Summary
이 연구에서는 단백질 안정성의 변화를 모니터링하고 단백질-리간드 상호작용의 친화성을 추정하여 DARTS 실험의 데이터 분석 기능을 향상시켰습니다. 상호 작용은 두 개의 곡선으로 플롯 될 수있다: proteolytic 곡선과 용량 의존 곡선. 우리는 모범사례로 mTOR-rapamycin 상호 작용을 사용했습니다.
Abstract
약물 선호도 반응형 표적 안정성(DARTS)은 신규한 소분자 단백질 표적을 검출하는 강력한 방법입니다. 그것은 알려진된 작은 분자-단백질 상호 작용을 확인 하 고 천연 제품에 대 한 잠재적인 단백질 목표를 찾는 데 사용할 수 있습니다. 다른 방법에 비해 DARTS는 기본, 수정되지 않은 작은 분자를 사용하며 간단하고 작동하기 쉽습니다. 이 연구에서는 단백질 안정성의 변화를 모니터링하고 단백질-리간드 상호작용의 친화성을 추정하여 DARTS 실험의 데이터 분석 기능을 더욱 향상시켰습니다. 단백질-리간드 상호작용은 단백질 용해 곡선과 용량 의존 곡선의 두 가지 곡선으로 플롯될 수 있습니다. 우리는 우리의 프로토콜의 설립을위한 예시 사례로 mTOR- 라파마이신 상호 작용을 사용했다. 프로테올리화 곡선으로부터 우리는 pronase에 의한 mTOR의 프로테오리시스가 라파마이신의 존재에 의해 억제되었다는 것을 보았다. 용량 의존성 곡선은 라파마이신 및 mTOR의 결합 친화성을 추정할 수 있게 해 주었으며, 이를 통해 우리는 라파마이신및 mTOR의 결합친화도를 추정할 수 있게 하였다. 이 방법은 신규표적 단백질을 정확하게 식별하고 약물 표적 참여의 최적화를 위한 강력하고 간단한 방법이 될 가능성이 높습니다.
Introduction
소분자 표적 단백질을 식별하는 것은 잠재적인 치료 약물의 기계학적이해 및 개발에 필수적이다 1,2,3. 친화성 크로마토그래피는 소분자의 표적 단백질을 식별하는 고전적인 방법으로서, 좋은결과를4,5. 그러나, 이 방법은 소분자의 화학적 변형이 종종 감소되거나 변형된 결합 특이성 또는 친화도를 초래한다는 점에서 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 몇몇 새로운 전략은 최근에 작은 분자의 화학적 변형 없이 작은 분자 표적을 확인하기 위하여 개발되고 적용되었습니다. 라벨없는 소분자의 표적 식별을 위한 이러한 직접적인 방법은 약물 친화성반응형 표적 안정성(DARTS) 6, 산화율(SPROX)7,세포열시프션 분석법(CETSA) 8을 포함한다. ,9, 및 열 프로테오메 프로파일링 (TPP)10. 이들 방법은 자연적이고 수정되지 않은 소분자를 사용하고 표적 단백질(11)을찾기 위해 직접 결합 상호작용에만 의존하기 때문에 매우 유리하다.
이러한 새로운 방법 중, DARTS는 대부분의 실험실에서 쉽게 채택 할 수있는 비교적 간단한 방법론이다12,13. DARTS는 리간드 결합 단백질이 언바운드 단백질에 비해 효소 분해에 대한 변형된 감수성을 입증한다는 개념에 의존합니다. 새로운 표적 단백질은 액체 크로마토그래피 질량 분석법 (LC-MS/MS)을 통해 SDS-PAGE 젤의 변경된 밴드를 검사하여 검출할 수 있습니다. 이 방법은 성공적으로 천연 물 및 약물의 이전에 알려지지 않은 대상의 식별을 위해 구현되었습니다14,15,16,17,18, 19. 또한 특정 단백질20,21에화합물의 결합을 스크리크 또는 검증하는 수단으로강력하다. 본 연구에서는, 우리는 작은 분자를 가진 단백질 안정성에 있는 변경을 감시하고 단백질 리간드 결합 친화도를 확인하 여 실험에 개선을 제시합니다. 우리는 우리의 접근을 설명하기 위하여 보기로 mTOR- rapamycin 상호 작용을 이용합니다.
