Summary
我们提供一种简单而有效的方法,将治疗E18.5胸腺素的2'脱氧腺苷移植到裸鼠的肾胶囊中。该方法应辅助研究胸腺上皮细胞功能和T细胞成熟。
Abstract
胸腺是重要的中央免疫器官,在T细胞的发育和分化中起着至关重要的作用。胸腺移植是研究胸腺上皮细胞功能和T细胞在体内成熟的重要方法。在这里,我们将描述在我们的实验室中使用的实验方法,将2'-脱氧腺苷(以耗尽供体的淋巴细胞)治疗胚胎胸腺移植到贫血裸鼠的肾脏胶囊中。此方法既简单又高效,不需要特殊技能或设备。通过这一简单方法获得的结果表明,移植胸腺能有效支持受体的T细胞生产。此外,还将进一步阐明与议定书有关的若干要点。
Introduction
胸腺是中央免疫器官,胸腺胸腺细胞内经过正阴性选择,成为成熟的T细胞1,2。异常阳性或阴性选择分别导致免疫缺陷或自身免疫性疾病3,4。因此,胸腺器官移植是研究供体胸腺中T细胞选择过程的重要途径。这种方法在分析由基因突变介导的胸腺上皮功能时尤为重要,基因突变在突变5时引起胚胎致命表型。
为了研究受体的T细胞在移植胸腺中的成熟,有必要消耗胸腺内的供体淋巴细胞。为此,胚胎14天、15天或16天(E14,E15,E16)胸腺通常选择6,7。从更成熟的阶段胸腺也可以成功地耗尽捐赠者的淋巴细胞,通过治疗2'-脱氧腺苷。然而,关于消耗淋巴细胞和使用较老胸腺培养的详细方案之前没有描述8,9。虽然移植协议已被几个研究10,11引入,但进一步修改和改进这些协议是必要的。
我们的协议分为两部分:(i) 在含有2'脱氧腺苷的培养物中,通过培养物从晚期E18.5胸腺中消耗T淋巴细胞。(二) 将培养的胸腺移植到接受者体内。在此过程中,我们开发了一种简单的方法,将大组织(E18.5胸腺)输送到肾胶囊中,降低了肾损伤的几率。在关注后期胸腺的同时,我们的方案也可以直接用于或修改胸腺移植,用于不同发育阶段或其他类似大小的组织。
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Protocol
所提出的方案符合暨南大学伦理委员会关于动物护理的指导方针。
注:所用材料列在"材料表"中。
1.胚胎胸腺的分离
- 在实验前对所有手术器械进行高压灭菌,用70%乙醇对工作台/机进行灭菌。
- 使用二氧化碳,麻醉和安乐死怀孕的雌性小鼠(成功交配后18.5天)。然后用70%乙醇擦拭腹部区域。
注: 在这里,我们交配Insm1+/lacZ女性和Insm1+/lacZ男性。在从子宫分离胚胎之前,对五巴比妥进行内胎内注射,并为每个胚胎进行斩首。 - 使用剪刀,从膀胱开始,在腹部做一个"V"形的切口,一直运行到子宫的每个角。
- 使用剪刀,切割中庭和子宫颈/阴道,并收集子宫。将子宫放入含有冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)的培养皿中。接下来,通过将前子宫壁从一个子宫角切割到另一个子宫角,露出包裹中的胚胎。使用细钳子,剥去包裹的二叶精组织,并切断脐带以释放胚胎。将所有胚胎放在新的培养皿中,直到胸腺分离。
- 用70%的酒精擦拭胚胎,并将其放入新的培养皿中。从此步骤开始,确保保持无菌条件。
- 用剪刀剪下颚,取出胚胎的头部,用纸巾排血。接下来,将胚胎固定在同一个培养皿上。
注:我们为Insm1和lacZ基因分型切出每个胚胎的尾部。 - 使用剪刀,沿轴线水平切割侧胸壁,然后切开隔膜以打开胸部。胸腺现在应该是两个白色的叶位于气管前面,毗邻心脏。
- 将弯曲的尖钳放在胸腺后面,然后轻轻拉出胸腺。请务必检查胸腺的完整性,以确认它包含两个关节叶。
- 用1x PBS清洗胸腺,并在立体显微镜下修剪结缔组织和血管。
2. 分离胚胎胸腺的培养
- 在24孔板的每口孔中加入500μL培养基(RPMI1640 + 15%胎儿牛血清(FBS)=100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。将干净的胸腺米转移到井中,每口井有一个胸腺。图 1显示了培养基中分离的胸腺。
- 在每个胸腺中含有的井中,将2'-脱氧糖苷添加到1.25 mM的最终浓度中。
- 将孤立的胸腺培养8天,每两天刷新一次培养基质和2'脱氧核糖核糖核病。
3. 在肾胶囊中建立下帽空间
- 要准备针头和夹紧的输液管(图2),请用剪刀以45°角切割管部分上的头皮静脉针。
- 称量裸鼠,然后用五巴比妥麻醉它(1.5%)注射(75微克/克体重)。
- 当未观察到脚趾捏合后有反射时,将鼠标放在操作台上的右侧位置。
- 用0.5%的波维酮碘拭子,在手术区从身体内到外侧对皮肤进行两次消毒。
- 使用剪刀,使一个5-9毫米的皮肤切口平行于脊柱在左肾区域(在最后一根肋骨和iliac峰之间)。接下来,通过切开皮下组织和肌肉打开腹腔,并暴露肾脏。
- 肾脏暴露后,一手使用一对钳子将肌肉和脂肪组织从脊柱侧切口边缘提起。用另一只手,轻轻地挤压肾脏(或者,肾脏可以用双手的手指挤出)。
- 为确保肾胶囊在手术过程中潮湿,用盐水(0.9%NaCl)润湿肾脏表面。
- 在肾胶囊中创建一个刻痕,并使用步骤 3.1 中准备的针头轻轻划伤右下角的肾胶囊。刻痕的大小应为肾脏的1⁄2⁄2/3宽度;不要划伤肾脏。
- 将步骤 3.1 中准备的输液管滑入肾胶囊上的缺口中。沿着肾脏的长侧轻轻分离肾胶囊,直到在肾胶囊内达到3⁄4mm。拉回输液管;建立肾下囊空间。
4. 移植胚胎鼠胸腺
- 洗涤在步骤 2.3 中两次培养的胸腺,以耗尽培养基。
- 将步骤 3.1 中准备的夹击输液管连接到注射器连接接口处的注射器。将准备好的胸腺缓慢吸入输液管。
- 轻轻地将夹紧的输液管插入肾胶囊,并到达上部杆。将胸腺送入肾胶囊;缓慢收回管,同时轻轻推动注射器的柱塞。
- 使用酒精灯,稍微加热步骤 3.1 中准备的针头。在确保整个胸腺位于下盖空间内后,使用加热针烧结刻痕。
- 烧灼后,恢复腹腔的肾脏。缝合围肠和肌肉。
- 使用经过修改的中断式床垫缝合线,关闭皮肤切口(至少系三节,并切掉任何多余的线)。
- 使用波维酮碘拭子,消毒切口。为了减轻疼痛,在手术过程中进行皮下注射氟辛(2微克/克体重),然后在手术后3天进行。
- 直到完全从麻醉中恢复过来,在红外灯下保持小鼠温暖。
- 在解剖移植的胸腺和进行前文型分析之前,将胸腺留在受体的肾胶囊中8周,并进行前所述5、8、9的体称性分析。
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Representative Results
这里我们展示的分离的E18.5胸腺包含两个完整的叶 (图1)。此外,我们显示头皮静脉针被剪切,形成输液管的斜面 (图 2)。接下来,我们还展示了在受体小鼠生长8周后移植在肾胶囊(图3A)和胸腺中所状的胸腺位置的代表性图像(图3B)。为了确定T细胞是否在移植胸腺的裸小鼠中产生,在移植的胸腺和外周血液中,我们使用CD4和CD8抗体染色和流动细胞测定分析检测了细胞群。外周血是从逆轨正血管中采集的,如前所述12。我们发现T细胞是在移植的胸腺和用胸腺移植的裸鼠的外周血中产生的。然而,在非移植的裸鼠的外周血中未发现T细胞(图4)。为了确定T细胞的来源,我们检查了Insm1和lacZ基因在外周白细胞使用基因分型方法,在我们的实验室经常使用和描述之前13,14。由于供体胚胎Insm1基因被一个或两个等位基因中的lacZ基因所取代,当T细胞与供体胸腺一起移植时,我们可以检测从外周收集的T细胞基因组中的lacZ基因接受者的血液,这表明他们是由捐赠者胸腺产生的。此外,由于没有lacZ基因存在,当从受体的造血细胞生成T细胞时,不会检测到lacZ。我们没有在外周T细胞中检测到lacZ基因,表明T细胞是由受体产生的(图5)。
图1:从E18.5胚胎中分离的胸腺。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:胸腺提供由头皮静脉针制成的工具。头皮静脉针在输液管部分靠近针头处以 45° 的角度切割,以创建斜面。手术中均使用针头和输液管。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:胸腺移植到肾胶囊中。(A) 在肾脏胶囊中新鲜移植的E18.5胸腺。(B) 肾胶囊中的胸腺在受体生长8周后。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:从移植胸腺、胸腺移植和非移植裸鼠的血液分离出的T细胞流动细胞学分析。CD4和CD8+抗体用于T细胞染色。CD4+CD8=双阳性细胞,CD4=单阳性,CD8=单阳性和 CD4-CD8-双负细胞显示在每个象限中,如图所示。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:确定胸腺移植裸鼠中外周血T细胞的来源。显示外周血白细胞中lacZ基因和Insm1基因的基因分型。阶梯: DNA标记, * * 阳性控制DNA, -:阴性对照DNA, Anim1: 从裸体小鼠的外周白细胞移植与Insm1lacZ/lacZ胸腺, Anim2: 从裸体小鼠的外周白细胞移植的DNA与Insm1+/lacZ胸腺。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
胚胎胸腺肾下囊移植是研究胸腺上皮细胞功能和T细胞在体内成熟过程的重要方法。虽然对胚胎胸腺器官培养和移植有若干实验性研究6,7,我们的方案提供了一个简单的替代程序,对小鼠胚胎胸腺培养和肾下囊移植较老的胸腺组织。
我们的协议通过合并几个不同的修改6,7,10,11来改进以前的协议。 首先,我们使用从E18.5分离的胸腺进行移植,而不是E14-E16胸腺。其优点是,胸腺在这个后期发育阶段包含相对成熟的胸腺结构和上皮细胞群。虽然新生儿或成年小鼠是成熟胸腺的替代来源,但如果围产期致命表型发生由于基因操作,如在Jmjd6或Insm1基因5,13突变,这种方法为研究成熟的胸腺提供了可行的替代方案。第二个修饰是移植前E18胸腺培养方法的预预见。此外,在移植过程中,我们使用针头在肾胶囊上制造一个刻痕,而不是用钳子和剪刀采摘和切割肾胶囊。这种修饰减少了肾胶囊损伤和肾脏损伤。最后一个修改是在缝合步骤中。经过修改的中断的垂直床垫缝合线消除了皮肤上的外缝合线,因此防止切口因咬牙而打开。
虽然该协议用于E18.5胸腺移植到肾胶囊,它可以被修改为移植胸腺在其他发育阶段或其他组织具有类似大小。此外,不同领域的不同用户可以相应地修改所使用的材料,特别是麻醉试剂,因为麻醉试剂可能受当地法律的限制。我们协议中使用的五巴比妥的剂量为75微克/克体重。然而,最大剂量不应超过100μg/g体重,以防止麻醉动物死亡。虽然胸腺移植到肾胶囊是体内胸腺功能研究的有效方法,但上述方法存在一定的局限性。这些限制包括胸腺在8周体内生长期间(1/12)从肾胶囊中退出的风险。其次,另一个限制是手术后小鼠死亡(6/30)。然而,这种死亡主要是由五巴比妥过量引起的。因此,可以使用其他允许的麻醉方法。
总之,我们提供一个简单而有效的方案来分离和培养E18.5胸腺,然后移植胸腺到肾胶囊。这样就可以分析胸腺上皮细胞的功能和T细胞成熟的过程。
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Disclosures
未声明任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了暨南大学对S.J.的启动包和中国广州科技项目(授权号201704020209至S.J.)的支持。我们感谢Amy Botta(多伦多约克大学生物学系,加拿大M3J 1P3)对手稿进行校对和编辑。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
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