Summary
Nós fornecemos um método simples e eficiente para transplantar 2 '-deoxyguanosine tratou e 18.5 timo na cápsula renal de um rato nu. Este método deve auxiliar no estudo da função de células epiteliais tímicas e da maturação das células T.
Abstract
O timo é um importante órgão imunológico central, que desempenha um papel essencial no desenvolvimento e diferenciação de células T. O transplante de timo é um método importante para investigar a função da célula epitelial tímica e a maturação das células T in vivo. Aqui nós descreveremos os métodos experimentais usados dentro de nosso laboratório para transplantar 2 '-deoxyguanosine (para esgotar os linfócitos do doador) timo embrionário tratado na cápsula renal de um rato nu camundongos. Este método é simples e eficiente e não requer habilidades especiais ou dispositivos. Os resultados obtidos através deste método simples mostraram que o Timo transplantado pode eficazmente suportar a produção das pilhas de T do receptor. Adicionalmente, vários pontos-chave no que diz respeito ao protocolo serão ainda mais elucidados.
Introduction
O timo é o órgão imunológico central, dentro dos timócitos Timo passam por seleção positiva e negativa, e tornam-se células T maduras1,2. A seleção anormal positiva ou negativa resulta em imunodeficiência ou patologias auto-imunes,respectivamente3,4. Conseqüentemente, a transplantação do órgão do timo é uma aproximação importante para estudar o processo da seleção das pilhas de T no timo do doador. Este método é particular crucial ao analisar a função epithelial Thymic negociada por mutações genéticas que causam o phenotype letal embrionário quando mutado5.
A fim estudar a maturação de pilhas de T de um receptor no timo transplantado, a prostração de linfócitos do doador dentro do timo é necessária. Para este fim, o Timo embrionário de 14, 15 ou 16 dias (E14, E15, E16) é usualmente selecionado6,7. Thymus de estágios mais maduros pode igualmente com sucesso ser esgotado dos linfócitos do doador tratando com 2 '-deoxyguanosine. Entretanto, um protocolo detalhado para esgotando linfócitos e o uso da cultura mais velha do Timo não tem sido descrito previamente8,9. Embora os protocolos de transplante tenham sido introduzidos por vários estudos10,11, é necessária uma maior modificação e melhoria desses protocolos.
Nosso protocolo é separado em duas partes: (i) depleção de linfócitos T do estágio de desenvolvimento tardio e 18,5 Timo pela cultura em 2 '-deoxyguanosine-contendo meios. (II) transplante do Timo cultivado em receptores. Neste procedimento, nós desenvolvemos uma maneira simples de entregar o grande tecido (E 18.5 Thymus) na cápsula renal com possibilidade reduzida de ferimento de rim. Ao centrar-se no timo mais atrasado da fase, nosso protocolo pode igualmente ser usado diretamente ou com as modificações para a transplantação do timo em vários estágios desenvolventes ou em outros tecidos feitos medida similares.
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Protocol
O protocolo apresentado adere às diretrizes do Comitê de ética da Universidade de Jinan em relação aos cuidados com os animais.
Nota: os materiais utilizados estão listados na tabela de materiais.
1. isolação do Timo embrionário
- Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes do experimento, e esterilizar o banco/capuz com 70% etanol.
- Usando o dióxido de carbono, anestesiar e eutanizar o rato fêmea grávido (18,5 dias de acoplamento bem sucedido do borne). Em seguida, limpe a região abdominal com 70% de etanol.
Nota: aqui nós acasalamos Insm1+/lacZ fêmeas e Insm1+/lacZ machos. A injeção intraplacental do pentobarbital foi executada antes que o isolamento dos embriões do útero e a decapitação fossem executados para cada embrião. - Usando tesouras, faça um corte em forma de "V" no abdômen a partir da bexiga e correndo até cada chifre do útero.
- Usando a tesoura, corte o mesométrio e colo/vagina, e recolher o útero. Coloque o útero em uma placa de Petri contendo soro de fosfato frio-tamponado (PBS) no gelo. Em seguida, expor os embriões que estão na decidua envelopada, cortando a parede uterina anterior de um chifre uterino para o outro. Usando tweezers finos, descasque para trás os tecidos envelopadas do decídua e corte o cabo de cordão umbilical para liberar os embriões. Coloque todos os embriões em um novo prato de Petri no gelo até o isolamento do timo.
