Summary
Proporcionamos un método simple y eficiente para trasplantar 2'-deoxyguanosine tratado E18.5 timo en la cápsula renal de un ratón desnudo. Este método debe ser un iida en el estudio de la función de células epiteliales timmicas y la maduración de las células T.
Abstract
El timo es un importante órgano inmune central, que desempeña un papel esencial en el desarrollo y diferenciación de los células T. El trasplante de timo es un método importante para investigar la función de las células epiteliales timmicas y la maduración in vivo de las células T. Aquí describiremos los métodos experimentales utilizados dentro de nuestro laboratorio para trasplantar 2'-deoxyguanosina (para agotar los linfocitos del donante) timo embrionario tratado en la cápsula renal de un ratón desnudo atímico. Este método es simple y eficiente y no requiere habilidades o dispositivos especiales. Los resultados obtenidos a través de este sencillo método mostraron que el timo trasplantado puede apoyar eficazmente la producción de células T del receptor. Además, se aclararán varios puntos clave con respecto al protocolo.
Introduction
El timo es el órgano inmune central, dentro del timo timi citocitos se someten a una selección positiva y negativa, y se convierten en células T maduras1,2. La selección positiva o negativa anormal da como resultado inmunodeficiencias o patologías autoinmunes respectivamente3,4. Por lo tanto, el trasplante de órganos de timo es un enfoque importante para estudiar el proceso de selección de células T en el timo del donante. Este método es particularmente crucial cuando se analiza la función epitelial timmica mediada por mutaciones genéticas que causan fenotipo letal embrionario cuando se muta5.
Para estudiar la maduración de las células T de un receptor en el timo trasplantado, es necesario agotar los linfocitos del donante dentro del timo. Para ello, el timo embrionario de 14, 15 o 16 días (E14, E15, E16) se selecciona generalmente6,7. El timo de etapas más maduras también se puede agotar con éxito de los linfocitos del donante mediante el tratamiento con 2'-deoxyguanosina. Sin embargo, un protocolo detallado para agotar linfocitos y el uso del cultivo de timo más antiguo no se ha descrito previamente8,9. Si bien los protocolos de trasplante han sido introducidos por varios estudios10,11, es necesario modificar y mejorar aún más estos protocolos.
Nuestro protocolo se divide en dos partes: (i) Agotamiento de linfocitos T de la etapa de desarrollo tardío E18.5 timo por cultivo en medios que contienen 2'-deoxyguanosine. (ii) Trasplante del timo cultivado en recipientes. En este procedimiento, desarrollamos una manera sencilla de administrar el tejido grande (E18.5 timo) en la cápsula renal con menor probabilidad de lesión renal. Mientras se centra en el timo de etapa posterior, nuestro protocolo también se puede utilizar directamente o con modificaciones para el trasplante de timo en varias etapas del desarrollo u otros tejidos de tamaño similar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El protocolo presentado se adhiere a las directrices del comité de ética de la Universidad de Jinan con respecto al cuidado de los animales.
NOTA: Los materiales utilizados se enumeran en la Tabla de materiales.
1. Aislamiento del timo embrionario
- Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes del experimento, y esterilizar el banco / campana con 70% etanol.
- Usando dióxido de carbono, anestetiza y eutanasia al ratón hembra embarazada (18,5 días después del apareamiento exitoso). Luego limpie la región abdominal con 70% de etanol.
NOTA: Aquí nos acoplamos a las hembras Insm1+/lacZ e Insm1+/lacZ. La inyección intraplacentaria de pentobarbital se realizó antes del aislamiento de embriones del útero y se realizó la decapitación para cada embrión. - Usando tijeras, haz un corte en forma de "V" en el abdomen comenzando desde la vejiga y corriendo hasta cada cuerno del útero.
- Con las tijeras, corta el mesometrium y el cuello uterino/vagina, y recoge el útero. Coloque el útero en una placa de Petri que contenga solución salina con fosfato frío (PBS) sobre hielo. A continuación, exponer los embriones que están en la decidua envuelta, cortando la pared uterina anterior de un cuerno uterino a la otra. Usando pinzas finas, retire los tejidos de la decidua envueltos y corte el cordón umbilical para liberar los embriones. Coloque todos los embriones en una nueva placa de Petri en hielo hasta el aislamiento del timo.
