Summary
I denna studie, vi förbättrat dataanalys kapacitet Dart experiment genom att övervaka förändringar i protein stabilitet och uppskatta affiniteten av protein-ligand interaktioner. Interaktionerna kan plottas i två kurvor: en proteolytisk kurva och en dosberoende kurva. Vi har använt mTOR-rapamycin interaktion som ett exemplariskt fall.
Abstract
Responsiv mål stabilitet för läkemedels tillhörighet (Dart) är en robust metod för detektion av nya mål för små molekyl proteiner. Det kan användas för att kontrollera kända små molekyl-proteininteraktioner och för att hitta potentiella protein mål för naturliga produkter. Jämfört med andra metoder, Dart använder infödda, oförändrade, små molekyler och är enkel och lätt att använda. I denna studie, vi ytterligare förbättrat dataanalys kapacitet Dart experiment genom att övervaka förändringar i protein stabilitet och uppskatta affiniteten av protein-ligand interaktioner. Proteinet-ligand interaktioner kan plottas i två kurvor: en proteolytisk kurva och en dos-beroende kurva. Vi har använt mTOR-rapamycin interaktion som ett exemplariskt fall för inrättandet av vårt protokoll. Från proteolytiska kurvan såg vi att proteolys av mTOR av pronase hämmade av närvaron av rapamycin. Dosberoende kurvan tillät oss att uppskatta bindaffinitet för rapamycin och mTOR. Denna metod kommer sannolikt att vara en kraftfull och enkel metod för att korrekt identifiera nya målproteiner och för optimering av drogen mål engagemang.
Introduction
Identifiera små molekyl målproteiner är avgörande för den mekanistiska förståelsen och utvecklingen av potentiella terapeutiska läkemedel1,2,3. Affinitetskromatografi, som en klassisk metod för att identifiera målproteiner hos små molekyler, har gett goda resultat4,5. Emellertid, denna metod har begränsningar, i att kemisk modifiering av små molekyler resulterar ofta i minskad eller förändrad bindande specificitet eller affinitet. För att övervinna dessa begränsningar har flera nya strategier nyligen utvecklats och tillämpats för att identifiera de små molekyl målen utan kemisk modifiering av de små molekylerna. Dessa direkta metoder för mål identifiering av etikettfria små molekyler inkluderar läkemedels tillhörighet lyhörd mål stabilitet (Dart)6, stabilitet av proteiner från satser av oxidation (sprox)7, cellulära termisk Skift analys (cetsa)8 ,9, och termisk proteomet profilering (TPP)10. Dessa metoder är mycket fördelaktiga eftersom de använder naturliga, oförändrade små molekyler och förlitar sig endast på direkta bindande interaktioner för att hitta målproteiner11.
Bland dessa nya metoder, Dart är en jämförelsevis enkel metod som lätt kan antas av de flesta Labs12,13. Dart beror på konceptet att ligand-bundna proteiner uppvisar modifierad känslighet för enzymatisk nedbrytning i förhållande till obundna proteiner. Det nya målproteinet kan upptäckas genom undersökning av det förändrade bandet i SDS-PAGE gel genom vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS/MS). Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt genomförts för identifiering av tidigare okända mål för naturprodukter och läkemedel14,15,16,17,18, 19. det är också kraftfullt som ett sätt att avskärma eller validera bindning av föreningar till ett specifikt protein20,21. I denna studie, presenterar vi en förbättring av experimentet genom att övervaka förändringar i protein stabilitet med små molekyler och identifiera protein-ligand bindande affiniteter. Vi använder mTOR-rapamycin interaktion som ett exempel för att demonstrera vårt förhållningssätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. samla och lyse celler
- Grow 293T celler med Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) med 10% foster bovint serum, 2 mM glutamin och 1% antibiotika. Inkubera kulturer vid 37 ° c under 5% CO2.
Observera: tillväxt tillståndet för cellerna kan påverka stabiliteten hos efterföljande experiment. - Expandera celler i kulturen tills du når 80 \ u201290% Confluence.
