Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

En semi-kvantitativ narkotika affinitet responsiv Target stabilitet (dart)-analysen for å studere Rapamycin/mTOR interaksjon

Published: August 27, 2019 doi: 10.3791/59656
* These authors contributed equally

Summary

I denne studien har vi forbedret Dataanalysefunksjonene i dart-eksperimentet ved å overvåke endringene i protein stabiliteten og estimere affinitet til protein ligand interaksjoner. Samspillet kan tegnes inn i to kurver: en proteolytiske kurve og en dose-avhengighet kurve. Vi har brukt mTOR-Rapamycin interaksjon som en eksemplarisk sak.

Abstract

Drug affinitet responsive Target stabilitet (dart) er en robust metode for påvisning av romanen små molekyl protein mål. Den kan brukes til å verifisere kjente små molekyl-protein interaksjoner og å finne potensielle protein mål for naturlige produkter. Sammenlignet med andre metoder, bruker dart native, uendret, små molekyler og er enkel og lett å betjene. I denne studien forbedret vi ytterligere Dataanalysefunksjonene i dart-eksperimentet ved å overvåke endringene i protein stabiliteten og estimere affinitet av protein-ligand interaksjoner. Den protein-ligand interaksjoner kan tegnes inn i to kurver: en proteolytiske kurve og en dose-avhengighet kurve. Vi har brukt mTOR-Rapamycin interaksjon som en eksemplarisk sak for etablering av vår protokoll. Fra proteolytiske kurven så vi at proteinolyse av mTOR ved pronase ble hemmet av tilstedeværelsen av Rapamycin. Den dose-avhengighet kurve tillot oss å anslå bindingen affinitet av Rapamycin og mTOR. Denne metoden vil trolig være en kraftfull og enkel metode for nøyaktig identifisering av romanen mål proteiner og for optimalisering av narkotika målet engasjement.

Introduction

Identifisering av små molekyl mål proteiner er avgjørende for mekanistisk forståelse og utvikling av potensielle terapeutiske legemidler1,2,3. Affinitet kromatografi, som en klassisk metode for å identifisere målet proteiner av små molekyler, har gitt gode resultater4,5. Denne metoden har imidlertid begrensninger, ved at kjemisk modifisering av små molekyler ofte resulterer i redusert eller endret bindende spesifisitet eller affinitet. For å overkomme disse begrensningene har flere nye strategier nylig blitt utviklet og anvendt for å identifisere de små molekyl målene uten kjemisk modifisering av de små molekylene. Disse direkte metodene for identifisering av etikett frie små molekyler inkluderer narkotika affinitet responsiv mål stabilitet (DARTS)6, stabilitet av proteiner fra utbredelsen av OKSIDASJON (SPROX)7, cellulær termisk Skift-analyse (CETSA)8 ,9, og termisk proteom profilering (TPP)10. Disse metodene er svært fordelaktige fordi de bruker naturlige, uendrede små molekyler og bare stole på direkte bindende interaksjoner for å finne mål proteiner11.

Blant disse nye metodene er dart en forholdsvis enkel metodikk som lett kan vedtas av de fleste Labs12,13. DART avhenger av konseptet som ligand-bundet proteiner demonstrere modifisert mottakelighet for enzymatisk degradering i forhold til ubundne proteiner. Det nye mål proteinet kan oppdages ved undersøkelse av det endrede båndet i SDS-side gel gjennom flytende kromatografi-Mass massespektrometri (LC-MS/MS). Denne tilnærmingen har blitt implementert for identifisering av tidligere ukjente mål av naturlige produkter og narkotika14,15,16,17,18, 19. det er også kraftig som et middel til skjermen eller validere binding av forbindelser til et bestemt protein20,21. I denne studien presenterer vi en forbedring av eksperimentet ved å overvåke endringene i protein stabiliteten med små molekyler og identifisere protein-ligand bindende slektskap. Vi bruker mTOR-Rapamycin interaksjon som et eksempel for å demonstrere vår tilnærming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. samle inn og lyse celler

  1. Grow 293T celler ved hjelp Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM) med 10% fosterets storfe serum, 2 mM glutamin og 1% antibiotika. Ruge kulturer ved 37 ° c under 5% CO2.
    Merk: vekst tilstanden til cellene kan påvirke stabiliteten i etterfølgende eksperimenter.
  2. Utvid cellene i kulturen til nå 80 \ u201290% samløpet.
  3. Bland 345 μL av cellelyse reagens (se tabell over materialer) med 25 μL av 20x protease inhibitor cocktail, 25 μL av 1 M natrium fluor, 50 μL av 100 mm β-glycerophosphate, 50 μL av 50 mm natrium geranylpyrofosfat, og 5 μL av 200 mm natrium orthovanadate. Hold lyseringsbufferen avkjølt på is.
    Merk: andre lyse Rings buffere med forskjellige vaskemidler (for eksempel Triton X-100 eller NP-40) kan brukes med DARTS så lenge de er ikke-denaturering. Membran proteiner eller kjernefysiske proteiner kan trekkes ut ved å legge 0,4% Triton X-100 eller 0,4% NP-40 til cellen lysat.
  4. Vask cellene to ganger med kaldt fosfat-bufret saltvann (PBS).
  5. Bruk en celle skraper for å samle cellene i en passende mengde cellelyse Rings buffer og overføre de lysering cellene til et 1,5 mL rør.
    Merk: antall celler som trengs for hvert dart-eksperiment vil variere basert på hvor mye protein som kan trekkes ut fra ulike cellelinjer. Generelt er protein konsentrasjonen av lysat som brukes, mellom 4 \ u20126 μg/μL. 1 10 cm plate av 293T celler ved 85 \ u201290% confluency, lysert med 300 μL av lyseringsbuffer resulterer vanligvis i en lysat med en proteinkonsentrasjon på ~ 5 μg/μL.
  6. Bland lyseringsbuffer/lysering cellene godt og ruge røret på isen i 10 min.
  7. Sentrifuger røret ved 18 000 × g i 10 min ved 4 ° c.
  8. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 mL rør og hold kjølt på is.
  9. Utfør en BCA-analysen for å anslå protein konsentrasjonen av lysater.

2. ruge protein lysater med det lille molekylet

  1. Split 99 μL av lysater i to 1,5 mL rør.
  2. Lag en start lager konsentrasjon på 10 mM lite molekyl. Når du utfører Dart, kan man begynne med en høyere konsentrasjon av det lille molekylet (5 \ u201210x EC50 verdi) for å sikre optimal binding.
    1. Tilsett enten 1 μL løsemiddel som det lille molekylet er oppløselig i eller 1 μL av små molekyl lager løsninger til hver alikvot av lysat. Ruge celle lysat med løsningene for 30 \ u201260 min ved romtemperatur med risting.
  3. På is, etablere seriell fortynninger (1:200, 1:400, 1:800 og 1:1600) av fersk tint pronase oppløsning i 1x TNC (for 1 mL 10x TNC buffer, bland 300 μL av ultrarent vann med 100 μL av 5 M natriumklorid, 100 μL av 1 M kalsiumklorid og 500 til 1 M Tris-HCl, pH 8,0).
  4. Undersøk en bred bredde av pronase: protein prosenter (f. eks, spenner fra 1:100 til 1:2000) for å garantere observerbarhet av den trinnvise effekten av pronase på mål (s).
    Merk: for å beregne pronase konsentrasjoner (eksempel): 5 μg/μL proteinkonsentrasjon x 20 μL prøve = 100 mikrogram protein. For et pronase: protein ratio på 1:100 trenger vi 0,5 μg/μL (100 μg ÷ 100 ÷ 2 μL) pronase løsning. Dette eksperimentet må kanskje gjentas flere ganger for å oppnå et egnet utvalg av pronase: protein prosenter.

3. Utfør proteinolyse

Merk: for proteinolyse utføres trinn ved romtemperatur med mindre annet er angitt

  1. Etter inkubasjons med det lille molekylet, deles hver alikvot inn i 20 μL prøver.
  2. Tilsett 2 μL av utvalget av pronase løsninger i hvert utvalg ved bestemte intervaller (hver 30 s). Bruk et likt volum på 1x TNC-buffer for å opprette et ufordøyd.
  3. Etter 5 \ u201220 min, stanse fordøyelsen via tillegg av 2 μL av kald 20x protease inhibitor cocktail hver 30 s. Bland godt og ruge på isen i 10 min.
  4. Fortynne prøver med riktig volum av 5x SDS-side lasting buffer og kok ved 95 ° c i 5 min.
  5. Utfør neste del av eksperimentet eller Oppbevar protein prøven på − 80 ° c.

