Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

В Vivo Функциональное исследование связанных с болезнями редких человеческих вариантов с использованием дрозофилы

Published: August 20, 2019 doi: 10.3791/59658
* These authors contributed equally

Summary

Целью данного протокола является описание дизайна и выполнения экспериментов in vivo в Drosophila melanogaster для оценки функциональных последствий редких вариантов генов, связанных с болезнями человека.

Abstract

Достижения в области технологии секвенирования сделали наборы данных всего генома и цельно-экзома более доступными как для клинической диагностики, так и для передовых исследований генетики человека. Хотя ряд алгоритмов силико были разработаны для прогнозирования патогенности вариантов, определенных в этих наборах данных, функциональные исследования имеют решающее значение для определения того, как конкретные геномные варианты влияют на функцию белка, особенно для неправильного Варианты. В Сети недиагностированных болезней (UDN) и других редких консорциумов исследований заболеваний, модель организмов (MO), включая Drosophila, C. elegans,зебрафиш, и мышей активно используются для оценки функции индикативного заболевания человека, вызывающих Варианты. Этот протокол описывает метод функциональной оценки редких человеческих вариантов, используемых в Центре скрининга модельных организмов Drosophila Core UDN. Рабочий процесс начинается со сбора информации о человеке и МО из нескольких общедоступных баз данных, используя веб-ресурс MARRVEL для оценки того, может ли этот вариант способствовать состоянию пациента, а также разрабатывать эффективные эксперименты на основе имеющихся знаний и ресурсов. Далее, генетические инструменты (например, T2A-GAL4 и UAS-человеческий cDNA линии) создаются для оценки функций вариантов интереса к Drosophila. После разработки этих реагентов для оценки функции вариантов могут проводиться двусторонние функциональные анализы, основанные на спасательных и переэкспрессивных экспериментах. В спасательной ветви эндогенные гены мухи «очеловечены», заменяя ортолотеозный ген дрозофилы эталонным или вариантом человеческих трансгенов. В ветви переэкспрессии, справочные и варианты человеческих белков экзогенно приводится в различных тканях. В обоих случаях любой фенотип (например, летальность, морфология глаз, электрофизиология) может использоваться в качестве считывания, независимо от заболевания, представляющих интерес. Различия, наблюдаемые между эталонными и вариантными аллелями, указывают на разновидно-специфический эффект и, таким образом, вероятную патогенность. Этот протокол позволяет быстро, in vivo оценки putative человека болезнетворных вариантов генов с известными и неизвестными функциями.

Introduction

Пациенты с редкими заболеваниями часто проходят трудное путешествие называют "диагностическая одиссея", чтобы получить точный диагноз1. Большинство редких заболеваний, как полагают, имеют сильное генетическое происхождение, что делает генетический / геномный анализ критических элементов клинической работы. В дополнение к последовательности генной панели кандидата и анализа вариаций числа копий на основе хромосомных микроаррей, технологий секвенирования всего генома (WES) и секвенирования всего генома (WGS) стали все более ценными инструментами за последнее десятилетие2, 3. В настоящее время, диагностическая ставка для выявления известных патогенных вариантов в WES и WGS составляет 25% (выше в детских случаях)4,5. В большинстве случаев, которые остаются невыявленными после клинической WES/WGS, общая проблема заключается в том, что существует много генов и вариантов кандидатов. Секвенирование следующего поколения часто определяет новые или ультра-редкие варианты во многих генах, и интерпретация того, способствуют ли эти варианты фенотипам болезни, является сложной задачей. Например, хотя большинство ерунда или frameshift мутации в генах, как полагают, потеря функции (LOF) аллели из-за ерунды опосредованного распада закодированного транскрипта, усечение мутаций, найденных в последних экзонов избежать этого процесса и может функционировать как доброкачественные или прироста функций (GOF) аллели6.

Кроме того, прогнозирование последствий аллеля неправильного зрения является сложной задачей, так как это может привести к ряду различных генетических сценариев, как впервые описано Германом Мюллером в 1930-х (т.е. аморф, гипоморф, гиперморф, антиморф, неоморф, или изоморф)7 . Многочисленные программы силико и методологии были разработаны для прогнозирования патогенности вариантов неправильности, основанных на эволюционной сохранении, типами изменения аминокислот, положением в функциональной области, частотой аллелей в общей популяции, и другие параметры8. Однако эти программы не являются комплексным решением для решения сложной проблемы интерпретации вариантов. Интересно, что недавнее исследование показало, что пять широко используемых алгоритмов прогнозирования патогенности (Полифен9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Мутация Taster) согласны на патогенность 80% времени8 . Примечательно, что даже когда все алгоритмы согласны, они возвращают неправильное предсказание патогенности до 11% времени. Это не только приводит к недостаткам клинической интерпретации, но и может отговорить исследователей от последующих на новые варианты, ложно перечисляя их как доброкачественные. Один из способов дополнить нынешнее ограничение в силико моделирования является предоставление экспериментальных данных, которые демонстрируют эффект функции варианта in vitro, ex vivo (например, культивированные клетки, органоиды), или in vivo.

In vivo функциональные исследования редких вариантов заболеваний, связанных в MO имеют уникальные сильные13 и были приняты многими редкими инициативами исследования заболеваний по всему миру, в том числе Недиагностированные болезни сети (UDN) в Соединенных Штатах и редких Болезни Модели и механизмы (RDMM) Сети в Канаде, Японии, Европе и Австралии14. В дополнение к этим скоординированным усилиям по интеграции исследователей МО в рабочий процесс диагностики редких заболеваний и механистических исследований в национальном масштабе, ряд индивидуальных совместных исследований между клиническими и MO исследователей привели к открытию и характеристика многих новых генов и вариантов, вызывающих болезни человека,82,83,84.

В UDN, централизованный модельНые органы скрининговый центр (MOSC) получает представления генов-кандидатов и вариантов с описанием состояния пациента и оценивает, является ли вариант может быть патогенным с помощью инструментов информатики и in vivo Эксперименты. В фазе I (2015-2018) UDN, MOSC состоит из Drosophila Core (Бейлор колледж медицины (BCM) и Зебрафиш ядро (Университет штата Орегон), которые работали совместно для оценки случаев. Используя анализ информатики и ряд различных экспериментальных стратегий в Drosophila и зебрафиш, MOSC до сих пор способствовали диагностике 132 пациентов, выявление 31 новых синдромов55, открытие нескольких новых человеческих гены заболеваний (например, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) и фенотипическое расширение известного заболевания гены (например, CACNA1A21,ACOX122).

В дополнение к проектам в рамках UDN, исследователи MOSC Drosophila Core внесли свой вклад в новые открытия генов болезни в сотрудничестве с Центрами менделианской геномики и другими инициативами (например, ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) с использованием того же набора информатики и генетики стратегии, разработанные для UDN. Учитывая значение исследований МО по диагностике редких заболеваний, MOSC был расширен, чтобы включить ядро C. elegans и второе ядро зебрафиш (оба в Университете Вашингтона в Сент-Луисе) для фазы II (2018-2022) UDN.

Данная рукопись описывает протокол функционального исследования in vivo, который активно используется в UDN MOSC Drosophila Core, чтобы определить, имеют ли варианты неправильного зрения функциональные последствия для белка, интересуемого с помощью трансгенных мух, которые выражают человека Белки. Цель этого протокола состоит в том, чтобы помочь исследователям МО работать совместно с клиническими исследовательскими группами, чтобы предоставить экспериментальные доказательства того, что вариант кандидата в гене интереса имеет функциональные последствия, тем самым облегчая клиническую диагностику. Этот протокол является наиболее полезным в сценарии, в котором исследователь Drosophila подошел клинический исследователь, который имеет редкое заболевание пациента с конкретным вариантом кандидата в гене интереса.

Этот протокол может быть разбит на три элемента: (1) сбор информации для оценки вероятности варианта интереса, ответственного за фенотип пациента и осуществимость функционального исследования в Drosophila, (2) сбор существующих генетических инструментов и создания новых, и (3) выполнения функциональных исследований in vivo. Третий элемент можно также разделить на два подэлемента на основе того, как можно оценивать функцию варианта интереса (спасательный эксперимент или стратегии, основанные на перевыражении). Важно отметить, что этот протокол может быть адаптирован и оптимизирован для многих сценариев, не связанных с исследованиями редких моногенных заболеваний (например, распространенные заболевания, взаимодействие генно-экологических и фармакологических/генетических экранов для определения терапевтических целей). Способность определять функциональность и патогенность вариантов не только принесет пользу интересуемому пациенту, обеспечивая точную молекулярную диагностику, но и окажет более широкое влияние как на трансляционные, так и на фундаментальные научные исследования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Сбор информации человека и МО для оценки: Вероятность варианта интересов, ответственного за фенотипы болезней и целесообразность функциональных исследований в Дрософиле

  1. Выполните обширные поиски базы данных и литературы, чтобы определить, являются ли конкретные гены и варианты интересов хорошими кандидатами для объяснения фенотипа интересуемого пациента. В частности, соберите следующую информацию.
    1. Оцените, если ген интереса был ранее вовлечен в другие генетические расстройства (фенотипическое расширение известного гена болезни) или это совершенно новый ген кандидата болезни (вариант гена неопределенного значения (GVUS)».
    2. Оценить частоту аллелей вариант анабиозвого интереса к базам данных популяций болезней или контролировать его.
    3. Оцените, есть ли вариации числа копий (CNV), которые включают этот ген в базы данных болезни или контролируют популяционные базы данных.
    4. Оцените, какие ортолотовые гены находятся в различных видах MO, включая мышь, зебра, Дрозофилу, C. elegans и дрожжи, а затем далее исследовать известные функции и модели экспрессии этих ортоломных генов.
    5. Оцените, присутствует ли вариант интереса в функциональной области белка и сохраняется ли аминокислота эволюционно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ответы на эти пять вопросов (шаги 1.1.1-1.1.5) можно получить, получив доступ к ряду баз данных человека и MO по отдельности или с помощью веб-ресурса MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant Exploration) (см. таблицу 1 для интернет-ресурсов)30, который подробно описан в сопроводительной статье31. Для конкретных примеров можно найти раздел «Репрезентативные результаты». Сайт Monarch Initiative32 и Gene2Function33 также предоставляют полезную информацию.
  2. Соберите дополнительную информацию для дальнейшей оценки того, является ли вариант хорошим кандидатом на болезнь из белковой функции и структуры точки зрения.
    1. Оцените, если вариант интереса, по прогнозам, будет разрушительным на основе алгоритмов прогнозирования силико.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вариант патогенности алгоритмы были разработаны многими исследовательскими группами в течение последних 15 лет, и некоторые из них также отображаются в результатах поиска MARRVEL. Более поздние программы, в том числе два перечисленных ниже, объединить несколько вариантов патогенности алгоритмов редикции и машинного обучения подходов для создания патогенности оценка. Для получения дополнительной информации об алгоритмах прогнозирования вариантов и их производительности, обратитесь к Ghosh, и др.8. i) CADD (комбинированное истощение, зависящее от аннотации): интегративный инструмент аннотации, построенный из более чем 60 геномных особенностей, который обеспечивает баллы для человеческих SNVs, а также короткие вставки и удаления11. ii) REVEL (редкий экзомический вариант ансамбля): сочетает в себе алгоритмы патогенности нескольких вариантов (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP и phastCons) для обеспечения комплексного балла для всех возможных вариантов человеческой ощутвия34.
    2. Определите, если человеческий ген / белок интерес или его MO ортологи были показаны генетически или физически взаимодействовать с генами / белками, ранее связанных с генетическими заболеваниями. Если это так, оценить, если пациент интерес экспонатов перекрывающихся фенотипов с этими расстройствами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько инструментов были разработаны для анализа генетических и белково-белковых взаимодействий на основе публикаций MO, а также крупномасштабных протеомики с экранов нескольких видов. STRING (инструмент поиска для повторяющихся экземпляров соседних генов)35: база данных для известных и предсказанных белково-белковых взаимодействий. Он интегрирует наборы данных генетического взаимодействия и совместного выражения, а также инструменты для интеллектуального анализа генов и белков, которые могут функционировать вместе в различных организмах. MIST (инструмент поиска молекулярного взаимодействия)36: база данных, которая интегрирует генетические и белковые данные взаимодействия от основных генетических МО (дрожжи, C. elegans, Drosophila, зебрафиш, лягушка, крыса, мышь) и людей. Прогноз взаимодействия, выведенные из ортолотовых генов/белков (интерлоги) также отображаются.
    3. Определите, была ли решена или смоделирована трех-D структура интересуемого белка. Если это так, определите, где вариант карты интереса относительно ключевых функциональных доменов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белковые структуры, решенные рентгеновской кристаллографией, ядерным магнитным резонансом (ЯМР) и криоэлектронной микроскопией, можно найти в общедоступных базах данных, включая PDB (банк данных о белках) и EMDatabank37. Хотя нет единой базы данных для предсказанных/смоделированных белковых структур, для выполнения белкового моделирования пользователям доступны несколько алгоритмов (т.е. SWISS-MODEL38,Modeller39и Phyre240).
  3. Общайтесь с клиническими сотрудниками для обсуждения информации, собранной в анализах информатики в разделах 1.1-1.2. Если клинические сотрудники также считают, что вариант и ген интереса являются хорошими кандидатами, чтобы объяснить фенотипы видели у пациента, перейти к разделу 2. Если есть конкретные вопросы о генотипе и фенотипе пациента, обсудите их с клиническими сотрудниками, прежде чем двигаться вперед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если считается, что вариант интереса вряд ли объяснить фенотип интереса (например, идентичный вариант, найденный в высокой частоте в контрольной популяции), обсудить это с клиническими сотрудниками, чтобы определить, является ли вариант хорошим кандидата, так как может не быть соответствующего опыта для интерпретации клинических фенотипов.

2. Сбор существующих генетических инструментов и создание новых реагентов для изучения конкретного варианта интересов

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как вариант интереса был определен хороший кандидат проводить экспериментально, собирать или генерировать реагенты для выполнения in vivo функциональных исследований. Для функциональных исследований, описанных в этом протоколе, некоторые ключевые drosophila меланогастер реагенты необходимы: 1) вверх по течению активации последовательности регулируемых человеческих cDNA трансгенных штаммов, которые несут ссылку или вариант последовательности, 2) потеря функции аллель гена мухи интерес, и 3) GAL4 линии, которые могут быть использованы для спасательных экспериментов.

  1. Поколение конструкций УАЗ-человека кДНК и трансгенных мух
    1. Определите и получите соответствующие конструкции кДНК человека. Многие клоны доступны из MGC (mammalian коллекция генов)43 и могут быть приобретены у отдельных продавцов. Для генов, которые в качестве альтернативы сращиваются, проверьте, какие изоформные кДНК соответствует использованию Ensembl или RefSeq.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Многие cDNAs доступны в рекомбиназе-опосредованной системы клонирования совместимых реагентов44, что упрощает подклонирование шаг. cDNAs может прийти в формате "открытый (без остановки кодон)" или "закрытый (с эндогенным или искусственным стоп-кодоном)" формат. В то время как открытые клоны позволяют C'-пометки белков, которые полезны для биохимических (например, западная поника) и клеточных биологических (например, иммуномаркировки) анализы для мониторинга экспрессии белка интерес, это может помешать функции белка в некоторых случаях.
    2. Субклон ссылка и вариант cDNA в Drosophila трансгенный вектор. Используйте систему трансгенеза, опосредованный ц31, так как это позволяет интегрировать справочно-вариант cDNA в одно и то же место в геноме45. Для этого проекта, MOSC Drosophila Core регулярно использует вектор pGW-HA.attB46.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если человек cDNA находится в рекомбиназе-опосредованной системы клонирования совместимых векторов (например, pDONR221, pENTR221), перейти к разделу 2.1.4, который объясняет LR реакции на субклон cDNAs в pGW-HA.attB.
      1. Если кДНК человека не находится в системе клонирования, опосредованной рекомбиназой, совместимой с плазмидом, подклон человеческого cDNA в вектор входа шлюза с использованием стандартных молекулярно-биологических методов (пример такого протокола описан ниже).
        1. Выполните навес ПЦР, чтобы ввести attB1 и attB2 оружия. Передняя грунтовка должна иметь attB1 последовательность 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAGCAAGCTTTTCACC-3', а затем первые 22 нуклеотидов целевой кДНК. Обратный грунт должен иметь attB2 последовательность 5'-GGGGACCACTTGTACAAGAAGCTGGGTCTTTTA-3', а затем обратный дополнение последних 25 нуклеотидов кДНа интереса. Исключите стоп-кодон кДНК, затем добавьте тег C', если хочется "открыть" клон, или добавьте стоп-кодон, чтобы "закрыть" клон.
        2. Подготовьте 100 л высокой точности PCR смеси, состоящей из 50 зЛ высокой точности PCR мастер-микс, 36 л дистиллированной воды, 5 л каждой вперед и обратных грунтовки, перечисленные в шаге 2.1.2.1.1 разбавленной до 10 км., и 4 л целевого КДН (150 нг/Л).
        3. Выполните ПЦР с использованием стандартного протокола мутагенеза, чтобы добавить attB1 и attB2 оружия на cDNA интереса. Условия будут варьироваться в зависимости от конструкции и вариантов интереса.
        4. Изолировать целевую кДНК с добавлением гомологических рукояток с помощью геля электрофорасиса и извлечения геля. Создайте 1% агарозного геля и выполняйте электрофорус с использованием стандартных методов. Акциз полосы, которая соответствует размеру кДНК плюс дополнительная длина гомологических оружия. Извлекайте ДНК из геля стандартными методами95. Коммерческие комплекты извлечения геля доступны от нескольких компаний.
        5. Выполните реакцию в ибробры рекомбиназы на основе протокола клонирования, опосредованного рекомбиназой, в соответствии с используемой системой.
        6. Преобразуйте смесь реакции ВР в химически компетентные клетки кишечной палочки. Компетентные ячейки могут быть сделаны в доме или приобретены у коммерческих поставщиков. Культура преобразованных клеток на ночь на пластине LB, содержащей соответствующие антибиотики для выбора колонии. На следующий день выберите несколько колоний и выращивайте их в независимых жидких культурах в одночасье.
        7. Изолировать ДНК от ночных культур через мини-подготовку. Сэнгер последовательность положительных клонов, чтобы убедиться, что кДНК имеет правильную последовательность96. Поддержание клеток из культур, которые являются положительными для желаемой последовательности в 25% глицерола хранится при -80 градусов по Цельсию.
    3. Выполните сайт-направленный мутагенез, чтобы ввести вариант интереса к плазмид gateway с ссылкой человека cDNA97. Подробный протокол для этого метода можно найти на веб-сайте поставщика48,49. Проверить наличие варианта в мутировавшей плазмид через Sanger секвенирования всего открытого кадра чтения (ORF), чтобы убедиться, что Есть никаких дополнительных вариантов, введенных через этот шаг мутагенеза.
    4. Subclone справка и вариант человека cDNAs в плазмида дарителя (Плазмиды шлюза с attL1 и attL2 местами) в transgenic плазмида (например, pGW-HA.attB с attR1 и attR2 местами) через реакцию clonase LR.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть UAS C31 векторов, предназначенных для обычных ограничений фермента на основе подклонирования (например, pUAST.attB50), если предпочтительнее субклон человека cDNAs с помощью методов ограничения фермента.
    5. Выберите стыковочные площадки СК31, в которых можно интегрировать трансгены UAS-human cDNA. Ряд стыковочных площадок были созданы несколькими лабораториями и являются общедоступными из фондовых центров50,52,53.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку это удобно иметь человеческий трансген на хромосоме, которая не содержит мухи ортолог гена интерес, рекомендуется использовать вторую хромосомы стыковки сайт "VK37 (BDSC фондовых #24872" когда муха ортолог находится на X , третья или четвертая хромосомы, и используйте третью хромосомную стыковку (VK33 (BDSC stock #24871), когда ортолог мухи находится на второй хромосоме.
    6. Впрысните конструкции UAS-human cDNA в мухи, выражающие интегразу С-31 в их зародышевой линии (например, ваз-C31, nos-C31).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроинъекция может быть выполнена в доме или отправлены на основные объекты или коммерческие объекты для трансгенеза. Подробный протокол для генерации трансгенных мух можно найти в цитируемой главе книги51.
    7. Создание стабильных трансгенных штаммов из инъекционных эмбрионов. Впрыскивает 100-200 эмбрионов на конструкцию94. На рисунке 1Аизображена репрезентативная схема пересечения трансгенной вставки во вторую хромосому стыковки (VK37). Ссылайтесь на приведенные книги54,55 для основной информации drosophila генетики.
  2. Получить или создать линию T2A-GAL4, которая облегчает функциональные анализы на основе спасения (см. рисунок 2 и раздел 3.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта линия будет служить двум целям. Во-первых, большинство проверенных линий T2A-GAL4 ведут себя как сильные аллели LOF, действуя как аллель генной ловушки. Во-вторых, линии T2A-GAL4 функционируют как драйвер GAL4, что позволяет экспрессию конструкций UAS (например, UAS-GFP, UAS-человеческие cDNA) под эндогенными элементами регуляции гена интереса56,57 (Рисунок2A-C).
    1. Поиск публичных фондовых коллекций для доступных линий T2A-GAL4, включая Drosophila Gene Disruption Project (ВВП)58, в котором было создано59линий T2A-GAL4. Эти штаммы в настоящее время доступны из Блумингтон Drosophila фондовый центр (BDSC) и доступны для поиска через ВВП и BDSC веб-сайтов.
    2. Если линия T2A-GAL4 для гена мухи, представляющих интерес, проверьте, доступнали соответствующая линия кодирования intronic MiMIC (Minos-mediated integration cassette) для преобразования в линию T2A-GAL4 с помощью рекомбинационной кассетной биржи (RMCE) )60 (рисунок 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: RMCE позволяет интроническим элементам MiMIC, которые находятся между двумя кодирующими экзонами, которые будут преобразованы в линию T2A-GAL4 через микроинъекцию донорской конструкции (пример схемы пересечения показан на рисунке 1B) или серии кресты, как описано в деталях57,59.
    3. Если линия T2A-GAL4 недоступна и соответствующего кодирования интронного MiMIC не существует, изучите возможность создания линии T2A-GAL4 через систему CRIMIC (CRISPR-опосредованная интеграционная кассета)59.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта методология использует CRISPR-опосредованное расщепление ДНК и гомология-направленный ремонт (HDR) для интеграции MiMIC-как кассета в кодирование интрон в гене интереса.
    4. Если ген интереса не имеет большой интрон (No gt;150 bp) или не имеет интронов, попытка стучать в GAL4 трансгена в ген мухи с системой CRISPR/Cas9 с использованием HDR, как описано20,61,62.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если поколение T2A-GAL4 или GAL4 стук в аллель трудно, попытка выполнить спасательные эксперименты с использованием этих уже существующих аллелей или RNAi линий и вездесущие или ткани конкретных GAL4 драйверов, как описано92 (REF).

3. Выполнение функционального анализа человеческого варианта интереса в Vivo в Drosophila

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните спасательный анализ (раздел 3.1), а также исследования экспрессии (раздел 3.2) с использованием инструментов, собранных или сгенерированных в разделе 2 для оценки последствий варианта интереса к vivo в Drosophila. Рассмотрите возможность использования обоих подходов, поскольку эти два подхода дополняют друг друга.

  1. Выполнение функционального анализа с помощью спасательных экспериментов
    Примечание: Гетерологические спасательные эксперименты вDrosophilaс помощью человеческих белков определить, является ли молекулярная функция двух ортолотовых генов были сохранены в течение 500 миллионов лет эволюции. Они также оценивают функцию варианта в контексте человеческого белка63. Хотя систематический анализ, изучающий сотни генных пар, не был зарегистрирован, несколько десятков генов человека и млекопитающих (например, мыши) способны заменить функциюDrosophilaГены13.
    1. При подходе, основанном на спасении, сначала определите, есть ли очевидные, scorable, и воспроизводимые фенотипы в LOF мутантов в мухи ортолог аортолог перед оценкой функций вариантов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущая литература по гену мухи является хорошим местом для данных шахты во-первых, и она может быть найдена с помощью баз данных, включая FlyBase и PubMed. Дополнительные базы данных, такие как MARRVEL, Monarch Initiative и Gene2Funcion, также полезны для сбора этой информации.
    2. Выполните глобальное исследование scorable фенотипов в гомозиготных и hemizygous (T2A-GAL4 аллель над молекулярно определенным хромосомным дефицитом животных, особенно если T2A-GAL4 аллель является первой мутацией, которая будет характеризоваться для конкретного гена. Оцените фенотипы, такие как летальность, бесплодие, долговечность, морфологические (например, размер и морфология глаза) и поведение (например, ухаживания, полет, альпинизм и дефекты чувствительности челки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если Есть нет основных фенотипов, выявленных с этого первичного экрана, более тонкие фенотипы, такие как неврологические дефекты, измеренные электрофизиологических записей могут быть использованы, если они высоко воспроизводимы и конкретные. Например, функциональные исследования с использованием электроретинограммы (ERG) описаны в шаге 3.2.3. Если не обнаруживается какой-либо фенотип, перейдите на раздел 3.2 и выполните функциональное исследование на основе переэкспрессии.
    3. После того, как scorable фенотип определяется в мухе LOF мутант, проверить ли ссылка человека cDNA может заменить функцию мухи ортолога, пытаясь использовать человека cDNA, чтобы спасти мутанта летать линии. Фенотипический асси, который будет проводиться здесь, зависит от результатов шага 3.1.2 и будет специфичен для изучаемого гена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если "гуманизация" гена мухи является успешным, в настоящее время существует платформа для сравнения эффективности спасения для варианта интереса по сравнению с эталонным аналогом. Спасение видел со ссылкой человека cDNA не должны быть совершенными. Частичное спасение мухи мутант фенотипа с помощью человеческого cDNA по-прежнему обеспечивает точку отсчета для выполнения сравнительных исследований с использованием варианта штамма кДНК человека.
    4. Используя систему анализа, выбранную в шаге 3.1.2, сравните наблюдаемое спасение со ссылкой на кДНК человека с наблюдаемым спасением с вариантом человеческой кДНК, чтобы определить, имеет ли вариант интереса последствия для гена интереса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вариант человеческой кДНК выполняет хуже, чем ссылка аллель, это говорит о том, что вариант интереса является вредным для функции белка. Если вариант и ссылка не могут быть функционально различимы, то 1) аллель может быть изоморф (вариант, который не влияет на функцию белка) или 2) анализ не является достаточно чувствительным, чтобы обнаружить тонкие различия.
    5. Если вариант оказывается вредным аллелем, то дальнейшую оценку экспрессии и внутриклеточной локализации эталонных и вариантных белков, представляющих интерес в vivo через западную помотку, иммунофлюоресцентное окрашивание, или другие методы93.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если UAS-человеческий cDNA генерируется из открытого клона в векторе pGW-HA.attB, используйте анти-HA антитела для выполнения этих биохимических и клеточных анализов. Если оригинальный клон является закрытым клоном, проверьте, могут ли коммерческие антитела против человеческих белков использоваться для этих анализов. Разница в уровнях экспрессии и внутриклеточной локализации может показать, как вариант интереса влияет на функцию белка.
  2. Выполнение функционального анализа с помощью исследований переэкспрессии
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повсеместный или ткани конкретных переэкспрессии человека cDNAs в противном случае диких летмующих может предоставить информацию, которая дополняет спасательные эксперименты, обсуждаемые в разделе 3.1. В то время как спасательные анализы в первую очередь предназначены для обнаружения вариантов LOF (аморфных, гипофофических), анализы на основе переэкспрессии могут также выявить варианты усиления функций (GOF), которые труднее оценить (гиперморфные, антиморфные, неоморфные).
    1. Выберите набор драйверов GAL4, чтобы переэкспрессировать интерес у человека cDNA. Ряд вездесущих и тканевых/сценических драйверов GAL4 можно приобрести в государственных фондовых центрах (например, BDSC), некоторые из которых используются чаще, чем другие. Сначала сосредоточьтесь на вездесущих драйверах и легко разослательных фенотипах (летальность, стерильность, морфологические фенотипы), затем перейдите к тканевым драйверам и более специфическим фенотипам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверить выражение драйверов GAL4 с помощью строки репортера (например, UAS-GFP), чтобы подтвердить шаблоны выражений перед использованием в экспериментах.
    2. Выразить ссылку и вариант человеческого cDNAs с использованием того же драйвера в том же состоянии (например, температура) путем пересечения 3-5 девственных женщин из линии GAL4 (например, ey-GAL4 для глаз имитального выражения диска) с 3-5 мужчин мух из линий UAS ,например, UAS-TBX2 (кв) или UAS-TBX2 (p.R305H) для примера, показанного в разделе 4.2 в одном флаконе.
      1. Перенесите кресты каждые 2-3 дня, чтобы иметь много животных, вычеркиваемых из одного креста.
    3. Изучите потомство и обнаружите любые различия между эталонными и вариантными штаммами (например, морфологией глаз) под микроскопом вскрытия. Изображение мух с помощью камеры, прикрепленной к микроскопу вскрытия для документирования фенотипа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если фенотип виден только в ссылке, но не в строке варианта, то вариант может быть аморфным или сильным гипоморфным аллелем. Если фенотип виден в обоих генотипах, но ссылка вызывает более сильный дефект, то вариант может быть мягким до слабого гипоморфного аллеля. Если ссылка не показывает фенотип или только показывает слабый фенотип, но вариант показывает сильный дефект, то вариант может быть аллелем GOF.
    4. Если фенотип не виден в стандартных условиях культуры (RT или при температуре 25 градусов по Цельсию, то установите кресты при различных температурах в диапазоне 18-29 градусов по Цельсию, так как система UAS/GAL4, как известно, чувствительны к температуре64,65). Как правило, экспрессия трансгенов UAS выше при более высоких температурах.
  3. Выполняйте дополнительные функциональные исследования, связанные с генами и интересующий населенность белка.
    Примечание: В дополнение к изучению общих дефектов, система анализов может быть выбрана для зондирования молекулярных функций гена и варианта. В одном примере, обсуждаемом в репрезентативных результатах (TBX2случае), записи ERG были использованы для того чтобы обусловить влияния варианта на функции фоторецептора, в виду того что ген лету интереса (bifid) были изучены широко в контексте развития визуальной системы. Подробные протоколы для ERG вDrosophilaможно найти в том виде, в каком было опубликовано ранее66,67,68.
    1. Генерировать мух для проверки на функциональные дефекты в зрительной системе. Крест девственных женщин от родопсина 1 (Rh1)-GAL4 линии для мужчин со ссылкой или вариант Омской кДНК трансгенов, чтобы выразить человеческие белки, представляющие интерес в R1-R6 фоторецепторов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крест 3-5 девственных самок до 3-5 самцов летит в одном флаконе и передать кресты каждые 2-3 дня, чтобы иметь много животных eclosing от одного креста. Все кресты должны храниться в инкубаторе, установленном при экспериментальной температуре, для получения последовательных результатов.
    2. Как только мухи начинают приседать (при 25 градусах Цельсия, 10 дней после установки первоначального креста), соберите потомство(Rh1-GAL4/) UAS-человек cDNA / )в свежие флаконы и поместить их обратно в инкубатор установлен при экспериментальной температуре в течение дополнительных 3 дней для визуальной системы, чтобы созреть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя ERG может быть выполнена на 1-2 дней старых мух, вновь закрытых мух может иметь большие колебания в их ERG сигнала. Если желательно изучить возрастной фенотип, эти мухи могут быть выдержаны в течение нескольких недель до тех пор, пока они регулярно (например, каждые 5 дней) передаются в новый флакон, чтобы избежать утопления во влажной пище.
    3. Подготовка мух для записи ERG путем первого обезвреживания мух с использованием CO2 или размещения их в флакон на льду. Аккуратно приклейте одну сторону мухи к стеклянному микроскопу слайда, чтобы обездвижить их.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько ссылок и вариантов мух могут быть приклеены к одному слайду. Поместите все мухи примерно в той же ориентации с одним глазом быть доступным для записи электрода. Будьте осторожны, чтобы не получить клей на глаз и оставить хоботок бесплатно.
    4. Подготовьте записи и эталонные электроды. Поместите 1,2 мм стеклянный капилляр в иголку и активируйте. Разбейте капиллярную трубку, чтобы получить два резких конические электроды. Полученные электроды должны быть полыми и иметь окончательные диаметры 0,5 мм.
    5. Заполните капилляры сольным раствором (100 мМ NaCl), убедившись, что нет пузырьков воздуха. Сдвиньте стеклянные капилляры над электродами серебряной проволоки (как записывающий электрод, так и эталонный электрод, см. Рисунок4) и защитите капилляры на месте.
    6. Нарежьте стимулятор и усилитель. Подробную настройку можно найти в Lauwers, и др.67. Установка UDN Drosophila MOSC состоит из оборудования, указанного в разделе материалов.
      1. Установите усилитель на 0,1 Гц фильтр высокого прохода, 300 Гц фильтр низкопроходимых, и 100 усиления.
      2. Установите стимулятор до 1 с периода, 500 мс ширина импульса, 500 мс задержка импульса, режим запуска, и 7 Amp.
      3. Подготовьте источник света для фотостимуляции. Используйте галогенный источник света для активации фоторецепторов мухи.
      4. Подготовьте программное обеспечение для записи на компьютере, подключенном к настройке ERG. Создайте протокол стимуляции с моделью приобретения "фиксированные события длины" и 20 s продолжительность.
    7. Акклиматизировать мух и полностью темноту, прежде чем начать записи ERG. Поместите мух в полную темноту, по крайней мере 10 минут до начала эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку мухи не могут обнаружить красный свет, используйте источник красного света в период темного привыкания.
    8. Поместите слайд, содержащий мух, на аппарат записи и переместите микроманипуляторы, несущие эталонные и записывающие электроды, в точку, близкую к интересной мухе на слайде. Следите за кончиком электрода и аккуратно поместите эталонный электрод в грудную клетку мухи (проникайте в кутикулу). После того, как эталонный электрод вставляется, поместите звукозаписывающий электрод на поверхность глаза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное положение этого эталонного электрода не оказывает существенного влияния на сигнал ERG. Электрод записи должен быть помещен на поверхности глаза, так как ERG является полевой потенциальной записью, а не внутриклеточной записью. Надлежащее давление, применяемое к записи электрода вызывает небольшой ямочка без проникновения в глаз.
    9. Выключите все огни еще на 3 мин, чтобы акклиматизировать сяхов в темную среду.
    10. Настройка программного обеспечения для записи и начать запись сигнала. При использовании галогенного источника света с ручным затвором включите источник света с закрытым затвором. Начните запись сигнала.
    11. Разоблачить летать глаза на свет, открывая и закрывая затвор каждые 1 с для 20 s продолжительность одного запуска.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выключение /выключение галогенного источника света можно управлять вручную или запрограммировать, чтобы стать автоматизированным с помощью белого источника светодиодного света. Более надежная и надежная ERG может быть получена с помощью галогенного источника света по сравнению с белым светом LED, вероятно, из-за более широкого спектра света, испускаемого из галогенного источника света.
    12. Запись ERGs от всех мух, которые установлены на стеклянной горке. Выполняйте ERGs от 15 мух на генотип в состоянии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые параметры, которые могут быть изменены, чтобы найти условие, которое показывает надежные различия между ссылкой и вариантом cDNAs может включать температуру, возраст или условия окружающей среды (например, воспитанный в светло-темном цикле или постоянном свете / темноте).
    13. Выполните анализ данных: сравните ERG со ссылкой, вариантом и элементами управления, чтобы определить, есть ли различия. Оцените данные ERG для изменений в переходных, деполоризация, внепереходных, и repolarization69 (Рисунок 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Деполяризация и реполяризация отражают активацию и инактивацию каскада фототрансдукции в фоторецепторах, в то время как на- и вне переходных являются мерами деятельности пост-синапических клеток, которые получают сигналы от фоторецепторов. Снижение амплитуды и измененная кинетика реполяризации часто связаны с дефектами с функцией фоторецепторов и здоровьем, в то время как дефекты в на-и-переходных встречаются у мутантов с дефектным развитием синапса, функцией или обслуживанием 70.
    14. При выявлении различий в фенотипах ERG с переэкспрессией эталонных против варианта человеческих cDNA, определить, является ли этот электрофизиологический фенотип связан со структурными и ультраструктурными дефектами в фоторецепторах и их синапсы, выполняя гистологический анализ и передачу электронной микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшее обсуждение интерпретации дефектов ERG и структурного/ультраструктурного анализа было ранее описано69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Функциональное исследование de novo Missense Variant в EBF3 связано с фенотипами нейроразвития
У 7-летнего мужчины с фенотипами нейроразвития, включая гипотонию, атаксию, глобальную задержку развития и выразительное нарушение речи, врачей и генетиков человека в Национальном проекте недиагностированных болезней здравоохранения (UDP) определены de novo missense вариант (p.R163 ) в EBF3 (Ранний B-Cell Factor 3)15, ген, который кодирует COE (Collier/Olfactory-1/Early B-Cell Factor) фактор транскрипции семьи. Это дело было передано в УДН В марте 2016 года для проведения функциональных исследований. Чтобы оценить, является ли этот ген хорошим кандидатом для этого дела, MOSC собрал генетическую и геномную информацию человека от OMIM, ClinVar, ExAC (в настоящее время расширендо за gnomAD), Geno2MP, DGV и DECIPHER. Кроме того, ортолотусы гены ключевых видов МО были идентифицированы с помощью инструмента DIOPT. Затем были получены экспрессионно-экспрессионные данные генов и фенотипическая информация из отдельных баз данных МО (например, Wormbase, FlyBase, ЗФИН, МГИ). Анализ информатики, проведенный для EBF3 и других новаторских исследований в UDN MOSC, лег в основу более позднего развития ресурса MARRVEL30.

Информация, собранная с помощью этой методологии, показала, что EBF3 не был связан с каким-либо известным генетическим заболеванием человека на момент анализа, и был сделан вывод о том, что вариант p.R163 был хорошим кандидатом, основанным на следующей информации. (1) Этот вариант ранее не сообщалось в базах данных контроля населения (ExAC) и болезни населения базы данных (Geno2MP), указывая, что это очень редкий вариант. (2) На основе ExAC, pLI (вероятность непереносимости LOF) оценка этого гена составляет 1,00 (pLI оценки варьируются от 0,00-1,00). Это указывает на то, что существует избирательное давление против вариантов LOF в этом гене в общей популяции и предполагает, что гаплоинстоцификция этого гена может вызвать болезнь. Для получения дополнительной информации о pLI оценка и его интерпретации, сопровождающих MARRVEL учебник статьи в JoVE31 и связанных с ними документов представить подробную информацию30,71.

Вариант p.R163 также считался хорошим кандидатом, потому что (3) он находится в эволюционно сохраненной днк-связной области этого белка, предполагая, что он может повлиять на связывание ДНК или другие белковые функции. (4) Остатки p.R163 эволюционно сохранены от C. elegans и Drosophila к людям, предлагая что оно может быть критически для протеина функционального через виды. (5) EBF3 ортолологов были вовлечены в развитие нейронов в нескольких MO72 в том числе C. elegans73, Drosophila74, Xenopus75, и мышей76. (6) Во время развития мозга у мышей, Ebf3 было показано, что функция ниже по течению Arx (Aristaless связанных homebox)77, ген, связанный с несколькими эпилепсии и интеллектуальной инвалидности синдромы у людей78. Таким образом, эти данные вместе свидетельствуют о том, что EBF3, скорее всего, имеет решающее значение для развития человека и что вариант p.R163 "может иметь функциональные последствия.

Чтобы оценить, влияет ли p.R163 на функцию EBF3, линия T2A-GAL4 для узлов (kn;муха-ортолог человека EBF379) была создана через RMCE кодирующего intronic MiMIC вставки15. Линия KNT2A-GAL4 является рецессивной смертельной и не в состоянии дополнить летальность классического аллеля kn (kncol-1), а также молекулярно определенный дефицит, который охватывает kn (Df)BSC429»80 . Выражение моделей GAL4 также отражает ранее сообщалось моделей выражения kn в головном мозге, а также в крыле воображаемый диск15. UAS трансгенных мух были затем созданы, чтобы позволить выражение ссылки и вариант человека EBF3 cDNA, а также дикого типа летать кДНК. Все три белка были помечены тегом C-терминала 3xHA. Важно отметить, что UAS дикого типа летать кн (кн)или ссылки человека EBF3 (EBF3)трансгены спасли летальность knT2A-GAL4/Df(2R)BSC429 в аналогичной степени ( Рисунок 3C,левая панель)81.

В отличие от этого, UAS-человеческий Трансген EBF3 с вариантом p.R163 (EBF3p.R163 )не смог спасти этого мутанта, предполагая, что вариант p.R163 влияет на функцию EBF3 in vivo15. Интересно, что при оценке с использованием анти-HA антитела, EBF3p.R163 "белок был успешно выражен в тканях мухи, и его уровни и субклеточной локализации (в первую очередь ядерной) были неотличимы от EBF3 и Кн. Это говорит о том, что этот вариант не вызывает фенотипа LOF из-за нестабильности белка или неправильной локализации. Для дальнейшей оценки того, влияет ли вариант p.R163 на функцию транскрипционной активации EBF3,вклеткахHEK293 был проведен ассс на основе люциферазы репортера. Этот эксперимент в культивированных человеческих клетках показал, что вариант EBF3p.R163 не смог активировать транскрипцию конструкций репортера, поддерживая модель LOF, полученную в ходе экспериментов дрозофилы.

Параллельно с экспериментальными исследованиями, сотрудничество с врачами, генетиками человека и генетическими консультантами в BCM привело к выявлению еще двух лиц с аналогичными симптомами. Один пациент нес идентичный вариант p.R163, а другой нес вариант неправильности, который повлиял на тот же остаток (p.R163L). Вариант p.R163L также не смог спасти муху-мутант93, предполагая, что этот аллель также повлиял на функцию EBF3. Интересно, что эта работа была опубликована спина к спине с двумя независимыми человеческими генетическими исследованиями, которые сообщили о дополнительных лиц с de novo missense, ерунда, кадровое смещение, и сплайсинг варианты в EBF3 связаны с аналогичными нейроразвития фенотипов82,83. Впоследствии были опубликованы три дополнительных документа, в которых сообщалось о дополнительных случаях de novo EBF3 и о снятии номеров84,85,86. Этот новый синдром нейроразвития в настоящее время известен как Гипотония, Атаксия, и синдром задержки развития (HADDS, MIM #617330) в Интернете Менделеев Наследие в человеке (OMIM, авторитетная база данных для генотипа-фенотипа отношений у людей).

Функциональное исследование доминирующо унаследованного Варианта Missense в TBX2, связанных с синдромным сердечно-сосудистым и скелетным расстройством развития
В небольшой семье, пораженной перекрывающимися спектрами краниофациальной дисморфизма, сердечных аномалий, скелетной пороков развития, иммунодефицита, эндокринных аномалий и нарушений развития, клинический сайт UDN Duke определил вариант неправильности (p.R20) в TBX2, который отделяется с фенотипами болезни87. Трое (сын, дочь, мать) из четырех членов семьи страдают от этого состояния, и сын проявил самый тяжелый фенотип. Клинически, он встретил диагноз "полный синдром ДиДжорджа", состояние часто вызвано гаплоинсточки TBX1. Хотя не было никаких мутаций, выявленных в TBX1 в этой семье, клиницисты и генетики человека сосредоточены на вариант в TBX2, так как предыдущие исследования на мышах показали, что эти гены имеют перекрывающиеся функции во время развития88 . TBX1 и TBX2 оба принадлежат к T-box (TBX) семейство транскрипционных факторов, которые могут выступать в качестве транскрипционных репрессоров, а также активаторы в зависимости от контекста.

Ранее варианты в 12 из 17 членов семейства TBX генов были связаны с болезнями человека. Мосгорсуд решил экспериментально использовать этот вариант на основе следующей информации, собранной через MARRVEL и другие ресурсы. (1) Этот вариант был сообщен только раз в когорте 90,000 «контрольных» индивидуалов в gnomAD (этот вариант был отфильтрочен вне в представлении значения по умолчанию, вероятно из-за низкого чтения охвата). Учитывая более мягкий фенотипический представление матери, это все еще можно рассматривать как редкий вариант, который может быть ответственным за фенотипы болезни. (2) Оценки pLI TBX2 в ExAC/gnomAD составляют 0,96/0,99, что является высоким (максимум 1,00 евро). Кроме того, оценка o/e (наблюдаемая/ожидаемая) оценка LOF в gnomAD составляет 0,05 (только 1/18.6 ожидаемый вариант LOF наблюдается в gnomAD). Эти номера предлагают что варианты LOF в этом гене выбраны против в общей населенности.

Кроме того, (3) p.R20 эволюционно сохраняется от C. elegans и Drosophila к людям, предполагая, что это может быть важным остатком для функции TBX2. (4) Несколько программ предсказывают, что вариант, вероятно, повреждения (полифен: возможно / вероятно повреждения, SIFT: вредные, CADD оценка: 24,4, REVEL оценка: 0,5). (5) МО мутантов проявляют дефекты в тканях, пострадавших у пациентов (например, нокаут мышей, проявляющих дефекты в сердечно-сосудистой системе, пищеварительной / алиментной системы, краниофациальной, конечностей / цифры). Таким образом, вместе с биологическими связями между TBX1 и TBX2 и фенотипические связи между этими пациентами и синдром диДжорджа, было оптимально для выполнения функциональных исследований вариантов в этом гене с использованием Drosophila.

Чтобы оценить, влияет ли вариант p.R20 на функцию TBX2, линияT2A-GAL4 в бифиде (би; ортолог дрозофилы человека TBX2),была создана через RMCE кодирующего интронного MiMIC (Рисунок 2)87. Этот аллель, биT2A-GAL4, был рецессивный pupal смертельной и вел себя как сильный мутант LOF, похожий на ранее сообщалось bi LOF аллелей (например, биD2, биD4; Рисунок 2 E). Летальность этих классических и вновь созданных би аллелей была спасена геномной спасательной конструкцией стоимостью 80 кБ, несущей весь локус би, что указывает на то, что эти реагенты действительно являются чистыми аллелями LOF. Выражение шаблон GAL4 в биT2A-GAL4 линии также хорошо сочетается с ранее сообщалось моделей би выражения в нескольких тканях, в том числе в крыле воображаемый диск (Рисунок 2D).

Параллельно с этим были созданы Трансгенные линии UAS для т.д. с референтными или вариантными последовательностями (p.R20). К сожалению, ни один из трансгенов не смог спасти летальность линии T2A-GAL4. Важно отметить, что дикий тип летать UAS-bi transgene также не удалось спасти биT2A-GAL4 аллель, вероятно, из-за дозировки чувствительности этого гена. Действительно, переэкспрессия UAS-bi и UAS-TBX2вызвала некоторую степень летальности при переэкспрессии у дикого животного. Этот токсический эффект переэкспрессии би/TBX2 был использован в качестве функционального асссеа для оценки того, может ли вариант p.R20 повлиять на функцию TBX2. Так как ген Drosophila bi был широко изучен в контексте зрительной системы ,ген также известен как оптомоторный слепой (omb) , фенотипы, связанные с зрительной системой, были тщательно исследованы. Когда эталонTBX2 был выражен с помощью ey-GAL4 драйвер, который выражает UAS-трансгенов в глази и части мозга, имеющие отношение к зрительной системе, 85% летальности (рисунок3C, правая панель) и значительные уменьшение размера глаз(рисунок 4B) наблюдались. Этот фенотип был сильнее, чем фенотип наблюдается, когда дикий тип летать UAS-bi transgene был выражен, предполагая, что человек TBX2 является более вредным для мухи, когда overexpressed.

Интересно, что p.R20 "TBX2 был менее мощным в причинении летальности (Рисунок 3C, правая панель) и в индуцировании небольшой фенотип глаз (Рисунок 4B) с использованием того же драйвера при идентичном состоянии87, предлагая что вариант влияет на функцию протеина. Кроме того, функция фоторецепторов переэкспрессии ссылки и вариант TBX2 с использованием другого драйвера GAL4, (Rh1-GAL4), который конкретно выражает Трансгены УАЗ в R1-R6 фоторецепторов, показал, что вариант TBX2 выставлены гораздо мягче ERG фенотип по сравнению с ссылкой TBX2 (Рисунок 4B)87. Интересно, что большая часть белка p.R20'TBX2 все еще была найдена в ядре, подобно эталонного белка, предполагая, что вариант не влияет на ядерную локализацию. Luciferase основе транскрипционного подавления асссе в HEK293T клетки показали, что p.R20 "не удалось эффективно подавлять транскрипцию репортер астративные конструкции с palindromic Т-бокс сайтов87. Кроме того, снижение уровня белка TBX2p.R.R20 былоотмечено по сравнению с TBX2 , предполагая, что вариант может повлиять на перевод или стабильность белка TBX2, что, в свою очередь, влияет на его изобилие в клетке.

Дополнительные пациенты с редкими вариантами в TBX2 были определены врачами на UDN Duke клинического сайта параллельно с этими экспериментальными исследованиями.  8-летний мальчик с de novo missense (p.R305H) вариант из несвязанных семьи выставлены многие из особенностей, найденных в первой семье87. Дополнительные функциональные исследования в Drosophila и человеческих клеточных линий показали, что вариант p.R305H также влияет на функцию TBX2 и уровни белка, что убедительно свидетельствует о том, что дефекты в этом гене, вероятно, лежат в основе многих фенотипов, найденных в двух семьях. Это расстройство было недавно куратором как "позвоночных аномалий и переменной эндокринной и Т-клеточной дисфункции" (VETD, MIM #618223) в OMIM. Идентификация дополнительных лиц с повреждениями вариантов в TBX2 с перекрывающимися фенотипами имеет решающее значение для понимания полного спектра генотип-фенотип отношений для этого гена в болезни человека.

Figure 1
Рисунок 1 : Схема инъекций и пересечения для генерации линий UAS-human cDNA и T2A-GAL4. (A) Поколение UAS-человеческих трансгенов cDNA через микроинъекции и кресты. В качестве примера приводятся схемы пересечения для интеграции трансгенов во второй стыковочный участок (VK37) с использованием мужских мух первого и второго поколения. После инъекции трансгенной конструкции кДНК человека (pGW-HA.attB) в ранние эмбрионы, которые содержат источник зародышевой линии интегразы ЗС31 (помечены 3xP3-GFP и 3xP3-RFP) и стыковочным участком VK37 с пожелточным цветом(y маркера, трансгенные события могут сопровождаться белым минигеном, который присутствует в трансгенном переносчике. Рекомендуется перечеркить интегрозы NoC31, выбрав против мух с GFP и RFP. Окончательный стабильный запас может быть сохранен как гомозиготы или как сбалансированный запас, если хромосома несет второй сайт смертоносных / стерильных мутации хит. Наличие второго участка смертоносных/стерильных мутаций на трансгенных конструкциях обычно не влияет на исход функциональных исследований, пока эти трансгены используются в гетерозиготном состоянии(рисунок 3). (B) Поколение линий T2A-GAL4 через микроинъекцию и кресты. В качестве примера приводится схема пересечения для преобразования второй хромосомы MiMIC в элемент T2A-GAL4. Путем микроинъекционирования вектора экспрессии для integrase и RMCE вектор для T2A-GAL4 (pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70, выбирается соответствующая рамка для чтения MiMIC интереса. Смотрите следующие документы для деталей57,59 в эмбрионы проведения MiMIC в кодирования интрон в гене интереса, можно преобразовать оригинальный MiMIC в линии T2A-GAL4. Рисунок 2 А показывает схематическую схему преобразования RMCE. Событие преобразования может быть выбрано путем скрининга против y q маркера в оригинальной кассете MiMIC60. Поскольку RMCE может происходить в двух направлениях, только 50% успешного события преобразования приводит к успешному производству GAL4, который может быть обнаружен репортером UAS-GFP в следующем поколении. Окончательный стабильный запас может быть сохранен как homozygotes или как сбалансированный запас, если LOF гена является смертельным / стерильным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Преобразование элементов MiMIC в линии T2A-GAL4 через RMCE. (A) Интеграза СК31 облегчает рекомбинацию между двумя участками attP в мухе (вверху) и двумя участками attB, фланговыми кассетой T2A-GAL4, показанной как круговой вектор (внизу). (B) Успешные события RMCE приводят к потере выбираемого маркера (желтый) и вставке кассеты T2A-GAL4 в той же ориентации гена интереса. Так как событие RMCE может произойти в двух направлениях, только 50% реакции RMCE дает желаемый продукт. Продукт RMCE, вставленный в противоположную ориентацию, не будет функционировать как аллель генной ловушки или экспресс GAL4. Направленность конструкции должна быть подтверждена с помощью секвенирования Sanger. (C) Транскрипция (вверху) и перевод (внизу) гена интереса водит к поколению усеченной мРНК и протеина из-за сигнала polyA присытствыяя на 3' конце кассеты T2A-GAL4. T2A является рибосомным пропускным сигналом, который позволяет рибосоме остановиться и начать перевод после этого сигнала. Это используется для создания элемента GAL4, который не ковалентно прилагается к усеченный ген продукт интереса. GAL4 войдет в ядро и облегчит транскрипцию трансгенов, которые находятся под контролем элементов УАЗ. UAS-GFP может быть использован в качестве репортёра экспрессии генов, а УАЗ-человеческая кДНК может быть использована для спасательных экспериментов с помощью генной «гуманизации». (D) Показано пример элемента T2A-GAL4 в би-вождения выражение UAS-GFP (вверху). Этот шаблон выражения напоминает ранее сгенерированную линию ловушки усилителей для того же гена (biomb-GAL4;дно). (E) Сравнение T2A-GAL4 аллель би с ранее сообщалось LOF би аллелей. Эта цифра была принята и изменена из предыдущих публикаций57,87. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Функциональный анализ человеческих вариантов с использованием спасательных (левых) и исследований на основе переэкспрессии (справа). (A) (левая панель): Функция вариантов EBF3 была оценена с помощью спасательного анализа узла мухи (kn) LOF аллелей, сосредоточив внимание на летальности/жизнеспособности; (правая панель): функция вариантов в TBX2 была оценена путем выполнения переэкспрессии трансгенов тб22 человека у мух дикого типа, уделяя особое внимание летальности/жизнеспособности, морфологии глаз и фенотипов электрофизиологии (рисунок4) . (B) Пересечение схем для получения мух для тестирования в функциональных исследованиях. Рекомендуется всегда использовать нейтральный элемент UAS (например, UAS-lac, UAS-GFP)в качестве контрольного эксперимента. (C) Представитель результаты функциональных исследований EBF3p.R163 и TBX2p.R20 "варианты, соответственно, наряду с соответствующими контрольными экспериментами, которые необходимы для интерпретации результатов. Как спасательные анализ, так и исследования переэкспрессии показывают, что варианты ведут себя как аморфные или гипоморфные аллели. Данные о летальности/жизнеспособности, приведенные здесь, основаны на экспериментальных данных, представленных в предыдущих публикациях15,87. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : Функциональный анализ редкого варианта неправильности в человеческом TBX2 на основе морфологии глаз и электроретинограммы в Drosophila. (A) Схематическое изображение, показывающее типичное размещение записи и эталонных электродов на глазу мухи, наряду с репрезентативной электроретинограммой записи с четырьмя основными компонентами (на переходных, деполяризация, вне переходных, реполяризации). (B) TBX2 вариант (p.R20 ") функционирует как частичный аллель LOF на основе исследований экспрессии в летучем глазу с использованием драйверов GAL4, специфичных для зрительной системы (ey-GAL4 и Rh1-GAL4). Это показало, что эталонный TBX2 вызвал сильный морфологический и электрофизиологический фенотип по сравнению с вариантом белка. (Верхние панели): серьезное уменьшение размера глаз наблюдается при переэкспрессии UAS-TBX2- с ey-GAL4. UAS-TBX2p.R20 " Привод с ey-GAL4 также вызывает меньше глаз, но фенотип гораздо мягче. (Нижние панели): когда UAS-TBX2- выражается в основных фоторецепторах R1-R6 с использованием Rh1-GAL4, происходит потеря на- и внепереходных, снижение деполяризации и большая аномальная длительная деполяризация после потенциального (PDA) фенотипа, который не видел в управлении мух. Эти фенотипы не так серьезны, как когда UAS-TBX2p.R20" выражается с помощью того же Rh1-GAL4. Эта цифра была принята и изменена из предыдущих публикаций69,87. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Цель Инструмент Url
Функция варианта
алгоритмы прогнозирования
Полифен-2
Просеять
CADD
ПРОВАН
МутацияВкус
Revel
http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2
https://sift.bii.a-star.edu.sg
https://cadd.gs.washington.edu
http://provean.jcvi.org/index.php
http://www.mutationtaster.org
https://sites.google.com/site/revelgenomics
Редкие и недиагностированные
исследования заболеваний
Консорциумов
UDN
RDMM
ИРУД
SOLVE-RD
АФГН
https://undiagnosed.hms.harvard.edu
http://www.rare-diseases-catalyst-network.ca
https://irudbeyond.nig.ac.jp/en/index.html
http://solve-rd.eu
https://www.functionalgenomics.org.au
Интегративная база данных для
человек и модель
Информация о организме
МАРРВЕЛ
Монархическая инициатива
Gene2Function
Фенологи
http://marrvel.org
https://monarchinitiative.org
http://www.gene2function.org
http://www.phenologs.org
Генетика человека и
Базы данных геномики
ОМИМ
КлинВар
ExAC
гномАД
Геномп
DGV
Расшифровать
https://www.omim.org/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
http://exac.broadinstitute.org/
http://gnomad.broadinstitute.org/
http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/#/
http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home
https://decipher.sanger.ac.uk/
Инструмент идентификации ортолога ДИОПТ https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
Модель Ный организм
Базы данных и биомедицинские
Поиск литературы
WormBase (C elegans)
FlyBase (Дрозофила)
ФИН (Зебрафиш)
MGI (Мышь)
Pubmed
https://www.wormbase.org
http://flybase.org
https://zfin.org
http://www.informatics.jax.org
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
Генетика и белок
базы данных взаимодействия
Строка
Туман
https://string-db.org
http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/
Структура протеина
базы данных и
инструменты моделирования
WWPBD
ШВЕЙЦАРСКАЯ МОДЕЛЬ
Моделист
Фире2
http://www.wwpdb.org
https://swissmodel.expasy.org/
https://salilab.org/modeller/
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2
Сватовпроизводство пациентов
Платформ
Обмен сватами
GeneMatcher
Архив АГА
спичечный коробок
Расшифровать
MyGene2
Phenome Центральной
http://www.matchmakerexchange.org
https://www.genematcher.org
https://mme.australiangenomics.org.au/#/home
https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox
https://decipher.sanger.ac.uk
https://www.mygene2.org/MyGene2
https://phenomecentral.org
Человеческая стенограмма
аннотация и кДНК
информация о клонах
Коллекция генов млекопитающих
Энсембл
Рефсек
https://genecollections.nci.nih.gov/MGC
http://useast.ensembl.org
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

Таблица 1: Интернет-ресурсы, связанные с этим протоколом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Экспериментальные исследования с использованием Drosophila melanogaster обеспечивают надежную систему ассеев для оценки последствий связанных с болезнью человеческих вариантов. Это связано с большим объемом знаний и разнообразных генетических инструментов, которые были созданы многими исследователями в области летать за последнее столетие89. Как и любая другая экспериментальная система, однако, важно признать оговорки и ограничения, которые существуют.

Пещеры, связанные с майнингом данных
Хотя первым шагом в этом протоколе является добыча баз данных для информации, относящейся к гену, представляющим интерес, важно использовать его только в качестве отправной точки. Например, хотя в силико предсказание функции варианта обеспечивает ценную информацию, эти данные всегда следует интерпретировать с осторожностью. Есть некоторые случаи, в которых все основные алгоритмы предсказывают, что человеческий вариант является доброкачественным, но функциональные исследования в Drosophila ясно продемонстрировали разрушительный характер такого варианта24. Аналогичным образом, хотя белково-белковые взаимодействия, совместное выражение и структурные данные моделирования являются проницательными фрагментами информации, в этих больших наборах данных может присутствовать псевдопозитивная и псевдонегативная информация. Например, некоторые из ранее выявленных или прогнозируемых белково-белковых взаимодействий могут быть искусственными или рассматриваться только в определенных типах клеток и тканей.

Кроме того, может быть много ложных отрицательных взаимодействий, не отраженных в этих наборах данных, так как определенные белково-белковые взаимодействия являются переходными (например, ферментно-субстратные взаимодействия). Экспериментальная проверка имеет решающее значение для демонстрации того, что некоторые гены или белки генетически или физически взаимодействуют in vivo в биологическом контексте интереса. Аналогичным образом, структуры, предсказанные на основе моделирования гомологии, следует рассматривать как модель, а не решаемую структуру. Хотя эта информация может быть полезной, если будет установлено, что аминокислота, интересприсутствуюя, присутствует в структурно важной части белка, негативные данные не исключают возможности того, что вариант может быть разрушительным. Наконец, к ней следует относиться с информацией о генотипов-фенотипе, о которой ранее сообщалось, поскольку некоторая информация, засоренная в общедоступные базы данных, может быть неточной. Например, некоторая информация в базах данных МО основана на экспериментах, которые хорошо контролировались и проводились строго, в то время как другие могут поступать из большого экрана, без дальнейших последующих исследований и строгих мер контроля.

Эксперименты «Гуманизации» с использованием стратегии T2A-GAL4 не всегда успешны
В то время как спасательные и сверхэкспрессионные функциональные исследования с использованием кДН человека позволяют оценивать варианты в контексте человеческого белка, этот подход не всегда успешен. Если эталонная человеческая кДНК не может спасти фенотип мухи-мутанта, есть два вероятных объяснения. Первая возможность заключается в том, что человеческий белок нефункциональный или значительно снижает активность в контексте клетки мухи. Это может быть связано с 1) снижение экспрессии белка, стабильность, активность и / или локализации или 2) отсутствие совместимости с мухи белков, которые работают в многобелковом комплексе. Поскольку система UAS/GAL4 является чувствительной к температуре, мухи могут быть подняты при относительно высокой температуре (например, 29 градусов по Цельсию), чтобы увидеть возможность спасения в этом состоянии. Кроме того, uAS-fly cDNA конструкции и трансгена в качестве положительного контроля могут быть созданы. Если вариант интереса влияет на сохраненную аминокислоту, то подобный вариант можно ввести в cDNA лету для функционального изучения варианта в смысле ортолога лету. Хотя это не является необходимым, это очень помогает исследование в тех случаях, когда с помощью человеческой кДНК трансгенных линий дают отрицательные или неубедительные результаты(Рисунок 3).

Вторая возможность заключается в том, что экспрессия человеческого белка вызывает некоторую токсичность на уровне клеток или организма. Это может быть связано с антиморфной (например, действуя в качестве доминирующего отрицательного белка), гиперморфной (например, слишком большой активностью) или неоморфной (например, увеличение новой токсической функции, такой как агрегация белка, которая не всегда связана с эндогенной функцией гена процентов) эффекты. В этом случае сохранение мух при низкой температуре (например, 18 градусов по Цельсию) может облегчить некоторые из этих проблем. Наконец, Есть несколько сценариев, в которых переэкспрессия летать cDNA не может спасти муху T2A-GAL4 линии, как видно на примере TBX2, вероятно, из-за трикт дозировка зависимость гена продукта. Чтобы избежать переэкспрессии белка интерес, летать ген интерес может быть изменен непосредственно через CRISPR, геномные спасательные конструкции могут быть разработаны, который содержит вариант интереса, или спасательные эксперименты могут быть выполнены с помощью аллеля LOF21. Для небольших генов, "гуманизации" летать геномной спасательной конструкции можно рассматривать для тестирования человеческих вариантов, которые влияют на неконсервированные аминокислоты24. Таким образом, следует рассматривать альтернативные стратегии, когда эксперимент по гуманизации не позволяет проводить функциональную оценку варианта интереса.

Интерпретация отрицательных и положительных результатов
Если 1) как эталонный и вариант человека cDNAs спасти летать мутант фенотипов в аналогичной степени и 2) нет никакой разницы наблюдается во всех условиях испытания, то можно предположить, что вариант функционально неотличимы в Drosophila в Vivo. Важно отметить, однако, что эта информация не является достаточной, чтобы исключить, что вариант интереса является непатогенным, так как анализ Drosophila не может быть достаточно чувствительным или захватить все потенциальные функции гена / белка интерес отношение к людям. Положительные данные, с другой стороны, является убедительным свидетельством того, что вариант имеет пагубные последствия для функции белка, но этого данных по-прежнему недостаточно, чтобы претендовать на патогенность. Американский колледж медицинской генетики и геномики (ACMG) опубликовал набор стандартов и руководящих принципов для классификации вариантов в болезни человека связанных генов в "доброкачественные", "вероятно, доброкачественные", "вариант неизвестного значения (VUS)", "вероятно, патогенные", и "патогенный"90. Хотя эта классификация применяется только к установленным генам, связанным с болезнями, и не применима непосредственно к вариантам в "генах неопределенного значения" (GUS), все лица, участвующие в функциональных исследованиях человеческого варианта, настоятельно рекомендуется придерживаться этого руководства при представлении функции варианта отчетности.

Извлечение полезной биологической информации, когда ФЕнотипы MO не моделируют состояние болезней человека
Важно иметь в виду, что на основе чрезмерной экспрессии функциональных анализов имеют ограничения, тем более, что некоторые из фенотипов забил может иметь мало отношения к болезни состояние интереса. Аналогичным образом, фенотипы, которые оцениваются в ходе спасательных экспериментов, могут не иметь прямого отношения к болезни, представляющий интерес. Поскольку эти эксперименты проводятся вне эндогенных контекстов в беспозвоночной системе, их следует рассматривать не как модели заболеваний, а скорее как тест на генную функцию с использованием Дрозофилы в качестве «живой пробирки».

Даже если модель организма не имитирует состояние болезни человека, scorable фенотипы, используемые в спасательных экспериментах часто может обеспечить полезную биологическую информацию о состоянии болезни. Понятие "фенологи (неочевидные гомологисальные фенотипы)"91 может быть использовано для дальнейшего определения основных молекулярных связей между дрозофилой и человеческими фенотипами. Например, морфологические фенотипы в крыле мухи, грудной клетке, ноги и глаза являются отличными фенотипическими считываниями дефектов в Нотче, эволюционно сохранивемом пути, связанном со многими врожденными расстройствами, включая сердечно-сосудистые дефекты у людей62. Понимая молекулярную логику, лежащую в основе некоторых фенотипов в Дрозофиле,можно определить скрытые биологические связи между генами и фенотипами у людей, которые еще не поняты.

Непрерывная связь с клиническими сотрудниками
При работе с врачами для изучения функции редкого варианта, найденного у пациента, важно установить прочные отношения сотрудничества. Хотя клинические и основные биомедицинские исследователи могут разделять интересы в одних и тех же генах/генетических путях, существует большой культурный и языковой (например, медицинский жаргон, модельно-специфическая номенклатура) разрыв между клинической и научной областями. Сильные, основанные на доверии отношения между двумя сторонами могут быть построены на основе широкого общения. Кроме того, двунаправленная коммуникация имеет решающее значение для установления и поддержания этих отношений. Например, в двух случаях, описанных в разделе репрезентативных результатов, выявление дополнительных пациентов с аналогичными генотипами и фенотипами, а также последующее функциональное исследование имеют решающее значение для доказательства патогенности вариантов интереса. Даже при сильных функциональных данных, исследователи и клиницисты часто возникают трудности убедить человека генетиков, что вариант, выявленный в "n no 1" случаев является истинной причиной заболевания.

После того, как исследователь MO определяет, что вариант интереса наносит ущерб, очень важно, чтобы сообщить обратно клинических сотрудников как можно скорее, чтобы они могли активно пытаться определить соответствующие случаи путем сетей с другими врачами и человеческими генетиками. Такие инструменты, как Geno2MP «Генотипы менделей енотипов: деидентифицированная база данных из 9650 человек, зачисленных в Центр Менделейского университета по менделейской геномике41; включает пациентов и членов семьи, подозреваемых в имея генетические расстройства "можно искать, чтобы оценить лиц, которые могут иметь то же расстройство. Затем с ведущим врачом можно связаться с ним с помощью функции обмена сообщениями.

Кроме того, GeneMatcher может быть использован, который является сайт омрачания для клиницистов, основных исследователей и пациентов, которые разделяют интересы в тех же генах для выявления дополнительных пациентов, которые несут редкие варианты. Так как GeneMatcher является частью более широкой интегративной сети сватовства веб-сайтов под названием Matchmaker Exchange42, дополнительные базы данных по всему миру можно искать, в том числе австралийский геномики здравоохранения Альянс пациентов Архив, Широкий Matchbox , DECIPHER, MyGene2, и PhenomeCentral в одном GeneMatcher представления гена. Хотя участие в GeneMatcher возможно в качестве "исследователя", рекомендуется, чтобы основные ученые использовать этот сайт со своими клиническими сотрудниками, так как общение с другими врачами после матча требует определенного уровня медицинского Опыт.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Хосе Салазара, Джулию Ван и д-ра Карен Шульце за критическое прочтение рукописи. Мы признаем, д-р Нин Лю и Си Луо для функциональной характеристики TBX2 варианты обсуждаются здесь. Недиагностированные болезни Сети Модель Органы Скрининговый центр был поддержан через Национальные институты здравоохранения (NIH) Общий фонд (U54 NS093793). H. T. C. была дополнительно поддержана NIH-CNCDP-K12 и NINDS (1K12 NS098482) " , Американской академией неврологии (Неврология исследований грант), Берроуз Wellcome фонд (Карьера премии для медицинских ученых), Детское общество неврологии и детской неврологии фонда ( PERF Elterman грант), и NIH директора ранней независимости премии (DP5 OD026426). М. Ф.В. получил поддержку Фонда Симонса (Премия SFARI: 368479). S. Y. была также поддержана NIH (R01 DC014932), Фондом Симонса (Премия SFARI: 368479), Ассоциацией Альцгеймера (Новый грант исследователей: 15-364099), Наманским семейным фондом фундаментальных исследований и Фондом права Кэролайн Висс в Молекулярная медицина. Конфокальная микроскопия в BCM частично поддерживается NIH Grant U54HD083092 в Центр евразийных и опытно-конструкторских исследований (IDDRC) Neurovisualization Core.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l, Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , Forthcoming (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , Forthcoming (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer's Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , Forthcoming (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), Cambridge, England. 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, Clifton, N.J. 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, Clifton, N.J. 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , Forthcoming (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), Cambridge, England. 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE--Collier/Olf1/EBF--transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing and Wiley-Interscience. New York. (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

Генетика Выпуск 150 генетика человека и геномика Менделианские заболевания редкие и недиагностированные заболевания Сеть недиагностированных болезней Drosophila melanogaster вариант неизвестного значения VUS ген неопределенного значения GUS функциональный геномика трансгенные мухи система UAS/GAL4 T2A-GAL4 электроретинограмма ERG
В Vivo Функциональное исследование связанных с болезнями редких человеческих вариантов с использованием <em>дрозофилы</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao,More

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H. T., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter