Summary
En este estudio, mejoramos las capacidades de análisis de datos del experimento DARTS mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de las proteínas y la estimación de la afinidad de las interacciones proteína-ligand. Las interacciones se pueden trazar en dos curvas: una curva proteolítica y una curva de dependencia de dosis. Hemos utilizado la interacción mTOR-rapamicina como un caso ejemplar.
Abstract
La estabilidad de objetivos sensibles a la afinidad de fármacos (DARTS) es un método robusto para la detección de nuevos objetivos de proteínas de moléculas pequeñas. Se puede utilizar para verificar las interacciones molécula-proteína seres(as) conocidas y para encontrar posibles dianas proteicas para productos naturales. En comparación con otros métodos, DARTS utiliza moléculas nativas, no modificadas, pequeñas y es simple y fácil de operar. En este estudio, mejoramos aún más las capacidades de análisis de datos del experimento DARTS mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de las proteínas y la estimación de la afinidad de las interacciones proteína-ligand. Las interacciones proteína-ligand se pueden trazar en dos curvas: una curva proteolítica y una curva de dependencia de dosis. Hemos utilizado la interacción mTOR-rapamicina como un caso ejemplar para el establecimiento de nuestro protocolo. De la curva proteolítica vimos que la proteólisis de mTOR por pronasa fue inhibida por la presencia de rapamicina. La curva de dependencia de dosis nos permitió estimar la afinidad vinculante de rapamicina y mTOR. Es probable que este método sea un método potente y sencillo para identificar con precisión nuevas proteínas diana y para la optimización de la participación objetivo de fármacos.
Introduction
La identificación de proteínas diana de moléculas pequeñas es esencial para la comprensión mecanicista y el desarrollo de fármacos terapéuticos potenciales1,2,3. La cromatografía de afinidad, como método clásico para identificar las proteínas diana de moléculas pequeñas, ha dado buenos resultados4,5. Sin embargo, este método tiene limitaciones, en que la modificación química de moléculas pequeñas a menudo resulta en una especificidad o afinidad de unión reducida o alterada. Para superar estas limitaciones, recientemente se han desarrollado y aplicado varias estrategias nuevas para identificar los objetivos de moléculas pequeñas sin modificación química de las moléculas pequeñas. Estos métodos directos para la identificación diana de moléculas pequeñas sin etiquetas incluyen la estabilidad objetivo sensible a la afinidad de los fármacos (DARTS)6, la estabilidad de las proteínas a partir de las tasas de oxidación (SPROX)7, el ensayo de cambio térmico celular (CETSA)8 ,9, y perfilado de proteome térmico (TPP)10. Estos métodos son muy ventajosos porque utilizan moléculas pequeñas naturales y no modificadas y dependen únicamente de interacciones de unión directa para encontrar proteínas objetivo11.
Entre estos nuevos métodos, DARTS es una metodología comparativamente simple que puede ser fácilmente adoptada por la mayoría de los laboratorios12,13. DARTS depende del concepto de que las proteínas ligadas a ligando de ligando demuestran la susceptibilidad modificada a la degradación enzimática en relación con las proteínas no unidas. La nueva proteína diana se puede detectar mediante el examen de la banda alterada en gel SDS-PAGE a través de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS/MS). Este enfoque se ha implementado con éxito para la identificación de objetivos previamente desconocidos de productos naturales y medicamentos14,15,16,17,18, 19. También es potente como medio para detectar o validar la unión de compuestos a una proteína específica20,21. En este estudio, presentamos una mejora en el experimento mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de proteínas con moléculas pequeñas y la identificación de afinidades de unión proteína-ligand. Utilizamos la interacción mTOR- rapamicina como ejemplo para demostrar nuestro enfoque.
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Protocol
1. Recoger y lijar células
- Cultivar células 293T usando el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal, 2 mM de glutamina y 1% de antibióticos. Incubar cultivos a 37oCpor debajo del 5% de CO 2.
NOTA: El estado de crecimiento de las celdas puede afectar a la estabilidad de los experimentos posteriores. - Amplíe las celdas en el cultivo hasta que alcancen la confluencia del 80-u201290%.
- Mezclar 345 ml de reactivo de lisis celular (ver la Tabla de Materiales)con 25 l de cóctel inhibidor de la proteasa 20x, 25 ml de fluoruro sódico de 1 M, 50 ml de 100 m de glicerofosfato, 50 ml de pirofosfato sódico de 50 ml y 5 ml de ortovanato sódico de 200 mM. Mantenga el tampón de lisis refrigerado en hielo.
NOTA: Otros tampones de lisis con diversos detergentes (por ejemplo, Triton X-100 o NP-40) se pueden utilizar con DARTS siempre y cuando no se desnaturalizen. Las proteínas de membrana o proteínas nucleares se pueden extraer añadiendo 0.4% Triton X-100 o 0.4% NP-40 al lisado celular. - Lave las células dos veces con solución salina con fosfato frío (PBS).
- Utilice un rascador de células para recoger las células en una cantidad apropiada de tampón de lisis celular y transferir las células de lising en un tubo de 1,5 ml.
NOTA: El número de células necesarias para cada experimento DARTS variará en función de la cantidad de proteína que se pueda extraer de varias líneas celulares. En general, la concentración proteica del lisato utilizado se encuentra entre 4 u20126 g/L. Una placa de 10 cm de células de 293T a 85-u201290% de confluencia, lysed con 300 s de tampón de lisis típicamente resulta en un lisado con una concentración de proteínas de 5 g / L. - Mezclar bien las células tampón/lisis y incubar el tubo en hielo durante 10 min.
- Centrifugar el tubo a 18.000 oG durante 10 min a 4oC.
- Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml y manténgalo refrigerado sobre hielo.
- Realizar un ensayo BCA para aproximar la concentración proteica de los lysatos.
2. Incubar lete proteínas con la molécula pequeña
- Dividir 99 l de los lysates en dos tubos de 1,5 ml.
- Hacer una concentración de stock inicial de 10 mM pequeña molécula. Al realizar DARTS, se puede comenzar con una mayor concentración de la molécula pequeña (5-u201210x el valor EC50) para asegurar una unión óptima.
- Añadir 1 l de disolvente en el que la molécula pequeña es soluble o de 1 l de soluciones de stock de moléculas pequeñas a cada alícuota de lisato. Incubar el lisado celular con las soluciones para 30 u201260 min a temperatura ambiente con temblor.
- En hielo, establezca diluciones en serie (1:200, 1:400, 1:800 y 1:1600) de solución de pronasa recién desawed en 1x TNC (Para 1 mL de tNC 10x, mezcle 300 l de agua ultrapura con 100 ol de cloruro de sodio de 5 M, 100 ml de 1 M de tnc tcmón, mezcle 300 l de agua ultrapura con 100 ol de cloruro de sodio de 5 M, 100 ml de 1 M de tampón de calcio de 1 M , y 500 l de 1 M Tris-HCl, pH 8,0).
- Examine una amplia gama de proporciones pronasa:proteína (por ejemplo, que abarcan de 1:100 a 1:2000) para garantizar la observabilidad del efecto escalonado de la pronasa en los objetivos.
NOTA: Para calcular las concentraciones de pronasa (ejemplo): concentración de proteína de 5 g/L x 20 oL de muestra a 100 g de proteína. Para una relación pronase:proteína de 1:100 necesitamos una solución de pronasa de 0,5 g/l (100 g a 100 x 2 l). Este experimento puede tener que repetirse varias veces para obtener un rango adecuado de proporciones pronasa:proteína.
3. Realizar proteólisis
NOTA: Para la proteólisis, los pasos se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario
- Después de la incubación con la molécula pequeña, divida cada alícuota en muestras de 20 ml.
- Añadir 2 l de la gama de soluciones de pronasa en cada muestra a intervalos específicos (cada 30 s). Utilice un volumen igual de búfer TNC 1x para establecer una muestra de control no digerida.
- Después de 5 u201220 min, detenga la digestión mediante la adición de 2 ol de cóctel inhibidor de la proteasa fría 20x cada 30 s. Mezcle bien e incubar en hielo durante 10 minutos.
- Diluir las muestras con el volumen adecuado de 5 tampón de carga SDS-PAGE y hervir a 95 oC durante 5 min.
- Llevar a cabo la siguiente porción del experimento o almacenar la muestra de proteína a 80 oC.
4. Cuantificación y análisis
- Después de DARTS, realice la tinción azul de Coomassie de acuerdo con el protocolo22publicado anteriormente.
- Las bandas de proteínas manchadas deben ser muy claras después de la desención. Vierta la solución de desfinación usada y agregue una solución fresca de ácido acético al 1% para cubrir el gel. Coloque el gel bajo la luz para observar las bandas con diferencias significativas entre grupos con (grupo de muestra) o sin (grupo de control) la molécula pequeña.
- Corte las dos bandas correspondientes del gel con un instrumento estéril y realice LC-MS/MS inmediatamente.
NOTA: LC-MS/MS debe realizarse lo antes posible porque las proteínas del gel se degradarán continuamente. - Digerir las bandas, extraer péptidos y realizar el análisis LC-MS/MS23.
- Para analizar los datos de LC-MS/MS, primero identifique todas las proteínas de la banda individual. En segundo lugar, utilice la coincidencia del espectro de péptidos (PSM) para representar la abundancia de cada proteína.
NOTA: PSM proporciona el número total de secuencias de péptidos identificadas para la proteína, incluidas las identificadas de forma redundante. En general, la frecuencia con la que se identifica/secuencia un péptido se puede utilizar como una estimación aproximada de cuán abundante es la proteína en la muestra. Las proteínas enriquecidas en el grupo de muestra sin el grupo de control son proteínas de interés.
- Para analizar los datos de LC-MS/MS, primero identifique todas las proteínas de la banda individual. En segundo lugar, utilice la coincidencia del espectro de péptidos (PSM) para representar la abundancia de cada proteína.
- Procurar los anticuerpos primarios de las proteínas seleccionadas. Realizar mancha occidental para verificar que la molécula pequeña puede unirse directamente a las proteínas objetivo potenciales24.
- Cargar cantidades iguales de proteína en los pozos de un 8% de gel SDS-PAGE, junto con un marcador de peso molecular adecuado. Ejecuta el gel durante 30 min a 80 V, luego ajusta la tensión a 120 V y continúa funcionando durante 1.u20122 h.
- Cuantifique las diferentes bandas de proteínas diana utilizando el software de procesamiento y análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales).
- Analice los datos y dibuje las curvas.
- Determinación de la curva proteolítica para una proteína diana
- La relación pronase:proteína es variada cuando se realiza proteólisis. Normalice los datos del análisis de imágenes atribuyendo los valores de intensidad de banda correspondientes a las bandas no digeridas al 100%.
- Utilice el análisis de regresión no lineal del software de análisis estadístico y dibujo para trazar una curva de datos normalizados para la intensidad relativa de la banda y las relaciones pronase:proteína.
- En primer lugar, abra el software, seleccione el tipo de tabla y gráfico como XY y permita 3 valores de réplica en subcolumnas en paralelo. A continuación, introduzca los datos correspondientes en el espacio debajo de x e y. En x, introduzca los números 0, 1, 2, 3, 4, 5 (como los portalugares correspondientes pronasa:proteínas).
- En la columna y, introduzca los datos normalizados para las intensidades de banda relativas. Realice "Regresión no lineal" e implemente una "Dosis-respuesta-Estimulación" utilizando la ecuación "Log (agonista) versus response—Variable slope (cuatro parámetros)".
- Convierta las anotaciones del eje X en la curva en las relaciones pronase:proteína correspondientes.
- Determinación de la curva de dependencia de la dosis para una proteína diana
NOTA: Para el análisis de la dosis-dependencia, la molaridad de la molécula pequeña se diferencia entre las muestras. La relación pronase:proteína estable debe ser informada mediante el análisis de los datos de proteólisis. Para el experimento de la dosis se debe utilizar la relación pronase:proteína que mostró la máxima diferencia en la intensidad de la proteína diana durante la curva proteolítica.- Cuantifique las diferentes bandas de proteínas diana utilizando un software de análisis de imágenes. Al igual que en la generación de la curva de dependencia de dosis, normalice los datos del análisis de imágenes atribuyendo los valores de intensidad de la banda correspondientes a la banda menos digerida al 100%.
- Aplique el análisis de regresión no lineal dentro del software de análisis estadístico y dibujo a los datos normalizados. En primer lugar, abra el software, seleccione el tipo de tabla y gráfico como XY e introduzca 3 valores de réplica en subcolumnas en paralelo.
- A continuación, introduzca los datos correspondientes en el espacio inferior a x e y. Para la variable 'x', introduzca diferentes concentraciones de la molécula pequeña; 'y' incluye los datos normalizados correspondientes para la intensidad relativa de la banda.
- Transformar los valores x mediante X - Log(X). Por último, emplee la regresión no lineal e implemente una estimulación dosis-respuesta utilizando la ecuación "Log (agonista) versus response—Variable slope (cuatro parámetros)".
- Determinación de la curva proteolítica para una proteína diana
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Representative Results
El diagrama de flujo del experimento se describe en la Figura1. El resultado de la tinción azul de Coomassie se muestra en la Figura2. La incubación con la molécula pequeña confiere protección contra la proteólisis. Se encuentran tres bandas que parecen estar protegidas por la incubación con rapamicina sobre el control del vehículo. Los resultados esperados del experimento de curva proteolítica se muestran en la Figura3. Como prueba de principio, examinamos el mTOR de proteína bien estudiado, que es el objetivo de la rapamicina25del fármaco. La hincha occidental ilustra la presencia de proteína mTOR en proporciones de baja pronasa:proteína y su reducción y pérdida con proporciones crecientes (Figura3A). La proteólisis de mTOR por pronasa se inhibe claramente por la presencia de rapamicina y la adición de rapamicina genera un cambio obvio en la curva proteolítica (Figura3B). Para investigar los efectos de la concentración de fármacos, mantuvimos una relación constante pronasa:proteína mientras variamos las concentraciones de rapamicina. A medida que la concentración de ligando se acerca a la saturación de unión objetivo, se observa una mayor presencia de proteína diana. La dosis de rapamicina mejoró el nivel de mTOR, lo que sugiere la creciente estabilidad de mTOR con tratamiento con rapamicina (Figura 4A). La cuantificación de las intensidades de la banda de proteína objetivo permite la representación de la estabilidad objetivo en función de la concentración de ligando según lo ejemplificado por la curva de la Figura 4B. Estos resultados sugieren fuertemente que mTOR es la proteína diana de la rapamicina.
Figura 1: Esquema del enfoque DARTS para el análisis semicuantitativo de objetivos farmacológicos. El lisato celular se incuba en presencia o ausencia de una molécula pequeña, seguido de proteólisis y electroforesis proteica. Las bandas proteicas protegidas se extirpan y se someten a espectroscopia de masas. Las dianas proteicas se identifican como aquellas proteínas que muestran una mayor resistencia a la proteasa en presencia de la molécula pequeña. A continuación, western-blot se utiliza para identificar y analizar semicuantitativamente las proteínas diana. Los datos se expresan como medias de desviación estándar (SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplo de visualización de manchas azules de Coomassie de DARTS con la pequeña molécula rapamicina. Los puntos rojos flanquean las bandas protegidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ilustración de la cantidad restante de mTOR accesible para la detección en función de la relación pronasa:proteína utilizada para el tratamiento de las isladas de células 293T. (A) La protección de mTOR contra la proteólisis por rapamicina se evaluó mediante el análisis de la mancha occidental. (B) La intensidad de las bandas mTOR se cuantificó utilizando el software de análisis y dibujo estadístico. La línea estaba equipada con una curva logística de cuatro parámetros. Los datos se obtuvieron de los tres experimentos independientes y se expresaron como media sD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ilustración de la cantidad de mTOR estabilizado accesible para la detección en presencia de concentraciones crecientes de rapamicina. 293T lisados celulares fueron incubados con rapamicina (0, 1, 10, 100, 1000, 10000 nM) durante 1 h, luego los lysatos celulares fueron sometidos a la digestión a la proporción de pronasa:proteína de 1:400. (A) El efecto de estabilización de la rapamicina en el mTOR fue evaluado por la mancha occidental. (B) La intensidad de las bandas mTOR se cuantificó utilizando el software de análisis y dibujo estadístico. La línea estaba equipada con una curva logística de cuatro parámetros. Los datos se obtuvieron de los tres experimentos independientes y se expresaron como media sD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
DARTS permite la identificación de pequeñas dianas de moléculas explotando el efecto protector de la unión a proteínas contra la degradación. DARTS no requiere ninguna modificación química o inmovilización de la molécula pequeña26. Esto permite utilizar moléculas pequeñas para determinar sus objetivos de proteína de unión directa. Los criterios de evaluación estándar para el método Clásico DARTS incluyen la tinción de gel, espectrometría de masas y la hincha occidental12,13. La metodología clásica también menciona que estos datos pueden ser analizados cuantitativamente, pero no existe tal ejemplo. Aquí, utilizamos los principios del ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA) para analizar semicuantitativamente los datos, y obtener parámetros similares a los suministrados por CESTA (Tm y EC50) lo que aumenta la utilidad del análisis DARTS8. La interacción ligando-objetivo se puede trazar contra la relación pronasa:proteína para mostrar cambios obvios en curvas proteolíticas. Llevar a cabo proteólisis utilizando diferentes proporciones pronase:proteína puede ayudar a reducir la concentración de pronasa que se debe utilizar en experimentos aguas abajo. Además, utilizando la concentración optimizada de pronasa, la proteólisis llevada a cabo en presencia de diferentes concentraciones de la molécula pequeña puede proporcionar una medida indirecta de la afinidad de la molécula pequeña con su proteína diana. Además, la generación de una curva de dependencia de la dosis permite la aproximación de los efectos sobre las proteínas diana dependientes de la concentración de ligandos. La inclusión de la capacidad analítica para la dependencia de la dosis es una poderosa expansión de la metodología DARTS; proporcionar un enfoque sencillo y rápido para sondear el mecanismo terapéutico de las moléculas pequeñas. Este enfoque basado en gel es el más fácil de implementar. Se puede utilizar para el cribado de alto rendimiento para compuestos que unen una proteína específica20,27,28. Además, DARTS se puede utilizar para analizar verdaderas interacciones con baja afinidad, ya que el lavado no se incluye como un paso experimental12,26. Además, en comparación con CETSA, DARTS tiene ventajas en la identificación de los objetivos de las proteínas de membrana ya que DARTS permite una mejor evaluación de las proteínas de membrana mediante el uso de detergentes suaves y estabilizadores11.
El experimento también tiene algunas limitaciones. En primer lugar, cuando el lisato celular tiene una baja abundancia de proteína diana, el método DARTS no se puede utilizar para visualizar fácilmente alteraciones en la proteólisis de la proteína diana. Se requieren pasos adicionales para concentrar estas proteínas para aplicar esta metodología. En segundo lugar, solo probamos la interacción de rapamicina/mTOR. Se sabe que la interacción es potente y estable. Sin embargo, algunas moléculas pequeñas pueden unirse a sus objetivos de manera menos selectiva, o transitoria, y no está claro si tales moléculas pequeñas se pueden analizar con este ensayo. En tercer lugar, algunas proteínas diana pueden ser extremadamente sensibles o resistentes a los proteasas utilizados.
El análisis de ensayo DARTS permite la identificación de posibles interacciones proteicas a través de la evaluación de curvas proteolíticas generadas a través de una gama de proporciones pronasa:proteína en presencia o ausencia de un ligando de moléculas pequeñas. Emocionantemente, nuestras modificaciones en el esquema de procedimiento estándar del ensayo DARTS ponen de relieve la capacidad de este método para ser utilizado en la generación de curva de concentración-respuesta. Estos productos son de especial utilidad en el desarrollo de fármacos, lo que permite identificar las concentraciones de fármacos mecanísticamente relevantes. Además, la comparación de las curvas de concentración-respuesta generadas mediante ligandos dispares ofrece información sobre las afinidades de unión comparativa para varios ligandos del mismo objetivo; una capacidad potencialmente útil en la predicción de la eficacia de moléculas pequeñas y el refinamiento de la dosificación. Esperamos que esta demostración de poder analítico ampliado de DARTS sea útil en el desarrollo, implementación y comprensión de fármacos de moléculas pequeñas, particularmente para ligandos y objetivos difíciles de analizar utilizando enfoques alternativos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por las becas de investigación DE NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, y una beca de investigación del Departamento de Defensa W81XWH-16-1-0482.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
- O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
- McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
- Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
- Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
- Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
- Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
- Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
- Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
- Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
- Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
- Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
- Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
- Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
- Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
- Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
- Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
- Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
- Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).
