Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

في فيفو دراسة وظيفية من المتغيرات البشرية النادرة المرتبطة بالأمراض باستخدام دروسوفيلا

Published: August 20, 2019 doi: 10.3791/59658
Automatic Translation
*1, *2, 1,3,4,5, 1,2,4, 1,2,4,5
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو تحديد تصميم وأداء التجارب في الجسم الحي في دروسوفيلا melanogaster لتقييم العواقب الوظيفية للمتغيرات الجينية النادرة المرتبطة بالأمراض البشرية.

Abstract

وقد أدى التقدم المحرز في تكنولوجيا التسلسل إلى جعل مجموعات البيانات المتعلقة بالجينوم الكامل ومجموعة البيانات الكاملة إمكانية الوصول إلى كل من التشخيص السريري والبحوث المتطورة في مجال علم الوراثة البشرية. على الرغم من أنه تم تطوير عدد من خوارزميات السيليكو للتنبؤ بمسببات الأمراض من المتغيرات المحددة في مجموعات البيانات هذه، فإن الدراسات الوظيفية حاسمة لتحديد كيفية تأثير المتغيرات الجينية المحددة على وظيفة البروتين، وخاصة بالنسبة للأخطاء المتغيرات. في شبكة الأمراض غير المشخصة (UDN) وغيرها من اتحادات البحوث الأمراض النادرة، وتستخدم الكائنات الحية النموذجية (MO) بما في ذلك Drosophila، C. elegans، حمار وحشي ، والفئران بنشاط لتقييم وظيفة المفترضة التي تسبب الأمراض البشرية المتغيرات. يصف هذا البروتوكول طريقة للتقييم الوظيفي للمتغيرات البشرية النادرة المستخدمة في مركز فحص الكائنات الحية النموذجية Drosophila Core of UDN. يبدأ سير العمل بجمع المعلومات البشرية ومعلومات MO من قواعد بيانات عامة متعددة، وذلك باستخدام مورد الويب MARRVEL لتقييم ما إذا كان من المرجح أن يساهم البديل في حالة المريض، فضلا عن تصميم تجارب فعالة على أساس المتاحة المعرفة والموارد. بعد ذلك، يتم إنشاء الأدوات الوراثية (على سبيل المثال، T2A-GAL4 وخطوط UAS-human cDNA) لتقييم وظائف المتغيرات ذات الاهتمام في دروسوفيلا. وعند تطوير هذه الكواشف، يمكن إجراء عمليات فحص وظيفية ذات شقين تستند إلى تجارب الإنقاذ والتعبير المفرط لتقييم وظيفة المتغيرات. في فرع الإنقاذ، يتم "أنسنة" جينات ذبابة الذاتية عن طريق استبدال جين دروسوفيلا التقويمية مع مرجع أو الجينات البشرية البديلة. في فرع التعبير المفرط، يتم دفع البروتينات البشرية المرجعية والبديلة بشكل خارجي في مجموعة متنوعة من الأنسجة. في كلتا الحالتين، يمكن استخدام أي نمط ظاهري قابل للتآكل (مثل الفتك، ومورفولوجيا العين، والفيزيولوجيا الكهربائية) كقراءة، بغض النظر عن مرض الفائدة. الاختلافات التي لوحظت بين الأليلات المرجعية والبديلة تشير إلى تأثير متغير محدد، وبالتالي من المحتمل أن تكون الإمراض. يسمح هذا البروتوكول بإجراء تقييمات سريعة في الجسم الحي للمتغيرات المسببة للأمراض البشرية المفترضة للجينات ذات الوظائف المعروفة وغير المعروفة.

Introduction

المرضى الذين يعانون من أمراض نادرة غالبا ما تخضع لرحلة شاقة يشار إليها باسم "أوديسي التشخيص" للحصول على تشخيص دقيق1. ويعتقد أن معظم الأمراض النادرة لها أصل وراثي قوي، مما يجعل التحليلات الوراثية/الجينية عناصر حاسمة من العمل السريري. بالإضافة إلى تسلسل لوحة الجينات المرشحة وتحليل تباين عدد النسخ استناداً إلى المصفوفات الدقيقة الكروموسومية، أصبحت تقنيات التسلسل الكامل للجينوم وتسلسل الجينوم الكامل أدوات قيّمة بشكل متزايد على مدى العقد الماضي2، 3. حاليا، معدل التشخيص لتحديد متغير مسببات الأمراض المعروفة في WES وWGS هو ~ 25٪ (أعلى في حالات الأطفال)4،5. بالنسبة لمعظم الحالات التي لا تزال غير مشخصة بعد WES السريرية / WGS، وهناك مسألة شائعة هي أن هناك العديد من الجينات المرشحة والمتغيرات. غالباً ما يحدد الجيل التالي من التسلسل المتغيرات الجديدة أو النادرة جدًا في العديد من الجينات، وتفسير ما إذا كانت هذه المتغيرات تساهم في الأنماط الظاهرية للأمراض أمر صعب. على سبيل المثال، على الرغم من أن معظم الهراء أو الطفرات frameshift في الجينات ويعتقد أن فقدان الوظيفة (LOF) الأليلات بسبب الاضمحلال بوساطة هراء من النص المشفر، واقتطاع الطفرات وجدت في الexons الماضي الهروب من هذه العملية، ويمكن أن تعمل كما حميدة أو كسب وظيفة (GOF) alleles6.

وعلاوة على ذلك، فإن التنبؤ بآثار الأليل الخاطئ مهمة شاقة، لأنه يمكن أن يؤدي إلى عدد من السيناريوهات الوراثية المختلفة كما وصفها هيرمان مولر لأول مرة في الثلاثينات (أي غير متبلور، هيمورف، فرط الشكل، مضاد للمورفّف، نيومورف، أو إيزومورف)7 . وقد وضعت العديد من في برامج silico والمنهجيات للتنبؤ المسببة للأمراض من المتغيرات missense على أساس الحفظ التطوري، ونوع من تغيير الأحماض الأمينية، ووضع داخل مجال وظيفي، تردد أليل في عموم السكان، وغيرها منالمعلمات 8. ومع ذلك، هذه البرامج ليست حلا شاملا لحل المشكلة المعقدة لتفسير متغير. ومن المثير للاهتمام، أظهرت دراسة حديثة أن خمس خوارزميات التنبؤالمسببة للأمراض البديل المستخدمة على نطاق واسع (بوليفين 9، SIFT10، CADD11، PROVEAN12، متذوق الطفرة) تتفق على الإمراض ~ 80٪ من الوقت8 . وتجدر الإشارة إلى أنه حتى عندما تتفق جميع الخوارزميات، فإنها تعيد تنبؤاً غير صحيح بالإمراض يصل إلى 11% من الوقت. وهذا لا يؤدي فقط إلى تفسير سريري معيب ولكن أيضا قد يثني الباحثين عن متابعة المتغيرات الجديدة عن طريق إدراجها زورا بأنها حميدة. إحدى الطرق لاستكمال القيد الحالي في النمذجة السيليكو هو توفير البيانات التجريبية التي تبين تأثير وظيفة متغير في المختبر, فيالجسم الحي السابق (على سبيل المثال, الخلايا المستزرعة, organoids), أو في الجسم الحي.

في الدراسات الوظيفية في الجسم الحي من المتغيرات المرتبطة بالأمراض النادرة في MO لديها نقاط قوة فريدةمن نوعها 13 وقد اعتمدت من قبل العديد من المبادرات البحثية الأمراض النادرة في جميع أنحاء العالم، بما في ذلك شبكة الأمراض غير المشخصة (UDN) في الولايات المتحدة ونادرة نماذج الأمراض والآليات (RDMM) شبكات في كندا واليابان وأوروبا وأستراليا14. بالإضافة إلى هذه الجهود المنسقة لدمج الباحثين MO في سير عمل تشخيص الأمراض النادرة والدراسات الميكانيكية على نطاق وطني، أدى عدد من الدراسات التعاونية الفردية بين الباحثين السريرية وMO إلى اكتشاف وتوصيف العديد من الجينات والمتغيرات الجديدة المسببة للأمراض البشرية82و83و84.

في UDN، يتلقى مركز فحص الكائنات النموذجية المركزية (MOSC) تقديمات من الجينات والمتغيرات المرشحة مع وصف لحالة المريض ويقيّم ما إذا كان من المحتمل أن يكون البديل مسبب ًا للأمراض باستخدام أدوات المعلوماتية وفي الجسم الحي التجارب. في المرحلة الأولى (2015-2018) من UDN، تتألف MOSC من دور دروسوفيلا الأساسية [كلية بايلور للطب (BCM)] وحمار وحشي كور (جامعة أوريغون) التي عملت بشكل تعاوني لتقييم الحالات. باستخدام تحليل المعلوماتية وعدد من الاستراتيجيات التجريبية المختلفة في دروسوفيلا وحمار وحشي، وقد ساهمت MOSC حتى الآن في تشخيص 132 مريضا، وتحديد 31 متلازمة جديدة55،واكتشاف العديد من الإنسان الجديد جينات المرض (على سبيل المثال، EBF315، ATP5F1D16، TBX217، IRF2BPL18، COG419، WDR3720)والتوسع phenotypic من الأمراض المعروفة الجينات (على سبيل المثال، CACNA1A21، ACOX122).

بالإضافة إلى المشاريع داخل UDN، ساهم الباحثون MOSC Drosophila الأساسية في اكتشافات جينية جديدة للمرض بالتعاون مع مراكز الجينوم المندلية وغيرها من المبادرات (على سبيل المثال، ANKLE223، TM2D3 24، NRD125، OGDHL25، ATAD3A26، ARIH127، MARK328، DNMBP29) باستخدام نفس المجموعة من المعلوماتية والوراثية الاستراتيجيات التي وضعت للUDN. وبالنظر إلى أهمية دراسات وزارة الصحة بشأن تشخيص الأمراض النادرة، تم توسيع نطاق الـ MOSC ليشمل النواة C. elegans وجوهر سمك الحمار الوحشي الثاني (كلاهما في جامعة واشنطن في سانت لويس) للمرحلة الثانية (2018-2022) من UDN.

تصف هذه المخطوطة بروتوكول دراسة وظيفية في الجسم الحي يستخدم بنشاط في الـ UDN MOSC Drosophila Core لتحديد ما إذا كانت المتغيرات غير المنطقية لها عواقب وظيفية على البروتين الذي يهمه الأمر باستخدام الذباب المعدل وراثياً الذي يعبر عن الإنسان البروتينات. والهدف من هذا البروتوكول هو مساعدة الباحثين MO العمل بالتعاون مع مجموعات البحوث السريرية لتقديم أدلة تجريبية على أن البديل المرشح في جين من الفائدة له عواقب وظيفية، وبالتالي تسهيل التشخيص السريري. هذا البروتوكول هو الأكثر فائدة في السيناريو الذي يتم الاتصال بالباحث Drosophila من قبل محقق سريري لديه مريض مرض نادر مع متغير مرشح معين في جين من الفائدة.