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Protocol
1. 세포를 수집하고 포액
- Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)를 사용하여 10 % 태아 소 혈청, 2 mM 글루타민 및 1 % 항생제를 사용하여 293T 세포를 성장시다. 37°C에서 5% CO2 미만의배양물.
참고: 세포의 성장 상태는 후속 실험의 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. - 80\u201290% 합류에 도달할 때까지 배양에서 세포를 확장합니다.
- 345 μL의 세포 용해 시약 (재료 표참조) 20x 프로테아제 억제제 칵테일 25 μL, 불소 나트륨 1개 중 25 μL, 100 mM β-글리세로포스페이트 50 μL, 50 mM 의 50 μL 의 50 μL 또는 50 mmmmmmmmmm. 얼음에 진정 된 라시스 버퍼를 유지 합니다.
참고: 다양한 세제(예: 트리톤 X-100 또는 NP-40)가 있는 기타 용해 완충제는 변성되지 않는 한 DARTS와 함께 사용할 수 있습니다. 막 단백질 또는 핵 단백질은 세포 용해액에 0.4% 트리톤 X-100 또는 0.4% NP-40을 첨가하여 추출될 수 있다. - 차가운 인산염 완충식염수(PBS)로 세포를 두 번 세척합니다.
- 세포 스크레이퍼를 사용하여 적절한 양의 세포 용해 완충액으로 세포를 수집하고 용해 세포를 1.5 mL 튜브로 옮김을 전달합니다.
참고: 각 DARTS 실험에 필요한 세포의 수는 다양한 세포주에서 추출할 수 있는 단백질의 양에 따라 달라집니다. 일반적으로, 사용된 용해물의 단백질 농도는 4\u20126 μg/μL 사이이다. 85\u201290% 동률에서 293T 세포의 10cm 플레이트 1개, 용해 완충액300 μL로 용해되어 전형적으로 ~5 μg/μL의 단백질 농도를 가진 용해액을 초래한다. - 용해 완충 / 용해 세포를 잘 혼합하고 10 분 동안 얼음에 튜브를 인큐베이션.
- 4 °C에서 10 분 동안 18,000 × g에서 튜브를 원심 분리합니다.
- 상급체를 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고 얼음에 차갑게 유지하십시오.
- BCA 분석기를 수행하여 단백질 농도를 근사화합니다.
2. 단백질이 작은 분자로 인큐베이션됩니다.
- 99 μL의 매해를 두 개의 1.5 mL 튜브로 분할합니다.
- 10mM 소분자의 시작 재고 농도를 확인합니다. DARTS를 수행할 때, 최적의 결합을 보장하기 위해 소분자(EC50 값 5\u201210x)의 고농도로 시작할 수 있다.
- 소분자가 용해되는 용매 의 1 μL 또는 용해물의 각 aliquot에 작은 분자 스톡 용액의 1 μL을 추가합니다. 세포가 흔들림과 실온에서 30\u201260 분 동안 용액으로 용해됩니다.
- 얼음에, 1 x TNC에 갓 해동 된 프로나제 용액의 직렬 희석 (1 :200, 1:400, 1:800 및 1:1600)을 확립하십시오 (10x TNC 버퍼의 1 mL의 경우, 염화 나트륨 100 μL, 100 μl의 염화나트륨 100 μL, 100 μl의 염화칼슘 100μL을 혼합하십시오. , 1 M Tris-HCl, pH 8.0의 500 μL.
