Summary
В этом исследовании мы расширили возможности анализа данных эксперимента DARTS, отслеживая изменения в стабильности белка и оценивая сродство белково-лигандовых взаимодействий. Взаимодействия могут быть построены на две кривые: протеолитическая кривая и кривая доза-зависимости. Мы использовали mTOR-rapamycin взаимодействия в качестве образцового случая.
Abstract
Препарат Affinity Responsive Target Stability (DARTS) является надежным методом обнаружения новых малых целей белка молекулы. Он может быть использован для проверки известных небольших молекулно-белковых взаимодействий и для поиска потенциальных целей белка для натуральных продуктов. По сравнению с другими методами, DARTS использует родные, неизмененные, маленькие молекулы и прост и прост в эксплуатации. В этом исследовании мы еще больше расширили возможности анализа данных эксперимента DARTS, отслеживая изменения в стабильности белка и оценивая сродство белково-лигандовых взаимодействий. Взаимодействия белково-лигандов могут быть построены на две кривые: протеолитическая кривая и кривая доза-зависимости. Мы использовали взаимодействие mTOR-rapamycin в качестве образцового аргумента для создания нашего протокола. Из протеолитической кривой мы увидели, что протеолиз mTOR pronase тормозится наличием рапамицина. Кривая доза-зависимость позволила оценить связывающее сродство рапамицина и mTOR. Этот метод, вероятно, будет мощным и простым методом для точного определения новых целевых белков и для оптимизации целевого взаимодействия с наркотиками.
Introduction
Выявление малых молекул целевых белков имеет важное значение длямеханистического понимания и развития потенциальных терапевтических препаратов 1,2,3. Хроматография сродства, как классический метод определения целевых белков малых молекул, дала хорошие результаты4,5. Однако, этот метод имеет ограничения, в том, что химическая модификация малых молекул часто приводит к снижению или измененной связывания специфичности или сродства. Для преодоления этих ограничений недавно было разработано и применено несколько новых стратегий для выявления малых молекулных целей без химической модификации малых молекул. Эти прямые методы для целевой идентификации этикетки свободных малых молекул включают препарат сродство реагировать целевой стабильности (DARTS)6, стабильность белков от ставок окисления (SPROX)7, клеточный тепловой анализ (CETSA)8 ,9, и теплового протеома профилирования (TPP)10. Эти методы являются весьма выгодными, поскольку они используют природные, неизмененные небольшие молекулы и полагаться только на прямые связывающие взаимодействия, чтобы найти целевые белки11.
Среди этих новых методов, DARTS является сравнительно простой методологии, которая может быть легко принята в большинстве лабораторий12,13. DARTS зависит от концепции, что лиганд-связанных белков продемонстрировать модифицированную восприимчивость к ферментативной деградации по отношению к несвязанных белков. Новый целевой белок может быть обнаружен путем изучения измененной полосы в геле SDS-PAGE с помощью жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Этот подход был успешно реализован для выявления ранее неизвестных целей натуральных продуктов и лекарств14,15,16,17,18, 19. Он также является мощным в качестве средства для проверки или проверки связывания соединений с конкретным белком20,21. В этом исследовании мы представляем улучшение эксперимента путем мониторинга изменений в стабильности белка с небольшими молекулами и выявления белка-лиганд связывания сходства. Мы используем mTOR-rapamycin взаимодействия в качестве примера, чтобы продемонстрировать наш подход.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Собирать и лиза клетки
- Выращивайте 293T-клетки с помощью модифицированной среды «Орел» (DMEM) с 10% сывороткой крупного рогатого скота, глутамином 2 мМ и 1% антибиотиками. Инкубировать культуры при 37 градусах Цельсия под 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние роста клеток может повлиять на стабильность последующих экспериментов. - Расширяйте клетки в культуре до достижения 80-u201290% слияния.
- Смешайте 345 л реагента лизации клеток (см. Таблицу Материалов)с 25 qL 20-x кислогоингового коктейля, 25 л 1 М фтора натрия, 50 мЛ 100 мм и глицерофосфат, 50 мл 50 мм пирофосфата натрия и 5 мл. Держите буфер лисиса охлажденным на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие буферы лиза с различными моющими средствами (например, Triton X-100 или NP-40) могут быть использованы с DARTS до тех пор, пока они не денатурируют. Мембранные белки или ядерные белки могут быть извлечены путем добавления 0,4% Triton X-100 или 0,4% NP-40 в клеточный лизат. - Вымойте клетки дважды с холодной фосфат-буферной сосуд (PBS).
- Используйте клеточный скребок для сбора клеток в соответствующем количестве буфера лиза клетки и переноса лизинирующих клеток в трубку объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток, необходимых для каждого эксперимента DARTS будет варьироваться в зависимости от того, сколько белка может быть извлечено из различных клеточных линий. В целом, концентрация белка в используемом лисате находится между 4 х u20126 мкг/Л. Одна 10-сантиметровая пластина из 293T-клеток при флюенции 85 кв201290%, лисизированная с 300 злис-буфером лиза, как правило, приводит к концентрации белка с концентрацией белка в 5 мкг/л. - Смешайте лисис буфер / лизинируя клетки хорошо и инкубировать трубку на льду в течение 10 минут.
- Центрифуга трубки на 18000 г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
- Перенесите супернатант в новую трубку 1,5 мл и держите охлажденным на льду.
- Выполните анализ BCA, чтобы приблизить концентрацию белка в лисатах.
2. Инкубировать лисатпрома с малой молекулой
- Разделите 99 л лисатов на две трубки длиной 1,5 мл.
- Сделать стартовую концентрацию запасов 10 мМ небольшой молекулы. При выполнении DARTS, можно начать с более высокой концентрации небольшой молекулы (5'u201210x ec50 значение), чтобы обеспечить оптимальное связывание.
- Добавьте либо 1 зл растворителя, что небольшая молекула растворима в или 1 л малых растворов запасов молекулы для каждого aliquot из lysate. Инкубировать клеточный лисат с растворами в течение 30 х u201260 мин при комнатной температуре с встряхиванием.
- На льду установите серийные разбавления (1:200, 1:400, 1:800 и 1:1600) свежеразмороженного раствора проназе в 1x ТНК (за 1 мл 10-х буфера ТНК, смешайте 300 л сверхчистой воды с 100 мл хлорида 5 М натрия, 100 мл. , и 500 л из 1 M Tris-HCl, рН 8.0).
- Изучите широкоширное соотношение проназе: белков (например, охватывающие от 1:100 до 1:2000), чтобы гарантировать наблюдаемость пошагового эффекта проназе на цель (ы).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета концентрации проназе (пример): 5 мкг/Л концентрации белка х 20 л образца 100 мкг белка. Для проназе: коэффициент белка 1:100 нам нужно 0,5 мкг/л (100 мкг, 100 й2 йл) pronase раствор. Этот эксперимент, возможно, придется повторить несколько раз, чтобы получить подходящий диапазон pronase: белковые соотношения.
3. Выполните протеолиза
ПРИМЕЧАНИЕ: Для протеолиза, шаги выполняются при комнатной температуре, если иное не отмечено
- После инкубации с небольшой молекулой, разделить каждый aliquot на 20 образцов Л.
- Добавьте 2 злицы диапазона проназе решений в каждом образце через определенные промежутки времени (каждые 30 с). Используйте равный объем буфера TNC 1x для создания непереваренных контрольных образцов.
- После 5'u201220 мин, остановить пищеварение путем добавления 2 л холодного 20x протеазы ингибитор коктейль каждые 30 с. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 10 минут.
- Разбавить образцы с соответствующим объемом 5x SDS-PAGE погрузки буфера и кипятить при 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
- Проведите следующую часть эксперимента или храните образец белка при 80 градусах Цельсия.
4. Количественная оценка и анализ
- После DARTS, выполнить Coomassie синий окрашивание в соответствии с ранее опубликованным протоколом22.
- Окрашенные белковые полосы должны быть очень четкими после дестиназания. Налейте использованный раствор дестана и добавьте свежий 1% уксусной кислоты раствор для покрытия геля. Положите гель под свет для того чтобы наблюдать полосы с значительно разницами между группами с (группой образца) или без (группы управления) малая молекула.
- Вырежьте две соответствующие полосы из геля с помощью стерильного инструмента и немедленно выполните LC-MS/MS.
ПРИМЕЧАНИЕ: LC-MS/MS необходимо сделать как можно скорее, потому что белки в геле будут постоянно ухудшаться. - Дайджест полос, экстракт пептидов и выполнять АНАЛИЗ LC-MS/MS23.
- Для анализа данных LC-MS/MS сначала определите все белки в отдельной полосе. Во-вторых, используйте пептидный спектр матча (PSM) для представления обилия каждого белка.
ПРИМЕЧАНИЕ: PSM обеспечивает общее количество идентифицированных пептидных последовательностей для белка, в том числе выявляемых. В целом, как часто пептид идентифицируется / секвенированный может быть использован в качестве приблизительной оценки того, насколько обильный белок в образце. Белки, обогащенные в группе образцов над контрольной группой, представляют интересуемые белки.
- Для анализа данных LC-MS/MS сначала определите все белки в отдельной полосе. Во-вторых, используйте пептидный спектр матча (PSM) для представления обилия каждого белка.
- Закупай первичные антитела выбранных белков. Выполните западное пятно, чтобы убедиться, что небольшая молекула может связываться непосредственно с потенциальными белками цели24.
- Загрузите одинаковое количество белка в скважины 8% гель SDS-PAGE, а также соответствующий молекулярный маркер веса. Выполнить гель в течение 30 минут при 80 В, затем отрегулировать напряжение до 120 В и продолжить работать на 1'u20122 ч.
- Количественная оценка различных целевых белковых полос с использованием программного обеспечения для обработки изображений и анализа (см. Таблицу Материалов).
- Проанализируйте данные и нарисуйте кривые.
- Определение протеолитической кривой для целевого белка
- Соотношение проназе:белка изменяется при выполнении протеолиза. Нормализация данных анализа изображений путем отнесения значений интенсивности полосы, соответствующих непереваренных диапазонам, до 100%.
- Используйте нелинейный регрессионный анализ статистического анализа и составление программного обеспечения для составления кривой нормализованных данных для относительной интенсивности полос и коэффициентов pronase:protein.
- Во-первых, откройте программное обеспечение, выберите тип таблицы и графика как XY и допускайте 3 значения репликации в бок о бок подколоннах. Затем введите соответствующие данные в пространстве ниже x и y. В соответствии с x, вввод номера 0, 1, 2, 3, 4, 5 (как держатели мест соответствующих pronase: белковые соотношения).
- В столбце y введите нормализованные данные для относительной интенсивности полосы. Выполните "Нелинейную регрессию" и реализуйте уравнение "Доза-ответ-стимуляция" с помощью уравнения "Log (агонист) против ответа-Variable slope (четыре параметра)" уравнение.
- Преобразуйте аннотации X-оси в кривой в соответствующие соотношения pronase:protein.
- Определение кривой дозы-зависимости для целевого белка
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа дозы-зависимости, моляритость небольшой молекулы отличается между образцами. Стабильный коэффициент pronase:protein должен быть основан на анализе данных протеолиза. Соотношение pronase:protein, которое показало максимальную разницу в интенсивности целевого белка во время протеолитической кривой, должно быть использовано для эксперимента по доза-зависимости.- Количественная оценка различных целевых белковых полос с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Как и в генерации кривой доза-зависимости, нормализуем данные из анализа изображений, приписывая значения интенсивности полосы, соответствующие наименее усваемой полосе, до 100%.
- Примените нелинейный регрессионный анализ в рамках статистического анализа и составление программного обеспечения к нормализованным данным. Во-первых, откройте программное обеспечение, выберите тип таблицы и графика как XY и введите 3 значения репликации в бок о бок подколонны.
- Затем введите соответствующие данные в пространстве ниже x и y. Для переменной 'x', ввод различных концентраций небольшой молекулы; 'y' включает в себя соответствующие нормализованные данные относительной интенсивности полос.
- Преобразование значений x с помощью X и Log (X). Наконец, используйте нелинейную регрессию и реализуем стимуляцию дозы-реакции с помощью уравнения "Log (агонист) против ответа -Variable slope (четыре параметра)" уравнение.
- Определение протеолитической кривой для целевого белка
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Диаграмма потока эксперимента изложена на рисунке 1. Результат синего окрашивания Coomassie показан на рисунке 2. Инкубация с небольшой молекулой обеспечивает защиту от протеолиза. Три полосы, которые, как представляется, защищены инкубации с рапамицином над управлением транспортным средством найдены. Ожидаемые результаты эксперимента протеолитической кривой показаны на рисунке 3. В качестве доказательства принципа, мы изучили хорошо изученный белок mTOR, который является мишенью для препарата рапамицин25. Западный blotting иллюстрирует наличие протеина mTOR на низких коэффициентах pronase: коэффициенты протеина и свои уменьшения и потери с увеличивая коэффициентами(рисунок 3A). Протеолиз mTOR pronase явно тормозится наличием рапамицина и добавление рапамицина генерирует очевидный сдвиг в протеолитической кривой (Рисунок 3B). Для исследования последствий концентрации препарата, мы поддерживали постоянную проназа: соотношение белка при различных концентрациях рапамицина. По мере того как концентрация лиганда приближается к цели связывающей насыщенности, наблюдается повышенное присутствие целевого белка. Рапамицин дозы зависимо повысилу уровень mTOR, предполагая рост стабильности mTOR с лечением рапамицина(Рисунок 4A). Количественная оценка интенсивности целевого белкового диапазона позволяет воспроизлучать целевую стабильность как функцию концентрации лиганда, о чем свидетельствует кривая на рисунке 4B. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что mTOR является целевым белком рапамицина.
Рисунок 1: Схема подхода DARTS к полуколичественному анализу, направленного на достижение целевых лекарственных препаратов. Клеточный лизат инкубируется в присутствии или отсутствии небольшой молекулы, за которой следует протеоз и белковый электрофорез. Защищенные белковые полосы вырезаются и подвергаются масс-спектроскопии. Белковые мишени идентифицируются как те белки, которые демонстрируют повышенную устойчивость протеазы в присутствии небольшой молекулы. Затем западная подись используется для выявления и полуколичественного анализа целевых белков. Данные выражаются в качестве средств и стандартного отклонения (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Пример Coomassie синий окрашивание визуализации DARTS с небольшой молекулы рапамицина. Красные точки фланг защищенных полос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Иллюстрация оставшегося количества mTOR доступны для обнаружения в качестве функции pronase: белок соотношение, используемое для лечения 293T клеточных лизата. (A) Защита mTOR от протеолиза рапамицином была оценена западным анализом поблучники. (B) Интенсивность полос mTOR была количественно с помощью статистического анализа и разработки программного обеспечения. Линия была оснащена четырехпопараметрыной логистической кривой. Данные были получены в результате трех независимых экспериментов и были выражены в виде среднего sD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Иллюстрация количества стабилизированного mTOR, доступного для обнаружения при наличии возрастающих концентраций рапамицина. 293T клеточные лизаты были инкубированы рапамицином (0, 1, 10, 100, 1000, 10000 нм) на 1 ч, затем клеточные лизаты были подвергнуты пищеварению на проназе: соотношение белка 1:400. (A) Стабилизационный эффект рапамицина на mTOR был оценен западным пятном. (B) Интенсивность полос mTOR была количественно с помощью статистического анализа и разработки программного обеспечения. Линия была оснащена четырехпопараметрыной логистической кривой. Данные были получены в результате трех независимых экспериментов и были выражены в виде среднего sD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DARTS позволяет идентифицировать небольшие молекулы целей, используя защитный эффект связывания белка против деградации. DARTS не требует каких-либо химических модификаций или иммобилизации небольшой молекулы26. Это позволяет использовать небольшие молекулы для определения своих прямых целей связывания белка. Стандартные критерии оценки классического метода DARTS включают гель окрашивание, масс-спектрометрию и западный blotting12,13. Классическая методология также упоминает, что эти данные могут быть количественно проанализированы, но нет такого примера. Здесь мы используем принципы клеточного теплового анализа (CETSA) для полуколичественного анализа данных и получения параметров, аналогичных тем, которые поставляются CESTA (Tm и EC50), что повышает полезность анализа DARTS8. Взаимодействие лиганда-цели можно нарисовать против pronase:отношение протеина для того чтобы показать очевидные переносы в протеолитических кривых. Проведение протеолиз с использованием различных pronase: белковые соотношения могут помочь в сужении концентрации проназа, которые должны быть использованы в экспериментах вниз по течению. Далее, используя оптимизированную концентрацию проназа, протеолиз, проводимый в присутствии различных концентраций небольшой молекулы, может обеспечить косвенное измерение сродства небольшой молекулы с ее целевым белком. Кроме того, генерация кривой доза-зависимости позволяет прибавлять от воздействия на целевые белки, зависящие от концентрации лиганд. Включение аналитического потенциала для доза-зависимости является мощным расширением методологии DARTS; обеспечение простого и быстрого подхода к зондирования терапевтического механизма малых молекул. Этот подход на основе геля является самым простым в реализации. Он может быть использован для высокой пропускной связи скрининга для соединений, которые связывают конкретный белок20,27,28. Кроме того, DARTS могут быть использованы для анализа истинных взаимодействий с низким сродством, потому что мытье не входит в качестве экспериментального шага12,26. Кроме того, по сравнению с CETSA, DARTS имеет преимущества в определении целей мембранных белков, так как DARTS позволяет лучше оценивать мембранные белки за счет использования мягких, стабилизирующих моющих средств11.
Эксперимент также имеет некоторые ограничения. Во-первых, когда клеточный лизат имеет низкое обилие целевого белка, метод DARTS не может быть использован для легкой визуализации изменений в протеолизе целевого белка. Для применения этой методологии необходимы дополнительные шаги по концентрации этих белков. Во-вторых, мы тестируем только взаимодействие рапамицина/мТОР. Взаимодействие, как известно, является мощным и стабильным. Тем не менее, некоторые небольшие молекулы могут связываться со своими целями менее избирательно, или преходяще, и не ясно, если такие маленькие молекулы могут быть проанализированы с этим анализом. В-третьих, некоторые целевые белки могут быть чрезвычайно чувствительны мишенями или устойчивы к используемым протеазам.
Анализ анализа DARTS позволяет выявить потенциальные взаимодействия белка путем оценки протеолитических кривых, генерируемых по целому ряду пронас: белковые соотношения в присутствии или отсутствии небольшой молекулы лиганд. Интересно, что наши изменения в стандартном процедурном контуре dARTS assay подчеркивают способность этого метода, который будет использоваться в генерации кривой концентрации-реакции. Эти выходы имеют особую полезность в разработке лекарственных средств, что позволяет выявлять механистически соответствующие концентрации лекарственных средств. Кроме того, сравнение кривых концентрации и реакции, создаваемых с использованием разрозненных лигандов, дает представление о сравнительном связывающем сродстве для нескольких лиганд одной и той же цели; потенциал потенциально полезен в прогнозировании эффективности малых молекул и уточнении дозирования. Мы надеемся, что эта демонстрация расширенной аналитической мощности DARTS будет полезна в разработке, внедрении и понимании малых молекулнаркотиков, особенно для лигандов и целей, трудно анализировать с помощью альтернативных подходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана NIH научно-исследовательских грантов R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, а также ДОР научно-исследовательский грант W81XWH-16-1-0482.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
- O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
- McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
- Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
- Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
- Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
- Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
- Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
- Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
- Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
- Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
- Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
- Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
- Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
- Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
- Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
- Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
- Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
- Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).