- Limpie un embrión con un 70% de alcohol y colóquelo en un nuevo plato de Petri. A partir de este paso, asegúrese de que se mantengan las condiciones estériles.
- Cortando cerca de la mandíbula inferior con tijeras, retire la cabeza del embrión y drene la sangre con una toalla de papel. A continuación, fije el embrión en la misma placa de Petri en posición supina.
NOTA: Cortamos un pedazo de la cola de cada embrión para el genotipado Insm1 y lacZ. - Usando tijeras, corta la pared lateral del pecho horizontalmente a lo largo del frente axilar, y luego corta el diafragma para abrir el pecho. El timo ahora debe ser visible como dos lóbulos blancos situados delante de la tráquea y adyacentes al corazón.
- Coloca los fórceps de punta doblada detrás del timo y luego tira del timo suavemente. Asegúrese de verificar la integridad del timo para confirmar que contiene dos lóbulos articulados.
- Lavar el timo con 1 PBS y recortar los tejidos conectivos y vasos sanguíneos bajo un estereomicroscopio.
2. Cultivo del timo embrionario aislado
- Añadir 500 l de medio de cultivo (RPMI1640 + 15% suero bovino fetal (FBS) + 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina) a cada pocal de una placa de 24 pocillos. Transfiere el timi limpio a los pozos con un timo por pozo. La Figura 1 muestra el timo aislado en los medios de cultivo.
- A cada pozo que contiene timo añadir 2'-desoxigranosina a una concentración final de 1,25 mM.
- Cultivar el timo aislado durante ocho días, refrescando los medios de cultivo y 2'-desoxigranosina cada dos días.
3. Establecer el espacio subcapsular en la cápsula renal
- Para preparar la aguja y eltubo de perfusión recortado (Figura 2), corte la aguja de la vena del cuero cabelludo en la parte del tubo en un ángulo de 45o utilizando tijeras.
- Pesar el ratón desnudo y luego anestesiarlo con un pentobarbital (1,5%) inyección (75 g/g de peso corporal).
- Cuando no se observe ningún reflejo después del pellizco del dedo del ratón, coloque el ratón sobre la mesa de operación en una posición lateral derecha.
- Con un hisopo de yodo de povidona al 0,5%, desinfecte la piel dos veces en el área quirúrgica desde el interior hasta el exterior del cuerpo.
- Con tijeras, haga una incisión cutánea de 5-9 mm paralela a la columna vertebral en el área renal izquierda (entre la última costilla y la cresta ilíaca). A continuación, abra la cavidad abdominal cortando a través del tejido subcutáneo y el músculo y exponga el riñón.
- Con el riñón expuesto, usa un par de pinzas en una mano para levantar el músculo y el tejido graso del borde de la incisión del lado de la columna vertebral. Con la otra mano, apriete suavemente el riñón (alternativamente, el riñón se puede exprimir con los dedos de ambas manos).
- Para asegurarse de que la cápsula renal está húmeda durante la cirugía, humedezca la superficie del riñón con salina (0,9% NaCl).
- Cree un nick en la cápsula renal y rasque suavemente la cápsula renal en la parte inferior derecha usando la punta de la aguja preparada en el paso 3.1. El tamaño de la nick debe ser 1/2–2/3 anchos del riñón; no rasquen el riñón.
- Deslice el tubo de perfusión preparado en el paso 3.1 en la muesca de la cápsula renal. Disocia suavemente la cápsula renal con el riñón a lo largo del lado largo del riñón hasta llegar a 3-4 mm dentro de la cápsula renal. Retraiga el tubo de perfusión; se establece el espacio subcapsular renal.
4. Trasplantar el timo murino embrionario
- Lave el timo cultivado en el paso 2.3 dos veces en salina para agotar los medios de cultivo.
- Conecte el tubo de perfusión recortado preparado en el paso 3.1 a una jeringa en su interfaz de conexión de jeringa. Aspirar el timo preparado en el tubo de perfusión lentamente.