ويمكن تقسيم هذا البروتوكول إلى ثلاثة عناصر: (1) جمع المعلومات لتقييم احتمال أن يكون البديل من الفائدة المسؤولة عن النمط الظاهري للمريض وجدوى دراسة وظيفية في دروسوفيلا، (2) جمع الأدوات الوراثية الموجودة وإنشاء أدوات جديدة، و (3) إجراء دراسات وظيفية في الجسم الحي. ويمكن تقسيم العنصر الثالث كذلك إلى عنصرين فرعيين يستندان إلى كيفية تقييم وظيفة متغير من الاهتمامات (تجربة الإنقاذ أو الاستراتيجيات القائمة على التعبير المفرط). ومن المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول يمكن تكييفه وتحسينه إلى حد كبير مع العديد من السيناريوهات خارج بحوث الأمراض المونوجينية النادرة (مثل الأمراض الشائعة، والتفاعلات بين الجينات والبيئة، والشاشات الدوائية/الجينية لتحديد الأهداف العلاجية). القدرة على تحديد وظيفة وإمراض المتغيرات لن تستفيد فقط المريض من الاهتمام من خلال توفير التشخيص الجزيئي الدقيق ولكن سيكون لها أيضا آثار أوسع على كل من البحث العلمي الترجمة والأساسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. جمع المعلومات البشرية وMO لتقييم: احتمال وجود متغير من الفائدة تكون مسؤولة عن الأنماط الظاهرية للمرض وجدوى الدراسات الوظيفية في دروسوفيلا

  1. إجراء عمليات بحث واسعة في قاعدة البيانات والأدب لتحديد ما إذا كانت الجينات والمتغيرات المحددة ذات الأهمية هي مرشحة جيدة لشرح النمط الظاهري للمريض الذي يهمه الأمر. وعلى وجه التحديد، جمع المعلومات التالية.
    1. تقييم ما إذا كان جين الفائدة قد تورط سابقا في اضطرابات وراثية أخرى (التوسع الفينوتي للجين المرض المعروف) أو هذا هو جين مرشح مرض جديد تماما [متغير الجينات ذات الأهمية غير المؤكدة (GVUS)].
    2. تقييم تردد الأليل من البديل من الاهتمام بالأمراض أو السيطرة على قواعد البيانات السكانية.
    3. تقييم ما إذا كانت هناك اختلافات في عدد النسخ (CNVs) التي تشمل هذا الجين في قواعد بيانات المرض أو السيطرة على السكان.
    4. تقييم ما هي الجينات التقويمية في أنواع MO مختلفة بما في ذلك الماوس، حمار وحشي، Drosophila، C. elegans، والخميرة، ثم مزيد من التحقيق في الوظائف المعروفة وأنماط التعبير من هذه الجينات التقويمية.
    5. تقييم ما إذا كان البديل من الفائدة موجودة في مجال وظيفي للبروتين وإذا تم الحفاظ على الأحماض الأمينية ذات الأهمية تطوريا.
      ملاحظة:يمكن الحصول على إجابات على هذه الأسئلة الخمسة (الخطوات 1-1-1-1-1-5) عن طريق الوصول إلى عدد من قواعد البيانات البشرية وقواعد بيانات MO بشكل فردي أو باستخدام مورد الويب "موارد مجمعة للكائن الحي النموذجي لاستكشاف المتغيرات النادرة" (انظر الجدول 1 للموارد على الانترنت)30، والتي توصف بتعمق في المادة31المصاحبة . راجع قسم النتائج التمثيلية للاطلاع على أمثلة محددة. كما يوفر الموقع الشبكي لمبادرة الملك32 وGene2Function33 معلومات مفيدة.
  2. جمع معلومات إضافية لمزيد من تقييم ما إذا كان البديل هو مرشح مرض جيد من وظيفة البروتين وهيكل وجهة نظر.
    1. تقييم ما إذا كان من المتوقع أن يكون البديل من الفائدة ضارة استناداً إلى خوارزميات التنبؤ silico.
      ملاحظة:تم تطوير خوارزميات الإمراض البديل من قبل العديد من مجموعات البحث على مدى السنوات ال 15 الماضية، ويتم عرض بعضها أيضا في نتائج البحث MARRVEL. أكثر البرامج الحديثة، بما في ذلك اثنين المدرجة أدناه، والجمع بين خوارزميات التطفل الإمراض متعددة ونهج التعلم الآلي لتوليد درجة الإمراض. لمزيد من المعلومات حول خوارزميات التنبؤ المتغيرة وأدائها، راجع غوش وآخرون8. '1' CADD (استنفاد مشترك يعتمد على الشروح): أداة الشرح التكاملي التي بنيت من أكثر من 60 من السمات الجينية، والتي توفر درجات للمركبات ذات التراكم الذاتي البشرية، فضلا عن عمليات الإدراج والحذف القصيرة11. '2' REVEL (rare exome variant مجموعة المتعلم): يجمع بين خوارزميات متعددة الإمراض البديل (موتبريد، FATHMM، VEST، PolyPhen، SIFT، PROVEAN، MutationAssessor، MutationTaster، LRT، GERP، SiPhy، phyloP، وphastCons) لتوفير درجة متكاملة لجميع المتغيرات البشرية الممكنة غير المنطقية34.
    2. تحديد ما إذا كان قد ثبت أن الجين البشري / البروتين ذات الأهمية أو تقويم العظام MO لها للتفاعل وراثيا أو جسديا مع الجينات / البروتينات المرتبطة سابقا بالأمراض الوراثية. إذا كان الأمر كذلك، تقييم ما إذا كان المريض من مصلحة معارض الأنماط الظاهرية المتداخلة مع هذه الاضطرابات.
      ملاحظة:تم تطوير العديد من الأدوات لتحليل التفاعلات الوراثية والبروتينالبروتينية استناداً إلى منشورات MO وكذلك البروتيوميات على نطاق واسع من شاشات الأنواع المتعددة. STRING (أداة البحث عن الحالات المتكررة من الجينات المجاورة)35: قاعدة بيانات للتفاعلات البروتين البروتين المعروفة والمتوقعة. وهو يدمج مجموعات بيانات التفاعل الجيني والتعبير المشترك، فضلا عن أدوات استخراج النصوص لتحديد الجينات والبروتينات التي قد تعمل معا في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية. MIST (أداة البحث التفاعل الجزيئي)36: قاعدة بيانات تدمج البيانات الوراثية والبروتين البروتين التفاعل من المنظمات المنظمات غير الحكومية الوراثية الأساسية (الخميرة، C. elegans، Drosophila، حمار وحشي، الضفدع، الفئران، الماوس) والبشر. كما يتم عرض التنبؤ بالتفاعلات المستخلصة من الجينات/البروتينات التقويمية (الفواصل).
    3. تحديد ما إذا كان قد تم حل هيكل 3-D من البروتين من الفائدة أو على غرار. إذا كان الأمر كذلك، حدد مكان تعيين متغير الفائدة بالنسبة إلى المجالات الوظيفية الرئيسية.
      ملاحظة:يمكن العثور على هياكل البروتين التي تم حلها بواسطة التصوير البلوري بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي (NMR) والفحص المجهري بالتبريد الإلكتروني في قواعد البيانات العامة بما في ذلك PDB (بنك بيانات البروتين) وEMDatabank37. على الرغم من عدم وجود قاعدة بيانات واحدة لهياكل البروتين المتوقعة/المنمذجة، يتوفر عدد من الخوارزميات (أي SWISS-MODEL38وModeller39وPhyre240)للمستخدمين لأداء نمذجة البروتين.
  3. التواصل مع المتعاونين السريريين لمناقشة المعلومات التي تم جمعها من تحليلات المعلوماتية في الأقسام 1.1-1.2. إذا كان المتعاونون السريرية يشعرون أيضا أن البديل والجين من الاهتمام هي المرشحين جيدة لشرح الأنماط الظاهرية ينظر في المريض، والمضي قدما إلى القسم 2. إذا كانت هناك أسئلة محددة حول النمط الجيني للمريض والنمط الظاهري، ناقشها مع المتعاونين السريرية قبل المضي قدما.
    ملاحظة: إذا كان هناك شعور بأن البديل من الفائدة من غير المرجح أن يفسر النمط الظاهري للاهتمام (على سبيل المثال، متغير متطابقة وجدت في التردد العالي في السكان السيطرة)، مناقشة هذا مع المتعاونين السريرية لتحديد ما إذا كان البديل هو جيد مرشح، كما قد لا يكون هناك الخبرة المناسبة لتفسير الأنماط الظاهرية السريرية.

2. جمع الأدوات الوراثية الموجودة وإنشاء كواشف جديدة لدراسة متغير محدد للاهتمام

ملاحظة:بمجرد أن يتم تحديد البديل من الفائدة مرشح جيد لمتابعة تجريبيا، وجمع أو توليد الكواشف لأداء في الدراسات الوظيفية في الجسم الحي. بالنسبة للدراسات الوظيفية الموصوفة في هذا البروتوكول، هناك حاجة إلى بعض الكواشف الرئيسية Drosophila melanogaster: 1) السلالات المعدلة المنشأ ة من قبل الإنسان التي تنظم تسلسل التنشيط في المنبع التي تحمل التسلسل المرجعي أو البديل، 2) فقدان الوظيفة أليل من جين ذبابة ذات فائدة، و 3) خط GAL4 التي يمكن استخدامها لتجارب الإنقاذ.

  1. توليد البنى المضادة للحمض النووي للأمم المتحدة البشرية والذباب المعدل وراثيا
    1. تحديد والحصول على المنشآت cDNA البشرية المناسبة. العديد من الحيوانات المستنسخة متاحة من MGC (جمع الجينات الثدييات)43 ويمكن شراؤها من الثأر المحدد. بالنسبة للجينات التي يتم لصقها بدلاً من ذلك، تحقق من أي من الـ isoform cDNA يتوافق مع استخدام Ensembl أو RefSeq.
      ملاحظة:تتوفر العديد من cDNAs في الكواشف المتوافقة مع نظام الاستنساخ المؤتلف بوساطة44،مما يبسط خطوة الاستنساخ الفرعي. cDNAs قد تأتي في شكل "مفتوحة (لا وقف codon)" أو "مغلقة (مع codon توقف الذاتية أو الاصطناعية)". في حين أن النسخ المفتوحة تسمح C'-وضع العلامات من البروتينات التي هي مفيدة للبيوكيميائية (على سبيل المثال، وصمة عار الغربية) والخلايا البيولوجية (على سبيل المثال، تلطيخ المناعة) اختبار لرصد التعبير عن البروتين من الفائدة، فإنه قد تتداخل مع وظيفة البروتين في بعض الحالات.
    2. [سوب-كرّون] المرجع و [فرينت] [كدن] داخل [دروسوفيلا] متجهة [رجنجنكل]. استخدم نظام التحويل الذي يتم التّشأ به φC31، حيث يسمح هذا بدمج المراجع والبديل cDNAs في نفس الموقع في الجينوم45. لهذا المشروع، وMOSC Drosophila الأساسية يستخدم بشكل روتيني ناقلات pGW-HA.attB46.
      ملاحظة:إذا كان cDNA البشري في ناقلات متوافقة مع نظام الاستنساخ المؤتلف بوساطة (على سبيل المثال، pDONR221، pENTR221)، انتقل إلى القسم 2.1.4، الذي يفسر ردود فعل LR لاستنساخ الـ cDNAs إلى pGW-HA.attB.
      1. إذا لم يكن cDNA البشري في نظام استنساخ متوافق مع المؤتلف بوساطة مؤتلف، فإن الاستنساخ الفرعي للقدرات المحلية البشرية في متجه دخول البوابة باستخدام التقنيات البيولوجية الجزيئية القياسية (يتم توثيق مثال على هذا البروتوكول أدناه).
        1. إجراء PCR معلقة لإدخال الأسلحة attB1 و attB2. يجب أن يكون التمهيدي إلى الأمام تسلسل attB1 5'-GGGGACAAGTGTGTACAAAAAAGCAGGCTCACC-3' تليها أول 22 النيوكليوتيدات من cDNA الهدف. التمهيدي العكسي يجب أن يكون تسلسل attB2 5 '-GGGGACCACTTTGTACAAAGAGAGAGGTGTGTTTA'3' تليها تكملة عكسية من النيوكليوتيدات 25 الماضي من cDNA من الفائدة. استبعاد codon وقف cDNA، ثم إضافة علامة C' إذا كان من المرغوب فيه "فتح" استنساخ، أو إضافة codon وقف إلى "إغلاق" استنساخ.
        2. إعداد 100 ميكرولتر من مزيج PCR عالي الدقة يتكون من 50 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لـ PCR عالي الدقة، و36 ميكرولتر من الماء المقطر، و5 ميكرولتر من كل التمهيديات الأمامية والعكسية المدرجة في الخطوة 2.1.2.1.1.1 المخففة إلى 10 ميكرومتر، و4 ميكروت من cDNA المستهدفة (150 نانوغرام/ميكرولتر).
        3. إجراء PCR باستخدام بروتوكول الطفرات القياسية لإضافة الأسلحة attB1 و attB2 على cDNA من الفائدة. تختلف الظروف حسب البناء والمتغيرات ذات الفائدة.
        4. عزل cDNA الهدف مع الأسلحة homology المضافة عن طريق الكهربائي هلام واستخراج هلام. إنشاء 1٪ هلام أغاروز وأداء الكهربائي باستخدام الأساليب القياسية. استئصال الفرقة التي تتوافق مع حجم cDNA بالإضافة إلى طول إضافي من الأسلحة homology. استخراج الحمض النووي من هلام من خلال الأساليب القياسية95. تتوفر مجموعات استخراج الجل التجارية من العديد من الشركات.
        5. إجراء رد فعل إعادة الدمج في المختبر على أساس بروتوكول الاستنساخ بوساطة المؤتلفة وفقا للنظام المستخدم.
        6. تحويل مزيج تفاعل BP إلى خلايا E. coli المختصة كيميائياً. ويمكن صنع الخلايا المختصة في المنزل أو شراؤها من البائعين التجاريين. ثقافة الخلايا المحولة بين عشية وضحاها على لوحة LB تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة لاختيار مستعمرة. في اليوم التالي، حدد العديد من المستعمرات وزراعتها في الثقافات السائلة المستقلة بين عشية وضحاها.
        7. عزل الحمض النووي من الثقافات بين عشية وضحاها من خلال miniprep. Sanger تسلسل استنساخ إيجابية للتأكد من أن cDNA لديه التسلسل الصحيح96. الحفاظ على الخلايا من الثقافات التي هي إيجابية للتسلسل المطلوب في 25٪ الجلسرين المخزنة في -80 درجة مئوية.
    3. تنفيذ الطفرات الموجهة نحو الموقع لإدخال البديل من الاهتمام في بلازميد بوابة مع cDNA الإنسان المرجعي97. يمكن العثور على بروتوكول مفصل لهذه الطريقة في موقع البائع48،49. التحقق من وجود البديل في بلازميد متحولة عن طريق تسلسل Sanger من إطار القراءة المفتوح بأكمله (ORF) لضمان عدم وجود متغيرات إضافية أدخلت من خلال هذه الخطوة الطفرات.
    4. Subclone المرجع والبديل cDNAs البشرية في بلازميد المانحة (بوابة بلازميدات مع مواقع attL1 و attL2) في بلازميد المعدلة وراثيا (على سبيل المثال، pGW-HA.attB مع مواقع attR1 و attR2) عن طريق رد فعل CLONase LR.
      ملاحظة:هناك ناقلات UAS φC31 المصممة للتقييد التقليدي القائم على الإنزيم subcloning (على سبيل المثال، pUAST.attB50)إذا كان يفضل أن subclone cDNAs الإنسان عن طريق أساليب إنزيم تقييد.
    5. حدد مواقع الإرساء φC31 التي يمكن فيها دمج الجينات المتحولة UAS-البشرية. وقد تم إنشاء عدد من مواقع الإرساء من قبل العديد من المختبرات وهي متاحة للجمهور من مراكز الأوراق المالية50،52،53.
      ملاحظة:بما أنه من الملائم أن يكون الجين البشري على كروموسوم لا يحتوي على تقويم ذبابة الجين موضع الاهتمام، فمن المستحسن استخدام موقع إرساء كروموسوم ثاني [VK37 (bDSC stock #24872] عندما يكون تقويم العظام الطائر على X ، ثالث، أو رابع كروموسومات، واستخدام موقع إرساء كروموسوم ثالث [VK33 (bDSC الأسهم #24871] عندما يكون تقويم العظام يطير على الكروموسوم الثاني.
    6. حقن UAS-الإنسان cDNA المنشآت في الذباب التعبير عن φC31 integrase في الجرثومة الخاصة بهم (على سبيل المثال، vas-φC31، nos-φC31).
      ملاحظة: يمكن إجراء الحقن المجهري في المنزل أو إرساله إلى المرافق الأساسية أو الكيانات التجارية للتكوين. ويمكن الاطلاع على بروتوكول مفصل لتوليد الذباب المعدلوراثيا في الفصل51الكتاب المذكورة .
    7. إنشاء سلالات مستقرة من الجينات المحقنة. حقن ~ 100-200 الأجنة في بناء94. ويُصوَّر في الشكل 1ألفمخطط عبور تمثيلي لإدخال الجينات المتحولة في موقع إرساء كروموسوم ثان (VK37). الرجوع إلى الكتب المذكورة54،55 للحصول على المعلومات الأساسية علم الوراثة Drosophila.
  2. الحصول على أو إنشاء خط T2A-GAL4 الذي يسهل الاختبارات الوظيفية المستندة إلى الإنقاذ (انظر الشكل 2 والفرع 3-1).
    ملاحظة:هذا الخط سوف تخدم غرضين. أولا، معظم خطوط T2A-GAL4 اختبار يتصرف كما alleles LOF قوية من خلال العمل كأليل فخ الجينات. ثانياً، تعمل خطوط T2A-GAL4 كسائق GAL4 يسمح بالتعبير عن بنيات UAS (مثل UAS-GFP، UAS-human cDNAs) في إطار عناصر التنظيم الذاتية للجين ذي الأهمية56و57 (الشكل2 A-C).
    1. البحث في مجموعات الأسهم العامة لخطوط T2A-GAL4 المتاحة بما في ذلك مشروع تعطيل الجينات Drosophila (GDP)58 التي تم إنشاء حوالي 1000 خطوط T2A-GAL459. هذه السلالات متاحة حاليا من مركز الأسهم بلومينغتون دروسوفيلا (BDSC) ويمكن البحث فيها من خلال كل من الناتج المحلي الإجمالي وBDSC المواقع.
    2. إذا لم يتوفر خط T2A-GAL4 لجين الطيران ذو الفائدة، فتحققمما إذا كان خط الإنترونيكس MiMIC (كاسيت التكامل بوساطة مينوس) متاحًا للتحويل إلى خط T2A-GAL4 باستخدام تبادل كاسيت بوساطة مؤتلف (RMCE) )60 (الشكل2ألف).
      ملاحظة:يسمح RMCE عناصر MiMIC intronic التي هي في ما بين اثنين من exons الترميز لتحويلها إلى خط T2A-GAL4 من خلال الحقن المجهري من بناء المانحة (يظهر مثال على مخطط عبور في الشكل 1B)أو سلسلة من الصلبان، كما هو موضح بالتفصيل57،59.
    3. في حالة عدم توفر خط T2A-GAL4 وعدم وجود MiMIC تشفير مناسب، استكشاف إمكانية إنشاء خط T2A-GAL4 عبر CRIMIC (راديو التكامل بوساطة كريسبر) نظام59.
      ملاحظة:تستخدم هذه المنهجية انشقاق الحمض النووي بوساطة كريسبر والإصلاح الموجه بعلم الأوسمة (HDR) لدمج كاسيت يشبه MiMIC في إينترون الترميز في جين من الفائدة.
    4. إذا كان جين الفائدة يفتقر إلى الإنترون كبيرة (> 150 bp) أو ليس لديه introns، في محاولة لضرب في TRANSGENE GAL4 في جين ذبابة مع نظام كريسبر / Cas9 باستخدام تقرير التنمية البشرية كما هو موضح20،61،62.
      ملاحظة:إذا كان من الصعب توليد AT2A-GAL4 أو GAL4 طرق في الأليل، محاولة إجراء تجارب الإنقاذ باستخدام هذه الأليلات الموجودة من قبل أو خطوط RNAi والسائقين GAL4 في كل مكان أو الأنسجة المحددة كما هو موضح92 (REF).

3. إجراء تحليل وظيفي للمتغير البشري للاهتمام في الجسم الحي في دروسوفيلا

ملاحظة:إجراء تحليل قائم على الإنقاذ (القسم 3-1) وكذلك دراسات التعبير المفرط (القسم 3-2) باستخدام الأدوات التي تم جمعها أو إنشاؤها في القسم 2 لتقييم عواقب متغير الاهتمام بالجسم الحي في دروسوفيلا. النظر في استخدام كلا النهجين، لأن هذين النهجين متكاملان.

  1. إجراء تحليل وظيفي من خلال التجارب القائمة على الإنقاذ
    ملاحظهالتجارب الغيرية القائمة على الإنقاذ في:Drosophilaباستخدام البروتينات البشرية تحديد ما إذا كانت الوظيفة الجزيئية للجينات التقويمية اثنين قد تم الحفاظ على أكثر من ~ 500 مليون سنة من التطور. كما أنها تقيم وظيفة البديل في سياق البروتين البشري63. على الرغم من أنه لم يتم الإبلاغ عن تحليل منهجي يدرس مئات من أزواج الجينات، فإن عدة عشرات من الجينات البشرية والثدييات (على سبيل المثال، الماوس) قادرة على استبدال وظيفةDrosophilaالجينات13.
    1. في النهج القائم على الإنقاذ، أولاتحديد ما إذا كان هناك واضحة، قابلة للتآكل، والقابلة للاستنساخ الأنماط الظاهرية في المسوخ LOF في تقويم الذبابة قبل تقييم وظائف المتغيرات.
      ملاحظة:الأدب السابق على جين ذبابة هو مكان جيد لمنجم البيانات أولا، ويمكن العثور عليها باستخدام قواعد البيانات بما في ذلك FlyBase وPubMed. كما أن قواعد البيانات الإضافية مثل MARRVEL وMonarch Initiative وGene2Funcion مفيدة أيضاً في جمع هذه المعلومات.
    2. إجراء مسح عالمي للأنماط الظاهرية القابلة للتآكل في المتجانسات وhemizygous (T2A-GAL4 أليل على الحيوانات نقص الكروموسومات محددة جزيئيا، وخاصة إذا كان العليل T2A-GAL4 هو أول طفرة تتميز لجين معين. تقييم الأنماط الظاهرية مثل الفتك، والعقم، وطول العمر، والمورفولوجية (على سبيل المثال، حجم ومورفولوجيا العين) والسلوك (مثل التودد، والطيران، والتسلق، وعيوب حساسية الانفجار).
      ملاحظة:إذا لم تكن هناك أنماط ظاهرية رئيسية تم تحديدها من هذه الشاشة الأولية، يمكن استخدام الأنماط الظاهرية الأكثر دقة مثل العيوب العصبية التي تقاس بالتسجيلات الفسيولوجية الكهربائية إذا كانت قابلة للاستنساخ بشكل كبير ومحددة. وعلى سبيل المثال، يرد في الخطوة 3-2-3 وصف للدراسات الوظيفية التي تستخدم الإلكتروريتيوغرام (ERG). إذا كان هناك فشل في الكشف عن أي النمط الظاهري القابل للتآكل، انتقل إلى القسم 3.2 وإجراء الدراسة الوظيفية المستندة إلى التعبير الزائد.
    3. مرة واحدة يتم التعرف على النمط الظاهري القابلة للتآكل في ذبابة LOF متحولة، اختبار ما إذا كان cDNA الإنسان المرجعي يمكن أن تحل محل وظيفة ortholog ذبابة عن طريق محاولة استخدام cDNA البشرية لإنقاذ خط ذبابة متحولة. يعتمد اختبار الفينوتيبيك الذي سيتم إجراؤه هنا على نتائج الخطوة 3.1.2 وسوف يكون خاصًا بالجين الذي تجري دراسته.
      ملاحظة:إذا كان "إضفاء الطابع الإنساني" على جين ذبابة ناجحة، هناك الآن منصة لمقارنة كفاءة الإنقاذ لالبديل من الفائدة مقارنة مع النظير المرجعي. الإنقاذ ينظر مع مرجع الإنسان cDNA ليس من الضروري أن تكون مثالية. الإنقاذ الجزئي للنمط الظاهري متحولة ذبابة باستخدام cDNA الإنسان لا يزال يوفر نقطة مرجعية لإجراء دراسات مقارنة باستخدام سلالة cDNA البشرية البديلة.
    4. باستخدام نظام فحص المحدد في الخطوة 3.1.2، قارن الإنقاذ الذي لوحظ مع cDNA البشرية المرجعية للإنقاذ الذي لوحظ مع cDNA البشرية البديلة لتحديد ما إذا كان البديل من الفائدة له عواقب على جين الفائدة.
      ملاحظة:إذا كان ال [كدنّا] [فرينت] إنسانيّة ينجز مريضة من ال [ألّل] مرجع, يقترح هذا أنّ ال [فرينت] الفائدة ضارّة إلى البروتين عمل. إذا كان البديل والمرجع لا يمكن تمييزها وظيفيا، ثم 1) قد يكون الأليل isomorph (متغير لا يؤثر على وظيفة البروتين) أو 2) والقول ليست حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن الاختلافات خفية.
    5. إذا تم العثور على البديل ليكون أليل ضار، ثم مزيد من تقييم التعبير والتوطين داخل الخلايا من البروتينات المرجعية والبديل ة ذات الأهمية في الجسم الحي عبر وصمة عار الغربية، تلطيخ الفلورة المناعية، أو غيرها من الطرق93.
      ملاحظة:إذا تم إنشاء cDNA UAS-الإنسان من استنساخ مفتوحة في متجه pGW-HA.attB، استخدم الأجسام المضادة للHA لإجراء هذه الاختبارات البيوكيميائية والخلوية. إذا كان الاستنساخ الأصلي هو استنساخ مغلق، اختبار ما إذا كان يمكن استخدام الأجسام المضادة التجارية ضد البروتينات البشرية لهذه الاختبارات. قد يكشف الاختلاف في مستويات التعبير والتعريب داخل الخلايا كيف يؤثر متغير الاهتمام على وظيفة البروتين.
  2. إجراء تحليل وظيفي من خلال دراسات التعبير المفرط
    ملاحظة:يمكن أن يوفر التعبير المفرط في كل مكان أو الخاص بالأنسجة عن الـ cDNAs البشري في الذباب البري من نوع خلاف ذلك معلومات مكملة للتجارب المستندة إلى الإنقاذ التي نوقشت في القسم 3-1. في حين تم تصميم الاختبارات المستندة إلى الإنقاذ في المقام الأول للكشف عن المتغيرات LOF (غير متبلور، نقص الحركة)، قد تكشف الاختبارات المفرطة القائمة على التعبير أيضا ً عن متغيرات كسب الوظيفة (GOF) التي يصعب تقييمها (فرط الشكل، ومضاد للأشكال، والنيومورفيك).
    1. حدد مجموعة من برامج تشغيل GAL4 للمبالغة في التعبير عن cDNAs البشرية ذات الأهمية. يتوفر عدد من السائقين GAL4 في كل مكان والأنسجة/المرحلة المحددة من مراكز الأسهم العامة (على سبيل المثال، BDSC)، وبعضها يستخدم بشكل أكثر تواترا ً من غيرها. التركيز أولا على السائقين في كل مكان والأنماط الظاهرية القابلة للتآكل بسهولة (الفتك، العقم، الأنماط الظاهرية)، ثم الانتقال إلى السائقين الأنسجة محددة والأنماط الظاهرية أكثر تحديدا.
      ملاحظة: التحقق من صحة تعبير برامج تشغيل GAL4 مع خط مراسل (على سبيل المثال، UAS-GFP) لتأكيد أنماط التعبير قبل الاستخدام في التجارب.
    2. التعبير عن المرجع والبديل cDNAs الإنسان باستخدام نفس السائق تحت نفس الحالة (على سبيل المثال، درجة الحرارة) عن طريق عبور 3-5 الإناث العذراء من خط GAL4 (على سبيل المثال ey-GAL4 للتعبير عن قرص العين التخيلي) مع 3-5 الذباب الذكور من خطوط UAS [على سبيل المثال، UAS-TBX2(+) أو UAS-TBX2(p.R305H) على سبيل المثال المبين في القسم 4.2] في قارورة واحدة.
      1. نقل الصلبان كل 2-3 أيام أن يكون العديد من الحيوانات المنغلقة من صليب واحد.
    3. فحص السلالات والكشف عن أي اختلافات بين المرجعية وسلالات البديل (على سبيل المثال، مورفولوجيا العين) تحت المجهر تشريح. صورة الذباب باستخدام كاميرا تعلق على مجهر تشريح لتوثيق النمط الظاهري.
      ملاحظة:إذا كان يتم رؤية النمط الظاهري فقط في المرجع ولكن ليس في خط البديل، ثم قد يكون البديل أليل غير متبلور أو هيمورفولوجي قوي. إذا كان ينظر إلى النمط الظاهري في كل من الأنماط الجينية ولكن المرجع يسبب عيب أقوى، ثم قد يكون البديل الأليل تحت الشكل خفيفة إلى ضعيفة. إذا كان المرجع لا يظهر النمط الظاهري أو يعرض فقط النمط الظاهري ضعيفة ولكن البديل يظهر عيب قوي، ثم قد يكون البديل أليل GOF.
    4. إذا لم يتم رؤية النمط الظاهري في ظروف الثقافة القياسية (RT أو في 25 درجة مئوية، ثم تعيين الصلبان في درجات حرارة مختلفة تتراوح بين 18-29 درجة مئوية، منذ نظام UAS / GAL4 ومن المعروف أن تكون حساسة لدرجة الحرارة64،65). عادة، التعبير عن الجينات المتحولة UAS أعلى في درجات حرارة أعلى.
  3. إجراء دراسات وظيفية إضافية تتعلق بالجينات والبروتين ذات الأهمية.
    ملاحظهبالإضافة إلى فحص العيوب العامة، يمكن اختيار نظام الفحص للتحقيق في الوظائف الجزيئية للجين والبديل. في أحد الأمثلة التي نوقشت في النتائج التمثيلية (TBX2حالة)، واستخدمت تسجيلات ERG لتحديد آثار البديل على وظيفة المستقبل اتلاف، منذ جين ذبابة من الفائدة (bifid) قد درست على نطاق واسع في سياق تطوير النظام البصري. بروتوكولات مفصلة لERG فيDrosophilaيمكن العثور عليها كما نشرت سابقا66,67,68.
    1. توليد الذباب لاختبار العيوب الوظيفية في النظام البصري. عبر الإناث العذراء من خط رودوبسين 1 (Rh1)-GAL4 إلى الذكور مع مرجع أو متغير UAS-الإنسان cDNA الجينات للتعبير عن البروتينات البشرية ذات الاهتمام في مستقبلات ضوئية R1-R6.
      ملاحظة:عبور 3-5 الإناث العذراء إلى 3-5 الذباب الذكور في قارورة واحدة ونقل الصلبان كل 2-3 أيام أن يكون العديد من الحيوانات المنغلقة من صليب واحد. يجب أن تبقى جميع الصلبان في حاضنة تعيين في درجة الحرارة التجريبية للحصول على نتائج متسقة.
    2. مرة واحدة الذباب تبدأ في eclose (في 25 درجة مئوية، ~ 10 أيام بعد وضع الصليب الأولي)، وجمع ذرية(Rh1-GAL4 / +؛ UAS-الإنسان cDNA /+) في قارورة جديدة ووضعها مرة أخرى في حاضنة تعيين في درجة الحرارة التجريبية لمدة 3 أيام إضافية للنظام البصري لنضج.
      ملاحظة: علىالرغم من أنه يمكن إجراء ERG على الذباب القديم 1-2 يوم، قد يكون الذباب المغلق حديثا تقلبات كبيرة في إشارة ERG الخاصة بهم. إذا كان من المرغوب فيه لفحص النمط الظاهري المعتمد على العمر، يمكن أن تتراوح أعمارهم بين هذه الذباب لعدة أسابيع طالما أنها يتم نقلها بانتظام (على سبيل المثال، كل ~ 5 أيام) إلى قارورة جديدة لتجنب الغرق في الغذاء الرطب.
    3. إعداد الذباب لتسجيل ERG عن طريق التخدير الأول الذباب باستخدام CO2 أو وضعها في قارورة على الجليد. الغراء بلطف جانب واحد من ذبابة على شريحة المجهر الزجاجي لشل لهم.
      ملاحظة:يمكن لصقها على مرجع متعددة والذباب البديل على شريحة واحدة. وضع جميع الذباب في نفس الاتجاه تقريبا مع عين واحدة يمكن الوصول إليها للقطب تسجيل. يجب الحرص على عدم الحصول على الغراء على العين وترك proboscis مجانا.
    4. إعداد الأقطاب الكهربائية للتسجيل والمرجع. ضع شعيرات زجاجية مقاس 1.2 مم في وعاء إبرة ونشط. كسر الأنبوب الشعري للحصول على اثنين من الأقطاب الحادة مدبب. يجب أن تكون الأقطاب الكهربائية الناتجة جوفاء وأن تكون أقطارها النهائية من <0.5 مم.
    5. ملء الشعيرات الدموية مع محلول ملحي (100 مل NaCl)، والتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء. حرك الشعيرات الدموية الزجاجية فوق أقطاب الأسلاك الفضية (كل من قطب التسجيل والقطب المرجعي، راجع الشكل4) وتأمين الشعيرات الدموية في مكانها.
    6. تكوين محفز ومكبر للصوت. ويمكن الاطلاع على مجموعة مفصلة في Lauwers، وآخرون67. يتكون إعداد UDN Drosophila MOSC من المعدات المدرجة في قسم المواد.
      1. تعيين مكبر للصوت إلى 0.1 هرتز فلتر تمرير عالية، 300 هرتز مرشح تمرير منخفض، و100 كسب.
      2. تعيين محفز إلى فترة 1 ثانية، 500 مللي ثانية عرض النبض، 500 مللي ثانية تأخير النبض، وضع التشغيل، و 7 أمبير.
      3. إعداد مصدر الضوء لتحفيز الصور. استخدام مصدر ضوء الهالوجين لتنشيط مستقبلات الضوء يطير.
      4. إعداد برنامج التسجيل على جهاز كمبيوتر متصل بإعداد ERG. إنشاء بروتوكول تحفيز مع نموذج اكتساب "أحداث طول ثابت" ومدة 20 ق.
    7. تكييف الذباب لإكمال الظلام قبل بدء تسجيلات ERG. ضع الذباب في ظلام دامس لمدة 10 دقائق على الأقل قبل بدء التجربة.
      ملاحظة:بما أن الذباب لا يستطيع الكشف عن الضوء الأحمر، استخدم مصدر ضوء أحمر خلال فترة السكن المظلم.
    8. ضع الشريحة التي تحتوي على الذباب على جهاز التسجيل وحرك المتلاعبات الدقيقة التي تحمل الأقطاب المرجعية وتسجل إلى نقطة قريبة من ذبابة الاهتمام على الشريحة. مشاهدة غيض من القطب ووضع بعناية القطب المرجعي في صدر الذبابة (اختراق بشرة). بمجرد إدخال القطب المرجعي بشكل صلب، ضع قطب التسجيل على سطح العين.
      ملاحظة:لا يؤثر الموقع الدقيق لهذا القطب المرجعي تأثيراً كبيراً على إشارة ERG. يجب وضع قطب التسجيل على سطح العين لأن ERG هو تسجيل محتمل ميداني بدلاً من تسجيل داخل الخلايا. الكمية المناسبة من الضغط المطبق على قطب التسجيل يسبب ديمبل صغيرة دون اختراق العين.
    9. إيقاف جميع الأضواء لمدة 3 دقائق أخرى لتهيئة الذباب إلى البيئة المظلمة.
    10. إعداد برنامج التسجيل والبدء في تسجيل الإشارة. في حالة استخدام مصدر ضوء الهالوجين مع الغالق اليدوي، قم بتشغيل مصدر الضوء مع إغلاق الغالق. ابدأ بتسجيل الإشارة.
    11. فضح عيون ذبابة للضوء عن طريق فتح وإغلاق مصراع كل 1 ق لمدة 20 ق من تشغيل واحد.
      ملاحظة:يمكن التحكم في/إيقاف تشغيل مصدر ضوء الهالوجين يدويًا أو برمجته ليصبح تلقائيًا باستخدام مصدر ضوء LED أبيض. يمكن الحصول على ERG أكثر قوة وموثوقية باستخدام مصدر ضوء الهالوجين مقارنة بضوء أبيض LED، من المرجح أن يرجع ذلك إلى طيف الضوء الأوسع المنبعث من مصدر ضوء الهالوجين.
    12. تسجيل ERGs من جميع الذباب التي يتم تركيبها على الشريحة الزجاجية. تنفيذ ERGs من 15 الذباب لكل النمط الجيني لكل حالة.
      ملاحظة:قد تتضمن بعض المعلمات التي يمكن تغييرها للعثور على شرط يظهر اختلافات قوية بين المراجع وcDNAs البديل درجة الحرارة أو العمر أو الظروف البيئية (على سبيل المثال، تربى في دورة ضوء الظلام أو ضوء ثابت / الظلام).
    13. إجراء تحليل البيانات: مقارنة ERGs من المرجع والبديل وعناصر التحكم لتحديد ما إذا كانت هناك اختلافات. تقييم بيانات ERG للتغيرات في العابرين، وإزالة البولوبتوري، والعابرين، وإعادة الاستقطاب69 (الشكل4باء).
      ملاحظة: إزالة الاستقطاب وإعادة الاستقطاب تعكس تنشيط وتعطيل تتالي الترانسدوستيداخل المستقبلات الضوئية، في حين أن العابرين على وقبالة هي مقاييس لأنشطة الخلايا ما بعد متشابك التي تتلقى إشارات من المستقبلات الضوئية. غالباً ما يرتبط انخفاض السعة والحركة المتغيرة لإعادة الاستقطاب في عيوب مع وظيفة المستقبل اتّصالي ّ وصحة، في حين أنّ العيوب في العابرين على وإلى خارج هاوجدت في المسوخ الذين يعانون من خلل في تطوير المشبك أو وظيفته أو الصيانة 70.
    14. عند تحديد الاختلافات في الأنماط الظاهرية ERG مع التعبير المفرط للمرجع مقابل cDNAs البشرية البديلة، وتحديد ما إذا كان هذا النمط الظاهري الكهربائي الفسيولوجي يرتبط مع العيوب الهيكلية والهيكلية الفائقة في المستقبلات الضوئية والخاصة بهم نقاط الاشتباك العصبي عن طريق إجراء التحليل النسيجي والفحص المجهري الإلكترون الإرسال.
      ملاحظة:سبق وصف المزيد من المناقشة بشأن تفسير عيوب فريق الخبراء والتحليل الهيكلي/الهيكلي الفائق69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

دراسة وظيفية من دي نوفو Missense البديل في EBF3 مرتبطة الأنماط الظاهرية العصبية
في ذكر يبلغ من العمر 7 سنوات مع الأنماط الظاهرية العصبية التنموية بما في ذلك نقص التوتر، والترنح، وتأخر النمو العالمي، واضطراب الكلام التعبيري، والأطباء وعلماء الوراثة البشرية في المعاهد الوطنية للأمراض الصحية غير المشخصة المشروع (UDP) حددت البديل de novo missense (p.R163Q) في EBF3 (في وقت مبكر B-الخلية عامل3)15، وهو الجين الذي يرمز COE (Collier /Olfactory-1/Early B-Cell Factor) عامل النسخ العائلي. وقد قُدمت هذه القضية إلى اللجنة في آذار/مارس 2016 لإجراء دراسات وظيفية. لتقييم ما إذا كان هذا الجين مرشحا جيدا لهذه الحالة، جمعت MOSC معلومات وراثية وجينية بشرية من OMIM، كلينفار، إكساك (توسعت الآن إلى جنوماد)، جينو2النائب، DGV، وDECIPHER. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحديد الجينات التقويمية في الأنواع الرئيسية MO باستخدام أداة DIOPT. ثم تم الحصول على التعبير الجيني والمعلومات الفينوتية من قواعد بيانات MO الفردية (على سبيل المثال، Wormbase، FlyBase، ZFIN، MGI). شكلت تحليلات المعلوماتية التي أجريت لEBF3 وغيرها من الدراسات الرائدة في UDN MOSC الأساس لتطوير الموارد في وقت لاحق من MARRVEL30.

وتشير المعلومات التي تم جمعها باستخدام هذه المنهجية إلى أن EBF3 لم يكن مرتبطاً بأي اضطراب وراثي بشري معروف وقت التحليل، وتم التوصل إلى أن البديل p.R163Q كان مرشحاً جيداً استناداً إلى المعلومات التالية. (1) لم يُبلَّغ من قبل عن هذا البديل في قواعد بيانات السكان الخاضعة للمراقبة (ExAC) وقاعدة بيانات السكان المتعلقة بالأمراض (Geno2MP)، مما يشير إلى أن هذا البديل نادر جداً. (2) استنادا ً إلى ExAC، فإن درجة pLI (احتمال عدم تحمل LOF) لهذا الجين هي 1.00 (تتراوح درجات pLI من 0.00-1.00). وهذا يشير إلى أن هناك ضغط انتقائي ضد المتغيرات LOF في هذا الجين في عموم السكان ويشير إلى أن القصور في هذا الجين قد يسبب المرض. لمزيد من المعلومات حول درجة pLI وتفسيرها، والمادة التعليمية المصاحبة MARRVEL في JoVE31 والأوراق ذات الصلة توفير تفاصيل30،71.

كما اعتبر البديل p.R163Q مرشحا جيدا لأنه (3) يقع في مجال ربط الحمض النووي المحفوظة تطوريا من هذا البروتين، مما يشير إلى أنه قد يؤثر على الحمض النووي ملزمة أو غيرها من وظائف البروتين. (4) يتم حفظ بقايا p.R163 بشكل تطوري من C. elegans وDrosophila إلى البشر، مما يشير إلى أنه قد يكون حاسما للبروتين وظيفية عبر الأنواع. (5) وقد تورطت EBF3 orthologs في تطوير الخلايا العصبية في مو متعددة72 بما في ذلك C. elegans73، Drosophila74، Xenopus75، والفئران76. (6) خلال نمو الدماغ في الفئران، وقد ثبت Ebf3 للعمل المصب من Arx (Aristalessذات الصلة homebox)77، وهو جين المرتبطة العديد من الصرع والعجز الذهني متلازمات في البشر78. وبالتالي، تشير هذه البيانات معا إلى أن EBF3 من المرجح جدا أن تكون حاسمة لتطوير الأعصاب البشرية وأن البديل p.R163Q قد يكون لها عواقب وظيفية.

لتقييم ما إذا كان p.R163Q يؤثر على وظيفة EBF3، تم إنشاء خط T2A-GAL4 لعقده (kn؛ تقويم العظام يطير من EBF379الإنسان) عن طريق RMCE من الترميز intronic MiMIC الإدراج15. خط knT2A-GAL4 هو قاتل متنحي وفشل في استكمال فتكا من ك نا ألايل الكلاسيكية (kncol-1)وكذلك نقص محدد جزيئيا أن يغطي KN [Df(2R)BSC429]80 . أنماط التعبير من GAL4 يعكس أيضا أنماط ذكرت سابقا من التعبير kn في الدماغ وكذلك في القرص التخيلي الجناح15. ثم تم إنشاء الذباب المعدل وراثيا UAS للسماح للتعبير عن المرجعية والبديل الإنسان EBF3 cDNA وكذلك البرية من نوع يطير KN cDNA. تم وضع علامة على جميع البروتينات الثلاثة مع علامة C-terminal 3xHA. الأهم من ذلك، UAS البرية من نوع يطير KN (kn+) أو مرجع الإنسان EBF3 (EBF3+) transgenes أنقذ قاتلة knT2A-GAL4/ Df (2R) BSC429 إلى حد مماثل ( الشكل 3جيم،اللوحة اليسرى)81.

وعلى النقيض من ذلك، لم يتمكن UAS-human EBF3 transgene مع البديل p.R163Q(EBF3p.R163Q)من إنقاذ هذا المتحول، مما يشير إلى أن البديل p.R163Q يؤثر على وظيفة EBF3 في الجسم الحي15. ومن المثير للاهتمام، عند تقييمها باستخدام الأجسام المضادة للها، تم التعبير بنجاح عن بروتين EBF3p.R163Q في أنسجة ذبابة، ومستوياتها وتوطينها تحت الخلية (النووية في المقام الأول) كانت لا يمكن تمييزها عن تلك التي EBF3+ و Kn+. وهذا يشير إلى أن البديل لا يسبب النمط الظاهري LOF بسبب عدم استقرار البروتين أو سوء التوطين. لمزيد من تقييم ما إذا كان البديل p.R163Q أثرت على وظيفة التنشيط النسخي من EBF3، تم إجراء تقييم مراسل يستند إلى لوسيفيراز في خلايا HEK29315. كشفت هذه التجربة في الخلايا البشرية المستزرعة أن البديل EBF3p.R163Q فشل في تنشيط نسخ من بنيات المراسل، ودعم نموذج LOF التي تم الحصول عليها من تجارب دروسوفيلا.

وبالتوازي مع الدراسات التجريبية، أدى التعاون مع الأطباء وعلماء الوراثة البشرية والمستشارين الوراثيين في BCM إلى تحديد شخصين إضافيين مع أعراض مماثلة. حمل أحد المرضى البديل p.R163Q متطابقة، وحمل آخر متغير غير منطقي التي أثرت على نفس البقايا (p.R163L). فشل البديل p.R163L أيضا لإنقاذ ذبابة KN متحولة93 مما يشير إلى أن هذا أليل أثرت أيضا وظيفة EBF3. ومن المثير للاهتمام، تم نشر هذا العمل على الوراء مع اثنين من الدراسات المستقلة علم الوراثة البشرية التي أبلغت عن أفراد إضافيين مع دي نوفو سوء الشعور، هراء، frameshift، وربط المتغيرات في EBF3 مرتبطة مماثلة الأنماط الظاهرية العصبية82،83. وفي وقت لاحق، نُشرت ثلاث ورقات إضافية تفيد بحالات إضافية من المتغيرات من طراز de novo EBF3 وحذف رقم النسخ84و85و86. وتعرف هذه المتلازمة الجديدة النمو العصبي الآن باسم نقص التوتر، ترنح، ومتلازمة التنمية المتأخرة (HADDS، MIM #617330) في الميراث المندلي على الانترنت في الإنسان (OMIM، وهي قاعدة بيانات موثوقة للعلاقات النمط الجيني النمط الظاهري في البشر).

دراسة وظيفية للمتغير سوء الشعور الموروثة المهيمنة في TBX2 مرتبطة باضطراب القلب والأوعية الدموية والهيكل العظمي والهيكل العظمي
في عائلة صغيرة تتأثر بطيف متداخلمن خلل الشكل القحفي، وشذوذ القلب، وتشوه الهيكل العظمي، ونقص المناعة، وتشوهات الغدد الصماء، وضعف النمو، حدد موقع UDN Duke السريري متغيرًا خاطئًا (p.R20Q) في TBX2 الذي يفصل مع الأنماط الظاهرية المرض87. ويتأثر بهذه الحالة ثلاثة (ابن، ابنة، أم) من بين أفراد الأسرة الأربعة، وقد أظهر الابن أشد النمط الظاهري. سريريا, التقى تشخيص "متلازمة ديجورج كاملة", حالة غالبا ما تسببها haploinsufficiency TBX1. في حين لم تكن هناك طفرات تم تحديدها في TBX1 في هذه الأسرة، ركز الأطباء وعلماء الوراثة البشرية على متغير في TBX2، منذ الدراسات السابقة في الفئران أظهرت أن هذه الجينات لها وظائف متداخلة أثناء التنمية88 . ينتمي كل من TBX1 وTBX2 إلى عائلة T-box (TBX) من عوامل النسخ التي يمكن أن تعمل كأجهزة قمع نسخية وكذلك منشطات وفقًا للسياق.

في السابق، كانت المتغيرات في 12 من أصل 17 من أفراد جينات عائلة TBX مرتبطة بالأمراض البشرية. وقررت اللجنة أن تتبع هذا البديل تجريبياً استناداً إلى المعلومات التالية التي جُمعت من خلال شركة MARRVEL وغيرها من الموارد. (1) تم الإبلاغ عن هذا البديل مرة واحدة فقط في مجموعة من حوالي 90،000 "السيطرة" الأفراد في gnomAD (تم تصفية هذا البديل في طريقة عرض افتراضية، على الأرجح بسبب انخفاض التغطية يقرأ). وبالنظر إلى العرض الفينوتيالأكثر اعتدالاً للأم، لا يزال يمكن اعتبار ذلك متغيراً نادراً قد يكون مسؤولاً عن الأنماط الظاهرية للمرض. (2) درجات pLI من TBX2 في ExAC/gnomAD هي 0.96/0.99، وهو مرتفع (الحد الأقصى = 1.00). وبالإضافة إلى ذلك، فإن درجة LOF (الملحوظة/المتوقعة) في gnomAD هي 0.05 (فقط 1/18.6 متغير LOF المتوقع لوحظ في gnomAD). تشير هذه الأرقام إلى أن المتغيرات LOF في هذا الجين يتم اختيارضد في عموم السكان.

بالإضافة إلى ذلك، (3) يتم حفظ p.R20 تطوريا من C. elegans وDrosophila للبشر، مما يشير إلى أن هذا قد يكون بقايا هامة لوظيفة TBX2. (4) برامج متعددة تتوقع أن البديل من المرجح أن تكون ضارة (polyphen: ربما / ربما ضارة، SIFT: الضارة، CADD درجة: 24.4، REVEL درجة: 0.5). (5) تظهر متحولات MO عيوباً في الأنسجة المتأثرة بالمرضى (على سبيل المثال، الفئران بالضربة القاضية التي تظهر عيوباً في جهاز القلب والأوعية الدموية، والجهاز الهضمي/الجهاز الهضمي، والوجه القحفي، والأطراف/الرقم). وبالتالي، جنبا إلى جنب مع الروابط البيولوجية بين TBX1 و TBX2 والروابط phenotypic بين هؤلاء المرضى ومتلازمة ديجورج، كان الأمثل لإجراء دراسات وظيفية من المتغيرات في هذا الجين باستخدام Drosophila.

لتقييم ما إذا كان البديل p.R20Q يؤثر على وظيفة TBX2، تم إنشاءخط T2A-GAL4 في bifid (ثنائية ؛ تقويم العظام Drosophila من TBX2الإنسان) ، عن طريق RMCE من الترميز انترولي MiMIC (الشكل2)87. هذا allele, ثنائيةT2A-GAL4, كان متنحي ة وتصرف كمتحولة LOF قوية, على غرار ما سبق الإبلاغ عنه bi LOF alleles (على سبيل المثال, ثنائيةD2, ثنائيD4; الشكل 2 تمإنقاذ قاتلة هذه الأليلات ثنائية الكلاسيكية وولدت حديثا من قبل بناء إنقاذ الجينوم ة 80 كيلوبايت التي تحمل المكان الثنائي بأكمله، مما يشير إلى أن هذه الكواشف هي في الواقع الأليلات LOF نظيفة. كما يتطابق نمط التعبير عن GAL4 في خط T2A-GAL4 ثنائي بشكل جيد مع الأنماط التي تم الإبلاغ عنها سابقاً من التعبير الثنائي في أنسجة متعددة بما في ذلك في القرص التخيلي الجناح (الشكل2D).

وبالتوازي مع ذلك، تم إنشاء خطوط المعدلة وراثياً من قبل UAS لتسلسلات TBX2 التي تحمل المرجع أو المتغير (p.R20Q). ولسوء الحظ، لم يتمكن أي من الجين اتلاف خط T2A-GAL4 ثنائي. الأهم من ذلك، ويطير البرية من نوع UAS-bi transgene فشلت أيضا في إنقاذ ثنائيةT2A-GAL4 أليل، على الأرجح بسبب حساسية الجرعة من هذا الجين. في الواقع، تسبب التعبير المفرط من UAS-bi+ و UAS-TBX2+ إلى درجة ما من الفتك عندما أعرب عن مبالغة في الحيوانات البرية من النوع. وقد استخدم هذا التأثير السام للتعبير المفرط ثنائي/TBX2 كتقييم وظيفي لتقييم ما إذا كان متغير p.R20Q قد يؤثر على وظيفة TBX2. منذ تم دراسة جين Drosophila ثنائي على نطاق واسع في سياق النظام البصري [يعرف الجين أيضا باسم أعمى الحركية البصرية (omb)]، تم التحقيق على نطاق واسع في الأنماط الظاهرية المتعلقة بالنظام البصري. عندما تم التعبير عن الإشارة TBX2 باستخدام سائق ey-GAL4 الذي يعبر عن UAS-transgenes في العين وأجزاء من الدماغ ذات الصلة بالنظام البصري، ~ 85٪ قاتلة (الشكل3C، لوحة الحق) وكبيرة وقد لوحظ انخفاض حجم العين (الشكل4باء). وكان هذا النمط الظاهري أقوى من النمط الظاهري الذي لوحظ عندما تم التعبير عن ناقل ة طائرة من النوع البري UAS-bi، مما يشير إلى أن TBX2 البشري هو أكثر ضررا على ذبابة عندما أعرب عن مبالغة.

ومن المثير للاهتمام، كان p.R20Q TBX2 أقل فعالية في التسبب في الفتك (الشكل3C،اللوحة اليمنى) وفي تحفيز النمط الظاهري العين الصغيرة (الشكل4B)باستخدام نفس السائق تحت حالة متطابقة87،مما يشير إلى أن البديل يؤثر على وظيفة البروتين. وعلاوة على ذلك، فإن وظيفة المستقبلات الضوئية الإفراط في التعبير عن مرجع ومتغير TBX2 باستخدام سائق GAL4 مختلفة، (Rh1-GAL4) التي تعبر على وجه التحديد الجينات المتحولة UAS في مستقبلات ضوئية R1-R6، كشفت أن البديل TBX2 عرضت أكثر اعتدالا ERG النمط الظاهري مقارنة مع الرقم المرجعي TBX2 (الشكل4B)87. ومن المثير للاهتمام، أن معظم بروتين TBX2 p.R20Q لا يزال موجودًا في النواة، على غرار البروتين المرجعي، مما يشير إلى أن البديل لم يؤثر على التوطين النووي. وأظهرت دراسة قمع ية على أساس لوسيفيراز في خلايا HEK293T أن p.R20Q لم تكن قادرة على قمع فعال نسخ من بناء مراسل مع مواقع T-box palindromic87. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ انخفاض في مستويات البروتين من TBX2p.R20Q بالمقارنة مع TBX2+، مما يشير إلى أن البديل قد يؤثر على الترجمة أو استقرار البروتين من TBX2 ، والذي يؤثر بدوره على وفرة داخل الخلية.

تم تحديد مرضى إضافيين يعانون من المتغيرات النادرة في TBX2 من قبل الأطباء في موقع UDN Duke السريري بالتوازي مع هذه الدراسات التجريبية.  صبي يبلغ من العمر 8 سنوات مع سوء فهم دي نوفو (p.R305H) البديل من عائلة لا علاقة لها عرضت العديد من الميزات الموجودة في الأسرة الأولى87. كشفت دراسات وظيفية إضافية في Drosophila وخطوط الخلايا البشرية أن البديل p.R305H يؤثر أيضا على وظيفة TBX2 ومستويات البروتين، مما يشير بقوة إلى أن العيوب في هذا الجين من المرجح أن تكمن وراء العديد من الأنماط الظاهرية الموجودة في العائلتين. وقد تم مؤخرا رعاية هذا الاضطراب باسم "الشذوذ الفقرات والغدد الصماء المتغيرة وخلل في الخلايا T" (VETD، MIM #618223) في OMIM. تحديد أفراد إضافيين مع المتغيرات الضارة في TBX2 مع الأنماط الظاهرية المتداخلة أمر بالغ الأهمية لفهم الطيف الكامل للعلاقات النمط الجيني النمط الظاهري لهذا الجين في الأمراض البشرية.

Figure 1
الشكل 1 حقن وعبور مخطط لتوليد UAS-الإنسان cDNA وخطوط T2A-GAL4. (أ) توليد الجينات المتحولة من قبل UAS-human cDNA من خلال الحقن المجهري والصلبان. يظهر على سبيل المثال مخطط عبور لدمج الجينات المتحولة في موقع إرساء كروموسوم ثاني (VK37) باستخدام الذباب الذكور في الجيلين الأول والثاني. عند حقن الإنسان cDNA φC31 بناء المعدلة وراثيا (pGW-HA.attB) في الأجنة المبكرة التي تحتوي على مصدر الجرثومية من φC31 integrase (المسمى مع 3xP3-GFP و 3xP3-RFP) وVK37 موقع الإرساء [المسمى مع أصفر+ (ص+ + ) علامة] ، يمكن اتباع الأحداث المعدلة وراثيا مع الأبيض+ (ث+) الجين المصغر الموجود في ناقلات المعدلة وراثيا. فمن المستحسن لعبور integrase φC31 عن طريق اختيار ضد الذباب مع GFP وRFP. يمكن الاحتفاظ بالمخزون المستقر النهائي كالمتجانسات أو كمخزون متوازن إذا كان الكروموسوم يحمل موقع ًا ثانيًا طفرة قاتلة/معقمة. وجود الموقع الثاني الطفرات القاتلة / المعقمة على المنشآت المعدلة وراثيا عادة لا يؤثر على نتيجة الدراسات الوظيفية طالما يتم استخدام هذه الجينات في حالة غير متجانسة (الشكل3). (ب) توليد خطوط T2A-GAL4 من خلال الحقن المجهري والصلبان. يظهر مخطط العبور لتحويل إدخال MiMIC كروموسوم ثاني إلى عنصر T2A-GAL4 كمثال. عن طريق حقن ناقل تعبير لφC31 integrase وناقلات RMCE لT2A-GAL4 (pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70، يتم اختيار إطار القراءة المناسب لMiMIC من الفائدة. انظر الأوراق التالية للحصول على تفاصيل57،59 في الأجنة التي تحمل MiMIC في intron الترميز في الجينات ذات الأهمية ، يمكن للمرء تحويل MiMIC الأصلي إلى خط T2A GAL4. الشكل 2 يظهر رسم تخطيطي لتحويل RMCE. يمكن اختيار حدث التحويل عن طريق الفرز مقابل علامة y+ في كاسيت MiMICالأصلي 60. منذ RMCE يمكن أن تحدث في اتجاهين، فقط 50٪ من حدث التحويل الناجح يؤدي إلى إنتاج ناجح من GAL4، والتي يمكن الكشف عنها من قبل مراسل UAS-GFP transgene في الجيل القادم. ويمكن الاحتفاظ بالمخزون المستقر النهائي كمتجانسات أو كمخزون متوازن إذا كان LOF للجين قاتلًا/معقمًا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 تحويل عناصر MiMIC إلى خطوط T2A-GAL4 عبر RMCE. (A) φC31 integrase يسهل إعادة الجمع بين موقعي attP اثنين في ذبابة (أعلى) واثنين من المواقع attB المحيطة كاسيت T2A-GAL4 يظهر كمتجه دائري (أسفل). (ب) أحداث RMCE الناجحة تؤدي إلى فقدان علامة للاختيار (أصفر+) وإدراج كاسيت T2A-GAL4 في نفس الاتجاه من الجين من الفائدة. وبما أن حدث RMCE يمكن أن يحدث في اتجاهين، فإن 50% فقط من رد فعل RMCE ينتج المنتج المطلوب. منتج RMCE إدراجها في الاتجاه المعاكس لن تعمل كأليل فخ الجينات أو التعبير GAL4. يجب تأكيد اتجاه البناء عن طريق تسلسل Sanger. (C) النسخ (أعلى) والترجمة (أسفل) من الجين من الفائدة يؤدي إلى توليد mRNA مقتطعة والبروتين بسبب إشارة بوليا موجودة في نهاية 3 'من كاسيت T2A-GAL4. وT2A هو إشارة تخطي ريبوسوم، والذي يسمح للريبوسوم لوقف وإعادة بدء الترجمة بعد هذه الإشارة. يتم استخدام هذا لإنشاء عنصر GAL4 غير متصل بشكل مشترك إلى المنتج الجيني المقتطع ة الفائدة. وستدخل GAL4 النواة وستسهل نسخ الجينات المتحولة التي تخضع لسيطرة عناصر UAS. يمكن استخدام UAS-GFP كمراسل تعبير جيني، ويمكن استخدام CDNA UAS-human لتجارب الإنقاذ عن طريق "إضفاء الطابع الإنساني" على الجينات. (D) هو مثال على عنصر T2A-GAL4 في التعبير عن القيادة ثنائية من UAS-GFP (أعلى). يشبه نمط التعبير هذا خط فخ محسن تم إنشاؤه مسبقًا لنفس الجين (biomb-GAL4; أسفل). (E) مقارنة بين T2A-GAL4 allele من ثنائية مع LOF bi alleles التي تم الإبلاغ عنها سابقا. وقد اعتمد هذا الرقم وعدل من المنشورات السابقة٥٧و٨٧. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 التحليل الوظيفي للمتغيرات البشرية باستخدام الدراسات المستندة إلى الإنقاذ (يسار) والدراسات المستندة إلى التعبير المفرط (يمين). (أ) (اللوحة اليسرى): تم تقييم وظيفة المتغيرات EBF3 مع تحليل يستند إلى الإنقاذ من عقدة ذبابة (kn) LOF أليل مع التركيز على الفتك / البقاء على قيد الحياة؛ (اللوحة اليمنى): تم تقييم وظيفة المتغيرات في TBX2 من خلال إجراء التعبير المفرط للجينات المتحولة من نوع TBX2 البشرية في الذباب البري، مع التركيز على الفتك/ الجدوى، ومورفولوجيا العين، والأنماط الظاهرية للفيزيولوجيا الكهربائية (الشكل 4) . (ب) مخططات العبور للحصول على الذباب ليتم اختبارها في الدراسات الوظيفية. ينصح دائماً باستخدام عنصر UAS محايد (على سبيل المثال، UAS-lacZ، UAS-GFP)كتجربة تحكم. (C) النتائج التمثيلية من الدراسات الوظيفية للمتغيرات EBF3p.R163Q و TBX2p.R20Q، على التوالي، جنبا إلى جنب مع تجارب التحكم المناسبة اللازمة لتفسير النتائج. ويكشف كل من التحليل القائم على الإنقاذ والدراسات المفرطة التعبير أن المتغيرات يتصرف ونفة غير متبلور أو هيبومورفيك. وتستند بيانات الفتك/الصلاحية المبينة هنا إلى البيانات التجريبية الواردة في المنشورات السابقة15و87. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 التحليل الوظيفي لمتغير نادر غير منطقي في TBX2 البشري على أساس مورفولوجيا العين والكهربائي في دروسوفيلا. (أ) صورة تخطيطية تظهر الموضع النموذجي للتسجيل والأقطاب المرجعية على عين الذبابة، جنبا إلى جنب مع تسجيل الكهربائي التمثيلي مع أربعة مكونات رئيسية (على عابرة، إزالة الاستقطاب، خارج عابرة، إعادة الاستقطاب). (B) TBX2 البديل (p.R20Q) يعمل كأليل LOF جزئية على أساس دراسات التعبير المفرط في العين ذبابة باستخدام السائقين GAL4 محددة للنظام البصري (ey-GAL4 و Rh1-GAL4). وأظهر هذا أن الرقم المرجعي TBX2 تسبب في النمط الظاهري المورفولوجي والفسيولوجي القوي مقارنة بالبروتين البديل. (الألواح العليا): ينظر إلى انخفاض حاد في حجم العين على التعبير المفرط من UAS-TBX2+ مع ey-GAL4. UAS-TBX2p.R20Q. مدفوعة مع ey-GAL4 يسبب أيضا العين أصغر, ولكن النمط الظاهري هو أكثر اعتدالا بكثير. (لوحات أسفل): عندما يتم التعبير عن UAS-TBX2+ في مستقبلات ضوئية R1-R6 الأساسية باستخدام Rh1-GAL4، هناك فقدان للعابرين على وخارج، وانخفاض إزالة الاستقطاب، وكبيرة غير طبيعية إزالة الاستقطاب لفترات طويلة بعد النمط الظاهري المحتمل (PDA)، الذي لا ينظر إليه في الذباب السيطرة. هذه الأنماط الظاهرية ليست شديدة كما هو الحال عندما يتم التعبير عن UAS-TBX2p.R20Q باستخدام نفس Rh1-GAL4. وقد اعتمد هذا الرقم وعدل من المنشورات السابقة69و87 . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الغرض اداه Url
متغير وظيفة
خوارزميات التنبؤ		 بولي فين-2
التدقيق
فى الانمابة
بروفيان
متذوق الطفرة
عربد		 http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2
https://sift.bii.a-star.edu.sg
https://cadd.gs.washington.edu
http://provean.jcvi.org/index.php
http://www.mutationtaster.org
https://sites.google.com/site/revelgenomics
نادرة وغير مشخصة
أبحاث المرض
اتحادات		 UDN
فى السنوات
IRUD
SOLVE-RD
فى الانماع		 https://undiagnosed.hms.harvard.edu
http://www.rare-diseases-catalyst-network.ca
https://irudbeyond.nig.ac.jp/en/index.html
http://solve-rd.eu
https://www.functionalgenomics.org.au
قاعدة بيانات تكاملية لـ
الإنسان ونموذج
معلومات عن الكائن الحي		 مارفيل
مبادرة الملك
جين2Function
فينولس		 http://marrvel.org
https://monarchinitiative.org
http://www.gene2function.org
http://www.phenologs.org
الوراثية البشرية و
قواعد بيانات الجينوم		 فى الانمايات
كلينفار
ExAC
محمد محمد
جينوإم ب
DGV
فك		 https://www.omim.org/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
http://exac.broadinstitute.org/
http://gnomad.broadinstitute.org/
http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/#/
http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home
https://decipher.sanger.ac.uk/
أداة تحديد تقويم العظام ديابت https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
نموذج الكائن الحي
قواعد البيانات والطب الحيوي
البحث عن الأدب		 قاعدة الدودة (C elegans)
قاعدة الطيران(دروسوفيلا)
ZFIN (حمار وحشي)
إم جي آي (ماوس)
مجلات		 https://www.wormbase.org
http://flybase.org
https://zfin.org
http://www.informatics.jax.org
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
الوراثية والبروتينية
قواعد بيانات التفاعل		 سلسله
الضباب		 https://string-db.org
http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/
بنية البروتين
قواعد البيانات و
أدوات النمذجة		 WWPBD
نموذج سويسري
مُوّر أزياء
فير2 		http://www.wwpdb.org
https://swissmodel.expasy.org/
https://salilab.org/modeller/
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2
التوفيق بين المرضى
منصات		 تبادل الخاطب
جين ماكر
أرشيف أغا
مربع الثقاب
فك
ماي جين2
فينوم سنترال		 http://www.matchmakerexchange.org
https://www.genematcher.org
https://mme.australiangenomics.org.au/#/home
https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox
https://decipher.sanger.ac.uk
https://www.mygene2.org/MyGene2
https://phenomecentral.org
نسخة بشرية
التعليق التوضيحي وcDNA
استنساخ المعلومات		 مجموعة جينات الثدييات
إنكمبل
رفيق		 https://genecollections.nci.nih.gov/MGC
http://useast.ensembl.org
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

الجدول 1: الموارد المتاحة على الإنترنت المتصلة بهذا البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توفر الدراسات التجريبية باستخدام Drosophila melanogaster نظام تقييم قوي لتقييم عواقب المتغيرات البشرية المرتبطة بالأمراض. ويرجع ذلك إلى مجموعة كبيرة من المعرفة والأدوات الوراثية المتنوعة التي تم إنشاؤها من قبل العديد من الباحثين في مجال الطيران على مدى القرن الماضي89. ومع ذلك، فإن من المهم، شأنهشأن أي نظام تجريبي آخر، الاعتراف بالمحاذير والقيود القائمة.

المحاذير المرتبطة باستخراج البيانات
وعلى الرغم من أن الخطوة الأولى في هذا البروتوكول هي استخدام قواعد البيانات المتعلقة بالألغام للحصول على معلومات تتعلق بجين ذي أهمية، فمن المهم استخدامه كنقطة انطلاق فقط. على سبيل المثال، على الرغم من أن التنبؤ في silico من وظيفة متغير يوفر رؤى قيمة، وينبغي دائما تفسير هذه البيانات بحذر. هناك بعض الحالات التي تتوقع فيها جميع الخوارزميات الرئيسية أن البديل البشري حميدة، ولكن الدراسات الوظيفية في دروسوفيلا أظهرت بوضوح الطبيعة الضارة لمثل هذا البديل24. وبالمثل، على الرغم من أن التفاعلات البروتينالبروتينية، والتعبير المشترك، وبيانات النمذجة الهيكلية كلها أجزاء ثاقبة من المعلومات، قد تكون هناك معلومات إيجابية زائفة وسلبية زائفة موجودة في مجموعات البيانات الكبيرة هذه. على سبيل المثال، قد تكون بعض التفاعلات البروتينالبروتينية التي تم تحديدها أو التنبؤ بها سابقاً اصطناعية أو لا تُرى إلا في أنواع معينة من الخلايا والأنسجة.

وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون هناك العديد من التفاعلات السلبية الزائفة التي لم يتم التقاطها في مجموعات البيانات هذه، لأن بعض التفاعلات البروتينية والبروتينية عابرة (على سبيل المثال، تفاعلات الأنزيم والركيزة). التحقق التجريبي أمر بالغ الأهمية لإثبات أن بعض الجينات أو البروتينات وراثيا أو جسديا تتفاعل في الجسم الحي في السياق البيولوجي للاهتمام. وبالمثل، ينبغي معاملة الهياكل المتوقعة القائمة على نمذجة الهومولوجيا على أنها نموذج بدلا من أن تحل. على الرغم من أن هذه المعلومات قد تكون مفيدة إذا وجد أن الأحماض الأمينية ذات الأهمية موجودة في جزء مهم هيكليا من البروتين, البيانات السلبية لا تستبعد إمكانية أن البديل قد تكون ضارة. وأخيراً، ينبغي أيضاً التعامل بحذر مع بعض المعلومات ذات النمط الجيني الظاهري المبلغ عنها سابقاً، لأن بعض المعلومات المحفوظة في قواعد البيانات العامة قد لا تكون دقيقة. فعلى سبيل المثال، تستند بعض المعلومات الواردة في قواعد بيانات وزارة الدفاع إلى تجارب تمت التحكم فيها بشكل جيد وتنفيذها بدقة، في حين أن معلومات أخرى قد تأتي من ورقة شاشة كبيرة لا تتضمن دراسات متابعة أخرى وضوابط صارمة.

تجارب "الأنسنة" باستخدام استراتيجية T2A-GAL4 غير ناجحة دائماً
وفي حين أن الدراسات الوظيفية القائمة على الإنقاذ والتعبير المفرط باستخدام القدرات المحلية البشرية تسمح بتقييم المتغيرات في سياق البروتين البشري، فإن هذا النهج ليس ناجحاً دائماً. إذا كان مرجع cDNA الإنسان لا يمكن إنقاذ النمط الظاهري متحولة ذبابة، وهناك تفسيرين محتملين. الاحتمال الأول هو أن البروتين البشري غير وظيفي أو قد انخفض النشاط بشكل كبير في سياق خلية ذبابة. قد يكون هذا بسبب 1) انخفاض التعبير البروتين، والاستقرار، والنشاط و / أو التوطين أو 2) عدم التوافق مع البروتينات ذبابة التي تعمل في مجمع متعدد البروتين. وبما أن نظام UAS/GAL4 حساس لدرجة الحرارة، يمكن رفع الذباب عند درجة حرارة عالية نسبياً (على سبيل المثال، 29 درجة مئوية) لمعرفة إمكانية الإنقاذ في هذه الحالة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إنشاء وحدة من عمليات تحويل الحمض النووي الريبي (UAS-fly) والتحويل كعنصر تحكم إيجابي. إذا كان البديل من الفائدة يؤثر على الأحماض الأمينية المحفوظة، يمكن إدخال البديل مماثلة في cDNA ذبابة للدراسة الوظيفية للمتغير في سياق ortholog ذبابة. على الرغم من أن هذا ليس ضروريا، فإنه يساعد إلى حد كبير الدراسة في الحالات التي تستخدم خطوط cDNA البشرية المعدلة وراثيا تعطي نتائج سلبية أو غير حاسمة (الشكل3).

الاحتمال الثاني هو أن التعبير عن البروتين البشري يسبب بعض السمية على مستوى الخلايا أو الكائن الحي. قد يكون هذا بسبب مضاد للمورفّث (على سبيل المثال، بمثابة بروتين سلبي مهيمن)، وفرط الأشكال (على سبيل المثال، الكثير من النشاط)، أو نيومورفيك (على سبيل المثال، كسب وظيفة سامة جديدة مثل تجميع البروتين الذي لا يرتبط دائماً بالوظيفة الذاتية لجين الفائدة) الآثار. في هذه الحالة، فإن الحفاظ على الذباب في درجة حرارة منخفضة (على سبيل المثال، 18 درجة مئوية) قد يخفف من بعض هذه المشاكل. وأخيرا، هناك بعض السيناريوهات التي الإفراط في التعبير عن cDNA ذبابة قد لا ينقذ خط T2A-GAL4 ذبابة كما رأينا في المثال TBX2، من المرجح بسبب الاعتماد على جرعة trict من المنتج الجيني. لتجنب الإفراط في التعبير عن البروتين من الفائدة، يمكن تعديل جين ذبابة من الفائدة مباشرة عن طريق CRISPR، يمكن تصميم بناء إنقاذ الجينوم الذي يحتوي على البديل من الاهتمام، أو يمكن إجراء تجارب الإنقاذ باستخدام آليل LOF21. بالنسبة للجينات الصغيرة، يمكن اعتبار "إضفاء الطابع الإنساني" على بناء الإنقاذ الجينومي الطائر لاختبار المتغيرات البشرية التي تؤثر على الأحماض الأمينية غير المحفوظة24. وباختصار، ينبغي النظر في استراتيجيات بديلة عندما لا تسمح تجربة إضفاء الطابع الإنساني بإجراء تقييم وظيفي لمتغير الاهتمام.

تفسير النتائج السلبية والإيجابية
إذا كان كل من المرجع والبديل cDNAs الإنسان إنقاذ الأنماط الظاهرية متحولة ذبابة إلى درجة مماثلة و 2) لا يوجد فرق لوحظ في جميع الظروف اختبارها، ثم يمكن افتراض أن البديل هو وظيفيا لا يمكن تمييزها في Drosophila في فيفو. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن هذه المعلومات لا تكفي لاستبعاد أن البديل من الفائدة غير المسببة للأمراض، لأن اختبار دروسوفيلا قد لا يكون حساسا بما فيه الكفاية أو التقاط جميع الوظائف المحتملة للجين / البروتين من الفائدة ذات الصلة بالبشر. البيانات الإيجابية، من ناحية أخرى، هو مؤشر قوي على أن البديل له عواقب ضارة على وظيفة البروتين، ولكن هذه البيانات وحدها لا تزال غير كافية للمطالبة بالإمراض. وقد نشرت الكلية الأمريكية لعلم الوراثة الطبية وعلم الجينوم (ACMG) مجموعة من المعايير والمبادئ التوجيهية لتصنيف المتغيرات في الجينات المرتبطة بالأمراض البشرية إلى "حميدة"، "حميدة على الأرجح"، "البديل غير معروف أهمية (VUS)"، "من المرجح أن تكون المسببة للأمراض"، و "المسببة للأمراض"90. على الرغم من أن هذا التصنيف ينطبق فقط على الجينات الراسخة المرتبطة بالأمراض ولا ينطبق مباشرة على المتغيرات في "الجينات ذات الأهمية غير المؤكدة" (GUS)، يتم تشجيع جميع الأفراد المشاركين في الدراسات الوظيفية البديل البشري بقوة على الالتزام بهذا المبدأ التوجيهي عند الإبلاغ عن وظيفة متغير.

استخراج معلومات بيولوجية مفيدة عندما MO فينولات لا نموذج حالة مرض بشري
من المهم أن نضع في اعتبارنا أن الاختبارات الوظيفية القائمة على التعبير المفرط لها قيود، خاصة وأن بعض الأنماط الظاهرية التي يتم تسجيلها قد لا تكون لها صلة تذكر بحالة المرض ذات الاهتمام. وبالمثل، قد لا تكون للأنواع الظاهرية التي يجري تقييمها من خلال تجارب الإنقاذ أي صلة مباشرة بمرض الفائدة. وبما أن هذه التجارب تجري خارج السياقات الذاتية في نظام لافقاري، فلا ينبغي اعتبارها نماذج للأمراض بل كاختبار لوظيفة الجينات باستخدام دروسوفيلا بوصفها "أنبوب اختبار حي".

وحتى إذا كان الكائن الحي النموذجي لا يحاكي حالة مرض بشري، فإن الأنماط الظاهرية القابلة للتآكل المستخدمة في تجارب الإنقاذ يمكن أن توفر في كثير من الأحيان رؤى بيولوجية مفيدة في حالات المرض. مفهوم "فينولوغات (الأنماط الظاهرية المتجانسة غير واضحة)"91 يمكن استخدامها لمزيد من تحديد الروابط الجزيئية الكامنة بين Drosophila والأنماط الظاهرية البشرية. على سبيل المثال، الأنماط الظاهرية المورفولوجية في جناح الطيران، والصدر، والساقين، والعينين هي قراءة فينوتيبيك ممتازة للعيوب في مسار الإشارات الشق، وهو مسار الحفاظ على تطوري مرتبط ة بالعديد من الاضطرابات الخلقية، بما في ذلك عيوب القلب والأوعية الدموية في البشر62. من خلال فهم المنطق الجزيئي وراء بعض الأنماط الظاهرية في دروسوفيلا، فمن الممكن تحديد الروابط البيولوجية الخفية بين الجينات والأنماط الظاهرية في البشر التي لم يتم فهمها بعد.

التواصل المستمر مع المتعاونين السريريين
عند العمل مع الأطباء لدراسة وظيفة متغير نادر وجدت في المريض، من المهم إقامة علاقة تعاونية قوية. على الرغم من أن الباحثين الطبيين الطبيين السريريين والأساسيين قد يتشاركون في المصالح في نفس الجينات/المسارات الوراثية، إلا أن هناك فجوة ثقافية ولغوية كبيرة (مثل المصطلحات الطبية، والتسميات النموذجية الخاصة بالكائنات الحية) بين المجالين السريري والعلمي. ويمكن بناء علاقة قوية قائمة على الثقة بين الطرفين من خلال اتصالات واسعة النطاق. وعلاوة على ذلك، فإن الاتصال ثنائي الاتجاه أمر بالغ الأهمية لإقامة هذه العلاقة والحفاظ عليها. فعلى سبيل المثال، في الحالتين الموصوفتين في قسم النتائج التمثيلية، كان تحديد المرضى الإضافيين الذين يعانون من أنماط جينية وظاهرية مماثلة، فضلا عن الدراسة الوظيفية اللاحقة، أمرا حاسما لإثبات إمراض المتغيرات ذات الأهمية. حتى مع البيانات الوظيفية القوية، غالباً ما يواجه الباحثون والأطباء صعوبات في إقناع علماء الوراثة البشرية بأن البديل المحدد في حالات "n = 1" هو السبب الحقيقي للمرض.

بمجرد أن يحدد الباحث MO أن البديل من الفائدة يضر، فمن الأهمية بمكان التواصل مرة أخرى إلى المتعاونين السريرية في أقرب وقت ممكن حتى يتمكنوا من محاولة بنشاط لتحديد الحالات المطابقة عن طريق التواصل مع الأطباء الآخرين وعلماء الوراثة البشرية. أدوات مثل جينو2MP [الأنماط الجينية للأنماط الظاهرية المندلية: قاعدة بيانات غير محددة من 9,650 الأفراد المسجلين في مركز جامعة واشنطن للدراسة الجينومية المندلية41; تشمل المرضى وأفراد الأسرة المشتبه في وجود اضطرابات وراثية] يمكن البحث فيها لتقييم الأفراد الذين قد يكون لديهم نفس الاضطراب. بعد ذلك، يمكن الاتصال بالطبيب الرئيسي باستخدام ميزة المراسلة.

بدلا من ذلك، يمكن استخدام GeneMatcher، وهو موقع التوفيق بين الأطباء والباحثين الأساسيين، والمرضى الذين يشتركون في المصالح في نفس الجينات لتحديد المرضى الإضافيين الذين يحملون متغيرات نادرة. منذ GeneMatcher هو جزء من شبكة تكاملية أكبر من مواقع التوفيق تسمى Matchmaker Exchange42، يمكن البحث في قواعد بيانات إضافية في جميع أنحاء العالم ، بما في ذلك أرشيف المرضى تحالف صحة الجينوم الأسترالي ، مربع الثقاب الواسع ، DECIPHER، MyGene2، وفينومسنترال في تقديم جينماكر واحد. على الرغم من أن المشاركة في GeneMatcher ممكن ك "باحث"، فمن المستحسن أن العلماء الأساسيين استخدام هذا الموقع مع المتعاونين السريرية، منذ التواصل مع الأطباء الآخرين بعد مباراة يتطلب مستويات معينة من الطبية الخبره.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر خوسيه سالازار وجوليا وانغ والدكتورة كارين شولتز على القراءة النقدية للمخطوطة. ونحن نعترف الدكتورين نينغ ليو وشي لو للتوصيف الوظيفي للمتغيرات TBX2 التي نوقشت هنا. تم دعم مركز فحص الكائنات الحية النموذجية للأمراض غير المشخصة من خلال الصندوق المشترك للمعاهد الوطنية للصحة (U54 NS093793). H. T. C. كما تم دعمها من قبل NIH [CNCDP-K12 وNINDS (1K12 NS098482)] ، الأكاديمية الأمريكية لعلم الأعصاب (منحة أبحاث علم الأعصاب)، صندوق بوروز ويلكوم (جائزة مهنية للعلماء الطبيين)، جمعية طب الأعصاب لدى الأطفال ومؤسسة طب الأعصاب لدى الأطفال ( منحة بيرف الترمان)، وجائزة الاستقلال المبكر لمدير المعهد الوطني للصحة (DP5 OD026426). كما حظيت بالدعم من مؤسسة سيمونز (جائزة SFARI: 368479). S. Y. بدعم كذلك من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 DC014932)، ومؤسسة سيمونز (جائزة SFARI: 368479)، وجمعية الزهايمر (منحة البحث الباحث الجديد: 15-364099)، صندوق الأسرة نعمان للبحوث الأساسية، وكارولين ويس صندوق القانون للبحوث في الطب الجزيئي. يتم دعم الفحص المجهري البؤري في BCM جزئيامن قبل NIH منحة U54HD083092 لمركز بحوث الإعاقات الذهنية والتنموية (IDDRC) نواة التصور العصبي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l, Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , Forthcoming (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , Forthcoming (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer's Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , Forthcoming (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), Cambridge, England. 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, Clifton, N.J. 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, Clifton, N.J. 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , Forthcoming (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), Cambridge, England. 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE--Collier/Olf1/EBF--transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing and Wiley-Interscience. New York. (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

علم الوراثة العدد 150 علم الوراثة البشرية وعلم الجينوم الأمراض المندلية الأمراض النادرة وغير المشخصة شبكة الأمراض غير المشخصة Drosophila melanogaster البديل من أهمية غير معروفة VUS الجينات ذات الأهمية غير المؤكدة GUS وظيفية علم الجينوم، الذباب المعدل وراثيا، نظام UAS/GAL4، T2A-GAL4، الكهربائي، ERG
في فيفو دراسة وظيفية من المتغيرات البشرية النادرة المرتبطة بالأمراض باستخدام <em>دروسوفيلا</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao,… More

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H. T., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter