Summary
Nous fournissons une méthode simple et efficace pour transplanter 2'-deoxyguanosine traité E18.5 thymus dans la capsule rénale d'une souris nue. Cette méthode devrait aider dans l'étude de la fonction des cellules épithéliales thymiques et de la maturation des lymphocytes T.
Abstract
Le thymus est un organe immunitaire central important, qui joue un rôle essentiel dans le développement et la différenciation des lymphocytes T. La transplantation de Thymus est une méthode importante pour étudier la fonction épithéliale thymique et la maturation des lymphocytes T in vivo. Ici nous décraurons les méthodes expérimentales utilisées dans notre laboratoire pour transplanter 2'-deoxyguanosine (pour épuiser les lymphocytes du donneur) ont traité le thymume embryonnaire dans la capsule rénale d'une souris nue athymique. Cette méthode est à la fois simple et efficace et ne nécessite pas de compétences ou d'appareils spéciaux. Les résultats obtenus par cette méthode simple ont prouvé que le thymus transplanté peut effectivement soutenir la production de lymphocytes T du destinataire. En outre, plusieurs points clés en ce qui concerne le protocole seront encore élucidés.
Introduction
Le thymus est l'organe immunitaire central, dans les thymocytes subissent une sélection positive et négative, et deviennent des cellules T matures1,2. Une sélection anormale positive ou négative entraîne une immunodéficience ou des pathologies auto-immunes respectivement3,4. Par conséquent, la transplantation d'organe de thymus est une approche importante pour étudier le processus de sélection des lymphocytes T dans le thymus du donneur. Cette méthode est particulièrement cruciale lors de l'analyse de la fonction épithéliale thymique médiée par des mutations génétiques qui causent un phénotype mortel embryonnaire lorsqu'il est muté5.
Afin d'étudier la maturation des lymphocytes T d'un receveur dans le thymus transplanté, l'épuisement des lymphocytes du donneur dans le thymus est nécessaire. À cette fin, embryonnaire de 14, 15 ou 16 jours (E14, E15, E16) thymus est généralement sélectionné6,7. Le thymus des stades plus mûrs peut également être épuisé avec succès des lymphocytes du donneur en traitant avec 2'-deoxyguanosine. Cependant, un protocole détaillé pour épuiser les lymphocytes et l'utilisationde la culture plus ancienne de thymus n'a pas été précédemment décrit 8,9. Tandis que les protocoles de transplantation ont été introduits par plusieurs études10,11, d'autres modifications et améliorations de ces protocoles sont nécessaires.
Notre protocole est séparé en deux parties : (i) L'épuisement des lymphocytes T du stade de développement tardif E18.5 thymus par culture dans les médias contenant 2'-deoxyguanosine. (ii) Transplantation du thymus cultivé en receveurs. Dans cette procédure, nous avons développé un moyen simple de livrer le grand tissu (E18.5 thymus) dans la capsule rénale avec le risque réduit de dommages de rein. Tout en se concentrant sur le thymus stade ultérieur, notre protocole peut également être utilisé directement ou avec des modifications pour la transplantation de thymus à divers stades de développement ou d'autres tissus de taille similaire.
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Protocol
Le protocole présenté respecte les lignes directrices du comité d'éthique de l'Université Jinan concernant les soins aux animaux.
REMARQUE : Les matériaux utilisés sont répertoriés dans le Tableau des matériaux.
1. Isolement du thymus embryonnaire
- Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant l'expérience, et stériliser le banc / hotte avec 70% d'éthanol.
- À l'aide de dioxyde de carbone, anesthésiez et euthanasiez la souris femelle enceinte (18,5 jours après l'accouplement réussi). Ensuite, essuyez la région abdominale avec 70% d'éthanol.
REMARQUE : Ici, nous avons accouplé les femelles Insm1et les mâles Insm1 et Les mâlesde lacZ. L'injection intraplacental du pentobarbital a été exécutée avant que l'isolement des embryons de l'utérus et la décapitation aient été exécutés pour chaque embryon. - À l'aide de ciseaux, faire une coupe en forme de « V » sur l'abdomen à partir de la vessie et en cours d'exécution jusqu'à chaque corne de l'utérus.
- À l'aide des ciseaux, couper le mesometrium et le col de l'utérus/vagina, et recueillir l'utérus. Placer l'utérus dans un plat Petri contenant de la saline à phosphate froid (PBS) sur la glace. Ensuite, exposez les embryons qui se trouvent dans la décidua enveloppée, en coupant la paroi utérine antérieure d'une corne utérine à l'autre. À l'aide d'une pince fine, peler les tissus de décidua enveloppés et couper le cordon ombilical pour libérer les embryons. Placer tous les embryons dans un nouveau plat Petri sur la glace jusqu'à l'isolement du thymus.
- Essuyez un embryon avec 70% d'alcool et placez-le dans un nouveau plat Petri. À partir de cette étape, assurez-vous que les conditions stériles sont maintenues.
- En coupant près de la mâchoire inférieure avec des ciseaux, retirer la tête de l'embryon et drainer le sang avec un essuie-tout. Ensuite, fixez l'embryon sur le même plat Petri en position de supine.
REMARQUE : Nous coupons un morceau de la queue de chaque embryon pour le génotypage Insm1 et lacZ. - À l'aide de ciseaux, couper la paroi thoracique latérale horizontalement le long de l'avant axillaire, puis couper le diaphragme pour ouvrir la poitrine. Le thymus doit maintenant être visible sous forme de deux lobes blancs situés devant la trachée et adjacents au cœur.
- Placer les forceps pliés derrière le thymus, puis retirer le thymus doucement. Assurez-vous de vérifier l'intégrité du thymus pour confirmer qu'il contient deux lobes joints.
- Laver le thymus avec 1x PBS et couper les tissus conjonctifs et les vaisseaux sanguins sous un stéréomicroscope.
2. Culture du thymus embryonnaire isolé
- Ajouter 500 l de milieu de culture (RPMI1640 - sérum bovin fœtal (FBS) à 150 U/mL de pénicilline et 100 og/mL de streptomycine) à chaque puits d'une plaque de 24 puits. Transférer le thymi propre dans les puits avec un thymus par puits. La figure 1 montre le thymus isolé dans les médias culturels.
- À chaque puits contenant du thymus, ajouter 2'-deoxygranosine à une concentration finale de 1,25 mM.
- Culture du thymus isolé pendant huit jours, rafraîchissant à la fois les médias de culture et 2'-deoxygranosine tous les deux jours.
3. Établir l'espace sous-capsulaire dans la capsule rénale
- Pour préparer l'aiguille et le tube d'infusion coupé (Figure 2), couper l'aiguille de veine du cuir chevelu sur la partie du tube à un angle de 45 degrés à l'aide de ciseaux.
- Pesez la souris nue, puis anesthésiez-la avec un pentobarbital (1,5%) l'injection (75 g/g de poids corporel).
- Lorsqu'aucun pincement d'orteil suivant réflexe n'est observé, placez la souris sur la table d'opération dans une position latérale droite.
- Avec un écouvillon de 0,5% d'iode de povidone, désinfecter la peau deux fois dans la zone chirurgicale de l'intérieur à l'extérieur du corps.
- À l'aide de ciseaux, faire une incision cutanée de 5 à 9 mm parallèlement à la colonne vertébrale dans la région rénale gauche (entre la dernière côte et la crête iliaque). Ensuite, ouvrez la cavité abdominale en coupant à travers le tissu et le muscle sous-cutanés et exposer le rein.
- Avec le rein exposé, utilisez une paire de pinces dans une main pour soulever le muscle et les tissus adipeux du bord de l'incision côté de la colonne vertébrale. Avec l'autre main, presser doucement le rein (alternativement, le rein peut être pressé à l'aide des doigts des deux mains).
- Pour s'assurer que la capsule rénale est humide pendant la chirurgie, mouiller la surface du rein avec salin (0,9% NaCl).
- Créez une entaille dans la capsule rénale, et grattez doucement la capsule rénale sur le côté inférieur droit à l'aide de la pointe de l'aiguille préparée à l'étape 3.1. La taille de la pseudo doit être de 1/2/2/3 largeurs du rein; ne pas gratter sur le rein.
- Faites glisser le tube d'infusion préparé à l'étape 3.1 dans le pseudo sur la capsule rénale. Dissocier doucement la capsule rénale avec le rein le long côté du rein jusqu'à ce qu'elle atteigne 3 à 4 mm à l'intérieur de la capsule rénale. Retirer le tube d'infusion; l'espace sous-capsulaire rénal est établi.
4. Transplanter le thymus murine embryonnaire
- Laver le thymus cultivé à l'étape 2.3 deux fois en salin pour épuiser les médias de culture.
- Connectez le tube d'infusion coupé préparé à l'étape 3.1 à une seringue à son interface de connexion de seringues. Aspirez lentement le thymus préparé dans le tube d'infusion.
- Insérez délicatement le tube d'infusion coupé dans la capsule rénale et atteignez le pôle supérieur. Livrer le thymus dans la capsule rénale; rétracter le tube lentement tout en poussant doucement le piston de la seringue.
- À l'aide d'une lampe à alcool, chauffer légèrement l'aiguille préparée à l'étape 3.1. Après s'être assuré que tout le thymus se trouve à l'intérieur de l'espace sous-capsulaire, utilisez l'aiguille chauffée pour cautériser la pseudo.
- Après la cautérisation, restaurer le rein dans la cavité abdominale. Suturer le péritoine et le muscle.
- À l'aide d'une suture verticale interrompue modifiée, fermez l'incision cutanée (attachez au moins trois noeuds et coupez tout fil excédentaire).
- À l'aide d'un écouvillon d'iode de povidone, désinfecter l'incision. Pour soulager la douleur, l'injection sous-cutanée de flunixin (2 g/g de poids corporel) a été effectuée pendant la chirurgie, puis pendant 3 jours après la chirurgie.
- Jusqu'à ce qu'il soit complètement remis de l'anesthésie, gardez la souris au chaud sous la lampe infrarouge.
- Gardez le thymus dans la capsule rénale du receveur pendant 8 semaines avant de disséquer le thymus transplanté et de procéder à une analyse phénotypique comme décrit précédemment5,8,9.
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Representative Results
Ici, nous montrons l'isolement E18.5 thymus contenant deux lobes complets (Figure 1). En outre, nous montrons l'aiguille de veine de cuir chevelu qui a été coupée pour former un bisau sur le tube d'infusion (figure 2). Ensuite, nous montrons également une image représentative de la position du thymus qui a été transplanté dans la capsule rénale (Figure 3A) et le thymus après 8 semaines de croissance chez les souris réceptées (Figure 3B). Pour déterminer si les lymphocytes T ont été produits chez des souris nues transplantées avec un thymus, dans le thymus transplanté et le sang périphérique, nous avons détecté les populations cellulaires utilisant l'analyse de la tonte et de la cytométrie des anticorps CD4 et CD8. Le sang périphérique a été recueilli du sinus rétro-orbital comme précédemment décrit12. Nous avons constaté que les lymphocytes T ont été produits à la fois dans le thymus transplanté et le sang périphérique de souris nues transplantées avec un thymus. Cependant, aucune cellule T n'a été détectée dans le sang périphérique de souris nues non transplantées (figure 4). Pour déterminer la source des lymphocytes T, nous avons vérifié les gènes Insm1 et lacZ dans les globules blancs périphériques en utilisant des méthodes de génotypage couramment utilisées dans notre laboratoire et décrit précédemment13,14. Puisque l'embryon donneur Du gène Insm1 a été remplacé par le gène lacZ dans un ou les deux allèles, lorsque les lymphocytes T ont été co-transplantés avec du thymus du donneur, nous avons pu détecter le gène lacZ dans le génome des lymphocytes T prélevés dans les sang du receveur, ce qui indique qu'ils ont été produits par le thymus donneur. En outre, comme aucun gène lacZ n'était présent, le lacZ ne serait pas détecté lorsque les lymphocytes T ont été générés à partir des cellules hématopoïétiques du receveur. Nous n'avons pas détecté le gène lacZ dans les lymphocytes T périphériques indiquant que les lymphocytes T ont été générés à partir du receveur (Figure 5).
Figure 1 : Thymus isolé des embryons E18.5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Thymus livre des outils fabriqués à partir de l'aiguille de veine de cuir chevelu. L'aiguille de veine de cuir chevelu a été coupée à la partie de tube d'infusion près de l'aiguille à un angle de 45 degrés pour créer un bisau. L'aiguille et le tube d'infusion ont été utilisés dans la procédure. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Thymus transplanté dans la capsule rénale. (A) Fraîchement transplanté E18.5 thymus dans la capsule rénale. (B) Thymus dans la capsule rénale après la croissance de 8 semaines dans le destinataire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Analyse de cytométrie de flux des cellules T isolées du thymus transplanté, du sang des souris nues thymus-transplantées et non transplantées. Des anticorps CD4 et CD8Ont ont été utilisés pour la coloration des lymphocytes T. CD4-CD8- cellules double ment positif, CD4- seul positif, CD8- seul positif et CD4-CD8- cellules double négatif sont montrés dans chacun des quadrants comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Identifier la source des lymphocytes T sanguins périphériques chez les souris nues transplantées par le thymus. Le génotypage du gène lacZ et du gène Insm1 dans les globules blancs périphériques est montré. Échelle: marqueur d'ADN, : ADN de contrôle positif, -: ADN de contrôle négatif, Anim1 : ADN des globules blancs périphériques de souris nues transplantés avec Insm1lacZ/lacZ thymus, Anim2 : ADN des globules blancs périphériques de souris nues transplantées avec Insm1et lacZ thymus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La transplantation sous-capsulaire rénale du thymus embryonnaire est une méthode importante pour étudier la fonction des cellules épithéliales thymiques et le processus de maturation des lymphocytes T in vivo. Bien qu'il existe plusieurs études expérimentales sur la culture embryonnaire d'organe de thymus et la transplantation6,7, notre protocole fournit une procédure alternative simple sur la culture embryonnaire de thymus murine et sous-capsulaire rénal transplantation pour le tissu de thymus plus âgé.
Notre protocole améliore les protocoles précédents en incorporant plusieurs modifications différentes 6,7,10,11. Tout d'abord, au lieu de E14-E16 thymus, nous avons utilisé le thymus isolé de E18.5 pour la transplantation. L'avantage est que le thymus à ce stade de développement ultérieur contient des structures thymiques relativement matures et des populations épithéliales de cellules. Bien que les souris nouveau-nés ou adultes soient une source alternative de thymus mature, si le phénotype mortel périnatal se produit à la suite de la manipulation de gène, telle que des mutations dans les gènes de Jmjd6 ou d'Insm1 5,13,cette méthode offre une alternative viable pour l'étude du thymus mature. Une deuxième modification est la prévision d'une méthode de culture de thymus E18 avant la transplantation. En outre, une troisième modification se produit dans la procédure de transplantation, dans laquelle nous avons utilisé la pointe de l'aiguille pour créer une entaille sur la capsule rénale au lieu de la cueillette et la coupe de la capsule rénale avec des pinces à épiler et des ciseaux. Cette modification a réduit les dommages rénaux de capsule et les dommages du rein. Une dernière modification est dans l'étape de suture. La suture verticale interrompue modifiée de matelas élimine la ligne extérieure de suture sur la peau et empêche donc l'ouverture de l'incision due à la mordre.
Tandis que ce protocole est employé pour la transplantation de thymus d'E18.5 dans la capsule de rein, il peut être modifié pour la transplantation du thymus à d'autres stades développementaux ou pour d'autres tissus avec des tailles semblables. En outre, les matériaux utilisés peuvent être modifiés en conséquence par différents utilisateurs de différents domaines, en particulier en ce qui concerne les réactifs d'anesthésie qui peuvent être limités par les lois locales. La dose de pentobarbital utilisée dans notre protocole est de 75 g/g de poids corporel. Cependant, la dose maximale ne doit pas être supérieure à 100 g/g de poids corporel pour prévenir la mort des animaux anesthésiés. Bien que la transplantation du thymus dans la capsule rénale soit une méthode efficace pour l'étude fonctionnelle du thymus in vivo, certaines limitations existent dans la méthode présentée ci-dessus. Ces limitations incluent le risque du thymus tombant hors de la capsule de rein pendant la période de croissance in vivo de 8 semaines (1 dans 12). Deuxièmement, une autre limitation est la mort de souris après la chirurgie (6 sur 30). Cependant, cette mort est principalement causée par l'overdose du pentobarbital. En tant que tel, d'autres méthodes autorisées d'anesthésie peuvent être employées.
En résumé, nous fournissons un protocole simple et efficace pour isoler et culturer le thymus E18.5 et ensuite transplanter le thymus dans la capsule rénale. Cela permet ensuite l'analyse de la fonction des cellules épithéliales thymiques et le processus de maturation des lymphocytes T.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêts n'a été déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le programme Start de l'Université De Jinan à S.J. et par le Programme des sciences et de la technologie de Guangzhou en Chine (Grant No. 201704020209 à S.J.). Nous remercions Amy Botta (Département de biologie, Université York, Toronto, ON M3J 1P3, Canada) pour la relecture et l'édition du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
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