- 광범위한 프로나제:단백질 비율(예: 1:100에서 1:2000까지)을 검사하여 타겟에 대한 프로나제의 단계적 효과 관찰 가능성을 보장합니다.
참고: 프로나제 농도(예): 5 μg/μL 단백질 농도 x 20 μL 샘플 = 100 μg 단백질. pronase:1:100의 단백질 비율을 위해 우리는 0.5 μg/μL (100 μg ∞ 100 ∞ 2 μL) 프론나아제 용액이 필요합니다. 본 실험은 적절한 범위의 프로나제:단백질 비를 얻기 위해 여러 번 반복되어야 할 수도 있다.
3. 프로테오리시스 수행
참고: 프로테오용해의 경우, 별도의 언급이 없는 한 실온에서 단계가 수행됩니다.
- 작은 분자로 배양 한 후, 각 aliquot를 20 μL 샘플로 나눕니다.
- 특정 간격(30s마다)에 각 샘플에 2 μL의 pronase 솔루션을 추가합니다. 동일한 볼륨의 1x TNC 버퍼를 사용하여 소화되지 않은 제어 샘플을 설정합니다.
- 5\u201220 분 후, 차가운 20 x 프로테아제 억제제 칵테일 2 μL을 추가하여 소화를 중단하십시오.
- 5x SDS-PAGE 로딩 버퍼의 적절한 부피로 샘플을 희석하고 95°C에서 5분간 끓입니다.
- 실험의 다음 부분을 수행하거나 단백질 샘플을 -80°C에 저장합니다.
4. 정량화 및 분석
- DARTS 후, 이전에 게시 된 프로토콜(22)에따라 Coomassie 파란색 염색을 수행합니다.
- 염색된 단백질 밴드는 탈지 후 매우 명확해야 합니다. 사용된 데스테인 용액을 붓고 신선한 1% 아세트산 용액을 첨가하여 젤을 덮습니다. 겔을 빛 아래에 두어 소분자(샘플 그룹)를 가진 그룹 들 또는(대조군)이 없는 그룹 들 사이에 유의한 차이를 가진 밴드를 관찰한다.
- 멸균 기구로 젤에서 두 개의 해당 밴드를 잘라내고 LC-MS/MS를 즉시 수행합니다.
참고: LC-MS/MS는 젤의 단백질이 지속적으로 저하되기 때문에 가능한 한 빨리 수행해야 합니다. - 밴드를 다이제스트하고, 펩티드를 추출하고,LC-MS/MS 분석(23)을 수행한다.
- LC-MS/MS 데이터를 분석하려면 먼저 개별 대역의 모든 단백질을 식별합니다. 둘째, 펩타이드 스펙트럼 일치(PSM)를 사용하여 각 단백질의 풍부를 나타낸다.
참고: PSM은 중복으로 확인된 단백질을 포함하는 단백질에 대한 확인된 펩티드 서열의 총 개수를 제공한다. 일반적으로, 얼마나 자주 펩티드가 확인되고/서열화되는지는 단백질이 샘플에서 얼마나 풍부한지에 대한 대략적인 추정치로서 사용될 수 있다. 대조군에 걸쳐 샘플 군에서 농축된 단백질은 관심 있는 단백질이다.
- LC-MS/MS 데이터를 분석하려면 먼저 개별 대역의 모든 단백질을 식별합니다. 둘째, 펩타이드 스펙트럼 일치(PSM)를 사용하여 각 단백질의 풍부를 나타낸다.
- 선택된 단백질의 1 차적인 항체를 조달합니다. 작은 분자가 잠재적인 표적 단백질(24)에 직접결합할 수 있는지 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행한다.
- 적절한 분자량 마커와 함께 8% SDS-PAGE 젤의 우물에 동일한 양의 단백질을 로드합니다. 80V에서 30분 동안 젤을 실행한 다음 전압을 120V로 조정한 다음 1\u20122 h로 계속 실행합니다.
- 이미지 처리 및 분석 소프트웨어를 사용하여 상이한 표적 단백질 대역을 정량화합니다(재료 표참조).
- 데이터를 분석하고 곡선을 그립니다.
- 표적 단백질에 대한 단백질 용해 곡선의 결정
- 프로나제:단백질 비는 단백질 을 단백질 화 할 때 다양합니다. 소화되지 않은 밴드에 해당하는 밴드 강도 값을 100%로 인식하여 이미지 분석에서 데이터를 정규화합니다.
- 통계 분석 및 그리기 소프트웨어의 비선형 회귀 분석을 사용하여 상대 대역 강도 및 단백질 비율에 대한 정규화된 데이터의 곡선을 플로팅합니다.
- 먼저 소프트웨어를 열고 테이블 및 그래프 유형을 XY로 선택하고 나란히 있는 하위 열에서 3개의 복제 값을 허용합니다. 그런 다음 x 및 y 아래의 공간에 해당 데이터를 입력합니다. x에서, 숫자 0, 1, 2, 3, 4, 5를 입력한다(장소 홀더로 해당 프로나제:단백질 비).
- y 열에 상대 밴드 강도에 대한 정규화된 데이터를 입력합니다. "비선형 회귀"를 수행하고 "로그(agonist) 대 응답-가변 경사(4개의 매개변수)" 방정식을 사용하여 "투여량-응답-자극"을 구현합니다.
- 곡선의 X축 주석을 해당 프로나제:단백질 비율로 변환합니다.
- 표적 단백질에 대한 용량 의존성 곡선의 결정
참고 : 용량 의존성 분석을 위해, 작은 분자의 몰은 샘플에 걸쳐 다르다. 안정한 pronase: 단백질 비율은 단백질 분석 데이터의 분석에 의해 통보되어야 합니다. 프로나제:단백질 방출 곡선 동안 표적 단백질 강도의 최대 차이를 보인 단백질 비는 용량 의존성 실험에 사용되어야 한다.- 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 상이한 표적 단백질 대역을 정량화합니다. 투여량 의존곡선의 생성과 마찬가지로, 최소 소화된 대역에 해당하는 밴드 강도 값을 100%로 기여하여 이미지 분석에서 데이터를 정규화합니다.
- 통계 분석 및 그리기 소프트웨어 내에서 비선형 회귀 분석을 정규화된 데이터에 적용합니다. 먼저 소프트웨어를 열고 테이블 및 그래프 유형을 XY로 선택한 다음 나란히 있는 하위 열에 3개의 복제 값을 입력합니다.
- 그런 다음 x 및 y 아래의 공간에 해당 데이터를 입력합니다. 'x' 변수의 경우, 소분자의 상이한 농도를 입력하는; 'y'는 상대 대역 강도에 대한 상응하는 정규화된 데이터를 포함한다.
- X = 로그(X)를 사용하여 x 값을 변환합니다. 마지막으로, 비선형 회귀를 사용하고 "로그(agonist) 대 응답-가변 경사(4개의 매개변수)" 방정식을 사용하여 용량-응답 자극을 구현합니다.
- 표적 단백질에 대한 단백질 용해 곡선의 결정
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Representative Results
실험의 플로우 차트는 그림1에 설명되어 있습니다. 쿠마시 블루 염색의 결과는 그림2에 나와 있습니다. 작은 분자를 가진 배양은 proteolysis에 대하여 보호를 부여합니다. 차량 제어를 통해 라파마이신으로 인큐베이션하여 보호되는 것으로 보이는 3개의 밴드가 발견되었습니다. 프로테오리틱 곡선 실험의 예상 결과는 그림3에 나와 있습니다. 원리증명으로, 우리는 약물 라파마이신25의표적이 되는 잘 연구된 단백질 mTOR을 조사했습니다. 서양 블로팅은 낮은 pronase에서 mTOR 단백질의 존재를 보여줍니다: 단백질 비율 및 증가 비율과 의 감소 및 손실 (그림3A). 프로나제에 의한 mTOR의 프로테오리즘은 라파마이신의 존재에 의해 명백하게 억제되고 라파마이신의 첨가는 프로테올리틱 곡선의 명백한 변화를 야기한다(도3B). 약물 농도의 효과를 조사하기 위해, 우리는 일정한 pronase를 유지 : 라파 마이신의 농도를 변화시키면서 단백질 비율. 리간드 농도가 표적 결합 포화에 가까워지면 표적 단백질의 증가된 존재가 관찰됩니다. 라파마이신 투여량-의존적으로 mTOR의 수준을 향상시켰으며, 라파마이신 처리를 통해 mTOR의 상승 안정성을 시사한다(도4A). 표적 단백질 밴드 강도의 정량화는 도 4B의곡선에 의해 예시된 바와 같이 리간드 농도의 함수로서 표적 안정성을 나타낼 수 있게 한다. 이러한 결과는 mTOR이 라파마이신의 표적 단백질임을 강력하게 시사한다.
도 1: 약물 표적 반정량 분석을 위한 DARTS 접근법의 회로도. 세포 용해는 작은 분자의 존재 또는 부재에서 배양되고, 단백질 용해 및 단백질 전기 공동이 뒤따릅니다. 보호된 단백질 밴드는 적출되고 질량 분광법을 행한다. 단백질 표적은 작은 분자의 존재에서 증가된 프로테아제 저항을 표시하는 그 단백질로 확인됩니다. 그런 다음 웨스턴 블롯은 표적 단백질을 식별하고 반정적으로 분석하는 데 사용됩니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 소분자 라파마이신을 가진 다트의 쿠마시 블루 염색 시각화의 예. 빨간 점은 보호 된 밴드 측면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 293T 세포 용해물의 치료에 사용되는 프로나제:단백질 비의 기능으로서 검출을 위해 접근가능한 mTOR의 잔량의 그림. (A) 라파마이신에 의한 프로테오리시스로부터의 mTOR의 보호를 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다. (b) mTOR 대역의 강도를 통계 분석 및 드로잉 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 이 라인에는 4개의 매개변수 로지스틱 곡선이 장착되었습니다. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 얻어졌고 평균 ±SD로 표현되었다.
도 4: 라파마이신의 농도가 증가하는 상황에서 검출을 위해 접근할 수 있는 안정화된 mTOR의 양을 예시한다. 293T 세포 용해액을 라파마이신(0, 1, 10, 100, 10000, 10000 nM)으로 1시간 동안 배양한 다음, 세포 용해액을 프로나제에서 1:400의 단백질 비율로 소화하도록 하였다. (A) mTOR에 대한 라파마이신의 안정화 효과는 웨스턴 블롯에 의해 평가되었다. (b) mTOR 대역의 강도를 통계 분석 및 드로잉 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 이 라인에는 4개의 매개변수 로지스틱 곡선이 장착되었습니다. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 얻어졌고 평균 ±SD로 표현되었다.