- Inserte suavemente el tubo de perfusión recortado en la cápsula renal y alcance el polo superior. Entregar el timo en la cápsula renal; retraer el tubo lentamente mientras empuja suavemente el émbolo de la jeringa.
- Con una lámpara de alcohol, caliente ligeramente la aguja preparada en el paso 3.1. Después de asegurarse de que todo el timo está dentro del espacio subcapsular, utilice la aguja calentada para cauterizar la muesca.
- Después de la cauterización, restaurar el riñón en la cavidad abdominal. Suturar el peritoneo y el músculo.
- Con una sutura de colchón vertical interrumpida modificada, cierre la incisión de la piel (ate al menos tres nudos y corte cualquier exceso de hilo).
- Con un hisopo de yodo povidona, desinfecte la incisión. Para aliviar el dolor, se realizó una inyección subcutánea de flunixina (2 g/g de peso corporal) durante la cirugía y luego durante 3 días después de la cirugía.
- Hasta que esté completamente recuperado de la anestesia, mantenga el ratón caliente debajo de la lámpara infrarroja.
- Conservar el timo en la cápsula renal del receptor durante 8 semanas antes de disepartir el timo trasplantado y realizar análisis fenotípicos como se describió anteriormente5,8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aquí mostramos el timo aislado E18.5 que contiene dos lóbulos completos (Figura1). Además, mostramos la aguja de la vena del cuero cabelludo que fue recortada para formar un bisel en el tubo de perfusión (Figura2). A continuación, también mostramos una imagen representativa de la posición del timo que se trasplantó en la cápsula renal (Figura3A)y el timo después de 8 semanas de crecimiento dentro de los ratones receptores (Figura3B). Para determinar si los linfocitos T se produjeron en ratones desnudos trasplantados con un timo, tanto en el timo trasplantado como en la sangre periférica, detectamos las poblaciones celulares utilizando la tinción de anticuerpos CD4 y CD8 y el análisis de citometría de flujo. La sangre periférica se recogió del seno retroorbital como se describió anteriormente12. Encontramos que los linfocitos T se produjeron tanto en el timo trasplantado como en la sangre periférica de ratones desnudos trasplantados con un timo. Sin embargo, no se detectaron linfocitos T en la sangre periférica de ratones desnudos no trasplantados (Figura4). Para determinar la fuente de las células T, comprobamos los genes Insm1 y lacZ en los glóbulos blancos periféricos utilizando métodos de genotipado utilizados rutinariamente en nuestro laboratorio y descritos anteriormente13,14. Dado que el gen Insm1 del embrión donante fue reemplazado por el gen lacZ en uno o ambos alelos, cuando las células T fueron co-trasplantadas con timo del donante, pudimos detectar el gen lacZ en el genoma de las células T recogidas de células periféricas sangre del receptor, lo que indica que fueron producidos por el tútimante donante. Además, como no había ningún gen lacZ presente, lacZ no se detectaría cuando las células T se generaran a partir de las células hematopoyéticas del receptor. No detectamos el gen lacZ en las células T periféricas que indica que las células T se generaron a partir del receptor (Figura5).
Figura 1: Timo aislado de embriones E18.5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Las herramientas de entrega de Thymus hechas de la aguja de la vena del cuero cabelludo. La aguja de la vena del cuero cabelludo se cortó en la parte del tubo de perfusión cerca de la aguja en un ángulo de 45o para crear un bisel. Tanto la aguja como el tubo de perfusión se utilizaron en el procedimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Thymus trasplantado en la cápsula renal. (A) Recién trasplantado E18.5 timo en la cápsula renal. (B) Thymus en la cápsula renal después de 8 semanas de crecimiento en el receptor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de citometría de flujo de los linfocitos T aislados del timo trasplantado, sangre de ratones desnudos trasplantados con timo y no trasplantados. Se utilizaron anticuerpos CD4 y CD8 para la tinción de células T. CD4+CD8+ celdas dobles positivas, CD4+ solo positivo, CD8+ solo positivo y CD4-celdas negativas dobles se muestran en cada uno de los cuadrantes como se indica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Identificación de la fuente de los linfocitos T de la sangre periférica en ratones desnudos trasplantados por timo. Se muestra el genotipado del gen lacZ y el gen Insm1 en los glóbulos blancos periféricos. Escalera: marcador de ADN, + : ADN de control positivo, -: ADN de control negativo, Anim1: ADN de glóbulos blancos periféricos de ratón desnudo trasplantado con Insm1lacZ/lacZ timo, Anim2: ADN de glóbulos blancos periféricos de ratón desnudo trasplantado con Insm1+/lacZ timo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El trasplante subcapsular renal del timo embrionario es un método importante para estudiar la función de las células epiteliales timmicas y el proceso de maduración de las células T in vivo. Aunque existen varios estudios experimentales sobre cultivo deórganos de timo embrionario y trasplante 6,7, nuestro protocolo proporciona un procedimiento alternativo simple sobre el cultivo del timo embrionario murino y subcapsular renal trasplante para tejido timo más antiguo.
Nuestro protocolo mejora los protocolos anteriores mediante la incorporación de varias modificaciones diferentes 6,7,10,11. En primer lugar, en lugar del timo E14-E16, utilizamos el timo aislado de E18.5 para el trasplante. La ventaja es que el timo en esta etapa posterior del desarrollo contiene estructuras timmicas relativamente maduras y poblaciones de células epiteliales. Aunque los ratones recién nacidos o adultos son una fuente alternativa de timo maduro, si el fenotipo letalperinatal se produce como resultado de la manipulación genética, como mutaciones en los genes Jmjd6 o Insm1 5,13, proporciona una alternativa viable para el estudio del timo maduro. Una segunda modificación es la previsión de un método de cultivo de timo E18 antes del trasplante. Además, se produce una tercera modificación en el procedimiento de trasplante, en el que usamos la punta de la aguja para crear un nick en la cápsula renal en lugar de recoger y cortar la cápsula renal con pinzas y tijeras. Esta modificación redujo tanto el daño en la cápsula renal como la lesión del riñón. Una última modificación está en el paso de sutura. La sutura de colchón vertical interrumpida modificada elimina la línea de sutura exterior en la piel y por lo tanto evita la apertura de la incisión debido a la mordida.
Mientras que este protocolo se utiliza para el trasplante de timo E18.5 en la cápsula renal, se puede modificar para el trasplante del timo en otras etapas del desarrollo o para otros tejidos con tamaños similares. Además, los materiales utilizados pueden ser modificados en consecuencia por diferentes usuarios de diferentes áreas, especialmente con respecto a los reactivos de anestesia que pueden ser restringidos por las leyes locales. La dosis de pentobarbital utilizada en nuestro protocolo es de 75 g/g de peso corporal. Sin embargo, la dosis máxima no debe ser más de 100 g/g de peso corporal para evitar la muerte de los animales anestesiados. Aunque el trasplante del timo en la cápsula renal es un método eficiente para el estudio funcional del timo in vivo, existen algunas limitaciones en el método presentado anteriormente. Estas limitaciones incluyen el riesgo de que el timo abandone la cápsula renal durante el período de crecimiento in vivo de 8 semanas (1 de cada 12). En segundo lugar, otra limitación es la muerte de ratones después de la cirugía (6 de cada 30). Sin embargo, esta muerte es causada principalmente por la sobredosis del pentobarbital. Como tal, se pueden emplear otros métodos de anestesia permitidos.
En resumen, proporcionamos un protocolo simple y eficiente para aislar y cultivar el timo E18.5 y luego trasplantar el timo en la cápsula renal. Esto permite el análisis de la función de las células epiteliales timicas y el proceso de maduración de las células T.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No se declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Paquete De Inicio de la Universidad Jinan a S.J. y por el Programa de Ciencia y Tecnología de Guangzhou China (Grant No. 201704020209 a S.J.). Agradecemos a Amy Botta (Departamento de Biología, Universidad de York, Toronto, ON M3J 1P3, Canadá) por la corrección y edición del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- T-Cell Development: Methods and Protocols. Bosselut, R., Vacchio, M. S. , Methods in Molecular Biology, vol. 1323 (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
