Summary
في هذه الدراسة، عززنا قدرات تحليل البيانات من تجربة DARTS من خلال رصد التغيرات في استقرار البروتين وتقدير تقارب التفاعلات البروتيني. ويمكن رسم التفاعلات في منحنىين: منحنى بروتيوليتيك ومنحنى الاعتماد على الجرعة. لقد استخدمنا التفاعل بين mTOR-rapamycin كحالة مثالية.
Abstract
استقرار الهدف المستجيب للأدوية (DARTS) هو طريقة قوية للكشف عن أهداف بروتين جزيء صغير جديدة. ويمكن استخدامه للتحقق من التفاعلات الصغيرة المعروفة بين الجزيئات والبروتين والعثور على أهداف البروتين المحتملة للمنتجات الطبيعية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، DARTS يستخدم الأصلي، غير المعدلة، جزيئات صغيرة وبسيطة وسهلة التشغيل. في هذه الدراسة، قمنا بزيادة تعزيز قدرات تحليل البيانات من تجربة DARTS من خلال رصد التغيرات في استقرار البروتين وتقدير تقارب التفاعلات البروتيني. يمكن رسم تفاعلات البروتين ligand في منحنىين: منحنى بروتيوليتيك ومنحنى الاعتماد على الجرعة. لقد استخدمنا التفاعل بين mTOR-rapamycin كحالة مثالية لوضع بروتوكولنا. من منحنى بروتيوليتيك رأينا أن البروتيوليز من mTOR من قبل بروناز كان يمنعها وجود رابامايسين. منحنى الاعتماد على الجرعة سمح لنا لتقدير التقارب ملزمة من رابامايسين وmTOR. ومن المرجح أن تكون هذه الطريقة طريقة قوية وبسيطة لتحديد البروتينات المستهدفة الجديدة بدقة ولتحسين المشاركة المستهدفة في مجال المخدرات.
Introduction
تحديد البروتينات المستهدفة جزيء صغير ضروري لفهم الميكانيكية وتطويرالأدوية العلاجية المحتملة 1،2،3. الكروماتوغرافيا التقارب، كطريقة كلاسيكية لتحديد البروتينات المستهدفة من الجزيئات الصغيرة، وقد أسفرت عن نتائج جيدة4،5. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لها قيود، في أن التعديل الكيميائي للجزيئات الصغيرة غالبا ما يؤدي إلى انخفاض أو تغيير خصوصية ملزمة أو تقارب. وللتغلب على هذه القيود، تم مؤخرا ً وضع وتطبيق عدة استراتيجيات جديدة لتحديد أهداف الجزيئات الصغيرة دون تعديل كيميائي للجزيئات الصغيرة. وتشمل هذه الطرق المباشرة لتحديد الهدف من الجزيئات الصغيرة خالية من الملصقات استقرار الهدف استجابة المخدرات (DARTS)6، واستقرار البروتينات من معدلات الأكسدة (SPROX)7، فحص التحول الحراري الخلوي (CETSA)8 ،9، والحرارية البروتيوم التنميط (TPP)10. هذه الأساليب هي مفيدة للغاية لأنها تستخدم جزيئات طبيعية صغيرة غير معدلة وتعتمد فقط على التفاعلات ملزمة مباشرة للعثور على البروتينات المستهدفة11.
من بين هذه الأساليب الجديدة، DARTS هو منهجية بسيطة نسبيا التي يمكن اعتمادها بسهولة من قبل معظم مختبرات12،13. يعتمد السهام على مفهوم أن البروتينات المرتبطة بالرباط تظهر قابلية معدلة للتحلل الأنزيمي بالنسبة للبروتينات غير المنضمة. ويمكن الكشف عن البروتين المستهدف الجديد عن طريق فحص النطاق المعدل في جل SDS-PAGE من خلال قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS/MS). تم تنفيذ هذا النهج بنجاح لتحديد الأهداف غير المعروفة سابقا من المنتجات الطبيعية والأدوية14،15،16،17،18، 19.كما أنها قوية كوسيلة لفحص أو التحقق من صحة ربط المركبات لبروتين معين20،21. في هذه الدراسة، نقدم تحسينا للتجربة من خلال رصد التغيرات في استقرار البروتين مع الجزيئات الصغيرة وتحديد الروابط ملزمة البروتين-ligand. نحن نستخدم mTOR- rapamycin التفاعل كمثال لإثبات نهجنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جمع وخلايا الليس
- تنمو خلايا 293T باستخدام دولبكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) مع 10٪ مصل البقر الجنين، 2 MM الجلوتامين والمضادات الحيوية 1٪. احتضان الثقافات في 37 درجة مئويةتحت 5٪ CO 2.
ملاحظة: قد تؤثر حالة نمو الخلايا على استقرار التجارب اللاحقة. - توسيع الخلايا في الثقافة حتى تصل إلى 80\u201290٪ التقاء.
- مزيج 345 ميكرولتر من كاشف تحلل الخلية (انظر جدولالمواد) مع 25 ميكرولتر من 20X كوكتيل مثبطات البروتياز، 25 ميكرولتر من 1 M فلوريد الصوديوم، 50 ميكرولتر من 100 مل بيتا غليسيروفوسفات، 50 ميكرولتر من 50 مل بيروفوسفات الصوديوم، و 5 ميكرولتر من 200 مل أورثوديفاناديت الصوديوم. الحفاظ على العازلة lysis المبردة على الجليد.
ملاحظة: يمكن استخدام المخازن العازلة الأخرى للتحلل مع المنظفات المختلفة (على سبيل المثال، تريتون X-100 أو NP-40) مع DARTS طالما أنها غير denaturing. يمكن استخراج بروتينات الغشاء أو البروتينات النووية عن طريق إضافة 0.4٪ تريتون X-100 أو 0.4٪ NP-40 إلى lysate الخلية. - غسل الخلايا مرتين مع الباردة الفوسفات المخزنة المالحة (PBS).
- استخدام مكشطة الخلية لجمع الخلايا في كمية مناسبة من المخزن المؤقت لضخ الخلايا ونقل الخلايا lysing إلى أنبوب 1.5 مل.
ملاحظة: عدد الخلايا اللازمة لكل تجربة DARTS سوف تختلف استناداً إلى كمية البروتين يمكن استخراجها من خطوط الخلايا المختلفة. بشكل عام، تركيز البروتين من lysate المستخدمة بين 4\u20126 ميكروغرام / ميكرولتر. لوحة واحدة 10 سم من الخلايا 293T في 85\u201290٪ الملاءمة، lysed مع 300 ميكرولتر من العازلة lysis عادة ما يؤدي في lysate مع تركيز البروتين من ~ 5 ميكروغرام / ميكرولتر. - خلط الخلايا العازلة lysis / lysing جيدا واحتضان الأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق.
- الطرد المركزي الأنبوب في 18،000 × ز لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية.
- نقل supernatant في أنبوب جديد 1.5 مل والحفاظ على المبردة على الجليد.
- إجراء تحليل BCA لتقريب تركيز البروتين من lysates.
2. يحضن البروتين مع جزيء صغير
- تقسيم 99 درجة مئوية من lysates إلى اثنين من أنابيب 1.5 مل.
- جعل تركيز الأسهم البداية من جزيء صغير 10 mM. عند أداء لعبة السهام، يمكن للمرء أن يبدأ بتركيز أعلى للجزيء الصغير (5\u201210x قيمة EC50) لضمان الربط الأمثل.
- إضافة إما 1 €L من المذيبات أن جزيء صغير قابل للذوبان في أو 1 ميكرولتر من حلول مخزون جزيء صغير إلى كل aliquot من lysate. الحاضنة خلية lysate مع حلول ل 30\u201260 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الهز.
- على الجليد، إنشاء تخفيفات تسلسلية (1:200، 1:400، 1:800 و 1:1600) من محلول pronase المذاب حديثا في 1X الشركات عبر الوطنية (ل1 مل من 10X الشركات عبر الوطنية العازلة، مزيج 300 ميكرولتر من المياه فائقة النقاء مع 100 ميكرو لتر من كلوريد الصوديوم 5 M، 100 ميكرولتر من 1 M كلوريد الكالسيوم ، و 500 درجة مئوية من 1 M Tris-HCl، درجة الحموضة 8.0).
- دراسة واسعة النطاق من pronase: نسب البروتين (على سبيل المثال، تمتد من 1:100 إلى 1:2000) لضمان الملاحظة من تأثير خطوة الحكمة من pronase على الهدف (الأهداف).
ملاحظة: لحساب تركيزات البروناز (مثال): 5 ميكروغرام/ميكرولتر تركيز البروتين × 20 ميكرولتر عينة = 100 ميكروغرام بروتين. لنسبة pronase: البروتين من 1:100 نحن بحاجة إلى 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر (100 ميكروغرام - 100 - 2 ميكرولتر) محلول بروناز. قد تضطر هذه التجربة إلى تكرار عدة مرات للحصول على مجموعة مناسبة من نسب البروتين: pronase.
3. أداء الانُسال اتّبي
ملاحظة: للانهاليس، يتم تنفيذ الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يُذكر خلاف ذلك
- بعد الحضانة مع جزيء صغير، وتقسيم كل aliquot إلى 20 عينات ميكرولتر.
- إضافة 2 μL من مجموعة من الحلول pronase في كل عينة على فترات محددة (كل 30 ثانية). استخدم وحدة تخزين متساوية من المخزن المؤقت للشركات عبر الوطنية 1x لتأسيس نموذج عنصر تحكم غير مهضوم.
- بعد 5\u201220 دقيقة، وقف الهضم عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من الباردة 20X كوكتيل مثبطات البروتياز كل 30 ثانية.
- تمييع العينات مع الحجم المناسب من 5X SDS-PAGE تحميل العازلة وتغلي في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تنفيذ الجزء التالي من التجربة أو تخزين عينة البروتين عند -80 درجة مئوية.
4- القياس الكمي والتحليل
- بعد السهام، وأداء البقع الزرقاء Coomassie وفقا للبروتوكول نشرت سابقا22.
- يجب أن تكون نطاقات البروتين الملون واضحة جداً بعد إزالة البقع. صب قبالة محلول ديستين المستخدمة وإضافة الطازجة 1٪ محلول حمض الخليك لتغطية هلام. وضع هلام تحت الضوء لمراقبة العصابات مع اختلافات كبيرة بين المجموعات مع (مجموعة عينة) أو بدون (مجموعة التحكم) جزيء صغير.
- قطع اثنين من العصابات المقابلة من هلام مع أداة معقمة وأداء LC-MS / MS على الفور.
ملاحظة: LC-MS/MS يجب أن يتم في أقرب وقت ممكن لأن البروتينات في هلام سوف تتحلل باستمرار. - هضم العصابات، واستخراج الببتيدات وإجراء تحليل LC-MS/MS23.
- لتحليل بيانات LC-MS/MS، قم أولاً بتحديد كافة البروتينات في النطاق الفردي. ثانيا، استخدام تطابق طيف الببتيد (PSM) لتمثيل وفرة كل بروتين.
ملاحظة: يوفر PSM العدد الإجمالي لتسلسلات الببتيد المحددة للبروتين، بما في ذلك تلك التي تم تحديدها بشكل زائد. بشكل عام، كيف في كثير من الأحيان يتم تحديد الببتيد / تسلسل يمكن استخدامها كتقدير تقريبي لمدى وفرة البروتين في العينة. البروتينات المخصب في مجموعة العينة على مجموعة التحكم هي البروتينات ذات الأهمية.
- لتحليل بيانات LC-MS/MS، قم أولاً بتحديد كافة البروتينات في النطاق الفردي. ثانيا، استخدام تطابق طيف الببتيد (PSM) لتمثيل وفرة كل بروتين.
- شراء الأجسام المضادة الأولية للبروتينات المختارة. قم بإجراء اللطخة الغربية للتحقق من أن الجزيء الصغير يمكن أن يرتبط مباشرة بالبروتينات المستهدفة المحتملة24.
- تحميل كميات متساوية من البروتين في الآبار من هلام SDS-PAGE 8٪، جنبا إلى جنب مع علامة الوزن الجزيئي المناسبة. تشغيل هلام لمدة 30 دقيقة في 80 V، ثم ضبط الجهد إلى 120 V ومواصلة تشغيل لمدة 1\u20122 ح.
- قياس نطاقات البروتين المستهدفة المختلفة باستخدام برامج معالجة وتحليل الصور (انظر جدولالمواد).
- تحليل البيانات ورسم المنحنيات.
- تحديد المنحنى البروتيوليتيك للبروتين المستهدف
- تختلف نسبة البروتين: pronase عند إجراء البروتيوليز. قم بتطبيع البيانات من تحليل الصورة عن طريق إسناد قيم كثافة النطاق المقابلة للنطاقات غير المهضومة إلى 100%.
- استخدم تحليل الانحدار غير الخطي لبرنامج التحليل الإحصائي والرسم لرسم منحنى من البيانات الطبيعية لكثافة النطاق النسبي ونسب البروتين pronase:.
- أولاً، افتح البرنامج، حدد نوع الجدول والرسم البياني كـ XY والسماح لـ 3 قيم نسخ متماثل في الأعمدة الفرعية جنباً إلى جنب. ثم أدخل البيانات المقابلة في المسافة أدناه س و y. تحت x، إدخال الأرقام 0، 1، 2، 3، 4، 5 (كما أصحاب مكان المقابلة pronase: نسب البروتين).
- في العمود y، أدخل البيانات التي تمت تسويتها لكثافة النطاق النسبي. تنفيذ "الانحدار غير الخطي" وتنفيذ "الجرعة استجابة التحفيز" باستخدام "سجل (مؤثر) مقابل استجابة-الميل المتغير (أربعة معلمات)".
- تحويل التعليقات التوضيحية للمحور س في المنحنى إلى نسب البروتين pronase المقابلة.
- تحديد منحنى الاعتماد على الجرعة للبروتين المستهدف
ملاحظة: لتحليل الاعتماد على الجرعة، يختلف الهوالة من جزيء صغير عبر العينات. يجب أن تكون نسبة البروتين pronase مستقرة مستنيرة من خلال تحليل بيانات البروتيوليسي. وينبغي استخدام نسبة pronase: البروتين التي أظهرت الفرق الأقصى في كثافة البروتين المستهدف خلال منحنى بروتيوليتيك لتجربة الاعتماد على الجرعة.- قم بتحديد نطاقات البروتين المستهدفة المختلفة باستخدام برنامج تحليل الصورة. كما هو الحال في توليد منحنى الاعتماد على الجرعة، تطبيع البيانات من تحليل الصورة عن طريق إسناد قيم كثافة النطاق المقابلة للنطاق الأقل هضما إلى 100٪.
- تطبيق تحليل الانحدار غير الخطي ضمن التحليل الإحصائي وبرنامج الرسم على البيانات التي تمت تسويتها. أولاً، افتح البرنامج، وحدد نوع الجدول والرسم البياني كـ XY، وأدخل 3 قيم نسخ متماثل في الأعمدة الفرعية جنباً إلى جنب.
- ثم أدخل البيانات المقابلة في المسافة أدناه x و y. بالنسبة لمتغير 'x'، إدخال تركيزات مختلفة من الجزيء الصغير؛ تتضمن 'y' البيانات الطبيعية المقابلة لشدة النطاق النسبي.
- تحويل قيم x باستخدام X = Log(X). وأخيراً، استخدم الانحدار غير الخطي، وتنفيذ تحفيز استجابة الجرعة باستخدام معادلة "سجل (مؤثر) مقابل استجابة-الميل المتغير (أربعة معلمات)".
- تحديد المنحنى البروتيوليتيك للبروتين المستهدف
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد مخطط تدفق التجربة في الشكل 1. وتظهر نتيجة تلطيخ الأزرق Coomassie في الشكل 2. الحضانة مع جزيء صغير يمنح الحماية ضد البروتيوليز. تم العثور على ثلاثة العصابات التي يبدو أنها محمية عن طريق الحضانة مع رابامايسين على السيطرة على المركبات. تظهر النتائج المتوقعة من تجربة منحنى البروتيوليتيك في الشكل 3. كدليل على المبدأ، درسنا mTOR البروتين مدروسة جيدا، والذي هو الهدف للrapamycin المخدرات25. النشاف الغربية يوضح وجود بروتين mTOR في pronase منخفضة: نسب البروتين والحد منها وفقدان مع زيادة النسب (الشكل3A). ومن الواضح أن الانحلال البروتيوليسي من قبل برونتي يمنعها وجود رابامايسين وإضافة رابامايسين يولد تحولا واضحا في منحنى بروتيوليتيك (الشكل 3ب). للتحقيق في آثار تركيز المخدرات، حافظنا على نسبة ثابتة: بروتين بروناسي في حين تركيزات متفاوتة من رابامايسين. مع اقتراب تركيز الرباط من تشبع ملزم الهدف، لوحظ وجود متزايد للبروتين المستهدف. Rapamycin جرعة تعتمد على تعزيز مستوى mTOR، مما يشير إلى ارتفاع استقرار mTOR مع علاج رابامايسين (الشكل4A). يسمح القياس الكمي لكثافة نطاق البروتين المستهدف بتمثيل الاستقرار المستهدف كدالة لتركيز الأربطة كما يتضح من المنحنى في الشكل 4B. وتشير هذه النتائج بقوة إلى أن mTOR هو البروتين المستهدف من رابامايسين.
الشكل 1: مخطط لنهج الجوانب غير الكمية للتحليل شبه الكمي المستهدف للمخدرات. يتم احتضان الليسات الخلية في وجود أو عدم وجود جزيء صغير، تليها البروتيوليز والكهربائي البروتين. يتم استئصال نطاقات البروتين المحمية وإخضاعها للتحليل الطيفي الشامل. يتم تحديد أهداف البروتين على أنها تلك البروتينات التي تظهر زيادة مقاومة البروتياز في وجود جزيء صغير. ثم يتم استخدام اللطخة الغربية لتحديد وتحليل شبه كمي البروتينات المستهدفة. يتم التعبير عن البيانات كوسيلة ± الانحراف المعياري (SD). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مثال على كوماسي الأزرق تلطيخ التصور من السهام مع الرابماسين جزيء صغير. النقاط الحمراء تحيط العصابات المحمية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توضيح للكمية المتبقية من mTOR التي يمكن الوصول إليها للكشف عنها كدالة لنسبة البروتين: البروناسي المستخدمة لعلاج الخلايا 293T lysates. (أ) تم تقييم حماية mTOR من البروتيوليز بواسطة رابامايسين من خلال تحليل اللطخة الغربية. (ب) تم تحديد كثافة نطاقات mTOR كمياً باستخدام برمجيات التحليل والرسم الإحصائية. تم تجهيز الخط مع منحنى اللوجستية أربع معلمات. وقد تم الحصول على البيانات من التجارب المستقلة الثلاث وتم التعبير عنها على أنها تعني ± SD. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توضيح لكمية mTOR المستقرة التي يمكن الوصول إليها للكشف في وجود تركيزات متزايدة من رابامايسين. 293T تم احتضان الخلايا lysates مع رابامايسين (0, 1, 10, 100, 10000, 10000 nM) لمدة 1 ساعة, ثم تعرضت lysates الخلية للهضم في نسبة البروتين pronase: من 1:400. (أ) تم تقييم تأثير تثبيت رابامايسين على mTOR من قبل وصمة عار الغربية. (ب) تم تحديد كثافة نطاقات mTOR كمياً باستخدام برمجيات التحليل والرسم الإحصائية. تم تجهيز الخط مع منحنى اللوجستية أربع معلمات. وقد تم الحصول على البيانات من التجارب المستقلة الثلاث وتم التعبير عنها على أنها تعني ± SD. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DARTS يسمح لتحديد أهداف جزيء صغير عن طريق استغلال تأثير وقائي من البروتين ملزمة ضد التدهور. DARTS لا يتطلب أي تعديل كيميائي أو تجميد جزيء صغير26. وهذا يسمح للجزيئات الصغيرة لاستخدامها لتحديد أهدافالبروتين ملزمة مباشرة. معايير التقييم القياسية لطريقة السهام الكلاسيكية تشمل تلطيخ هلام، قياس الطيف الكتلي والنشاف الغربية12،13. وتشير المنهجية التقليدية أيضا إلى أنه يمكن تحليل هذه البيانات كميا، ولكن لا يوجد مثال من هذا القبيل. هنا، نستخدم مبادئ فحص التحول الحراري الخلوي (CETSA) لتحليل البيانات شبه الكمية، والحصول على معلمات مماثلة لتلك التي توفرها CESTA (Tm وEC50) مما يزيد من فائدة تحليل DARTS8. يمكن رسم التفاعل بين الأربطة والهدف ضد نسبة البروتين: بروناسي لعرض التحولات الواضحة في منحنيات بروتيوليتيك. تنفيذ الانللات البروتية باستخدام pronase مختلفة: نسب البروتين يمكن أن تساعد في تضييق تركيز pronase التي ينبغي استخدامها في تجارب المصب. وعلاوة على ذلك، باستخدام التركيز الأمثل للبروناز، فإن البروتيوليس الذي يتم في وجود تركيزات مختلفة من الجزيء الصغير قد يوفر مقياسا غير مباشر لتقارب الجزيء الصغير مع البروتين المستهدف. وبالإضافة إلى ذلك، فإن توليد منحنى الاعتماد على الجرعة يسمح بتقريب الآثار على البروتينات المستهدفة التي تعتمد على تركيز الأربطة. إدراج القدرة التحليلية للاعتماد على الجرعة هو توسع قوي في منهجية اللجنة؛ توفير نهج مباشر وسريع لسبر الآلية العلاجية للجزيئات الصغيرة. هذا النهج القائم على هلام هو أسهل لتنفيذ. ويمكن استخدامه لفحص الإنتاجية العالية للمركبات التي تربط بروتين معين20،27،28. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام DARTS لتحليل التفاعلات الحقيقية مع تقارب منخفض، لأنه لا يتم تضمين الغسيل كخطوة تجريبية12،26. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع CETSA، DARTS له مزايا في تحديد أهداف البروتينات الغشاء كما DARTS يسمح بتقييم أفضل للبروتينات الغشاء من خلال استخدام المنظفات خفيفة، استقرار11.
كما أن التجربة لها بعض القيود. أولا، عندما يكون lysate الخلية وفرة منخفضة من البروتين المستهدف، لا يمكن استخدام طريقة DARTS لتصور بسهولة التعديلات في بروتيوليليس من البروتين المستهدف. ويلزم اتخاذ خطوات إضافية لتركيز هذه البروتينات من أجل تطبيق هذه المنهجية. ثانيا، نحن فقط اختبار التفاعل رابامايسين / mTOR. ومن المعروف أن التفاعل قوي ومستقر. ومع ذلك، قد ترتبط بعض الجزيئات الصغيرة بأهدافها بشكل أقل انتقائية، أو عابرة، وليس من الواضح ما إذا كان يمكن تحليل هذه الجزيئات الصغيرة مع هذا الفحص. ثالثا، قد تكون بعض البروتينات المستهدفة حساسة للغاية أو مقاومة للبروتياز المستخدمة.
يسمح تحليل تقييم السهام بتحديد تفاعلات البروتين المحتملة من خلال تقييم المنحنيات البروتيوليتيك ة التي يتم إنشاؤها عبر مجموعة من نسب البروتين: بروناز في وجود أو عدم وجود ليكاند جزيء صغير. ومن المثير للإثارة أن تعديلاتنا على المخطط الإجرائي القياسي لـ DARTS الاختبار تسلط الضوء على قدرة هذه الطريقة على استخدامها في توليد منحنى التركيز والاستجابة. وهذه النواتج ذات فائدة خاصة في تطوير العقاقير، مما يسمح بتحديد تركيزات المخدرات ذات الصلة من الناحية الآلية. وعلاوة على ذلك، فإن مقارنة منحنيات التركيز والاستجابة المتولدة باستخدام الأربطة المتباينة توفر نظرة ثاقبة على أوجه التقارب المقارنة الملزمة بالنسبة للعديد من الأربطة ذات الهدف نفسه؛ قدرة يمكن أن تكون مفيدة في التنبؤ بفعالية جزيء صغير وصقل الكميات. ونأمل أن يكون هذا العرض من القوة التحليلية الموسعة للـ DARTS مفيدا في تطوير وتنفيذ وفهم أدوية الجزيئات الصغيرة، ولا سيما بالنسبة للأربطة والأهداف التي يصعب تحليلها باستخدام نُهج بديلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المنح البحثية NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, ومنحة بحثية من قبل إدارة الوتّز W81XWH-16-1-0482.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
- O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
- McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
- Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
- Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
- Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
- Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
- Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
- Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
- Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
- Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
- Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
- Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
- Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
- Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
- Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
- Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
- Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
- Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).