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Discussion
DARTS는 열화에 대한 단백질 결합의 보호 효과를 이타함으로써 작은 분자 표적을 식별할 수 있습니다. DARTS는 소분자(26)의 어떠한 화학적 변형 이나 고정을 필요로 하지 않는다. 이것은 작은 분자가 그들의 직접적인 결합 단백질 표적을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 고전 DARTS 방법에 대한 표준 평가 기준은 겔 염색, 질량 분석 법 및 서부 블로팅12,13을포함한다. 고전적인 방법론은 또한 이러한 데이터를 정량적으로 분석 할 수 있다고 언급하지만 그러한 예는 제공되지 않습니다. 여기서, 우리는 세포 열 시프트 분석법(CETSA)의 원리를 사용하여 데이터를 반정적으로 분석하고, 다트 분석8의 효용성을 증가시키는 CESTA(Tm 및 EC50)에 의해 제공된 것과 유사한 파라미터를 얻는다. 리간드-표적 상호작용은 프로나제:단백질 비에 대해 플롯될 수 있으며, 단백질 곡선의 명백한 변화를 표시한다. 다른 pronase를 사용하여 proteolysis를 수행: 단백질 비율은 다운스트림 실험에서 사용되어야 하는 pronase의 사격량을 좁히는 것을 도울 수 있습니다. 또한, 프로나제의 최적화된 농도를 이용하여, 소분자의 상이한 농도의 존재에서 수행된 프로테오용해는 표적 단백질과 함께 소분자의 친화도의 간접적인 측정을 제공할 수 있다. 또한, 투여량 의존성 곡선의 생성은 리간드 농도에 의존하는 표적 단백질에 대한 효과의 근사치를 허용한다. 용량 의존에 대한 분석 용량의 포함은 DARTS 방법론의 강력한 확장이다; 소분자의 치료 메커니즘을 조사하는 간단하고 빠른 접근 법을 제공합니다. 이 젤 기반 접근 방식은 구현하는 것이 가장 쉽습니다. 특정 단백질20,27,28을결합하는 화합물에 대한 높은 처리량 스크리닝에 사용될 수 있다. 부가적으로, DARTS는 낮은 친화성과의 진정한 상호작용을 분석하기 위해 이용될 수 있으며, 세탁은 실험단계(12,26)로포함되지 않기 때문이다. 더욱이, CETSA와 비교하여, 다트는 경미하고 안정화세제11을사용하여 막 단백질의 더 나은 평가를 허용하기 때문에 막 단백질의 표적을 식별하는 장점이 있다.
실험에는 몇 가지 제한사항이 있습니다. 첫째, 세포 용해가 표적 단백질의 낮은 풍부를 가지고 있을 때, DARTS 방법은 표적 단백질의 단백질용해에서의 변화를 쉽게 시각화하는데 사용될 수 없다. 이 방법론을 적용하기 위해서는 이러한 단백질을 농축하는 추가 단계가 필요합니다. 둘째, 우리는 단지 라파마이신 / mTOR 상호 작용을 테스트합니다. 상호 작용은 강력하고 안정적인 것으로 알려져있다. 그러나, 몇몇 작은 분자는 그들의 표적에 보다 적게 선택적으로, 또는 일시적으로 결합할 수 있고, 그 같은 작은 분자가 이 분석법으로 분석될 수 있는지 명확하지 않다. 셋째, 일부 표적 단백질은 사용되는 프로테아제에 매우 민감하거나 내성이 있을 수 있다.
DARTS 분석 분석은 소분자 리간드의 존재 또는 부재에서 단백질 비율: pronase의 범위에 걸쳐 생성된 단백질 용해 곡선의 평가를 통해 잠재적인 단백질 상호 작용의 확인을 허용합니다. 흥미롭게도, DARTS 분석법의 표준 절차 개요에 대한 우리의 수정은 농도 응답 곡선의 생성에 사용되는이 방법의 용량을 강조. 이러한 출력은 기계론적으로 관련 약물 농도를 식별할 수 있도록 약물 개발에 특별한 유용성을 제공합니다. 더욱이, 서로 다른 리간드를 사용하여 생성된 농도-반응 곡선의 비교는 동일한 표적의 몇몇 리간드에 대한 비교 결합 친화도에 대한 통찰력을 제공한다; 용량은 소분자 효능 및 투약의 정제를 예측하는 데 잠재적으로 유용합니다. 우리는 DARTS의 확장된 분석 력의 이 데모가 소분자 약물의 개발, 구현 및 이해에 유용할 것으로 기대하며, 특히 대체 접근법을 사용하여 분석하기 어려운 리간드 및 표적을 위해 유용하게 사용할 수 있기를 바랍니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 연구 보조금 R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, 및 DOD 연구 보조금 W81XWH-16-1-0482에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
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