4. kvantifisering og analyse

  1. Etter Dart, Utfør Coomassie blå farging i henhold til den tidligere utgitte protokollen22.
  2. Den fargede protein band bør være veldig klar etter destaining. Hell av den brukte destain løsningen og tilsett fersk 1% eddiksyreløsning for å dekke gel. Sett gelen under lyset å observere bandene med betydelige forskjeller mellom grupper med (Sample Group) eller uten (kontrollgruppe) det lille molekylet.
  3. Skjær de to tilsvarende bandene fra gelen med et sterilt instrument og utføre LC-MS/MS umiddelbart.
    Merk: LC-MS/MS må gjøres så snart som mulig fordi proteinene i gelen vil forringe kontinuerlig.
  4. Fordøye bandene, ekstrakt peptider og utføre LC-MS/MS analyse23.
    1. Hvis du vil analysere LC-MS/MS-data, må du først identifisere alle proteinene i enkelt båndet. For det andre, bruk peptid spektrum match (PSM) for å representere overflod av hvert protein.
      Merk: PSM gir det totale antall identifiserte peptid sekvenser for proteinet, inkludert de redundant identifisert. Generelt, hvor ofte et peptid er identifisert/sekvensert kan brukes som et grovt anslag over hvor rikelig proteinet er i utvalget. Proteiner beriket i utvalgs gruppen over kontrollgruppen er proteiner av interesse.
  5. Anskaffe den primære antistoffer av de valgte proteiner. Utfør Western Blot for å verifisere at det lille molekylet kan binde direkte til de potensielle mål proteinene24.
    1. Legg like mye protein inn i brønnene til en 8% SDS-side gel, sammen med en passende molekylvekt markør. Kjør gel for 30 min på 80 V, deretter justere spenningen til 120 V og fortsette å kjøre for 1 \ u20122 h.
  6. Kvantifisere de forskjellige mål protein båndene ved hjelp av bildebehandlings-og analyseprogramvare (se tabell over materialer).
  7. Analysere dataene og tegne kurvene.
    1. Bestemmelse av proteolytiske kurve for et mål protein
      1. Pronase: protein ratio er variert når du utfører proteinolyse. Normalisere data fra bildeanalyse ved å tildele band intensitet verdier som tilsvarer ufordøyd band til 100%.
      2. Bruk ikke-lineær regresjonsanalyse av den statistiske analysen og tegneprogram varen til å plotte en kurve av normalisert data for relative band intensitet og pronase: protein prosenter.
      3. Først åpner programvaren, Velg type bord og graf som XY og la for 3 replikere verdier i side-ved-side subcolumns. Deretter skriver du inn de tilsvarende dataene i feltet under x og y. Under x, input tallene 0, 1, 2, 3, 4, 5 (som sted holdere tilsvarende pronase: protein prosenter).
      4. I y-kolonnen skriver du inn normalisert data for relative bånd intensitet. Utfør "ikke-lineær regresjon" og implementere en "dose-Response-stimulering" ved hjelp av "Logg (Agonistiske) versus Response-variable skråningen (fire parametere)" ligningen.
      5. Konverter merknadene for X-aksen i kurven til den tilsvarende pronase: protein prosenter.
    2. Bestemmelse av dose-avhengighet kurve for et mål protein
      Merk: for dose-avhengighet analyse, molaritet av det lille molekylet er forskjellig på tvers av prøvene. Den stabile pronase: protein forholdet skal informeres ved analyse av proteinolyse data. Pronase: protein ratio som viste maksimal forskjell i mål protein intensitet under proteolytiske kurven bør brukes for dose-avhengighet eksperimentet.
      1. Kvantifisere de ulike mål protein bandene ved hjelp av en bildeanalyse programvare. Som i generasjon av dose-avhengighet kurve, normalisere data fra bildeanalyse ved å tillegge bandet intensitet verdier som tilsvarer minst fordøyd bandet til 100%.
      2. Bruk den ikke-lineære regresjonsanalyse i den statistiske analysen og tegneprogram varen til normalisert data. Først, åpne programvaren, Velg type tabell og graf som XY, og skriv 3 replikere verdier i side-ved-side subcolumns.
      3. Deretter skriver du inn de tilsvarende dataene i feltet under x og y. For "x"-variabelen, input ulike konsentrasjoner av det lille molekylet; ' y ' inkluderer de tilsvarende normalisert dataene for relativ bånd intensitet.
      4. Transformer x-verdier ved hjelp av X = log (X). Til slutt, ansette ikke-lineær regresjon, og implementere en dose-respons stimulering ved hjelp av "log (Agonistiske) kontra Response-variable skråningen (fire parametere)" ligningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flytskjemaet for eksperimentet er skissert i figur 1. Resultatet av Coomassie blå farging er vist i figur 2. Inkubasjons med det lille molekylet gir beskyttelse mot proteinolyse. Tre band som ser ut til å være beskyttet av inkubasjons med Rapamycin over kjøretøyets kontroll er funnet. De forventede resultatene fra proteolytiske kurve eksperimentet er vist i Figur 3. Som en proof-of-prinsippet, undersøkte vi godt studert protein mTOR, som er målet for stoffet Rapamycin25. Vestlig blotting illustrerer tilstedeværelsen av mTOR protein ved lave pronase: protein prosenter og dens reduksjon og tap med økende prosenter (Figur 3A). Proteinolyse