Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rapamycin/mTOR बातचीत के अध्ययन के लिए एक अर्द्ध मात्रक औषध आत्मीयता उत्तरदायी लक्ष्य स्थिरता (DARTS) परख

Published: August 27, 2019 doi: 10.3791/59656
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Department of Orthopaedic Surgery, New York University Medical Center, 2Department of Cell Biology, New York University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन में, हमने प्रोटीन स्थिरता में परिवर्तनों की निगरानी करके और प्रोटीन-लिगंड अन्योन्यक्रियाओं की समानता का आकलन करके डार्ट्स प्रयोग की डेटा विश्लेषण क्षमताओं को बढ़ाया है। बातचीत दो घटता में प्लॉट किया जा सकता है: एक प्रोटीओलिटिक वक्र और एक खुराक निर्भरता वक्र. हमने एक अनुकरणीय मामले के रूप में MTOR-rapamycin बातचीत का उपयोग किया है।

Abstract

दवा आत्मीयता उत्तरदायी लक्ष्य स्थिरता (DARTS) उपन्यास छोटे अणु प्रोटीन लक्ष्य का पता लगाने के लिए एक मजबूत तरीका है. यह ज्ञात छोटे अणु प्रोटीन बातचीत सत्यापित करने के लिए और प्राकृतिक उत्पादों के लिए संभावित प्रोटीन लक्ष्य खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य तरीकों के साथ तुलना में, DARTS देशी, असंशोधित, छोटे अणुओं का उपयोग करता है और सरल और संचालित करने के लिए आसान है. इस अध्ययन में, हमने प्रोटीन स्थिरता में परिवर्तनों की निगरानी करके और प्रोटीन-लिगन्ड अन्योन्यक्रियाओं की समानता का आकलन करके डार्ट्स प्रयोग की डेटा विश्लेषण क्षमताओं को और बढ़ाया है। प्रोटीन-लिगंड अन्योन्यक्रियाओं को दो वक्रों में प्लॉट किया जा सकता है: एक प्रोटीओलिटिक वक्र और एक खुराक-निर्भरता वक्र। हमने अपने प्रोटोकॉल की स्थापना के लिए एक अनुकरणीय मामले के रूप में MTOR-rapamycin बातचीत का उपयोग किया है। प्रोटीओलिटिक वक्र से हमने देखा कि प्रोनेस द्वारा एमडीओआर का प्रोटीओलिसिस रैपामाइसिन की उपस्थिति से बाधित था। खुराक निर्भरता वक्र हमें rapamycin और MTOR के बंधन संबंध का अनुमान लगाने की अनुमति दी. इस विधि को सही उपन्यास लक्ष्य प्रोटीन की पहचान करने के लिए और दवा लक्ष्य सगाई के अनुकूलन के लिए एक शक्तिशाली और सरल तरीका होने की संभावना है.

Introduction

छोटे अणु लक्ष्य प्रोटीन की पहचान करने के लिए मशीनी समझ और संभावित चिकित्सीय दवाओं के विकास के लिए आवश्यक है1,2,3. छोटे अणुओं के लक्ष्य प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक शास्त्रीय विधि के रूप में एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी ने अच्छे परिणामदिए हैं 4,5. हालांकि, इस विधि की सीमाएं हैं, छोटे अणुओं के उस रासायनिक संशोधन में अक्सर कम या परिवर्तित बंधन विशिष्टता या समानता में परिणाम. इन सीमाओं को दूर करने के लिए, कई नई रणनीतियों हाल ही में विकसित किया गया है और छोटे अणुओं के रासायनिक संशोधन के बिना छोटे अणु लक्ष्यों की पहचान करने के लिए लागू किया गया है. लेबल मुक्त छोटे अणुओं के लक्ष्य की पहचान के लिए इन प्रत्यक्ष तरीकों दवा आत्मीयता उत्तरदायी लक्ष्य स्थिरता (DARTS)6, ऑक्सीकरण की दर से प्रोटीन की स्थिरता (SPROX)7, सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख (CETSA) 8 शामिल हैं ,9, और थर्मल प्रोटीओम प्रोफाइलिंग (TPP)10. ये विधियाँ अत्यधिक लाभप्रद हैं क्योंकि वे प्राकृतिक, असंशोधित छोटे अणुओं का उपयोग करते हैं और लक्ष्य प्रोटीन11को खोजने के लिए केवल प्रत्यक्ष बाध्यकारी अन्योन्यक्रियाओं पर निर्भर करते हैं।

इन नए तरीकों में , डार्ट्स एक अपेक्षाकृत सरल पद्धति है जिसे अधिकांश प्रयोगशालाओं12,13द्वारा आसानी से अपनाया जा सकता है . डार्ट्स अवधारणा पर निर्भर करता है कि ligand बाध्य प्रोटीन असीम प्रोटीन के सापेक्ष एंजाइमी गिरावट के लिए संशोधित संवेदनशीलता का प्रदर्शन. नए लक्ष्य प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस /एमएस) के माध्यम से एसडीएस-पेज जेल में परिवर्तित बैंड की परीक्षा द्वारा पता लगाया जा सकता है। प्राकृतिक उत्पादों और औषधियों के पूर्व अज्ञात लक्ष्यों की पहचान के लिए इस दृष्टिकोण को सफलतापूर्वक कार्यान्वित किया गया है14,15,16,17,18, 19. यह एक विशिष्ट प्रोटीन20,21के यौगिकों के बंधन की जांच या सत्यापन करने के साधन के रूप में भी शक्तिशाली है . इस अध्ययन में, हम छोटे अणुओं के साथ प्रोटीन स्थिरता में परिवर्तन की निगरानी और प्रोटीन-लिगंड बाध्यकारी सजातीयता की पहचान करके प्रयोग में सुधार प्रस्तुत करते हैं। हम अपने दृष्टिकोण को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में MTOR-rapamycin बातचीत का उपयोग करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. लीजिए और lyse कोशिकाओं

  1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 एमएम ग्लूटामाइन और 1% एंटीबायोटिक दवाओं के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) का उपयोग कर 293T कोशिकाओं हो जाना। 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट संस्कृतियों ।
    नोट: कोशिकाओं की वृद्धि की स्थिति बाद के प्रयोगों की स्थिरता को प्रभावित कर सकता है.
  2. संस्कृति में कोशिकाओं का विस्तार करें जब तक तक तक 80$u201290% संगम तक पहुँचने.
  3. मिक्स 345 डिग्री सेल्सियस सेल lysis अभिकर्मक के (सामग्री की तालिकादेखें) 20x प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के 25 डिग्री सेल्सियस के साथ, 1 एम सोडियम फ्लोराइड के 25 डिग्री सेल्सियस, 100 एमएम के 50 डिग्री सेल्सियस --ग्लिसरफॉस्फेट, 50 डिग्री सेल्सियस सोडियम पायरोफोस्फेट, और 200 मीटर की सोडियम पायरोटेट के 5 डिग्री सेल्सियस। lysis बफर बर्फ पर ठंडा रखें.
    नोट: विभिन्न डिटर्जेंट के साथ अन्य lysis बफ़र्स (जैसे, Triton एक्स-100 या एनपी-40) जब तक वे गैर-denaturing हैं के रूप में DARTS के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. झिल्ली प्रोटीन या परमाणु प्रोटीन 0.4% Triton X-100 या 0.4% एनपी-40 कोशिका lysate को जोड़कर निकाला जा सकता है.
  4. कोशिकाओं को दो बार ठंडे फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) से धोएं।
  5. सेल lysis बफर की एक उचित राशि में कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एक 1.5 एमएल ट्यूब में lysing कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए एक सेल खुरचनी का प्रयोग करें।
    नोट: प्रत्येक डार्ट्स प्रयोग के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या कितना प्रोटीन विभिन्न सेल लाइनों से निकाला जा सकता है के आधार पर अलग अलग होंगे. सामान्य तौर पर, उपयोग किए जाने वाले लाइसेट की प्रोटीन सांद्रता 4$u20126 g/$L के बीच होती है। 85$u201290% संगम पर 293T कोशिकाओं की एक 10 सेमी प्लेट, lysis बफर के 300 डिग्री एल के साथ lysed आम तौर पर एक प्रोटीन की एकाग्रता के साथ एक lysate में परिणाम $5 $g/
  6. lysis बफर / lysing कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिलाएं और 10 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब incubate.
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ट्यूब 18,000 डिग्री ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  8. सुपरनेंट को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर ठंडा रखें।
  9. lysates के प्रोटीन एकाग्रता अनुमानित करने के लिए एक बीसीए परख प्रदर्शन.

2. छोटे अणु के साथ इनक्यूबेट प्रोटीन lysates

  1. lysates के 99 डिग्री सेल्सियस को दो 1.5 एमएल ट्यूबों में विभाजित करें।
  2. 10 मम छोटे अणु की प्रारंभिक स्टॉक सांद्रता कीजिए। जब DARTS प्रदर्शन, एक छोटे अणु के एक उच्च एकाग्रता के साथ शुरू हो सकता है (5 $u201210x EC50 मान) इष्टतम बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए.
    1. विलायक के 1 डिग्री सेल्सियस जोड़ें कि छोटे अणु में घुलनशील है या छोटे अणु स्टॉक समाधान के 1 डिग्री एल lysate के प्रत्येक एलिकोट के लिए. मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर 30$u201260 मिनट के लिए समाधान के साथ इनक्यूबेट सेल lysate।
  3. बर्फ पर, 1x टीएनसी (10x टीएनसी बफर के 1 एमएल के लिए, 10x टीएनसी बफर के 1 एमएल के लिए, अल्ट्राप्यूर पानी के 300 डिग्री एल के मिश्रण के लिए 100 डिग्री सेल्सियस 5 एम सोडियम क्लोराइड, 1 एम कैल्शियम क्लोराइड के 100 डिग्री एल) में ताजा thawed pronase समाधान के सीरियल कमजोर पड़ने की स्थापना (1:200, 1:800 और 1:1600) , और 1 एम Tris-HCl, पीएच 8.0) के 500 $L.
  4. pronase की एक विस्तृत-ब्रेड्थ की जांच: प्रोटीन अनुपात (जैसे, 1:100 से 1:2000 तक फैले) लक्ष्य पर pronase के कदम-वार प्रभाव की प्रेक्षणीयता की गारंटी के लिए()
    नोट: pronase सांद्रता की गणना करने के लिए (उदाहरण के लिए): 5 [g/]L प्रोटीन सांद्रता x 20 ]L नमूना ] 100 $g प्रोटीन. एक pronase के लिए: 1:100 के प्रोटीन अनुपात हम की जरूरत है 0.5 [g/$L ] 100 [ 2 ] 2) pronase समाधान. इस प्रयोग pronase की एक उपयुक्त रेंज प्राप्त करने के लिए कई बार दोहराया जा सकता है: प्रोटीन अनुपात.

3. प्रोटीओलिसिस प्रदर्शन

नोट: प्रोटीओलिसिस के लिए, कमरे के तापमान पर कदम उठाए जाते हैं जब तक कि अन्यथा नोट न किया गया हो

  1. छोटे अणु के साथ ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक एलिकोट को 20 डिग्री सेल्सियस नमूनों में विभाजित करें।
  2. विशिष्ट अंतरालों पर प्रत्येक नमूने में pronase समाधानों की श्रेणी का 2 $L जोड़ें (प्रत्येक 30 s). एक अपाच्य नियंत्रण नमूने स्थापित करने के लिए 1x TNC बफ़र के बराबर वॉल्यूम का उपयोग करें।
  3. 5$u201220 मिनट के बाद, ठंड 20x प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल के 2 $L के अलावा के माध्यम से पाचन रोक हर 30 s. अच्छी तरह से मिक्स और 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट.
  4. 5x एसडीएस-पेज लोडिंग बफर की उचित मात्रा के साथ नमूनों को पतला करें और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें।
  5. प्रयोग के अगले भाग को बाहर ले जाना या प्रोटीन नमूने को $80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।