- Blanda 345 μL av celllysreagens (se tabellen med material) med 25 μl cocktail av 20x proteashämmare, 25 μl 1 M natriumfluorid, 50 μl 100 mm β-glycerofosfat, 50 μl 50 mm natriumpyrofosfat och 5 μl 200 mm natrium orthovanadate. Håll lyseringsbufferten kyld på is.
Anmärkning: andra lyseringsbuffertar med olika rengöringsmedel (t. ex. Triton X-100 eller NP-40) kan användas med dart så länge de inte är denaturerande. Membranproteiner eller kärn proteiner kan extraheras genom att tillsätta 0,4% Triton X-100 eller 0,4% NP-40 till cellen lysate. - Tvätta cellerna två gånger med kallfosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Använd en cell skrapa för att samla in cellerna i en lämplig mängd celllysis buffert och överföra lyseringslösning cellerna till en 1,5 mL rör.
Notera: antalet celler som behövs för varje Dart experiment kommer att variera beroende på hur mycket protein kan extraheras från olika cellinjer. I allmänhet är protein koncentrationen av det lysat som används mellan 4 \ u20126 μg/μL. 1 10 cm platta av 293t celler vid 85 \ u201290% confluency, lyserat med 300 μl av lyseringsbufferten vanligtvis resulterar i en lysat med en proteinhalt av ~ 5 μg/μl. - Blanda lysis buffert/lysing celler väl och Inkubera röret på is i 10 min.
- Centrifugera röret vid 18 000 × g i 10 min vid 4 ° c.
- Överför supernatanten till ett nytt 1,5 mL-rör och håll kyld på is.
- Utför en BCA-analys för att approximera protein koncentrationen av Lysates.
2. Inkubera protein celllysat med den lilla molekylen
- Dela 99 μL av lysaterna i två 1,5 mL-rör.
- Gör en start lager koncentration av 10 mM liten molekyl. När du utför Dart, kan man börja med en högre koncentration av den lilla molekylen (5 \ u201210x EC50-värdet) för att säkerställa optimal bindning.
- Tillsätt antingen 1 μL spädningsvätska som den lilla molekylen är löslig i eller 1 μL av småmolekylära stamlösningar till varje alikvot av lysat. Inkubera cell lysate med lösningarna för 30 \ u201260 min vid rumstemperatur med skakning.
- På is, upprätta seriella utspädningar (1:200, 1:400, 1:800 och 1:1600) av nyligen upptinade pronase lösning i 1x TNC (för 1 ml av 10X TNC buffert, blanda 300 μl av ultrarent vatten med 100 μl av 5 m natriumklorid, 100 μl av 1 m kalciumklorid och 500 μL av 1 M Tris-HCl, pH 8,0).
- Undersök en bred bredd av pronase: protein förhållanden (t. ex. spänner från 1:100 till 1:2000) för att garantera observerbarhet av Step-Wise effekten av pronase på mål (s).
Anmärkning: för beräkning av pronaskoncentrationer (exempel): 5 μg/μL proteinkoncentration x 20 μL prov = 100 μg protein. För en pronase: protein förhållandet 1:100 vi behöver 0,5 μg/μL (100 μg ÷ 100 ÷ 2 μL) pronase lösning. Detta experiment kan behöva upprepas flera gånger för att få ett lämpligt intervall av pronase: protein nyckeltal.
3. utför proteolys
Anmärkning: för proteolys utförs steg i rumstemperatur om inget annat anges
- Efter inkubering med den lilla molekylen, dividera varje alikvot med 20 μL prov.
- Tillsätt 2 μL av sortimentet av pronase-lösningar i varje prov med bestämda intervaller (var 30: e s). Använd en lika volym 1x TNC buffert för att upprätta ett osmält kontrollprov.
- Efter 5 \ u201220 min, halt nedbrytning genom tillsats av 2 μL kallt 20x proteashämmare cocktail varje 30 s. Blanda väl och inkubera på isen i 10 min.
- Späd prover med lämplig volym på 5x SDS-PAGE lastbuffert och koka vid 95 ° c i 5 min.
- Utför nästa del av experimentet eller förvara protein provet vid − 80 ° c.
4. kvantifiering och analys
- Efter Dart, utföra Coomassie Blåfärgning enligt tidigare publicerade protokoll22.
- De färgade protein banden bör vara mycket tydliga efter avfärgning. Häll av den använda destain lösning och tillsätt färsk 1% ättiksyra lösning för att täcka gelen. Sätt gelen under ljuset att observera banden med betydande skillnader mellan grupper med (provgrupp) eller utan (kontrollgrupp) den lilla molekylen.
- Skär de två motsvarande banden från gelen med ett sterilt instrument och utför omedelbart LC-MS/MS.
Obs: LC-MS/MS måste göras så snart som möjligt eftersom proteinerna i gelen kommer att försämras kontinuerligt. - Smälta banden, extrahera peptider och utföra LC-MS/MS analys23.
- För att analysera LC-MS/MS data, först identifiera alla proteiner i det enskilda bandet. För det andra, Använd peptid Spectrum match (PSM) för att representera överflödet av varje protein.
Anmärkning: PSM ger det totala antalet identifierade peptidsekvenser för proteinet, inklusive de redundant identifierade. I allmänhet, hur ofta en peptid identifieras/Sequenced kan användas som en grov uppskattning av hur rikligt proteinet är i provet. Proteiner som berikats i prov gruppen över kontrollgruppen är proteiner av intresse.
- För att analysera LC-MS/MS data, först identifiera alla proteiner i det enskilda bandet. För det andra, Använd peptid Spectrum match (PSM) för att representera överflödet av varje protein.
- För att anskaffa de primära antikropparna av de utvalda proteinerna. Utför Western blot för att kontrollera att den lilla molekylen kan binda direkt till de potentiella mål proteinerna24.
- Fyll på lika mycket protein i brunnarna på en 8%-gel med SDS-sida, tillsammans med en lämplig molekylvikt markör. Kör gelen i 30 min vid 80 V, justera sedan spänningen till 120 V och fortsätt köra för 1 \ u20122 h.
- Kvantifiera olika målprotein band med hjälp av bildbehandling och analysprogramvara (se tabellen av material).
- Analysera data och rita kurvorna.
- Bestämning av proteolytisk kurva för ett målprotein
- Den pronase: protein förhållandet är varierat när du utför proteolys. Normalisera data från bildanalys genom att tillräkna bandets intensitetsvärden som motsvarar de osmälta banden till 100%.
- Använd ickelinjär regressionsanalys av den statistiska analysen och ritprogram för att rita en kurva av normaliserade data för relativ bandintensitet och pronase: protein förhållanden.
- Öppna först programvaran, Välj typ av tabell och graf som XY och Tillåt 3 replikera värden i sida-vid-sida-underkolumner. Ange sedan motsvarande data i utrymmet under x och y. Under x, mata in siffrorna 0, 1, 2, 3, 4, 5 (som platshållare motsvarande pronase: protein nyckeltal).
- I kolumnen y anger du de normaliserade data för relativa band intensiteter. Utför "ickelinjär regression" och implementera en "dos-Response-stimulering" med "log (agonist) kontra respons — variabel lutning (fyra parametrar)" ekvation.
- Konvertera X-axelns anteckningar i kurvan till motsvarande pronase: protein förhållanden.
- Bestämning av dosberoende kurva för ett målprotein
Anmärkning: för dosberoende analys, den Molarity av den lilla molekylen skiljer sig åt mellan prover. Den stabila pronase: protein förhållandet bör informeras genom analys av proteolys data. Pronase: protein förhållandet som visade maximal skillnad i målproteinintensitet under den proteolytiska kurvan bör användas för det dosberoende experimentet.- Kvantifiera de olika målprotein banden med hjälp av en bildanalysprogram vara. Som i generering av dosberoende kurvan, normalisera data från bildanalys genom att tillräkna bandet intensitetsvärden som motsvarar det minst smälta bandet till 100%.
- Tillämpa den ickelinjära regressionsanalysen inom den statistiska analysen och ritprogram varan till normaliserade data. Öppna först programvaran, Välj typ av tabell och graf som XY och ange 3 replikera värden i sida-vid-sida-underkolumner.
- Ange sedan motsvarande data i utrymmet under x och y. För variabeln x, mata in olika koncentrationer av den lilla molekylen. "y" innehåller motsvarande normaliserade data för relativ bandintensitet.
- Omvandla x-värden med X = log (X). Slutligen, anställa ickelinjära regression, och genomföra en dos-responsstimulering med hjälp av "log (agonist) kontra svar — variabel lutning (fyra parametrar)" ekvation.
- Bestämning av proteolytisk kurva för ett målprotein
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flödesschema för experimentet beskrivs i figur 1. Resultatet av Coomassie Blåfärgning visas i figur 2. Inkubering med den lilla molekylen ger skydd mot proteolys. Tre band som verkar skyddas av inkubering med rapamycin över fordonskontroll hittas. De förväntade resultaten från experiment med proteolytiska kurvor visas i figur 3. Som ett proof-of-princip, undersökte vi väl studerade protein mTOR, som är målet för drogen rapamycin25. Western blotting illustrerar närvaron av mTOR protein vid låg pronase: protein förhållanden och dess minskning och förlust med ökande nyckeltal (figur 3A). Proteolys av mTOR av pronase hämmas tydligt av närvaron av rapamycin och tillägg av rapamycin genererar en uppenbar förskjutning i den proteolytiska kurvan (figur 3B). För att undersöka effekterna av läkemedelskoncentrationen, behöll vi en konstant pronase: protein förhållande medan varierande koncentrationer av rapamycin. Eftersom ligand koncentration närmar sig bindande mättnad, observeras en ökad förekomst av målprotein. Rapamycin förbättrade dosberoende nivån av mTOR, vilket tyder på ökad stabilitet hos mTOR med rapamycin behandling (figur 4A). Kvantifiering av mål proteinbandens intensitet gör att mål stabiliteten kan företrädas som en funktion av ligand-koncentrationen, vilket exemplifieras av kurvan i figur 4B. Dessa resultat tyder starkt på att mTOR är målet protein av rapamycin.
Figur 1: Schematisk av Dart tillvägagångssätt för drog mål semikvantitativ analys. Cell lysate inkuberas i närvaro eller frånvaro av en liten molekyl, följt av proteolys och proteinelektrofores. Skyddade protein band är exciderade och utsätts för masspektroskopi. Protein mål identifieras som de proteiner som uppvisar ökat proteasresistens i närvaro av den lilla molekylen. Sedan används Western-blot för att identifiera och delvis kvantitativt analysera mål proteinerna. Data uttrycks som medel ± standardavvikelse (SD). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på Coomassie Blåfärgning visualisering av Dart med den lilla molekylen rapamycin. Röda prickar flank de skyddade banden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: illustration av den återstående mängden mTOR som är tillgänglig för detektion som en funktion av pronase: protein-kvoten som används för behandling av 293T-celllysater. A) skydd av mTOR från proteolys genom rapamycin utvärderades genom analys av Western blot. Bintensiteten i mTOR-banden kvantifierades med hjälp av statistisk analys och ritprogram. Linjen utrustades med en logistisk kurva med fyra parametrar. Data erhölls från de tre oberoende experimenten och uttrycktes som medelvärde ± SD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: illustration av mängden stabiliserad mTOR som är tillgänglig för detektion i närvaro av ökande koncentrationer av rapamycin. 293t cell celllysat inkuberades med rapamycin (0, 1, 10, 100, 1000, 10000 nm) för 1 h, då cellen celllysat utsattes för matsmältningen vid pronase: protein förhållandet av 1:400. (A) stabiliserings effekten av rapamycin på mTOR utvärderades av Western blot. Bintensiteten i mTOR-banden kvantifierades med hjälp av statistisk analys och ritprogram. Linjen utrustades med en logistisk kurva med fyra parametrar. Data erhölls från de tre oberoende experimenten och uttrycktes som medelvärde ± SD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dart möjliggör identifiering av små molekyl mål genom att utnyttja den skyddande effekten av proteinbindning mot nedbrytning. Dart kräver inte någon kemisk modifiering eller immobilisering av den lilla molekylen26. Detta gör att små molekyler kan användas för att bestämma deras direkta bindande proteinmål. Standard bedömningskriterier för den klassiska Dart-metoden inkluderar gel färgning, masspektrometri och Western blotting12,13. Den klassiska metoden nämner också att dessa data kan analyseras kvantitativt, men det finns inget sådant exempel. Här använder vi principer för cellulära Thermal Shift assay (CETSA) att semi-kvantitativt analysera data, och få parametrar som liknar dem som tillhandahålls av CESTA (TM och EC50) vilket ökar nyttan av Dart analys8. Den ligand-Target interaktion kan plottas mot pronase: protein förhållande för att Visa uppenbara förändringar i proteolytiska kurvor. Genomföra proteolys med olika pronase: protein nyckeltal kan bidra till att minska koncentrationen av pronase som bör användas i nedströms experiment. Vidare, med hjälp av optimerad koncentration av pronase, proteolys utförs i närvaro av olika koncentrationer av den lilla molekylen kan ge ett indirekt mått på Affiniteten hos den lilla molekylen med dess målprotein. Dessutom tillåter generering av en dosberoende kurva för tillnärmning av effekter på målproteiner beroende på ligand koncentration. Införande av analytisk kapacitet för dosberoende är en kraftfull expansion av Dart metodik; att ge en enkel och snabb metod för att sondera den terapeutiska mekanismen hos små molekyler. Detta gel-baserade tillvägagångssätt är lättast att implementera. Det kan användas för hög genomströmning screening för föreningar som binder ett specifikt protein20,27,28. Dessutom kan Dart utnyttjas för att analysera sanna interaktioner med låg affinitet, eftersom tvättning inte ingår som en experimentell steg12,26. Dessutom, jämfört med CETSA, Dart har fördelar med att identifiera målen för membranproteiner som dart möjliggör en bättre bedömning av membranproteiner genom användning av mild, stabiliserande rengöringsmedel11.
Experimentet har också vissa begränsningar. Först, när cellen lysate har en låg förekomst av målprotein, Dart-metoden kan inte användas för att enkelt visualisera förändringar i proteolys av målproteinet. Ytterligare åtgärder för att koncentrera dessa proteiner krävs för att tillämpa denna metod. För det andra, vi bara testa rapamycin/mTOR interaktion. Interaktionen är känd för att vara potent och stabil. Emellertid, vissa små molekyler kan binda till sina mål mindre selektivt, eller transitivt, och det är inte klart om sådana små molekyler kan analyseras med denna analys. För det tredje kan vissa målproteiner vara extremt känsliga eller resistenta mot de proteaser som används.
Dart assay analys möjliggör identifiering av potentiella proteininteraktioner genom bedömning av proteolytiska kurvor genereras över en rad pronase: protein förhållanden i närvaro eller frånvaro av en liten molekyl ligand. Excitingly, våra ändringar av standarden processuella konturerna av Dart assay belysa kapaciteten hos denna metod som skall användas i generering av koncentration-responskurva. Dessa utgångar är av särskild nytta i läkemedelsutveckling, vilket möjliggör identifiering av mekanistiskt relevanta läkemedelskoncentrationer. Dessutom ger jämförelser av koncentrations-responskurvor som genereras med hjälp av olika ligander insikt i de komparativa bindnings affiniteterna för flera ligander av samma mål. en kapacitet potentiellt användbar i förutsägelse av små molekyl effektivitet och förfining av dosering. Vi hoppas att denna demonstration av utökad analytisk kraft Dart kommer att vara användbar i utvecklingen, genomförandet och förståelsen av små molekyler droger, särskilt för ligander och mål svårt att analysera med hjälp av alternativa metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av NIH forskningsanslag R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, och ett DOD forskningsbidrag W81XWH-16-1-0482.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
- O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
- McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
- Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
- Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
- Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
- Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
- Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
- Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
- Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
- Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
- Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
- Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
- Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
- Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
- Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
- Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
- Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
- Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).
