellulare di spostamento termico (CETSA)8 ,9, e tpp proteoma termico (TPP)10. Questi metodi sono altamente vantaggiosi perché usano piccole molecole naturali e non modificate e si basano solo su interazioni di legame diretto per trovare le proteine bersaglio11.
Tra questi nuovi metodi, DARTS è una metodologia relativamente semplice che può essere facilmente adottata dalla maggior parte dei laboratori12,13. I DARS dipendono dal concetto che le proteine legate al ligando dimostrano una suscettibilità modificata alla degradazione enzimatica rispetto alle proteine non legate. La nuova proteina bersaglio può essere rilevata esaminando la banda alterata nel gel SDS-PAGE attraverso la spettrometria di massa di cromatografia liquida (LC-MS/MS). Questo approccio è stato implementato con successo per l'identificazione di obiettivi precedentemente sconosciuti di prodotti naturali e farmaci14,15,16,17,18, 19. È anche potente come mezzo per vagliare o convalidare il legame di composti a una proteina specifica20,21. In questo studio, presentiamo un miglioramento all'esperimento monitorando i cambiamenti nella stabilità delle proteine con piccole molecole e identificando le affinità di legame proteina-ligando. Usiamo l'interazione mTOR- rapamicia come esempio per dimostrare il nostro approccio.
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Protocol
1. Raccogliere e lisire le cellule
- Coltiva 293T cellule utilizzando il mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) con 10% siero bovino fetale, 2 mM di glutammina e 1% antibiotici. Incubare le colture a 37 gradi centigradi al di sotto del 5% di CO2.
NOTA: Lo stato di crescita delle cellule può influenzare la stabilità degli esperimenti successivi. - Espandere le cellule nella coltura fino a raggiungere 80-u201290% confluenza.
- Mescolare 345 l di reagente di lisi cellulare (vedi la Tabella dei Materiali) con 25 - L di 20x cocktail inibitore della proteasi, 25 L di 1 M di fluoruro di sodio, 50 mL di 100 mM-glice; Mantenere il tampone di lisi refrigerato sul ghiaccio.
NOTA: Altri cuscinetti di lisi con vari detergenti (ad esempio, Triton X-100 o NP-40) possono essere utilizzati con i dARTS, purché non siano non denatura. Proteine di membrana o proteine nucleari possono essere estratte con l'aggiunta di 0.4% Triton X-100 o 0.4% NP-40 al lisato cellulare. - Lavare le cellule due volte con la salina fredda tampone di fosfato (PBS).
- Utilizzare un raschietto cellulare per raccogliere le cellule in una quantità appropriata di tampone di lisi cellulare e trasferire le cellule lisciviate in un tubo di 1,5 mL.
NOTA: Il numero di cellule necessarie per ogni esperimento di freccette varia in base alla quantità di proteine che possono essere estratte da varie linee cellulari. In generale, la concentrazione proteica del lisato utilizzata è compresa tra 4,u20126 g/L. Una piastra di 10 cm di cellule 293T a 85,u201290% di confluenza, lised con 300 l di list buffer in genere si traduce in un lisato con una concentrazione proteica di 5g . - Mescolare bene il tampone di lisi / le cellule di liscile e incubare il tubo sul ghiaccio per 10 min.
- Centrifugare il tubo a 18.000 g per 10 min a 4 gradi centigradi.
- Trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 1,5 mL e mantenere raffreddato sul ghiaccio.
- Eseguire un saggio BCA per approssimare la concentrazione proteica di lismi.
2. Incubare le lisa proteiche con la piccola molecola
- Dividere 99 luna di lisa in due tubi da 1,5 mL.
- Fare una concentrazione di stock iniziale di 10 mM piccola molecola. Durante l'esecuzione di dARTS, si può iniziare con una maggiore concentrazione della molecola piccola (5-u201210x il valore EC50) per garantire un legame ottimale.
- Aggiungete 1 l di solvente che la piccola molecola è solubile in o 1 l l di piccole soluzioni di brodo di molecola per ciascuna di lisa aliquota. Incubare le cellule lisa con le soluzioni per 30-u201260 min a temperatura ambiente con agitazione.
- Sul ghiaccio, stabilire diluizioni seriali (1:200, 1:400, 1:800 e 1:1600) di soluzione pronase appena scongelato in 1x TNC (Per 1 mL di 10x TNC tampone, mescolare 300 l di acqua ultrapura con 100 , L di 5 M di clururo di sodio, 100 L di 1 M calcio chloride e 500 ll di 1 M Tris-HCl, pH 8.0).
- Esaminare un'ampia gamma di rapporti pronase/proteine (ad esempio, che vanno da 1:100 a 1:2000) per garantire l'osservabilità dell'effetto graduale della pronase sui bersagli.
NOTA: Per calcolare le concentrazioni di pronase (esempio): concentrazione di 5 g/-L di concentrazione di proteine x 20 campione di proteine, 100 g di proteine. Per un rapporto pronase/proteine di 1:100 abbiamo bisogno di 0,5 g/ . Questo esperimento potrebbe dover essere ripetuto più volte per ottenere una gamma adeguata di rapporti pronase:protein.
3. Eseguire la proteolisi
NOTA: per la proteolisi, i passi vengono eseguiti a temperatura ambiente se non diversamente
- Dopo l'incubazione con la piccola molecola, dividerla in 20 campioni di aliquota.
- Aggiungere 2 l dell'intervallo di soluzioni pronase in ogni campione a intervalli specifici (ogni 30 s). Utilizzare un volume uguale di 1x buffer TNC per stabilire un campione di controllo non digerito.
- Dopo 5-u201220 min, interrompere la digestione tramite l'aggiunta di 2 - L di freddo 20x cocktail inibitore della proteasi ogni 30 s. Mescolare bene e incubare sul ghiaccio per 10 min.
- Diluire i campioni con il volume appropriato di 5x SDS-PAGE tampone di carico e far bollire a 95 gradi centigradi per 5 min.
- Eseguire la parte successiva dell'esperimento o conservare il campione di proteine a 80 gradi centigradi.
4. Quantificazione e analisi
- Dopo DARTS, eseguire la colorazione blu Coomassie secondo il protocollo pubblicato in precedenza22.
- Le fasce proteiche colorate dovrebbero essere molto chiare dopo la destaining. Versare la soluzione di destaina usata e aggiungere una soluzione di acido acetico fresco 1% per coprire il gel. Mettere il gel sotto la luce per osservare le bande con differenze significative tra i gruppi con (gruppo campione) o senza (gruppo di controllo) la piccola molecola.
- Tagliare le due bande corrispondenti dal gel con uno strumento sterile ed eseguire immediatamente LC-MS/MS.
NOTA: LC-MS/MS deve essere fatto il più presto possibile perché le proteine nel gel si degradano continuamente. - Digerire le bande, estrarre peptidi ed eseguire l'analisi LC-MS/MS23.
- Per analizzare i dati LC-MS/MS, identificare prima tutte le proteine nella singola banda. In secondo luogo, utilizzare peptide spectrum match (PSM) per rappresentare l'abbondanza di ogni proteina.
NOTA: PSM fornisce il numero totale di sequenze di peptidi identificate per la proteina, incluse quelle identificate in modo ridondante. In generale, la frequenza con cui un peptide viene identificato/sequenziato può essere utilizzato come una stima approssimativa dell'abbondante proteina nel campione. Le proteine arricchite nel gruppo campione sul gruppo di controllo sono proteine di interesse.
- Per analizzare i dati LC-MS/MS, identificare prima tutte le proteine nella singola banda. In secondo luogo, utilizzare peptide spectrum match (PSM) per rappresentare l'abbondanza di ogni proteina.
- Procurarsi gli anticorpi primari delle proteine selezionate. Eseguire la macchia occidentale per verificare che la piccola molecola possa legarsi direttamente alle potenziali proteine bersaglio24.
- Caricare la stessa quantità di proteine nei pozzi di un gel SDS-PAGE dell'8%, insieme a un marcatore di peso molecolare appropriato. Eseguire il gel per 30 min a 80 V, quindi regolare la tensione a 120 V e continuare a funzionare per 1 -u20122 h.
- Quantificare le diverse bande proteiche target utilizzando un software di elaborazione e analisi delle immagini (si veda la Tabella dei Materiali).
- Analizzare i dati e disegnare le curve.
- Determinazione della curva proteolitica per una proteina bersaglio
- Il rapporto pronano/proteine è variato quando si esegue la proteolisi. Normalizzare i dati dall'analisi dell'immagine attribuendo al 100% i valori di intensità della banda corrispondenti alle bande non digerite.
- Utilizzare l'analisi di regressione non lineare del software di analisi statistica e di disegno per tracciare una curva di dati normalizzati per l'intensità della banda relativa e i rapporti pronase:protein.
- In primo luogo, aprire il software, selezionare il tipo di tabella e grafico come XY e consentire 3 replicare i valori in sottocolonne side-by-side. Quindi immettere i dati corrispondenti nello spazio sottostante x e y. Sotto x, inserisci i numeri 0, 1, 2, 3, 4, 5 (come segnaposto corrispondenti rapporti pronase:protein).
- Nella colonna y, immettere i dati normalizzati per le intensità della banda relativa. Eseguire "Regressione non lineare" e implementare un'equazione "Dose-response-stimulation" utilizzando l'equazione "Log (agonist) e response: Pendenza variabile (quattro parametri)".
- Convertire le annotazioni dell'asse X nella curva nei rapporti pronase:protein corrispondenti.
- Determinazione della curva dose-dipendenza per una proteina bersaglio
NOTA: per l'analisi della dipendenza da dose, la molarità della piccola molecola è diversa da un campione all'altro. Il rapporto pronano/proteina stabile deve essere informato dall'analisi dei dati di proteolisi. Il rapporto pronase/protein che ha mostrato la massima differenza nell'intensità della proteina bersaglio durante la curva proteolitica dovrebbe essere utilizzato per l'esperimento dose-dipendenza.- Quantificare le diverse bande proteiche bersaglio utilizzando un software di analisi delle immagini. Come nella generazione della curva dose-dipendenza, normalizzare i dati dall'analisi dell'immagine attribuendo i valori di intensità della banda corrispondenti alla banda meno digerita al 100%.
- Applicare l'analisi di regressione non lineare all'interno del software di analisi statistica e disegno ai dati normalizzati. In primo luogo, aprire il software, selezionare il tipo di tabella e grafico come XY e immettere 3 valori di replica in sottocolonne side-by-side.
- Quindi, immettere i dati corrispondenti nello spazio sotto x e y. Per la variabile 'x', inserire diverse concentrazioni della piccola molecola; 'y' include i dati normalizzati corrispondenti per l'intensità della banda relativa.
- Trasformare i valori x utilizzando X : Log(X). Infine, impiegano la regressione non lineare e implementano una stimolazione della risposta alla dose utilizzando l'equazione "Log (agonista) e risposta: Pendenza variabile (quattro parametri)".
- Determinazione della curva proteolitica per una proteina bersaglio
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Representative Results
Il diagramma di flusso dell'esperimento è descritto nella figura 1. Il risultato della colorazione blu Coomassie è illustrato nella Figura 2. L'incubazione con la piccola molecola conferisce protezione contro la proteolisi. Vengono trovate tre bande che sembrano essere protette da incubazione con rapamicina sul controllo del veicolo. I risultati attesi dall'esperimento della curva proteolitica sono illustrati nella Figura 3. Come prova di principio, abbiamo esaminato la proteina mTOR ben studiata, che è l'obiettivo per la rapamicia del farmaco25. L'umidità occidentale illustra la presenza di proteine mTOR a bassi rapporti pronase:protein e la sua riduzione e perdita con rapporti crescenti (Figura 3A). La proteolisi di mTOR da pronase è chiaramente inibita dalla presenza di rapamicina e l'aggiunta di rapamicina genera un evidente cambiamento nella curva proteolitica (Figura 3B). Per studiare gli effetti della concentrazione di farmaci, abbiamo mantenuto un rapporto pronano/proteina costante mentre diverse concentrazioni di rapamicina. Poiché la concentrazione di ligando si avvicina alla saturazione del legame bersaglio, si osserva una maggiore presenza di proteine bersaglio. La dose di rapamicina ha migliorato il livello di mTOR, suggerendo l'aumento della stabilità di mTOR con trattamento con rapamicina (Figura 4A). La quantificazione delle intensità della banda proteica bersaglio consente di rappresentazione della stabilità del bersaglio in funzione della concentrazione di ligando, come esemplificato dalla curva nella figura 4B. Questi risultati suggeriscono fortemente che mTOR è la proteina bersaglio della rapamicia.
Figura 1: Schematico dell'approccio dei dARTS per l'analisi semi-quantitativa dell'obiettivo farmacologico. Il lisato cellulare è incubato in presenza o assenza di una piccola molecola, seguita da proteolisi ed elettroforesi proteica. Le bande proteiche protette vengono esordite e sottoposte a spettroscopia di massa. Gli obiettivi proteici sono identificati come quelle proteine che mostrano una maggiore resistenza alla proteasi in presenza della piccola molecola. Quindi western-blot viene utilizzato per identificare e analizzare semi-quantitativamente le proteine bersaglio. I dati sono espressi come mezzi : deviazione standard (SD). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempio di visualizzazione della colorazione blu Coomassie dei dARTS con la piccola molecola raamicina. I puntini rossi fiancheggiano le bande protette. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Illustrazione della quantità rimanente di mTOR accessibile per il rilevamento in funzione del rapporto pronae/proteina utilizzato per il trattamento di 293T lismi cellulari. (A) La protezione della mTOR dalla proteolisi mediante rapamicia è stata valutata mediante analisi delle macchie occidentali. (B) L'intensità delle bande mTOR è stata quantificata utilizzando il software di analisi statistica e di disegno. La linea era dotata di una curva logistica a quattro parametri. I dati sono stati ottenuti dai tre esperimenti indipendenti e sono stati espressi come media - SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Illustrazione della quantità di mTOR stabilizzato accessibile per il rilevamento in presenza di crescenti concentrazioni di rapamicia. 293T lismi cellulari sono stati incubati con rapamicina (0, 1, 10, 100, 1000, 10000 nM) per 1 h, quindi i lismi cellulari sono stati sottoposti a digestione al rapporto pronase:protein di 1:400. (A) L'effetto di stabilizzazione della rapamicicina sulla mTOR è stato valutato da una macchia occidentale. (B) L'intensità delle bande mTOR è stata quantificata utilizzando il software di analisi statistica e di disegno. La linea era dotata di una curva logistica a quattro parametri. I dati sono stati ottenuti dai tre esperimenti indipendenti e sono stati espressi come media - SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I DARS consentono di identificazione di piccoli bersagli molecolari sfruttando l'effetto protettivo del legame proteico contro la degradazione. I DARS non richiedono alcuna modifica chimica o immobilizzazione della piccola molecola26. Questo permette di utilizzare piccole molecole per determinare i loro bersagli proteici di legame diretto. I criteri di valutazione standard per il metodo classico DARTS includono colorazione gel, spettrometria di massa e gonfiore occidentale12,13. La metodologia classica menziona anche che questi dati possono essere analizzati quantitativamente, ma non vi è alcun esempio di questo tipo fornito. Qui, utilizziamo i principi dell'analisi del cambiamento termico cellulare (CETSA) per analizzare in modo semi-quantitativo i dati e ottenere parametri simili a quelli forniti dal CESTA (Tm e EC50) che aumenta l'utilità dell'analisi DARTS8. L'interazione legatura-bersaglio può essere tracciata rispetto al rapporto pronase:protein per mostrare evidenti spostamenti nelle curve proteolitiche. L'esecuzione della proteolisi con diversi rapporti pronase:protein può aiutare a restringere la concentrazione di pronase che dovrebbe essere utilizzata negli esperimenti a valle. Inoltre, utilizzando la concentrazione ottimizzata di pronase, la proteolisi effettuata in presenza di diverse concentrazioni della piccola molecola può fornire una misura indiretta dell'affinità della piccola molecola con la sua proteina bersaglio. Inoltre, la generazione di una curva dose-dipendenza consente di approssimare gli effetti sulle proteine bersaglio dipendenti dalla concentrazione di ligando. L'inclusione della capacità analitica per la dipendenza da dose è una potente espansione della metodologia DARTS; fornendo un approccio diretto e rapido per sondare il meccanismo terapeutico di piccole molecole. Questo approccio basato su gel è il più facile da implementare. Può essere utilizzato per lo screening ad alto throughput per composti che legano una proteina specifica20,27,28. Inoltre, i dARTS possono essere utilizzati per analizzare le interazioni reali con bassa affinità, perché il lavaggio non è incluso come passaggio sperimentale12,26. Inoltre, rispetto a CETSA, i dARTS hanno vantaggi nell'identificare gli obiettivi delle proteine della membrana come DARTS consente una migliore valutazione delle proteine della membrana attraverso l'uso di detergenti lievi e stabilizzanti11.
L'esperimento presenta anche alcune limitazioni. In primo luogo, quando la cellula lisata ha una bassa abbondanza di proteine bersaglio, il metodo DARTS non può essere utilizzato per visualizzare facilmente alterazioni nella proteolisi della proteina bersaglio. Per applicare questa metodologia sono necessari ulteriori passaggi per concentrare queste proteine. In secondo luogo, testiamo solo l'interazione rapamycin/mTOR. L'interazione è nota per essere potente e stabile. Tuttavia, alcune piccole molecole possono legarsi ai loro bersagli meno selettivi, o transitori, e non è chiaro se tali piccole molecole possano essere analizzate con questo saggio. In terzo luogo, alcune proteine bersaglio possono essere estremamente sensibili o resistenti alle proteasi utilizzate.
L'analisi del saggio DARTS consente di l'identificazione di potenziali interazioni proteiche attraverso la valutazione delle curve proteolitiche generate attraverso una gamma di rapporti pronase:proteine in presenza o assenza di un piccolo ligando molecolare. Eccitante, le nostre modifiche al profilo procedurale standard del saggio DARTS evidenziano la capacità di questo metodo di essere utilizzato nella generazione di curva di concentrazione-risposta. Queste uscite sono di particolare utilità nello sviluppo di farmaci, consentendo l'identificazione di concentrazioni di farmaci rilevanti meccanicamente rilevanti. Inoltre, il confronto tra concentrazione e risposta generate utilizzando leganti disparati offre informazioni sulle affinità di legame comparativo per diversi ligandi dello stesso obiettivo; una capacità potenzialmente utile nella previsione dell'efficacia della piccola molecola e nel perfezionamento del dosamento. Ci auguriamo che questa dimostrazione del potere analitico espanso dei DARS sia utile per lo sviluppo, l'implementazione e la comprensione di piccoli farmaci molecolari, in particolare per i ligogi e gli obiettivi difficili da analizzare utilizzando approcci alternativi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni di ricerca NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484 e da una sovvenzione di ricerca DOD W81XWH-16-1-0482.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
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