4. परिमाण और विश्लेषण

  1. DARTS के बाद, पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल22के अनुसार Coomasie नीले धुंधला प्रदर्शन करते हैं.
  2. दाग प्रोटीन बैंड destaining के बाद बहुत स्पष्ट होना चाहिए. इस्तेमाल किया destain समाधान बंद डालो और जेल को कवर करने के लिए ताजा 1% एसिटिक एसिड समाधान जोड़ें। के साथ समूहों के बीच महत्वपूर्ण मतभेद के साथ बैंड का निरीक्षण करने के लिए प्रकाश के नीचे जेल रखो (नमूना समूह) या बिना (नियंत्रण समूह) छोटे अणु.
  3. एक बाँझ साधन के साथ जेल से दो इसी बैंड कट और LC-MS /
    नोट: LC-MS/MS के रूप में जल्द से जल्द किया जाना चाहिए क्योंकि जेल में प्रोटीन लगातार नीचा होगा.
  4. बैंड डाइजेस्ट, पेप्टाइड्स निकालने और LC-MS/MS विश्लेषण23प्रदर्शन करते हैं।
    1. LC-MS/MS डेटा का विश्लेषण करने के लिए, पहले व्यक्तिगत बैंड में सभी प्रोटीन की पहचान करें। दूसरा, पेप्टाइड स्पेक्ट्रम मैच का उपयोग करें (पीएसएम) प्रत्येक प्रोटीन की बहुतायत का प्रतिनिधित्व करने के लिए.
      नोट: पीएसएम प्रोटीन के लिए पहचान पेप्टाइड दृश्यों की कुल संख्या प्रदान करता है, उन अनावश्यक रूप से पहचान सहित. सामान्य में, कितनी बार एक पेप्टाइड की पहचान की है / अनुक्रम कैसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन नमूने में है की एक मोटा अनुमान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. नियंत्रण समूह पर नमूना समूह में समृद्ध प्रोटीन ब्याज के प्रोटीन हैं.
  5. चयनित प्रोटीन के प्राथमिक एंटीबॉडी की खरीद. पश्चिमी दाग को इस प्रकार निष्पादित करें कि छोटा अणु सीधे संभावित लक्ष्य प्रोटीनोंसेबाध्य हो सकता है .
    1. एक 8% एसडीएस-पेज जेल के कुओं में प्रोटीन की समान मात्रा लोड, एक उपयुक्त आणविक वजन मार्कर के साथ. 80 V पर 30 मिनट के लिए जेल चलाने के लिए, तो वोल्टेज को समायोजित करने के लिए 120 V और के लिए चल रहा जारी रखने के 1$u20122 h.
  6. छवि संसाधन और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विभिन्न लक्ष्य प्रोटीन बैंड मात्रा (सामग्री की तालिकादेखें)।
  7. डेटा का विश्लेषण करें और वक्र ों को आरेखित करें।
    1. एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए प्रोटीओलिटिक वक्र का निर्धारण
      1. प्रोनेस: प्रोटीन अनुपात प्रोटीओलिसिस करते समय अलग-अलग होता है। अपाच्य बैंड के संगत बैंड तीव्रता मानों को 100% तक प्रतिटन करके छवि विश्लेषण से डेटा को सामान्य करें.
      2. सापेक्ष बैंड तीव्रता और pronase: प्रोटीन अनुपात के लिए सामान्यीकृत डेटा के एक वक्र साजिश करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण और ड्राइंग सॉफ्टवेयर के nonlinear प्रतिगमन विश्लेषण का प्रयोग करें.
      3. सबसे पहले, सॉफ्टवेयर खोलने के लिए, XY के रूप में तालिका और ग्राफ के प्रकार का चयन करें और साथ-साथ subcolumns में 3 दोहराने मूल्यों के लिए अनुमति देते हैं। फिर x और y के नीचे के स्थान में संबंधित डेटा दर्ज करें. x के अंतर्गत, संख्या 0, 1, 2, 3, 4, 5 (स्थान धारकों के रूप में संगत pronase: प्रोटीन अनुपात) इनपुट।
      4. y स्तंभ में, संबंधित बैंड तीव्रता के लिए सामान्यीकृत डेटा दर्ज करें. "Nonlinear प्रतिगमन" प्रदर्शन और "लॉग (एगोनिस्ट) बनाम response-Variable ढलान (चार पैरामीटर)" समीकरण का उपयोग कर एक "Dose-प्रतिक्रिया-उत्तेजना" को लागू करने।
      5. वक्र में X-अक्ष के एनोटेशन को संगत प्रोनेस: प्रोटीन अनुपात में कनवर्ट करें।
    2. एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए खुराक निर्भरता वक्र का निर्धारण
      नोट: खुराक-निर्भरता विश्लेषण के लिए, छोटे अणु की मोलरता नमूनों में भिन्न है। स्थिर प्रोनेस: प्रोटीन अनुपात प्रोटीओलिसिस डेटा के विश्लेषण द्वारा सूचित किया जाना चाहिए। प्रोनेस: प्रोटीन अनुपात जो प्रोटीओलिटिक वक्र के दौरान लक्ष्य प्रोटीन तीव्रता में अधिक से अधिक अंतर दिखाता है, खुराक-निर्भरता प्रयोग के लिए उपयोग किया जाना चाहिए।
      1. एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अलग लक्ष्य प्रोटीन बैंड मात्रा. खुराक-निर्भरता वक्र की पीढ़ी के रूप में, कम से कम पचा बैंड से संबंधित बैंड तीव्रता मूल्यों को 100% तक योगदान करके छवि विश्लेषण से डेटा को सामान्य करें।
      2. सांख्यिकीय विश्लेषण और आरेखण सॉफ़्टवेयर के भीतर nonlinear प्रतिगमन विश्लेषण सामान्यीकृत डेटा के लिए लागू करें। सबसे पहले, सॉफ्टवेयर खोलने के लिए, XY के रूप में तालिका और ग्राफ के प्रकार का चयन करें, और साथ-साथ subcolumns में 3 दोहराने मूल्यों दर्ज करें।
      3. उसके बाद, x और y के नीचे रिक्ति में संबंधित डेटा दर्ज करें. 'x' चर के लिए, छोटे अणु के इनपुट विभिन्न सांद्रता; 'y' रिश्तेदार बैंड तीव्रता के लिए इसी सामान्यीकृत डेटा भी शामिल है.
      4. X ] लॉग (X) का उपयोग करके x मान ों को रूपांतरित करें. अंत में, nonlinear प्रतिगमन को रोजगार, और एक खुराक प्रतिक्रिया उत्तेजना का उपयोग कर लागू "लॉग (एगोनिस्ट) बनाम प्रतिक्रिया-चर ढलान (चार पैरामीटर)" समीकरण.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रयोग का प्रवाह चार्ट चित्र 1में रेखांकित किया गया है। Coomasie नीले धुंधला का परिणाम चित्र 2में दिखाया गया है. छोटे अणु के साथ इन्क्यूबेशन प्रोटीओलिसिस के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करता है। वाहन नियंत्रण पर rapamycin के साथ ऊष्मायन द्वारा संरक्षित किया जा करने के लिए प्रकट होने वाले तीन बैंड पाए जाते हैं। प्रोटीओलिटिक वक्र प्रयोग के अपेक्षित परिणाम चित्र 3में दर्शाए गए हैं। एक सबूत के रूप में सिद्धांत के रूप में, हम अच्छी तरह से अध्ययन प्रोटीन MTOR, जो दवा rapamycin25के लिए लक्ष्य है की जांच की. पश्चिमी सोख्ता कम प्रोनास में मटकाप्रोटीन की उपस्थिति को दर्शाता है: प्रोटीन अनुपात और बढ़ते अनुपात के साथ इसकी कमी और हानि (चित्र 3ए)। प्रोनास द्वारा एमडीओआर का प्रोटीओलिसिस स्पष्ट रूप से रैपामाइसिन की उपस्थिति से बाधित होता है और रैपामाइसिन के अतिरिक्त प्रोटीओलिटिक वक्र में एक स्पष्ट बदलाव उत्पन्न करता है (चित्र 3ठ)। दवा एकाग्रता के प्रभाव की जांच करने के लिए, हम एक निरंतर pronase बनाए रखा: प्रोटीन अनुपात जबकि rapamycin की सांद्रता अलग. के रूप में लिगन्ड एकाग्रता लक्ष्य बाध्यकारी संतृप्ति के पास, लक्ष्य प्रोटीन की एक वृद्धि की उपस्थिति मनाया जाता है. Rapamycin खुराक निर्भर रूप से MTOR के स्तर में वृद्धि हुई है, rapamycin उपचार के साथ mTOR की बढ़ती स्थिरता का सुझाव (चित्र 4ए). लक्ष्य प्रोटीन बैंड तीव्रता का परिमाणीकरण चित्र 4ठमें वक्र द्वारा उदाहरण के रूप में लिगन्ड सांद्रता के एक समारोह के रूप में लक्ष्य स्थिरता के निरूपण की अनुमति देता है। इन परिणामों दृढ़ता से सुझाव है कि MTOR rapamycin के लक्ष्य प्रोटीन है.

Figure 1
चित्र 1: दवा लक्ष्य अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के लिए DARTS दृष्टिकोण के Schematic. कोशिका lysate एक छोटे अणु की उपस्थिति या अनुपस्थिति में incubated है, प्रोटीओलिसिस और प्रोटीन इलेक्ट्रोफोरोसिस के बाद. संरक्षित प्रोटीन बैंड excised और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोस्कोपी के अधीन हैं. प्रोटीन लक्ष्य उन प्रोटीन है कि छोटे अणु की उपस्थिति में वृद्धि protease प्रतिरोध प्रदर्शित के रूप में पहचान े रहे हैं. फिर पश्चिमी ब्लॉट का उपयोग लक्ष्य प्रोटीन की पहचान और अर्ध-मात्रात्मक रूप से विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। डेटा का अर्थ है - मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: छोटे अणु rapamycin के साथ DARTS के Coomasi नीले धुंधला दृश्य का उदाहरण. लाल डॉट्स संरक्षित बैंड के बगल में. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रोनास के एक समारोह के रूप में पता लगाने के लिए सुलभ एमटीओआर की शेष राशि का चित्रण: 293T सेल lysates के उपचार के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन अनुपात। (क) रैपामाइसिन द्वारा प्रोटीओलिसिस से सीटीओआर के संरक्षण का मूल्यांकन पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा किया गया था। (ख) सांख्यिकीय विश्लेषण और ड्राइंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए एम टी ओ आर बैंडों की तीव्रता का आकलन किया गया था। लाइन एक चार पैरामीटर रसद वक्र के साथ फिट किया गया था. डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त किए गए थे और मतलब के रूप में व्यक्त किए गए थे - एसडी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: rapamycin की बढ़ती सांद्रता की उपस्थिति में पता लगाने के लिए सुलभ स्थिर MTOR की मात्रा का चित्रण. 293T सेल lysates rapamycin के साथ incubated थे (0, 1, 10, 100, 1000, 1000 nM) 1 एच के लिए, तो सेल lysates pronase में पाचन के अधीन थे: 1:400 के प्रोटीन अनुपात. (क) मध्याह्न पर रैपामाइसिन के स्थिरीकरण प्रभाव का मूल्यांकन पश्चिमी दाग द्वारा किया गया था। (ख) सांख्यिकीय विश्लेषण और ड्राइंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए एम टी ओ आर बैंडों की तीव्रता का आकलन किया गया था। लाइन एक चार पैरामीटर रसद वक्र के साथ फिट किया गया था. डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त किए गए थे और मतलब के रूप में व्यक्त किए गए थे - एसडी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

डार्ट्स गिरावट के खिलाफ प्रोटीन बाइंडिंग के सुरक्षात्मक प्रभाव का शोषण करके छोटे अणु लक्ष्यों की पहचान के लिए अनुमति देता है. छोटे अणु के किसी रासायनिक संशोधन या स्थिरीकरण की आवश्यकता नहीं है. यह छोटे अणुओं उनके प्रत्यक्ष बाध्यकारी प्रोटीन लक्ष्य निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है. शास्त्रीय डार्ट्स विधि के लिए मानक मूल्यांकन मानदंड जेल धुंधला, मास स्पेक्ट्रोमेट्री और पश्चिमी blotting12,13शामिल हैं. क्लासिक पद्धति में यह भी उल्लेख किया गया है कि इन आंकड़ों का मात्रात्मक विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन ऐसा कोई उदाहरण नहीं दिया गया है। यहाँ, हम सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख के सिद्धांतों का उपयोग करें (CETSA) अर्द्ध मात्रात्मक डेटा का विश्लेषण करने के लिए, और CESTA द्वारा आपूर्ति की उन के समान पैरामीटर प्राप्त (Tm और EC50) जो DARTS विश्लेषण की उपयोगिता बढ़ जाती है8. लिगन्ड-लक्ष्य अन्योन्यक्रिया को प्रोनेस के विरुद्ध प्लॉट किया जा सकता है: प्रोटीओलिटिक वक्रों में स्पष्ट परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए प्रोटीन अनुपात। विभिन्न pronase का उपयोग कर प्रोटीओलिसिस बाहर ले जाने: प्रोटीन अनुपात नीचे प्रवाह प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाना चाहिए कि pronase की एकाग्रता को कम करने में मदद कर सकते हैं। इसके अलावा, pronase के अनुकूलित एकाग्रता का उपयोग कर, छोटे अणु के विभिन्न सांद्रता की उपस्थिति में किए गए प्रोटीओलिसिस अपने लक्ष्य प्रोटीन के साथ छोटे अणु की समानता का एक अप्रत्यक्ष उपाय प्रदान कर सकते हैं. इसके अलावा, एक खुराक निर्भरता वक्र की पीढ़ी Ligand एकाग्रता पर निर्भर लक्ष्य प्रोटीन पर प्रभाव के सन्निकटन के लिए अनुमति देता है. खुराक-निर्भरता के लिए विश्लेषणात्मक क्षमता का समावेश डार्ट्स पद्धति का एक शक्तिशाली विस्तार है; छोटे अणुओं की चिकित्सीय तंत्र की जांच करने के लिए एक सीधा और त्वरित दृष्टिकोण प्रदान. इस जेल आधारित दृष्टिकोण को लागू करने के लिए सबसे आसान है. इसका उपयोग उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए यौगिकों के लिए किया जा सकता है जो एक विशिष्ट प्रोटीन20,27,28को बांधते हैं . इसके अतिरिक्त, डार्ट्स कम आत्मीयता के साथ सच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, क्योंकि धोने एक प्रयोगात्मक चरण12,26के रूप में शामिल नहीं है. इसके अलावा, CETSA के साथ तुलना में, DARTS झिल्ली प्रोटीन के लक्ष्य की पहचान करने में लाभ है के रूप में DARTS हल्के, स्थिर डिटर्जेंट11के उपयोग के माध्यम से झिल्ली प्रोटीन का एक बेहतर आकलन की अनुमति देता है.

प्रयोग की भी कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, जब सेल lysate लक्ष्य प्रोटीन की एक कम बहुतायत है, DARTS विधि आसानी से लक्ष्य प्रोटीन के proteolysis में परिवर्तन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है. इस पद्धति को लागू करने के लिए इन प्रोटीनों को केंद्रित करने के लिए अतिरिक्त कदम उठाए जाने की आवश्यकता है। दूसरा, हम केवल rapamycin / बातचीत शक्तिशाली और स्थिर होने के लिए जाना जाता है. हालांकि, कुछ छोटे अणुओं कम चुनिंदा, या क्षणिक अपने लक्ष्य के लिए बाध्य कर सकते हैं, और यह स्पष्ट नहीं है अगर ऐसे छोटे अणुओं इस परख के साथ विश्लेषण किया जा सकता है. तीसरा, कुछ लक्ष्य प्रोटीन अत्यंत संवेदनशील या इस्तेमाल proteases के लिए प्रतिरोधी हो सकता है.

डार्ट्स परख विश्लेषण pronase की एक श्रृंखला भर में उत्पन्न proteolytic घटता के आकलन के माध्यम से संभावित प्रोटीन बातचीत की पहचान के लिए अनुमति देता है: उपस्थिति या एक छोटे अणु ligand की अनुपस्थिति में प्रोटीन अनुपात. रोमांचक, DARTS परख के मानक प्रक्रियात्मक रूपरेखा में हमारे संशोधनों एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र की पीढ़ी में इस्तेमाल किया जा करने के लिए इस विधि की क्षमता पर प्रकाश डाला. इन outputs दवा के विकास में विशेष उपयोगिता के हैं, यंत्रवत् प्रासंगिक दवा सांद्रता की पहचान की अनुमति. इसके अलावा, अलग ligands का उपयोग कर उत्पन्न एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता की तुलना एक ही लक्ष्य के कई ligands के लिए तुलनात्मक बंधन सजातीयताओं के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान करता है; एक क्षमता संभावित छोटे अणु प्रभावकारिता और dosing के शोधन की भविष्यवाणी में उपयोगी है. हम आशा करते हैं कि डार्ट्स की विस्तारित विश्लेषणात्मक शक्ति का यह प्रदर्शन छोटे अणु दवाओं के विकास, कार्यान्वयन, और समझ में उपयोगी होगा, विशेष रूप से ligands के लिए और वैकल्पिक दृष्टिकोण का उपयोग कर का विश्लेषण करने के लिए मुश्किल लक्ष्य.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम आंशिक रूप से NIH अनुसंधान अनुदान R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, और एक DOD अनुसंधान अनुदान W81XWH-16-1-0482 द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Dilute to 20X with ultrapure water
293T cell line ATCC CRL-3216 DMEM medium with 10% FBS
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher 23225
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Cell scraper Thermo Fisher 179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution Bio-Rad 1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma-Aldrich D2650
GraphPad Prism GraphPad Software Version 6.0 statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52 image processing and analysis software
M-PER Cell Lysis Reagent Thermo Fisher 78501
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning R21-040-CV
Pronase Roche PRON-RO 10 mg/ml
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium fluoride Sigma-Aldrich S7920
Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich 450243
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich 221368
Trizma base Sigma-Aldrich T1503 adjust to pH 8.0
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
  2. O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
  3. McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
  4. Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
  5. Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
  6. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
  7. Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
  8. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  9. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  10. Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
  11. Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
  12. Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
  13. Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
  14. Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
  15. Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
  16. Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
  17. Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
  18. Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
  19. Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
  20. Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
  21. Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
  22. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  23. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  24. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
  25. Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
  26. Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
  27. Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
  28. Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).

Tags

जैव रसायन अंक 150 डार्ट्स अर्द्ध मात्रात्मक MTOR Rapamycin बातचीत लक्ष्य
Rapamycin/mTOR बातचीत के अध्ययन के लिए एक अर्द्ध मात्रक औषध आत्मीयता उत्तरदायी लक्ष्य स्थिरता (DARTS) परख
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, C., Cui, M., Cui, Y.,… More

Zhang, C., Cui, M., Cui, Y., Hettinghouse, A., Liu, C. j. A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction. J. Vis. Exp. (150), e59656, doi:10.3791/59656 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter