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Biochemistry

Ein semi-quantitativer Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) Assay zur Untersuchung der Rapamycin/mTOR-Interaktion

Published: August 27, 2019 doi: 10.3791/59656
* These authors contributed equally

Summary

In dieser Studie haben wir die Datenanalysefunktionen des DARTS-Experiments verbessert, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität überwacht enden und die Affinität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen schätzen. Die Wechselwirkungen können in zwei Kurven dargestellt werden: eine proteolytische Kurve und eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve. Wir haben die mTOR-rapamycin-Interaktion als beispielhaften Fall genutzt.

Abstract

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) ist eine robuste Methode zum Nachweis neuartiger Proteinziele für kleine Moleküle. Es kann verwendet werden, um bekannte kleine Molekül-Protein-Wechselwirkungen zu überprüfen und potenzielle Proteinziele für natürliche Produkte zu finden. Im Vergleich zu anderen Methoden verwendet DARTS native, unveränderte, kleine Moleküle und ist einfach und einfach zu bedienen. In dieser Studie haben wir die Datenanalysefähigkeiten des DARTS-Experiments weiter verbessert, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität überwachten und die Affinität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen schätzten. Die Protein-Ligand-Wechselwirkungen können in zwei Kurven dargestellt werden: eine proteolytische Kurve und eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve. Wir haben die mTOR-rapamycin Interaktion als beispielhaftes Argument für die Erstellung unseres Protokolls genutzt. Aus der proteolytischen Kurve sahen wir, dass die Proteolyse von mTOR durch Pronase durch das Vorhandensein von Rapamycin gehemmt wurde. Die Dosis-Abhängigkeits-Kurve ermöglichte es uns, die Bindungsaffinität von Ramamycin und mTOR abzuschätzen. Diese Methode ist wahrscheinlich eine leistungsfähige und einfache Methode zur genauen Identifizierung neuartiger Zielproteine und zur Optimierung des Wirkstoffzielengagements.

Introduction

Die Identifizierung kleiner Molekül-Zielproteine ist für das mechanistische Verständnis und die Entwicklung potenzieller therapeutischer Medikamentewesentlich 1,2,3. Die Affinitätschromatographie als klassische Methode zur Identifizierung der Zielproteine kleiner Moleküle hat gute Ergebnisse erbracht4,5. Diese Methode hat jedoch Grenzen, da die chemische Modifikation kleiner Moleküle oft zu einer reduzierten oder veränderten Bindungsspezifität oder Affinität führt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden kürzlich mehrere neue Strategien entwickelt und angewendet, um die kleinen Molekülziele ohne chemische Modifikation der kleinen Moleküle zu identifizieren. Diese direkten Methoden zur Zielidentifikation von etikettenfreien kleinen Molekülen umfassen die wirkstoffaffinitätsresponsive Zielstabilität (DARTS)6, Stabilität von Proteinen aus Oxidationsraten (SPROX)7, zellulärer thermischer Schichtassay (CETSA)8 ,9und thermische proteom profiling (TPP)10. Diese Methoden sind sehr vorteilhaft, da sie natürliche, unveränderte kleine Moleküle verwenden und sich nur auf direkte Bindungswechselwirkungen verlassen, um Zielproteine zu finden11.

Unter diesen neuen Methoden ist DARTS eine vergleichsweise einfache Methode, die leicht von den meisten Labors übernommen werden kann12,13. DARTS hängt von dem Konzept ab, dass Ligandengebundene Proteine eine modifizierte Anfälligkeit für enzymatische Degradation im Vergleich zu ungebundenen Proteinen aufweisen. Das neue Zielprotein kann durch Untersuchung des veränderten Bandes im SDS-PAGE-Gel durch flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) nachgewiesen werden. Dieser Ansatz wurde erfolgreich für die Identifizierung von bisher unbekannten Zielen von Naturprodukten und Medikamenten14,15,16,17,18 , 19. Es ist auch leistungsfähig als Mittel, um die Bindung von Verbindungen an ein bestimmtes Protein zu überprüfen oder zu validieren20,21. In dieser Studie stellen wir eine Verbesserung des Experiments dar, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität mit kleinen Molekülen überwachen und Protein-Ligand-Bindungsaffinitäten identifizieren. Wir verwenden mTOR- rapamycin Interaktion als Beispiel, um unseren Ansatz zu demonstrieren.

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Protocol

1. Sammeln und Lyse-Zellen

  1. Wachsen Sie 293T-Zellen mit Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum, 2 mM Glutamin und 1% Antibiotika. Inkubationskulturen bei 37 °Cunter 5% CO2 .
    HINWEIS: Der Wachstumszustand der Zellen kann die Stabilität nachfolgender Experimente beeinflussen.
  2. Erweitern Sie Zellen in der Kultur bis zum Erreichen des Zusammenflusses von 80 bis 201290%.
  3. Mischen Sie 345 l Zelllysereagenz (siehe Materialtabelle) mit 25 l 20x Protease-Inhibitor-Cocktail, 25 l 1 M Natriumfluorid, 50 l mit 100 mM-Glyzerophosphat, 50 l 50 ml Natriumpyrophosphat und 5 l 200 mM Natriumorthovanadate. Den Lysepuffer gekühlt auf Eis halten.
    HINWEIS: Andere Lysepuffer mit verschiedenen Reinigungsmitteln (z. B. Triton X-100 oder NP-40) können mit DARTS verwendet werden, solange sie nicht denaturing sind. Membranproteine oder Kernproteine können extrahiert werden, indem 0,4% Triton X-100 oder 0,4% NP-40 in das Zelllysat hinzugefügt werden.
  4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit kalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS).
  5. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen in einer geeigneten Menge Zelllysepuffer zu sammeln und die Lysing-Zellen in ein 1,5 ml-Rohr zu übertragen.
    HINWEIS: Die Anzahl der Zellen, die für jedes DARTS-Experiment benötigt werden, hängt davon ab, wie viel Protein aus verschiedenen Zelllinien extrahiert werden kann. Im Allgemeinen liegt die Proteinkonzentration des verwendeten Lysats zwischen 4 und 20126 g/l. Eine 10-cm-Platte mit 293T-Zellen bei 85-u201290%-Konfluenz, lysiert mit 300 l Lysepuffer, führt typischerweise zu einem Lysat mit einer Proteinkonzentration von 5 g/l.
  6. Mischen Sie die Lysepuffer/Lysing-Zellen gut und inkubieren Sie die Röhre auf Eis für 10 min.
  7. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 18.000 g für 10 min bei 4 °C.
  8. Den Überstand in ein neues 1,5 ml Rohr geben und auf Eis gekühlt halten.
  9. Führen Sie einen BCA-Test durch, um die Proteinkonzentration von Lysaten anzunähern.

2. Inkubieren Sie Proteinlysate mit dem kleinen Molekül

  1. Die Lysate mit 99 °L in zwei 1,5 ml-Rohre aufteilen.
  2. Machen Sie eine Anfangsstoffkonzentration von 10 mM kleinen Molekül. Bei der Durchführung von DARTS kann man mit einer höheren Konzentration des kleinen Moleküls (5-u201210x des EC50-Wertes) beginnen, um eine optimale Bindung zu gewährleisten.
    1. Fügen Sie entweder 1 l Lösungsmittel hinzu, dass das kleine Molekül in kleinen Molekül-Stammlösungen löslich ist, oder 1 l kleiner Molekül-Stammlösungen zu jedem Aliquot von Lysat. Zelle mit den Lösungen für 30-u201260 min bei Raumtemperatur mit Schütteln bebrüten.
  3. Auf Eis serielle Verdünnungen (1:200, 1:400, 1:800 und 1:1600) frisch aufgetauter Pronaselösung in 1x TNC (für 1 ml 10x TNC-Puffer, Mischen Sie 300 l Reinstwasser mit 100 l 5 M Natriumchlorid, 100 l und 500 l von 1 M Tris-HCl, pH 8,0).
  4. Untersuchen Sie eine breite Breite der Pronase:Protein-Verhältnisse (z. B. von 1:100 bis 1:2000), um die beobachtungsweise Wirkung der Pronase auf die Ziel(en) zu gewährleisten.
    ANMERKUNG: Zur Berechnung der Pronase-Konzentrationen (Beispiel): 5 -g/l-Proteinkonzentration x 20-L-Probe = 100 g Protein. Für ein Pronase:Protein-Verhältnis von 1:100 benötigen wir eine Pronase-Lösung von 0,5 g/l (100 g bei 100 x 2 ,L). Dieses Experiment muss möglicherweise mehrmals wiederholt werden, um einen geeigneten Bereich von Pronase:Protein-Verhältnissen zu erhalten.

3. Proteolyse durchführen

ANMERKUNG: Bei der Proteolyse werden die Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben

  1. Teilen Sie nach der Inkubation mit dem kleinen Molekül jedes Aliquot in 20 L-Proben auf.
  2. Fügen Sie in jeder Probe in bestimmten Intervallen (alle 30 s) 2 L des Spektrums der Pronase-Lösungen hinzu. Verwenden Sie ein gleiches Volumen von 1x TNC-Puffer, um eine unverdaute Kontrollprobe einzurichten.
  3. Nach 5-u201220 min die Verdauung durch Zugabe von 2 l kalten 20x Protease-Hemmer-Cocktail alle 30 s stoppen. Gut mischen und 10 min auf Eis brüten.
  4. Proben mit dem entsprechenden Volumen von 5x SDS-PAGE Ladepuffer verdünnen und bei 95 °C 5 min kochen.
  5. Führen Sie den nächsten Teil des Experiments durch oder lagern Sie die Proteinprobe bei 80 °C.

4. Quantifizierung und Analyse

  1. Führen Sie nach DARTS Coomassie blaue Färbung nach dem zuvor veröffentlichten Protokoll22durch.
  2. Die gefärbten Proteinbänder sollten nach dem Entsalzen sehr klar sein. Gießen Sie die verwendete Destain-Lösung ab und fügen Sie frische 1% Essigsäurelösung hinzu, um das Gel zu bedecken. Setzen Sie das Gel unter das Licht, um die Bänder mit signifikanten Unterschieden zwischen Gruppen mit (Probengruppe) oder ohne (Kontrollgruppe) das kleine Molekül zu beobachten.
  3. Schneiden Sie die beiden entsprechenden Bänder aus dem Gel mit einem sterilen Instrument und führen Sie LC-MS/MS sofort auf.
    HINWEIS: LC-MS/MS muss so schnell wie möglich durchgeführt werden, da die Proteine im Gel kontinuierlich abgebaut werden.
  4. Verdauen Sie die Bänder, extrahieren Sie Peptide und führen Sie die LC-MS/MS-Analyse23durch.
    1. Um LC-MS/MS-Daten zu analysieren, identifizieren Sie zunächst alle Proteine im einzelnen Band. Zweitens verwenden Sie Peptidspektrum-Match (PSM), um die Fülle jedes Proteins darzustellen.
      HINWEIS: PSM liefert die Gesamtzahl der identifizierten Peptidsequenzen für das Protein, einschließlich der redundant identifizierten. Im Allgemeinen kann die Art und Weise, wie oft ein Peptid identifiziert/sequenziert wird, als grobe Schätzung der Fülle des Proteins in der Probe verwendet werden. Proteine, die in der Probengruppe über die Kontrollgruppe angereichert sind, sind Proteine von Interesse.
  5. Beschaffen Sie die primären Antikörper der ausgewählten Proteine. Führen Sie einen westlichen Blot durch, um zu überprüfen, ob das kleine Molekül direkt an die potenziellen Zielproteine binden kann24.
    1. Laden Sie gleiche Mengen an Protein in die Brunnen eines 8% SDS-PAGE Gels, zusammen mit einem geeigneten Molekulargewichtsmarker. Führen Sie das Gel 30 min bei 80 V aus, stellen Sie dann die Spannung auf 120 V ein und fahren Sie weiter für 1-u20122 h.
  6. Quantifizieren Sie die verschiedenen Zielproteinbänder mit Bildverarbeitungs- und Analysesoftware (siehe Materialtabelle).
  7. Analysieren Sie die Daten und zeichnen Sie die Kurven.
    1. Bestimmung der proteolytischen Kurve für ein Zielprotein
      1. Das Pronase:Protein-Verhältnis wird bei der Proteolyse variiert. Normalisieren Sie Daten aus der Bildanalyse, indem Sie die Bandintensitätswerte, die den unverdauten Bändern entsprechen, 100 % zuordnen.
      2. Verwenden Sie die nichtlineare Regressionsanalyse der statistik- und zeichnungssoftware, um eine Kurve normalisierter Daten für relative Bandintensität und Pronase:Protein-Verhältnisse darzustellen.
      3. Öffnen Sie zunächst die Software, wählen Sie den Tabellentyp und das Diagramm als XY aus und lassen Sie 3 Replikationswerte in nebeneinander liegenden Unterspalten zu. Geben Sie dann die entsprechenden Daten in den Bereich unter x und y ein. Geben Sie unter x die Zahlen 0, 1, 2, 3, 4, 5 ein (als Platzhalter entsprechende Pronase:Protein-Verhältnisse).
      4. Geben Sie in der y-Spalte die normalisierten Daten für relative Bandintensitäten ein. Führen Sie "Nichtlineare Regression" durch und implementieren Sie eine "Dosis-Response-Stimulation" mit der Gleichung "Log (Agonist) versus Response —Variable Neigung (vier Parameter)".
      5. Konvertieren Sie die Anmerkungen der X-Achse in der Kurve in die entsprechenden Pronase:Protein-Verhältnisse.
    2. Bestimmung der Dosis-Abhängigkeits-Kurve für ein Zielprotein
      HINWEIS: Für die Dosis-Abhängigkeits-Analyse ist die Molarität des kleinen Moleküls in den Proben unterschiedlich. Das stabile Pronase:Protein-Verhältnis sollte durch DieAnalyse von Proteolysedaten informiert werden. Das Pronase:Protein-Verhältnis, das den maximalen Unterschied in der Zielproteinintensität während der proteolytischen Kurve zeigte, sollte für das Dosisabhängigkeitsexperiment verwendet werden.
      1. Quantifizieren Sie die verschiedenen Zielproteinbänder mit einer Bildanalysesoftware. Wie bei der Generierung der Dosis-Abhängigkeits-Kurve normalisieren Sie Daten aus der Bildanalyse, indem Sie die Bandintensitätswerte, die dem am wenigsten verdauten Band entsprechen, 100 % zuordnen.
      2. Wenden Sie die nichtlineare Regressionsanalyse innerhalb der Statistik- und Zeichnungssoftware auf die normalisierten Daten an. Öffnen Sie zunächst die Software, wählen Sie den Tabellentyp und das Diagramm als XY aus, und geben Sie 3 Replikationswerte in nebeneinander anseitigen Unterspalten ein.
      3. Geben Sie dann die entsprechenden Daten in den Bereich unter x und y ein. Geben Sie für die Variable "x" unterschiedliche Konzentrationen des kleinen Moleküls ein; 'y' enthält die entsprechenden normalisierten Daten für die relative Bandintensität.
      4. Transformieren Sie x-Werte mit X = Log(X). Verwenden Sie schließlich die nichtlineare Regression, und implementieren Sie eine Dosis-Wirkungs-Stimulation mit der Gleichung "Log (Agonist) versus Response –Variable Neigung (vier Parameter)".

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Representative Results

Das Flussdiagramm des Experiments ist in Abbildung 1dargestellt. Das Ergebnis der Blauen Färbung von Coomassie ist in Abbildung 2dargestellt. Die Inkubation mit dem kleinen Molekül bietet Schutz gegen Proteolyse. Es werden drei Bänder gefunden, die durch Inkubation mit Rapamycin über fahrzeugkontrolle geschützt zu sein scheinen. Die erwarteten Ergebnisse aus dem proteolytischen Kurvenexperiment sind in Abbildung 3dargestellt. Als Proof-of-Prinzip haben wir das gut untersuchte Protein mTOR untersucht, das das Ziel für das Medikament Rapamycin25ist. Western Blotting veranschaulicht das Vorhandensein von mTOR-Protein bei niedrigen Pronase:Protein-Verhältnissen und seine Reduktion und Verlust mit steigenden Verhältnissen (Abbildung 3A). Die Proteolyse von mTOR durch Pronase wird durch das Vorhandensein von Ramamycin deutlich gehemmt und die Zugabe von Ramamycin erzeugt eine offensichtliche Verschiebung der proteolytischen Kurve (Abbildung 3B). Um die Auswirkungen der Arzneimittelkonzentration zu untersuchen, hielten wir ein konstantes Pronase:Protein-Verhältnis bei unterschiedlichen Konzentrationen von Rapamycin. Da sich die Ligandenkonzentration der Zielbindung nähert, wird eine erhöhte Anwesenheit von Zielprotein beobachtet. Rapamycin dosisabhängig verbesserte das Niveau von mTOR, was auf die steigende Stabilität von mTOR mit Rapamycin-Behandlung hindeutet (Abbildung 4A). Die Quantifizierung der Zielproteinbandintensitäten ermöglicht die Darstellung der Zielstabilität in Abhängigkeit von der Ligandenkonzentration, wie sie durch die Kurve in Abbildung 4Bveranschaulicht wird. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass mTOR das Zielprotein von Rapamycin ist.

Figure 1
Abbildung 1: Schematic des DARTS-Ansatzes für die semiquantitative Analyse von Wirkstoffzielen. Zelllysat wird in Gegenwart oder Abwesenheit eines kleinen Moleküls inkubiert, gefolgt von Proteolyse und Proteinelektrophorese. Geschützte Proteinbänder werden ausgeschnitten und einer Massenspektroskopie unterzogen. Proteinziele werden als Proteine identifiziert, die eine erhöhte Proteaseresistenz in Gegenwart des kleinen Moleküls aufweisen. Dann wird Western-Blot verwendet, um die Zielproteine zu identifizieren und semiquantitativ zu analysieren. Die Daten werden als Mittel ausgedrückt, die Standardabweichung (SD). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Beispiel für Coomassie blaue Färbung Visualisierung von DARTS mit dem kleinen Molekül Rapamycin. Rote Punkte flankieren die geschützten Bänder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Abbildung der verbleibenden mTOR-Menge, die als Funktion des Pronase:Protein-Verhältnisses zur Behandlung von 293T-Zelllysaten zur Detektion zugänglich ist. (A) Der Schutz von mTOR vor Proteolyse durch Rapamycin wurde durch Western-Blot-Analyse bewertet. (B) Die Intensität der mTOR-Bänder wurde mit Hilfe der statistischen Analyse- und Zeichensoftware quantifiziert. Die Strecke wurde mit einer vierparametern logistischen Kurve ausgestattet. Die Daten wurden aus den drei unabhängigen Experimenten gewonnen und als Mittelwert sD ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Abbildung der Menge des stabilisierten mTOR, der bei zunehmender Rapamycinkonzentration nachweisbar ist. 293T Zelllysate wurden mit Rapamycin (0, 1, 10, 100, 1000, 10000 nM) für 1 h inkubiert, dann wurden die Zelllysate im Pronase:Protein-Verhältnis von 1:400 verdaut. (A) Der Stabilisierungseffekt von Rapamycin auf mTOR wurde von Western Blot bewertet. (B) Die Intensität der mTOR-Bänder wurde mit Hilfe der statistischen Analyse- und Zeichensoftware quantifiziert. Die Strecke wurde mit einer vierparametern logistischen Kurve ausgestattet. Die Daten wurden aus den drei unabhängigen Experimenten gewonnen und als Mittelwert sD ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

DARTS ermöglicht die Identifizierung kleiner Molekülziele, indem die schützende Wirkung der Proteinbindung gegen Abbau genutzt wird. DARTS erfordert keine chemische Modifikation oder Immobilisierung des kleinen Moleküls26. Dadurch können kleine Moleküle verwendet werden, um ihre direkten Bindungsproteinziele zu bestimmen. Zu den Standardbewertungskriterien für die klassische DARTS-Methode gehören Gelfärbung, Massenspektrometrie und Western Blotting12,13. Die klassische Methodik erwähnt auch, dass diese Daten quantitativ analysiert werden können, aber es gibt kein solches Beispiel. Hier verwenden wir Prinzipien des zellulären thermischen Schicht-Assays (CETSA), um die Daten semiquantitativ zu analysieren und Parameter zu erhalten, die denen von CESTA (Tm und EC50) ähneln, was den Nutzen der DARTS-Analyse8erhöht. Die Liganden-Ziel-Interaktion kann gegen pronase:protein-Verhältnis dargestellt werden, um offensichtliche Verschiebungen in proteolytischen Kurven anzuzeigen. Die Durchführung der Proteolyse mit unterschiedlichen Pronase:Protein-Verhältnissen kann helfen, die Pronase-Konzentration, die in nachgelagerten Experimenten verwendet werden sollte, zu verengen. Darüber hinaus kann die proteolyse, die in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des kleinen Moleküls durchgeführt wird, mit der optimierten Pronasekonzentration ein indirektes Maß für die Affinität des kleinen Moleküls mit seinem Zielprotein liefern. Darüber hinaus ermöglicht die Erzeugung einer Dosis-Abhängigkeits-Kurve eine Annäherung der Wirkungen auf Zielproteine, die von der Ligandenkonzentration abhängig sind. Die Einbeziehung der analytischen Kapazität für die Dosisabhängigkeit ist eine starke Erweiterung der DARTS-Methodik; bietet einen einfachen und schnellen Ansatz, um den therapeutischen Mechanismus kleiner Moleküle zu untersuchen. Dieser gelbasierte Ansatz ist am einfachsten zu implementieren. Es kann für High-Throughput-Screening für Verbindungen verwendet werden, die ein bestimmtes Proteinbinden 20,27,28. Darüber hinaus kann DARTS für die Analyse echter Wechselwirkungen mit geringer Affinität verwendet werden, da Waschen nicht als experimenteller Schritt12,26enthalten ist. Darüber hinaus hat DARTS im Vergleich zu CETSA Vorteile bei der Identifizierung der Ziele von Membranproteinen, da DARTS eine bessere Bewertung von Membranproteinen durch den Einsatz von milden, stabilisierenden Reinigungsmitteln ermöglicht11.

Das Experiment hat auch einige Einschränkungen. Erstens, wenn das Zelllysat eine geringe Fülle an Zielprotein hat, kann die DARTS-Methode nicht verwendet werden, um Veränderungen in der Proteolyse des Zielproteins leicht zu visualisieren. Um diese Methode anzuwenden, sind zusätzliche Schritte zur Konzentration dieser Proteine erforderlich. Zweitens testen wir nur die Interaktion mit Rapamycin/mTOR. Die Interaktion ist bekannt, potent und stabil zu sein. Jedoch, einige kleine Moleküle können an ihre Ziele weniger selektiv binden, oder vorübergehend, und es ist nicht klar, ob solche kleinen Moleküle mit diesem Test analysiert werden können. Drittens können einige Zielproteine extrem empfindlich oder resistent gegen die verwendeten Proteasen sein.

Die DARTS-Assay-Analyse ermöglicht die Identifizierung potenzieller Proteinwechselwirkungen durch die Bewertung proteolytischer Kurven, die in Gegenwart oder Abwesenheit eines kleinen Molekülligands über eine Reihe von Pronase:Protein-Verhältnissen erzeugt werden. Spannenderweise unterstreichen unsere Änderungen an der Standard-Prozedurumrisslinie des DARTS-Assays die Fähigkeit dieser Methode, bei der Erzeugung von Konzentrations-Antwort-Kurven verwendet zu werden. Diese Ergebnisse sind von besonderem Nutzen in der Arzneimittelentwicklung und ermöglichen die Identifizierung mechanistisch relevanter Arzneimittelkonzentrationen. Darüber hinaus bietet der Vergleich von Konzentrations-Wirkungs-Kurven, die mit unterschiedlichen Liganden erzeugt werden, Einen Einblick in die vergleichenden Bindungsaffinitäten für mehrere Liganden desselben Ziels; eine Kapazität, die bei der Vorhersage der Wirksamkeit kleiner Moleküle und der Verfeinerung der Dosierung potenziell nützlich ist. Wir hoffen, dass diese Demonstration der erweiterten analytischen Kraft von DARTS bei der Entwicklung, Umsetzung und dem Verständnis von kleinen Molekülmedikamenten nützlich sein wird, insbesondere für Liganden und Ziele, die mit alternativen Ansätzen schwer zu analysieren sind.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH-Forschungsstipendien R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484 und ein DOD-Forschungsstipendium W81XWH-16-1-0482 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Dilute to 20X with ultrapure water
293T cell line ATCC CRL-3216 DMEM medium with 10% FBS
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher 23225
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Cell scraper Thermo Fisher 179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution Bio-Rad 1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma-Aldrich D2650
GraphPad Prism GraphPad Software Version 6.0 statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52 image processing and analysis software
M-PER Cell Lysis Reagent Thermo Fisher 78501
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning R21-040-CV
Pronase Roche PRON-RO 10 mg/ml
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium fluoride Sigma-Aldrich S7920
Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich 450243
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich 221368
Trizma base Sigma-Aldrich T1503 adjust to pH 8.0
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

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References

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