- Limpe um embrião com 70% de álcool e coloque-o em um novo prato de Petri. Desta etapa sobre, assegure-se de que as circunstâncias estéreis sejam mantidas.
- Cortando perto da mandíbula inferior com uma tesoura, retire a cabeça do embrião e escorra o sangue com uma toalha de papel. Em seguida, fixar o embrião no mesmo prato de Petri em posição supina.
Nota: nós cortamos um pedaço da cauda de cada embrião para Insm1 e lacZ Genotyping. - Usando tesouras, corte a parede torácica lateral horizontalmente ao longo da frente axilar e, em seguida, corte o diafragma para abrir o tórax. O Timo deve agora ser visível como dois lóbulos brancos localizados na frente da traquéia e adjacente ao coração.
- Coloque fórceps de ponta dobrada atrás do Timo e, em seguida, retire o Timo suavemente. Certifique-se de verificar a integridade do timo para confirmar que ele contém dois lóbulos articulados.
- Lave o Timo com 1X PBS e aparar os tecidos conjuntivos e vasos sanguíneos um estereomicroscópio.
2. cultura do Timo embrionário isolado
- Adicionar 500 μL de meio de cultura (RPMI1640 + 15% de soro bovino fetal (FBS) + 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) a cada poço de uma placa de 24 poços. Transfira o thymi limpo nos poços com um timo por bem. A Figura 1 exibe o Timo isolado em meios de cultura.
- Para cada Thymus-contendo bem adicionar 2 '-deoxygranosine a uma concentração final de 1,25 mM.
- Cultura o Timo isolado por oito dias, refrescando ambos os meios de cultura e 2 '-deoxygranosine cada dois dias.
3. estabeleça o espaço subcapsular na cápsula renal
- Para preparar a agulha e o tubo de infusão cortada (Figura 2), corte a agulha da veia do couro cabeludo na parte do tubo em um ângulo de 45 ° usando uma tesoura.
- Pesar o rato nu e, em seguida, anestesiá-lo com um pentobarbital (1,5%) injetável (75 μg/g de peso corporal).
- Quando não for observado nenhum reflexo após a pinça do dedo do pé, coloque o mouse sobre a mesa de operação em uma posição lateral direita.
- Com um cotonete do iodo do povidona de 0,5%, desinfete a pele duas vezes na área cirúrgica do interior à parte externa do corpo.
- Usando a tesoura, faça uma incisão da pele de 5 – 9 milímetros paralela à espinha na área renal esquerda (entre a última costela e a crista ilíaca). Em seguida, abra a cavidade abdominal cortando através do tecido e do músculo subcutaneous e exponha o rim.
- Com o rim exposto, use um par de pinças em uma mão para levantar o músculo e tecido adiposo fora da borda da incisão do lado da espinha. Com a outra mão, aperte suavemente o rim para fora (Alternativamente, o rim pode ser espremido usando os dedos de ambas as mãos).
- Para garantir que a cápsula renal é úmida durante a cirurgia, molhe a superfície do rim com soro fisiológico (0,9% NaCl).
- Crie um entalhe na cápsula do rim, e risque delicadamente a cápsula renal no lado direito mais baixo usando a ponta da agulha preparada na etapa 3,1. O tamanho do entalhe deve ser 1/2 – 2/3 larguras do rim; não arranhar no rim.
- Deslize o tubo de perfusão preparado no passo 3,1 para o entalhe na cápsula renal. Dissociar suavemente a cápsula renal com o rim ao longo do lado longo do rim até atingir 3 – 4mm dentro da cápsula renal. Desenhe de volta o tubo de infusão; o espaço subcapsular do rim é estabelecido.
4. transplante do Timo murino embrionário
- Lave o Timo cultivado na etapa 2,3 duas vezes em soro fisiológico para esgotar os meios de cultura.
- Conecte o tubo de infusão cortado preparado na etapa 3,1 a uma seringa em sua interface de conexão da seringa. Aspirar o Timo preparado para o tubo de infusão lentamente.
- Introduza suavemente o tubo de perfusão cortado na cápsula renal e chegue ao pólo superior. Entregar o timo na cápsula renal; Retraia o tubo lentamente ao simultaneamente empurrar o êmbolo da seringa suavemente.
- Usando uma lâmpada de álcool, aqueça levemente a agulha preparada na etapa 3,1. Depois de garantir que todo o Timo está dentro do espaço subcapsular, use a agulha aquecida para cauterizar o Nick.
- Após a cauterização, restaure o rim na cavidade abdominal. Sutura do peritônio e músculo.
- Usando uma sutura de colchão vertical interrompida modificada, feche a incisão da pele (amarre pelo menos três nós e corte afastado toda a linha adicional).
- Usando um cotonete do iodo do povidona, desinfete a incisão. Para aliviar a dor, a injeção subcutaneous do flunixin meglumine (2 μg/g do peso corporal) foi executada durante a cirurgia e então por 3 dias após a cirurgia.
- Até que completamente recuperado da anestesia, mantenha o rato morno a lâmpada infravermelha.
- Mantenha o timo na cápsula renal do receptor por 8 semanas antes de dissecação do Timo transplantado e realizando análise fenotípica como descrito anteriormente5,8,9.
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Representative Results
Aqui nós mostramos o e 18.5 Timo isolado que contem dois lóbulos completos (Figura 1). Além disso, mostramos a agulha da veia do couro cabeludo que foi cortada para formar um chanfro no tubo de infusão (Figura 2). Em seguida, também mostramos uma imagem representativa da posição do Timo que foi transplantado na cápsula renal (Figura 3a) e o Timo após 8 semanas de crescimento dentro dos camundongos receptores (Figura 3B). Para determinar se as células T foram produzidas em camundongos nus transplantados com um timo, tanto no timo transplantado quanto no sangue periférico, detectamos as populações celulares usando a coloração de anticorpos CD4 e CD8 e a análise de citometria de fluxo. O sangue periférico foi coletado da cavidade retro-orbital como descrito previamente12. Nós encontramos que as pilhas de T foram produzidas no timo transplantado e no sangue periférico dos ratos nus transplantados com um timo. No entanto, não foram detectadas células T no sangue periférico de camundongos nus não transplantados (Figura 4). Para determinar a fonte de células T, verificamos os genes Insm1 e lacZ nos glóbulos brancos periféricos utilizando métodos de genotipagem rotineiramente utilizados em nosso laboratório e descritos anteriormente13,14. Desde que o gene Insm1 do embrião do doador foi substituído pelo gene de lacZ em um ou ambos os alelos, quando as pilhas de T foram cotransplantadas com Timo do doador, nós poderíamos detectar o gene de lacZ no genoma das pilhas de t coletadas do periférico sangue do receptor, o que indica que eles foram produzidos pelo Timo doador. Adicionalmente, porque nenhum gene de lacZ estava atual, lacZ não seria detectado quando as pilhas de T foram geradas das pilhas Hematopoietic do receptor. Não detectamos o gene lacZ nas células t periféricas, indicando que as células t foram geradas a partir do receptor (Figura 5).
Figura 1: Timo isolado de embriões e 18,5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Thymus que entrega as ferramentas feitas da agulha da veia do escalpe. A agulha da veia do escalpe foi cortada na parte do tubo da infusão perto da agulha em um ângulo de 45 ° para criar um chanfro. A agulha e o tubo de infusão foram utilizados no procedimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Thymus transplantado na cápsula renal. (A) recentemente transplantado e 18,5 timo na cápsula renal. (B) Thymus na cápsula renal após o crescimento de 8 semanas no receptor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: análise da citometria de fluxo das células T isoladas do Timo transplantado, sangue de camundongos nus Thymus-transplantados e não transplantados. Anticorpos CD4 e CD8α foram utilizados para coloração das células T. Célulaspositivas CD4 + CD8+ duplas, CD4+ única positiva, CD8+ única positiva e células negativas CD4-CD8- duplas são mostradas em cada um dos quadrantes, conforme indicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: identificação da fonte das células T de sangue periférico em camundongos nus transplantados do timo. Genotyping do gene de lacZ e do gene Insm1 em pilhas brancas do sangue periférico é mostrado. Escada: marcador do ADN, +: ADN positivo do controle,-: ADN negativo do controle, Anim1: ADN dos glóbulos brancos periféricos do rato nu transplantado com Insm1lacZ/lacZ Thymus, Anim2: ADN dos glóbulos brancos periféricos do rato nu transplantados com Insm1+/lacZ Thymus. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A transplantação subcapsular renal do Timo embrionário é um método importante para estudar a função epithelial Thymic das pilhas e o processo da maturação das pilhas de T in vivo. Embora existam vários estudos experimentais sobre cultura e transplante de órgãos do Timo embrionário6,7, nosso protocolo fornece um procedimento alternativo simples na cultura do Timo embrionário murino e subcapsular renal transplantação para o tecido mais velho do timo.
Nosso protocolo melhora os protocolos anteriores incorporando diversas modificações 6,7,10,11. Primeiramente, em vez de E14-E16 timo, utilizou-se o Timo isolado de e 18,5 para transplante. A vantagem é que o Timo neste estágio de desenvolvimento mais atrasado contem estruturas Thymic relativamente maduras e populações epithelial da pilha. Embora o recém-nascido ou os ratos adultos sejam uma fonte alternativa de Timo maduro, se o phenotype letal perinatal ocorrer em conseqüência da manipulação do gene, tal como mutações em genes Jmjd6 ou Insm1 5,13, este método fornece uma alternativa viável para o estudo do Timo maduro. Uma segunda modificação é a previsão de um método da cultura de E18 Timo antes da transplantação. Adicionalmente, uma terceira modificação ocorre no procedimento de transplante, em que utilizamos a ponta da agulha para criar um entalhe na cápsula renal em vez de colher e cortar a cápsula renal com pinças e tesouras. Esta modificação reduziu dano da cápsula renal e ferimento do rim. Uma modificação final está na etapa de sutura. A sutura vertical interrompida modificada do colchão elimina a linha exterior da sutura na pele e impede conseqüentemente a abertura da incisão devido a morder.
Quando este protocolo for usado para a transplantação do timo de e 18.5 na cápsula do rim, pode ser modificada para a transplantação do timo em outros estágios desenvolventes ou para outros tecidos com tamanhos similares. Adicionalmente, os materiais usados podem ser modificados conformemente por usuários diferentes das áreas diferentes, especial com respeito aos reagentes da anestesia que podem ser restringidos por leis locais. A dosagem de pentobarbital utilizado em nosso protocolo é de 75 μg/g de peso corporal. No entanto, a dosagem máxima não deve ser superior a 100 μg/g de peso corporal para prevenir a morte dos animais anestesiados. Embora a transplantação do timo na cápsula renal seja um método eficiente para o estudo funcional do Timo in vivo, algumas limitações existem no método apresentado acima. Estas limitações incluem o risco do Timo que deixa cair fora da cápsula do rim durante o período de crescimento de 8 semanas in vivo (1 em 12). Em segundo lugar, outra limitação é a morte de camundongos após a cirurgia (6 em 30). No entanto, esta morte é causada principalmente pela overdose do pentobarbital. Como tal, outros métodos permitidos da anestesia podem ser empregados.
Em resumo, nós fornecemos um protocolo simples e eficiente para isolar e cultura o e 18.5 Timo e subseqüentemente transplantar o timo na cápsula renal. Isso, então, permite a análise da função das células epiteliais tímicas e do processo de maturação das células T.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo pacote de início da Universidade de Jinan para S.J. e pelo programa de ciência e tecnologia de Guangzhou China (Grant no. 201704020209 a S.J.). Agradecemos a Amy Botta (departamento de biologia, York University, Toronto, ON M3J 1P3, Canadá) para revisão e edição do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- T-Cell Development: Methods and Protocols. Bosselut, R., Vacchio, M. S. , Methods in Molecular Biology, vol. 1323 (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
