Summary
Forniamo un metodo semplice ed efficiente per trapiantare 2'-deossiguanosina trattata E18.5 tiromusnella capsula renale di un topo nudo. Questo metodo dovrebbe aiutare nello studio sia della funzione epiteliale timica che della maturazione delle cellule T.
Abstract
Il timo è un importante organo immunitario centrale, che svolge un ruolo essenziale nello sviluppo e nella differenziazione delle cellule T. Il trapianto di timo è un metodo importante per studiare la funzione delle cellule epiteliali timiche e la maturazione delle cellule T in vivo. Qui descriveremo i metodi sperimentali utilizzati all'interno del nostro laboratorio per trapiantare 2'-deossiguanosina (per esaurire i linfociti del donatore) trattati tiromo embrionale nella capsula renale di un topo nudo alatico. Questo metodo è semplice ed efficiente e non richiede abilità o dispositivi speciali. I risultati ottenuti con questo semplice metodo hanno mostrato che il timo trapiantato può sostenere efficacemente la produzione di cellule T del ricevente. Inoltre, diversi punti chiave per quanto riguarda il protocollo saranno ulteriormente chiariti.
Introduction
Il timo è l'organo immunitario centrale, all'interno dei timociti sottoposti a selezione positiva e negativa, e diventano cellule T mature1,2. La selezione positiva o negativa anomala provoca immunodeficienza o patologie autoimmuni rispettivamente3,4. Pertanto, il trapianto di organo timo è un approccio importante per studiare il processo di selezione delle cellule T nel timo del donatore. Questo metodo è particolarmente importante quando si analizza la funzione epiteliale timica mediata da mutazioni genetiche che causano fenotipo letale embrionale quando mutato5.
Per studiare la maturazione delle cellule T di un ricevente nel timo trapiantato, è necessario ridurre i linfociti del donatore all'interno del timo. A questo scopo, il timo embrionale di 14, 15 o 16 giorni (E14, E15, E16) viene solitamente selezionato6,7. Il timo da stadi più maturi può anche essere esaurito con successo dei linfociti del donatore trattando con 2'-deossiaguanosina. Tuttavia, un protocollo dettagliato per esaurire i linfociti e l'uso della vecchia coltura del timo non è stato descritto in precedenza8,9. Mentre i protocolli di trapianto sono stati introdotti da diversi studi10,11, ulteriore modifica e miglioramento di questi protocolli è necessario.
Il nostro protocollo è diviso in due parti: (i) Depletion of T lymphocites from late developmental stage E18.5 thymus by culture in 2'-deoxyguanosine-containing media. ii) Trapianto del timo colto in destinatari. In questa procedura, abbiamo sviluppato un modo semplice per fornire il grande tessuto (E18.5 timo) nella capsula renale con ridotta probabilità di lesioni renali. Mentre ci si concentra sul timo dello stadio successivo, il nostro protocollo può anche essere utilizzato direttamente o con modifiche per il trapianto di timo in varie fasi di sviluppo o altri tessuti di dimensioni simili.
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Protocol
Il protocollo presentato aderisce alle linee guida del comitato etico della Jinan University per quanto riguarda la cura degli animali.
NOTA: i materiali utilizzati sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Isolamento del timo embrionale
- Autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima dell'esperimento, e sterilizzare la panca / cappuccio con 70% etanolo.
- Utilizzando l'anidride carbonica, anestesizzare ed eutanasia il topo femminile incinta (18,5 giorni dopo l'accoppiamento di successo). Quindi pulire la regione addominale con 70% etanolo.
N.B.: Qui abbiamo accoppiato le femmine Insm1 e i maschi Insm1. L'iniezione intraplacentaria del pentobarbital sono state eseguite prima dell'isolamento degli embrioni dall'utero e la decapitazione è stata eseguita per ogni embrione. - Utilizzando le forbici, fare un taglio a forma di "V" sull'addome a partire dalla vescica e in esecuzione fino a ogni corno dell'utero.
- Usando le forbici, tagliare il mesotrium e la cervice/vagina e raccogliere l'utero. Collocare l'utero in una piastra Petri contenente su ghiaccio una salina fredda con tamponamenti di fosfato (PBS). Successivamente, esporre gli embrioni che sono nella decidua avvolta, tagliando la parete uterina anteriore da un corno uterino all'altro. Utilizzando una pinzetta fine, staccare i tessuti decidua avvolti e tagliare il cordone ombelicale per rilasciare gli embrioni. Mettere tutti gli embrioni in una nuova teglia Petri sul ghiaccio fino all'isolamento del timo.
- Pulire un embrione con il 70% di alcol e metterlo in una nuova teglia Petri. Da questo passaggio, assicurarsi che le condizioni sterili siano mantenute.
- Tagliando vicino alla mascella inferiore con le forbici, rimuovere la testa dell'embrione e drenare il sangue con un tovagliolo di carta. Quindi, fissare l'embrione sullo stesso piatto Petri in posizione supina.
NOTA: Abbiamo tagliato un pezzo della coda di ogni embrione per la genotipizzazione Insm1 e lac. - Utilizzando le forbici, tagliare la parete laterale del torace orizzontalmente lungo la parte anteriore ascellare, quindi tagliare il diaframma per aprire il torace. Il timo dovrebbe ora essere visibile come due lobi bianchi situati di fronte alla trachea e adiacenti al cuore.
- Posizionare le pinze piegate dietro il timo e poi estrarre delicatamente il timo. Assicurarsi di controllare l'integrità del timo per confermare che contiene due lobi congiunti.
- Lavare il timo con 1x PBS e tagliare i tessuti connettivi e i vasi sanguigni sotto uno stereomicroscopio.
2. Cultura del timo embrionale isolato
- Aggiungete al pozzo di un pozzo di una piastra di 24 pozzetto 100 U/mL di penicillina e 100 streptomici g/mL. Trasferire la timia pulita nei pozzi con un timo per pozzo. Figura 1 mostra il timo isolato nei mezzi di coltura.
- Ad ogni timo-contenente bene aggiungere 2'-deoxygranosine ad una concentrazione finale di 1,25 mM.
- Cultura il timo isolato per otto giorni, rinfrescando sia i media di coltura e 2'-deoxygranosine ogni due giorni.
3. Stabilire lo spazio del sottocapsulatore nella capsula renale
- Per preparare l'ago e il tubo di infusione ritagliato (Figura 2), tagliare l'ago della vena del cuoio capelluto sulla parte del tubo con un angolo di 45 gradi utilizzando le forbici.
- Pesare il topo nudo e poi anesazzarlo con un pentobarbital (1,5%) iniezione (75 g/g di peso corporeo).
- Quando non viene osservato alcun riflesso dopo il pizzico dell'aldidello, posizionare il mouse sul tavolo operatorio in una posizione laterale destra.
- Con uno 0,5% di tampone di iodio povidone, disinfettare la pelle due volte nell'area chirurgica dall'interno all'esterno del corpo.
- Utilizzando le forbici, fare un'incisione cutanea da 5-9 mm parallela alla colonna vertebrale nell'area renale sinistra (tra l'ultima costola e la cresta iliaca). Successivamente, aprire la cavità addominale tagliando attraverso il tessuto sottocutaneo e il muscolo ed esporre il rene.
- Con il rene esposto, utilizzare un paio di pinzette in una mano per sollevare il muscolo e il tessuto adiposo dal bordo dell'incisione lato colonna vertebrale. Con l'altra mano, spremere delicatamente il rene (in alternativa, il rene può essere spremuto con le dita di entrambe le mani).
- Per garantire che la capsula renale sia umida durante l'intervento chirurgico, bagnate la superficie del rene con salina (0,9% NaCl).
- Creare un nick nella capsula renale e graffiare delicatamente la capsula renale nella parte inferiore destra utilizzando la punta dell'ago preparata al passaggio 3.1. La dimensione del nick deve essere 1/2–2/3 larghezze del rene; non graffiare sul rene.
- Far scorrere il tubo di infusione preparato al punto 3.1 nel nick della capsula renale. Dissociare delicatamente la capsula renale con il rene lungo il lato lungo del rene fino a raggiungere 3-4 mm all'interno della capsula renale. Disegnare indietro il tubo di infusione; viene stabilito lo spazio del sottocapsulatore renale.
4. Trapiantare il timo murino embrionale
- Lavare il timo coltivato al passo 2.3 due volte in salina per esaurire i mezzi di coltura.
- Collegare il tubo di infusione ritagliato preparato nel passaggio 3.1 a una siringa alla sua interfaccia di collegamento della siringa. Aspirare lentamente il timo preparato nel tubo di infusione.
- Inserire delicatamente il tubo di infusione ritagliato nella capsula renale e raggiungere il palo superiore. Consegnare il timo nella capsula renale; ritrarre lentamente il tubo spingendo contemporaneamente lo stantuffo della siringa delicatamente.
- Utilizzando una lampada alcool, riscaldare leggermente l'ago preparato al punto 3.1. Dopo aver assicurato che l'intero timo sia all'interno dello spazio del sottocapsulare, utilizzare l'ago riscaldato per cauterizzare il nick.
- Dopo la cauterizzazione, ripristinare il rene nella cavità addominale. Suturare il peritoneo e il muscolo.
- Utilizzando una sutura verticale del materasso interrotta modificata, chiudere l'incisione cutanea (legare almeno tre nodi e tagliare qualsiasi filo in eccesso).
- Utilizzando un tampone di iodio povidone, disinfettare l'incisione. Per alleviare il dolore, l'iniezione sottocutanea di flunixina (2 g/g di peso corporeo) è stata eseguita durante l'intervento chirurgico e poi per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
- Fino a quando completamente recuperato dall'anestesia, mantenere il mouse caldo sotto la lampada a infrarossi.
- Mantenere il timo nella capsula renale del ricevente per 8 settimane prima di sezionare il timo trapiantato e condurre l'analisi fenotipica come precedentemente descritto5,8,9.
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Representative Results
Qui mostriamo il timo isolato E18.5 contenente due lobi completi (Figura 1). Inoltre, mostriamo l'ago della vena del cuoio capelluto che è stato ritagliato per formare uno smusso sul tubo di infusione (Figura 2). Successivamente, mostriamo anche un'immagine rappresentativa della posizione del timo che è stato trapiantato nella capsula renale (Figura 3A) e il timo dopo 8 settimane di crescita all'interno dei topi ricitati (Figura 3B). Per determinare se le cellule T sono state prodotte in topi nudi trapiantati con un timo, sia nel timo trapiantato che nel sangue periferico, abbiamo rilevato le popolazioni cellulari utilizzando l'analisi della colorazione e della citometria degli anticorpi CD4 e CD8. Il sangue periferico è stato raccolto dal sinus retroorbitale come descritto in precedenza12. Abbiamo scoperto che le cellule T sono state prodotte sia nel timo trapiantato che nel sangue periferico dei topi nudi trapiantati con un timo. Tuttavia, non sono state rilevate cellule T nel sangue periferico di topi nudi non trapiantati (Figura 4). Per determinare la fonte delle cellule T, abbiamo controllato i geni Insm1 e lactm nei globuli bianchi periferici utilizzando metodi di genotipizzazione abitualmente utilizzati nel nostro laboratorio e descritti in precedenza13,14. Dal momento che il gene Insm1 è stato sostituito dal gene lacz in uno o entrambi gli alleli, quando le cellule T sono state co-trapiantate con il timo dal donatore, abbiamo potuto rilevare il gene lac del ricevente, che indica che sono stati prodotti dal timo donatore. Inoltre, dato che non era presente alcun gene lac, il lac non sarebbe stato rilevato quando le cellule T sono state generate dalle cellule ematopoietiche del ricevente. Non abbiamo rilevato il gene lac, nelle cellule T periferiche, indicando che le cellule T sono state generate dal destinatario (Figura 5).
Figura 1: Timo isolato dagli embrioni E18.5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Timo che fornisce strumenti realizzati con l'ago della vena del cuoio capelluto. L'ago della vena del cuoio capelluto è stato tagliato alla parte del tubo di infusione vicino all'ago con un angolo di 45 gradi per creare uno smusso. Sia l'ago che il tubo di infusione sono stati utilizzati nella procedura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Timo trapiantato nella capsula renale. (A) Appena trapiantato E18.5 timo nella capsula renale. (B) Tironella capsula renale dopo 8 settimane di crescita nel ricevente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi della citometria di flusso delle cellule T isolate dal timo trapiantato, sangue di topi nudi trapiantati al timo e non trapiantati. Gli anticorpi CD4 e CD8 sono stati utilizzati per la colorazione delle cellule T. Inciascuno dei quadranti, in ciascuno dei quadranti, in ciascuno dei quadranti, in ognuno dei quadranti vengono visualizzate le celle doppie positivo, CD4, singolo positivo, CD8e CD4-le celle doppie negative. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Identificare la fonte delle cellule T del sangue periferico nel timo trapiantato topi nudi. Viene mostrata la genotipizzazione del gene lacè e del gene Insm1 nei globuli bianchi di sangue periferici. Scala: marcatore del DNA, : DNA di controllo positivo, -: DNA di controllo negativo, Anim1: DNA da globuli bianchi periferici di topo nudo trapiantato con insm1lac con il timo Insm1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il trapianto di subcapsulare renale del timo embrionale è un metodo importante per studiare la funzione delle cellule epiteliali timiche e il processo di maturazione delle cellule T in vivo. Anche se ci sono diversi studi sperimentali sulla coltura embrionale dell'organo timo e il trapianto6,7, il nostro protocollo fornisce una semplice procedura alternativa sulla coltura del timo embrionale murino e subcapsulare renale trapianto per timo più vecchio.
Il nostro protocollo migliora sui protocolli precedenti incorporando diverse modifiche 6,7,10,11. In primo luogo, invece del timo E14-E16, abbiamo utilizzato il timo isolato da E18.5 per il trapianto. Il vantaggio è che il timo in questa fase successiva dello sviluppo contiene strutture timiche relativamente mature e popolazioni di cellule epiteliali. Anche se i topi neonati o adulti sono una fonte alternativa di timo maturo, se il fenotipo letale perinatale si verifica a seguito di manipolazione genica, come mutazioni nei geni Jmjd6 o Insm1 5,13, questo metodo fornisce una valida alternativa per lo studio del timo maturo. Una seconda modifica è la previsione di un metodo di coltura del timo E18 prima del trapianto. Inoltre, si verifica una terza modifica nella procedura di trapianto, in cui abbiamo usato la punta dell'ago per creare un nick sulla capsula renale invece di raccogliere e tagliare la capsula renale con pinzette e forbici. Questa modifica ha ridotto sia il danno renale alla capsula che la lesione del rene. Un'ultima modifica è nella fase di sutura. La sutura verticale del materasso interrotta modificata elimina la linea di sutura esterna sulla pelle e quindi impedisce l'apertura dell'incisione a causa di mordere.
Mentre questo protocollo viene utilizzato per il trapianto di timo E18.5 nella capsula renale, può essere modificato per il trapianto del timo in altre fasi di sviluppo o per altri tessuti con dimensioni simili. Inoltre, i materiali utilizzati possono essere modificati di conseguenza da diversi utenti provenienti da diverse aree, in particolare per quanto riguarda i reagenti di anestesia che possono essere limitati dalle leggi locali. Il dosaggio del pentobarbital utilizzato nel nostro protocollo è di 75 g/g di peso corporeo. Tuttavia, il dosaggio massimo non deve essere più di 100 g/g peso corporeo per prevenire la morte degli animali anestesizzati. Anche se il trapianto del timo nella capsula renale è un metodo efficiente per lo studio funzionale del timo in vivo, esistono alcune limitazioni nel metodo presentato sopra. Queste limitazioni includono il rischio che il timo abbandoni la capsula renale durante il periodo di crescita in vivo di 8 settimane (1 su 12). In secondo luogo un'altra limitazione è la morte dei topi dopo l'intervento chirurgico (6 su 30). Tuttavia, questa morte è causata principalmente dall'overdose del pentobarbital. Come tale, altri metodi consentiti di anestesia possono essere impiegati.
In sintesi, forniamo un protocollo semplice ed efficiente per isolare e coltura il timo E18.5 e per poi trapiantare successivamente il timo nella capsula renale. Ciò consente quindi l'analisi della funzione epiteliale timica e del processo di maturazione delle cellule T.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal pacchetto iniziale della Jinan University a S.J. e dal programma di scienza e tecnologia di Guangzhou Cina (Grant No. 201704020209 a S.J.). Ringraziamo Amy Botta (Dipartimento di Biologia, Università di York, Toronto, ON M3J 1P3, Canada) per la revisione e la modifica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
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