av mTOR av pronase er klart hemmet av tilstedeværelsen av Rapamycin og tillegg av Rapamycin genererer en åpenbar forskyvning i proteolytiske kurve (Figur 3B). For å undersøke virkningene av konsentrasjonen av narkotika, opprettholdt vi en konstant pronase: protein ratio mens varierende konsentrasjoner av Rapamycin. Som ligand konsentrasjon nærmer mål binding metning, er en økt tilstedeværelse av målet protein observert. Rapamycin dose-sortert forbedret nivået av mTOR, antyder den økende stabiliteten til mTOR med Rapamycin behandling (Figur 4A). Kvantifisering av målet protein bandet intensitet tillater representasjon av målet stabilitet som en funksjon av ligand konsentrasjon som illustrert av kurven i Figur 4B. Disse resultatene sterkeste tyder på at mTOR er målet protein av Rapamycin.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av DARTS-tilnærmingen for narkotika målet semi-kvantitativ analyse. Cell lysat er inkubert i nærvær eller fravær av et lite molekyl, etterfulgt av proteinolyse og protein elektroforese. Beskyttede protein bånd er excised og utsettes for masse spektroskopi. Protein mål er identifisert som de proteiner som viser økt protease motstand i nærvær av det lille molekylet. Deretter Western-Blot brukes til å identifisere og semi-kvantitativt analysere målet proteiner. Data uttrykkes som betyr ± standardavvik (SD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: eksempel på Coomassie blå farge visualisering av DART med det lille molekylet-Rapamycin. Røde prikker flanke de beskyttede båndene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: illustrasjon av det resterende beløpet av mTOR tilgjengelig for deteksjon som en funksjon av pronase: protein ratio brukes til behandling av 293T celle lysater. (A) beskyttelse av mTOR fra proteinolyse ved Rapamycin ble evaluert av Western Blot analyse. (B) intensiteten av mTOR band ble kvantifisert ved hjelp av statistisk analyse og tegning programvare. Linjen ble utstyrt med en logistikk kurve med fire parametere. Data ble innhentet fra de tre uavhengige eksperimenter og ble uttrykt som gjennomsnittet ± SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: illustrasjon av mengden stabilisert mTOR tilgjengelig for påvisning i nærvær av økende konsentrasjoner av Rapamycin. 293T celle lysater ble inkubert med Rapamycin (0, 1, 10, 100, 1000, 10000 nM) for 1 time, da cellen lysater ble utsatt for fordøyelsen på pronase: protein ratio på 1:400. (A) stabiliserings effekten av Rapamycin på mTOR ble evaluert av Western Blot. (B) intensiteten av mTOR band ble kvantifisert ved hjelp av statistisk analyse og tegning programvare. Linjen ble utstyrt med en logistikk kurve med fire parametere. Data ble innhentet fra de tre uavhengige eksperimenter og ble uttrykt som gjennomsnittet ± SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DART tillater identifisering av små molekyl mål ved å utnytte den beskyttende effekten av proteinbinding mot degradering. DART krever ingen kjemiske modifikasjoner eller immobilisering av det lille molekylet26. Dette gjør at små molekyler kan brukes til å bestemme deres direkte bindende protein mål. Standard vurderingskriterier for den klassiske dart-metoden inkluderer gel farging, Mass massespektrometri og Western blotting12,13. Den klassiske metodikken nevner også at disse dataene kan bli kvantitativt analysert, men det er ingen slike eksempel gitt. Her bruker vi prinsipper for mobilnettet termisk forskyvning analysen (CETSA) til semi-kvantitativt analysere data, og få parametre som ligner på de som leveres av CESTA (TM og EC50) som øker nytten av DART analyse8. Den ligand-Target interaksjon kan tegnes mot pronase: protein ratio å vise åpenbare skift i proteolytiske kurver. Gjennomføring av proteinolyse ved hjelp av ulike pronase: protein prosenter kan hjelpe i innsnevring ned konsentrasjonen av pronase som bør brukes i nedstrøms eksperimenter. Videre, ved hjelp av optimalisert konsentrasjon av pronase, proteinolyse utført i nærvær av ulike konsentrasjoner av det lille molekylet kan gi et indirekte mål på affinitet av det lille molekylet med sin mål protein. I tillegg gir generering av en dose-avhengighet kurve for tilnærming av effekter på målet proteiner avhengig av ligand konsentrasjon. Inkludering av analytisk kapasitet for dose-avhengighet er en kraftig utvidelse av DART metodikk; gir en grei og rask tilnærming til undersøkelser av terapeutisk mekanisme av små molekyler. Denne gel-baserte tilnærmingen er den enkleste å implementere. Den kan brukes for høy gjennomstrømming screening for forbindelser som binder en bestemt protein20,27,28. I tillegg kan dart utnyttes for å analysere sanne interaksjoner med lav affinitet, fordi vasking ikke er inkludert som en eksperimentell trinn12,26. Videre, sammenlignet med CETSA, har DARTS fordeler med å identifisere målene for membran proteiner som dart gir en bedre vurdering av membran proteiner gjennom bruk av milde, stabiliserende vaskemidler11.

Eksperimentet har også noen begrensninger. Først når celle lysat har en lav overflod av mål protein, kan dart metoden ikke brukes til å enkelt visualisere endringer i proteinolyse av målet protein. Ytterligere tiltak for å konsentrere disse proteinene er nødvendig for å anvende denne metodikken. For det andre, vi bare teste Rapamycin/mTOR interaksjon. Samspillet er kjent for å være potent og stabil. Noen små molekyler kan imidlertid binde seg til målene sine mindre selektivt, eller midlertidig, og det er ikke klart om slike små molekyler kan analyseres med denne analysen. For det tredje kan noen mål proteiner være ekstremt følsomme eller motstandsdyktige mot proteaser som brukes.

DART analysen analyse gir mulighet for identifisering av potensielle protein interaksjoner gjennom vurdering av proteolytiske kurver generert over en rekke pronase: protein prosenter i nærvær eller fravær av et lite molekyl ligand. Spennende, våre modifikasjoner til standard prosessuelle omrisset av DART analysen markere kapasiteten til denne metoden som skal brukes i generasjon av konsentrasjon-respons kurve. Disse utgangene er av spesialverktøy i utvikling av narkotika, som tillater identifisering av mechanistically relevante legemiddel konsentrasjoner. Videre, sammenligning av konsentrasjon-respons kurver generert ved hjelp av ulike ligander gir innsikt til sammenlignende bindende slektskap for flere ligander av samme mål; en kapasitet potensielt nyttig i prediksjon av små molekyl effekt og avgrensning av dosering. Vi håper at denne demonstrasjonen av utvidet analytisk kraft dart vil være nyttig i utvikling, implementering og forståelse av små molekyl narkotika, spesielt for ligander og mål vanskelig å analysere ved hjelp av alternative tilnærminger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet dels av NIH forskningsstipend R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, og et DOD forskningsstipend W81XWH-16-1-0482.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Dilute to 20X with ultrapure water
293T cell line ATCC CRL-3216 DMEM medium with 10% FBS
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher 23225
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Cell scraper Thermo Fisher 179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution Bio-Rad 1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma-Aldrich D2650
GraphPad Prism GraphPad Software Version 6.0 statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52 image processing and analysis software
M-PER Cell Lysis Reagent Thermo Fisher 78501
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning R21-040-CV
Pronase Roche PRON-RO 10 mg/ml
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium fluoride Sigma-Aldrich S7920
Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich 450243
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich 221368
Trizma base Sigma-Aldrich T1503 adjust to pH 8.0
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
  2. O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
  3. McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
  4. Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
  5. Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
  6. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
  7. Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
  8. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  9. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  10. Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
  11. Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
  12. Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
  13. Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
  14. Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
  15. Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
  16. Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
  17. Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
  18. Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
  19. Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
  20. Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
  21. Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
  22. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  23. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  24. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
  25. Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
  26. Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
  27. Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
  28. Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).

Tags

Biokjemi Dart semi-kvantitativ mTOR Rapamycin interaksjoner Target
En semi-kvantitativ narkotika affinitet responsiv Target stabilitet (dart)-analysen for å studere Rapamycin/mTOR interaksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, C., Cui, M., Cui, Y.,More

Zhang, C., Cui, M., Cui, Y., Hettinghouse, A., Liu, C. j. A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction. J. Vis. Exp. (150), e59656, doi:10.3791/59656 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter