In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

Summary

Ziel dieses Protokolls ist es, das Design und die Leistung von In-vivo-Experimenten in Drosophila melanogaster zu skizzieren, um die funktionellen Folgen seltener Genvarianten im Zusammenhang mit menschlichen Krankheiten zu bewerten.

Abstract

Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie haben Vollgenom- und Ganzexom-Datensätze sowohl für die klinische Diagnose als auch für die Spitzenforschung der Humangenetik zugänglicher gemacht. Obwohl eine Reihe von Silico-Algorithmen entwickelt wurden, um die Pathogenität der in diesen Datensätzen identifizierten Varianten vorherzusagen, sind funktionelle Studien entscheidend, um zu bestimmen, wie spezifische genomische Varianten die Proteinfunktion beeinflussen, insbesondere für Missense Varianten. Im Undiagnosed Diseases Network (UDN) und anderen Forschungskonsortien für seltene Krankheiten werden Modellorganismen (MO) einschließlich Drosophila, C. elegans,Zebrafische und Mäuse aktiv verwendet, um die Funktion von vermeintlichen menschlichen Krankheiten zu bewerten. Varianten. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur funktionellen Bewertung seltener menschlicher Varianten, die im Model Organisms Screening Center Drosophila Core des UDN verwendet werden. Der Workflow beginnt mit dem Sammeln von menschlichen und MO-Informationen aus mehreren öffentlichen Datenbanken, wobei die MARRVEL-Webressource verwendet wird, um zu beurteilen, ob die Variante wahrscheinlich zum Zustand eines Patienten beiträgt, sowie effektive Experimente auf der Grundlage verfügbarer Wissen und Ressourcen. Als nächstes werden genetische Werkzeuge (z.B. T2A-GAL4 und UAS-Human cDNA-Linien) generiert, um die Funktionen von Varianten von Interesse an Drosophilazu bewerten. Bei der Entwicklung dieser Reagenzien können zweigleisige funktionelle Assays auf Basis von Rettungs- und Überexpressionsexperimenten durchgeführt werden, um die Variantenfunktion zu bewerten. Im Rettungszweig werden die endogenen Fliegengene "humanisiert", indem das orthologe Drosophila-Gen durch Referenz- oder Varianten-Humantransgene ersetzt wird. Im Überexpressionszweig werden die Referenz und die Variante menschlicher Proteine exogen in einer Vielzahl von Geweben angetrieben. In beiden Fällen kann jeder verschreibbare Phänotyp (z. B. Letalität, Augenmorphologie, Elektrophysiologie) unabhängig von der Krankheit des Interesses als Auslese verwendet werden. Die beobachteten Unterschiede zwischen Referenz- und Variantenallelen deuten auf einen variantenspezifischen Effekt und damit auf eine wahrscheinliche Pathogenität hin. Dieses Protokoll ermöglicht schnelle, in vivo Bewertungen von vermeintlichen menschlichen krankheitserregenden Varianten von Genen mit bekannten und unbekannten Funktionen.

Introduction

Patienten mit seltenen Krankheiten unterziehen sich oft einer anstrengenden Reise, die als "diagnostische Odyssee" bezeichnet wird, um eine genaue Diagnose zu erhalten¹. Es wird angenommen, dass die meisten seltenen Krankheiten einen starken genetischen Ursprung haben, was genetische/genomische Analysen zu kritischen Elementen der klinischen Aufarbeitung macht. Neben der Sequenzierung von Kandidatengenpanels und der Variationsvariation von Kopierzahlen auf Basis von chromosomalen Mikroarrays sind Die Technologien für die Ganz-Exom-Sequenzierung (WES) und die Vollgenomsequenzierung (WGS) in den letzten^zehnJahren zu immer wertvolleren Werkzeugen geworden. ³. Derzeit liegt die diagnostische Rate zur Identifizierung einer bekannten pathogenen Variante in WES und WGS bei 25 % (höher in pädiatrischen Fällen)^4,5. In den meisten Fällen, die nach dem klinischen WES/WGS nicht diagnostiziert werden, ist ein häufiges Problem, dass es viele Kandidatengene und Varianten gibt. Die Sequenzierung der nächsten Generation identifiziert häufig neuartige oder ultraseltene Varianten in vielen Genen, und es ist eine Herausforderung, zu interpretieren, ob diese Varianten zu Krankheitsphänotypen beitragen. Obwohl beispielsweise die meisten Unsinn- oder Frameshift-Mutationen in Genen als Funktionsverlust -allele (LOF) aufgrund des unsinnig vermittelten Zerfalls des codierten Transkripts angesehen werden, entweichen abgeschnittene Mutationen, die in den letzten Exons gefunden wurden, diesem Prozess und können als gutartige oder Funktionsverstärkung (GOF) Allele⁶.

Darüber hinaus ist die Vorhersage der Auswirkungen eines Missense-Alleels eine gewaltige Aufgabe, da es zu einer Reihe verschiedener genetischer Szenarien führen kann, wie Sie erstmals von Herman Muller in den 1930er Jahren beschrieben wurden (d. h. amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph oder isomorph)⁷ . Zahlreiche Silico-Programme und -Methoden wurden entwickelt, um die Pathogenität von Missense-Varianten auf der Grundlage der evolutionären Konservierung, der Art der Aminosäureänderung, der Position innerhalb eines funktionellen Bereichs, der Allelhäufigkeit in der allgemeinen Bevölkerung vorherzusagen, und andere Parameter⁸. Diese Programme sind jedoch keine umfassende Lösung, um das komplizierte Problem der Varianteninterpretation zu lösen. Interessanterweise hat eine aktuelle Studie gezeigt, dass fünf breit angelegte Varianten-Pathogenitätsvorhersagealgorithmen (Polyphen⁹, SIFT¹⁰, CADD¹¹, PROVEAN¹², Mutation Taster) sich auf Pathogenität von 80% der Zeit einigen 80% der Zeit⁸ . Bemerkenswert ist, dass selbst wenn alle Algorithmen zustimmen, sie eine falsche Vorhersage der Pathogenität bis zu 11% der Zeit zurückgeben. Dies führt nicht nur zu fehlerhaften klinischen Interpretation, sondern kann auch Forscher davon abhalten, neue Varianten zu verfolgen, indem sie sie fälschlicherweise als gutartig auflisten. Eine Möglichkeit, die aktuelle Beschränkung der Silico-Modellierung zu ergänzen, besteht darin, experimentelle Daten bereitzustellen, die die Wirkung der Variantenfunktion in vitro, ex vivo (z. B. kultivierte Zellen, Organoide) oder in vivo demonstrieren.

In vivo funktionelle Studien zu varianten seltenen Krankheiten in MO haben einzigartige Stärken¹³ und wurden von vielen Forschungsinitiativen für seltene Krankheiten auf der ganzen Welt übernommen, einschließlich des Undiagnosed Diseases Network (UDN) in den Vereinigten Staaten und Rare Krankheiten Modelle & Mechanismen (RDMM) Netzwerke in Kanada, Japan, Europa und Australien¹⁴. Zusätzlich zu diesen koordinierten Bemühungen, MO-Forscher in den Arbeitsablauf von Diagnosen seltener Krankheiten und mechanistischen Studien auf nationaler Ebene zu integrieren, haben eine Reihe individueller kollaborativer Studien zwischen klinischen und MO-Forschern zu der Entdeckung geführt. und Charakterisierung vieler neuer menschenkranker Gene und Varianten^82,83,84.

Im UDN erhält ein zentralisiertes Model Organisms Screening Center (MOSC) Einreichungen von Kandidatengenen und Varianten mit einer Beschreibung des Zustands des Patienten und beurteilt, ob die Variante mit Informatikwerkzeugen und in vivo pathogen sein dürfte. Experimente. In Phase I (2015-2018) des UDN bestand das MOSC aus einem Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] und Zebrafish Core (University of Oregon), das gemeinsam an der Beurteilung von Fällen arbeitete. Mit Hilfe der Informatikanalyse und einer Reihe verschiedener experimenteller Strategien in Drosophila und Zebrafischen hat das MOSC bisher zur Diagnose von 132 Patienten beigetragen, die Identifizierung von 31 neuen Syndromen⁵⁵, Entdeckung mehrerer neuer Krankheitsgene (z.B. EBF3¹⁵, ATP5F1D¹⁶, TBX2¹⁷, IRF2BPL¹⁸, COG4¹⁹, WDR37²⁰) und phänotypische Ausdehnung bekannter Krankheiten Gene (z. B. CACNA1A²¹, ACOX1²²).

Zusätzlich zu den Projekten innerhalb des UDN haben MOSC Drosophila Core-Forscher in Zusammenarbeit mit den Centers for Mendelian Genomics und anderen Initiativen (z.B. ANKLE2²³, TM2D3) zu neuen Entdeckungen von Krankheitsgenen beigetragen. ²⁴, NRD1²⁵, OGDHL²⁵, ATAD3A²⁶, ARIH1²⁷, MARK3²⁸, DNMBP²⁹) mit dem gleichen Satz von Informatik und Genetik Strategien, die für die UDN entwickelt wurden. Angesichts der Bedeutung von MO-Studien zur Diagnose seltener Krankheiten wurde das MOSC um einen C. elegans Core und einen zweiten Zebrafischkern (beide an der Washington University in St. Louis) für Phase II (2018-2022) des UDN erweitert.

Dieses Manuskript beschreibt ein in vivo funktionelles Studienprotokoll, das aktiv im UDN MOSC Drosophila Core verwendet wird, um festzustellen, ob Missense-Varianten funktionelle Folgen für das Protein von Interesse haben, indem transgene Fliegen, die menschliche Proteine. Das Ziel dieses Protokolls ist es, MO-Forschern zu helfen, mit klinischen Forschungsgruppen zusammenzuarbeiten, um experimentelle Beweise dafür zu liefern, dass eine Kandidatenvariante in einem Gen von Interesse funktionelle Folgen hat, wodurch die klinische Diagnose erleichtert wird. Dieses Protokoll ist am nützlichsten in einem Szenario, in dem ein Drosophila-Forscher von einem klinischen Forscher angesprochen wird, der einen Patienten mit einer seltenen Krankheit mit einer bestimmten Kandidatenvariante in einem Gen von Interesse hat.

Dieses Protokoll kann in drei Elemente unterteilt werden: (1) Sammeln von Informationen, um die Wahrscheinlichkeit zu beurteilen, dass die Variante des Interesses für den Patientenphänotyp verantwortlich ist, und die Durchführbarkeit einer funktionellen Studie in Drosophila, (2) bestehende genetische Instrumente und die Etablierung neuer Instrumente und (3) die Durchführung funktioneller Studien in vivo. Das dritte Element kann weiter in zwei Unterelemente unterteilt werden, je nach der Bewertung der Funktion einer Interessenvariante (Rettungsexperiment oder überexpressionbasierte Strategien). Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll an viele Szenarien außerhalb der Forschung an seltenen monogenen Krankheiten angepasst und optimiert werden kann (z. B. häufige Krankheiten, Gen-Umwelt-Wechselwirkungen und pharmakologische/genetische Screens zur Identifizierung therapeutischer Ziele). Die Fähigkeit, die Funktionalität und Pathogenität von Varianten zu bestimmen, wird nicht nur dem Patienten von Interesse durch eine genaue molekulare Diagnose nützen, sondern auch breitere Auswirkungen auf die translationale und wissenschaftliche Grundlagenforschung haben.

Protocol

1. Sammeln von menschlichen und MO-Informationen zu bewerten: Wahrscheinlichkeit einer Variante von Interesse verantwortlich für Krankheit Phänotypen und Machbarkeit von funktionellen Studien in Drosophila

1. Führen Sie umfangreiche Datenbank- und Literaturrecherchen durch, um festzustellen, ob die spezifischen Gene und Varianten von Interesse gute Kandidaten sind, um den Phänotyp des Patienten von Interesse zu erklären. Sammeln Sie insbesondere die folgenden Informationen.
   1. Beurteilen Sie, ob das Gen von Interesse zuvor in andere genetische Störungen verwickelt war (phänotypische Expansion des bekannten Krankheitsgens) oder ob es sich um ein völlig neues Krankheitskandidatengen handelt [Genvariante von ungewisser Bedeutung (GVUS)].
   2. Bewerten Sie die Allelhäufigkeit der Variante des Interesses an Krankheits- oder Kontrollpopulationsdatenbanken.
   3. Bewerten Sie, ob es Kopiernummernvariationen (CNVs) gibt, die dieses Gen in Krankheits- oder Kontrollpopulationsdatenbanken enthalten.
   4. Bewerten Sie, was die orthologous Gene sind in verschiedenen MO-Arten einschließlich Maus, Zebrafisch, Drosophila, C. elegans, und Hefe, dann weiter untersuchen die bekannten Funktionen und Expressionsmuster dieser orthologen Gene.
   5. Beurteilen Sie, ob die Variante von Interesse in einer funktionellen Domäne des Proteins vorhanden ist und ob die Aminosäure von Interesse evolutionär konserviert wird.
      ANMERKUNG: Antworten auf diese fünf Fragen (Schritte 1.1.1-1.1.5) können durch den individuellen Zugriff auf eine Reihe von Human- und MO-Datenbanken oder über die Webressource MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant Exploration) (siehe Tabelle) erhalten. 1 für Online-Ressourcen)³⁰, die in einem begleitenden Artikel³¹ausführlich beschrieben wird. Weitere Beispiele finden Sie im Abschnitt repräsentative Ergebnisse. Die Website der Monarch Initiative³² und Gene2Function³³ bieten ebenfalls nützliche Informationen.
2. Sammeln Sie zusätzliche Informationen, um weiter zu beurteilen, ob die Variante aus einer Proteinfunktion und Struktursicht ein guter Krankheitskandidat ist.
   1. Bewerten Sie, ob die Variante des Interesses auf der Grundlage von Silico-Vorhersagealgorithmen als schädlich vorhergesagt wird.
      ANMERKUNG: Variantenpathogenitätsalgorithmen wurden in den letzten 15 Jahren von vielen Forschungsgruppen entwickelt, und einige werden auch in den MARRVEL-Suchergebnissen angezeigt. Neuere Programme, einschließlich der beiden unten aufgeführten, kombinieren mehrere Varianten pathogenitätsrediction Algorithmen und Maschinelle Lernansätze, um eine Pathogenität serernizitätswert zu generieren. Weitere Informationen zu Variantenvorhersagealgorithmen und deren Leistung finden Sie unter Ghosh, et al.⁸. i) CADD (kombinierte annotationsabhängige Erschöpfung): integratives Anmerkungswerkzeug, das aus mehr als 60 genomischen Merkmalen besteht und Partituren für menschliche SNVs sowie kurze Einfügungen und Löschungen liefert¹¹. (ii) REVEL (rare exome variant ensemble learner): kombiniert mehrere Varianten-Pathogenitätsalgorithmen (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP und phastCons) für alle möglichen menschlichen Missense-Varianten³⁴.
   2. Bestimmen Sie, ob das menschliche Gen/Protein von Interesse oder seine MO-Orthologs nachweislich genetisch oder physisch mit Genen/Proteinen interagieren, die zuvor mit genetischen Krankheiten in Verbindung gebracht wurden. Wenn ja, beurteilen Sie, ob der Patient von Interesse überlappende Phänotypen mit diesen Störungen aufweist.
      HINWEIS: Mehrere Werkzeuge wurden entwickelt, um genetische und Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der Grundlage von MO-Publikationen sowie großangelegte Proteomik von mehreren Arten-Screens zu analysieren. STRING (Suchwerkzeug für wiederkehrende Fälle benachbarter Gene)³⁵: eine Datenbank für bekannte und vorhergesagte Protein-Protein-Wechselwirkungen. Es integriert genetische Interaktions- und Co-Expression-Datensätze sowie Text-Mining-Tools, um Gene und Proteine zu identifizieren, die in einer Vielzahl von Organismen zusammen funktionieren können. MIST (Molecular Interaction search tool)³⁶: eine Datenbank, die genetische und Protein-Protein-Interaktionsdaten von genetischen Kern-MOs (Hefe, C. elegans, Drosophila, Zebrafisch, Frosch, Ratte, Maus) und Menschen integriert. Vorhersage von Wechselwirkungen, die aus orthologous Genen/Proteinen (Interlogs) abgeleitet werden, werden ebenfalls angezeigt.
   3. Bestimmen Sie, ob die 3D-Struktur des von Interesse interessierten Proteins gelöst oder modelliert wurde. Wenn dies der Zutun der Option ist, bestimmen Sie, wo die Variante von Interessen im Verhältnis zu wichtigen funktionalen Domänen zugeordnet ist.
      ANMERKUNG: Proteinstrukturen, die durch Röntgenkristallographie, Kernspinresonanz (NMR) und Kryo-Elektronenmikroskopie gelöst werden, finden sich in öffentlichen Datenbanken, einschließlich der PDB (Proteindatenbank) und der EMDatabank³⁷. Obwohl es keine einzige Datenbank für vorhergesagte/modellierte Proteinstrukturen gibt, stehen Benutzern eine Reihe von Algorithmen (z. B. SWISS-MODEL³⁸, Modeller³⁹und Phyre₂⁴⁰) zur Verfügung, um Proteinmodellierung durchzuführen.
3. Kommunizieren Sie mit klinischen Mitarbeitern, um informationen aus den Informatikanalysen in den Abschnitten 1.1-1.2 zu diskutieren. Wenn klinische Mitarbeiter auch das Gefühl haben, dass die Variante und das Gen von Interesse gute Kandidaten sind, um die Phänotypen zu erklären, die beim Patienten gesehen werden, fahren Sie mit Abschnitt 2 fort. Wenn es spezifische Fragen über den Genotyp und Phänotyp des Patienten gibt, besprechen Sie diese mit den klinischen Mitarbeitern, bevor Sie vorankommen.
   ANMERKUNG: Wenn man der Meinung ist, dass die Variante von Interesse den Phänotyp des Interesses (z. B. identische Variante in hochfrequenter Kontrollpopulation) nicht erklären kann, besprechen Sie dies mit klinischen Mitarbeitern, um festzustellen, ob die Variante eine gute kandidaten, da es möglicherweise nicht die geeignete Expertise für die Interpretation klinischer Phänotypen gibt.

2. Sammeln vorhandener genetischer Werkzeuge und Einrichtung neuer Reagenzien zur Untersuchung einer spezifischen Variante von Interesse

ANMERKUNG: Sobald die Variante von Interesse festgestellt wurde, ist ein guter Kandidat, um experimentell zu verfolgen, Reagenzien zu sammeln oder zu erzeugen, um in vivo-Funktionsstudien durchzuführen. Für funktionelle Studien, die in diesem Protokoll beschrieben werden, werden einige wichtige Drosophila melanogaster Reagenzien benötigt: 1) vorgelagerte Aktivierungsequenz-regulierte menschliche cDNA-transgene Stämme, die die Referenz- oder Variantensequenz tragen, 2) ein Funktionsverlust Allel eines fliegenden Gens von Interesse und 3) eine GAL4-Linie, die für Rettungsexperimente verwendet werden kann.

1. Erzeugung von UAS-Human cDNA-Konstrukten und transgenen Fliegen
   1. Identifizieren und erhalten Sie die entsprechenden menschlichen cDNA-Konstrukte. Viele Klone sind aus der MGC (Mammalian Gen Collection)⁴³ erhältlich und können von ausgewählten Vendern erworben werden. Bei Genen, die alternativ gespleißt sind, prüfen Sie, welche Isoform cDNA der Verwendung von Ensembl oder RefSeq entspricht.
      HINWEIS: Viele cDNAs sind in rekombinator-vermittelten Klonsystem-kompatiblen Reagenzien⁴⁴erhältlich, was den Subklonschritt vereinfacht. cDNAs können in einem "offenen (kein Stop-Codon)" oder "geschlossenen (mit endogenem oder künstlichem Stop-Codon)" Format kommen. Während offene Klone das C'-Tagging von Proteinen ermöglichen, die für biochemische (z. B. Western Blot) und zellbiologische (z. B. Immunflecken) Assays nützlich sind, um die Expression des Proteins von Interesse zu überwachen, kann es in einigen Fällen die Proteinfunktion beeinträchtigen.
   2. Unterklonen Sie den Referenz- und Varianten-cDNA in den transgenen Drosophila-Vektor. Verwenden Sie das mit dem C31-vermittelte Transgenesesystem, da dadurch die Referenz- und Varianten-cDNAs an der gleichen Stelle im Genom⁴⁵integriert werden können. Für dieses Projekt verwendet der MOSC Drosophila Core routinemäßig den pGW-HA.attB Vektor⁴⁶.
      ANMERKUNG: Wenn sich die humane cDNA in rekombinant endenden Klonsystem-kompatiblen Vektoren befindet (z. B. pDONR221, pENTR221), fahren Sie zu Abschnitt 2.1.4 über, in dem LR-Reaktionen zum Unterklonen der cDNAs in pGW-HA.attB erklärt werden.
      1. Befindet sich die humane cDNA nicht in einem rekombinanten Klonsystem-kompatiblen Plasmid, unterklonen Sie die humanen cDNAs mit standardmolekularen biologischen Techniken in einen Gateway-Eintragsvektor (ein Beispiel für ein solches Protokoll ist unten dokumentiert).
         1. Führen Sie eine Überhang-PCR durch, um attB1- und attB2-Arme einzuführen. Die Vorwärtsgrundierung sollte die attB1-Sequenz 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCC-3' haben, gefolgt von den ersten 22 Nukleotiden der Ziel-cDNA. Der Reverse Primer sollte die attB2-Sequenz 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3' haben, gefolgt von der umgekehrten Ergänzung der letzten 25 Nukleotide der cDNA von Interesse. Schließen Sie das Stop-Codon der cDNA aus, fügen Sie dann ein C'-Tag hinzu, wenn es gewünscht ist, einen Klon zu "öffnen", oder fügen Sie ein Stop-Codon hinzu, um einen Klon zu "schließen".
         2. Bereiten Sie einen 100-Liter-PCR-Mix mit hoher Genauigkeit vor, der aus 50 l Hochtreue-PCR-Master-Mix, 36 l destilliertem Wasser, je 5 l von Vorwärts- und Rückwärtsprimern besteht, die in Schritt 2.1.2.1.1 auf 10 'M und 4 'L der Ziel-cDNA (150 ng/'L) verdünnt sind.
         3. Führen Sie PCR mit dem Standard-Mutagenese-Protokoll durch, um attB1- und attB2-Arme auf die cDNA von Interesse hinzuzufügen. Die Bedingungen variieren je nach Konstrukt und Varianten von Interesse.
         4. Isolieren Sie die Ziel-cDNA mit zusätzlichen Homologiearmen über Gelelektrophorese und Gelextraktion. Erstellen Sie 1% Agarose-Gel und führen Sie Die Elektrophorese mit Standardmethoden durch. Verbrauchen Sie das Band, das der Größe der cDNA plus der zusätzlichen Länge der Homologiearme entspricht. Extrahieren Sie DNA aus dem Gel durch Standardmethoden⁹⁵. Kommerzielle Gel-Extraktions-Kits sind von mehreren Unternehmen erhältlich.
         5. Führen Sie eine In-vitro-Rekombinatoasenreaktion basierend auf dem rekombinanten Klonprotokoll entsprechend dem verwendeten System durch.
         6. Verwandeln Sie den BP-Reaktionsmix in chemisch kompetente E. coli-Zellen. Kompetente Zellen können intern hergestellt oder von kommerziellen Anbietern gekauft werden. Kultur die transformierten Zellen über Nacht auf einer LB-Platte mit geeigneten Antibiotika für die Kolonieauswahl. Am nächsten Tag wählen Sie mehrere Kolonien aus und wachsen sie über Nacht in unabhängigen flüssigen Kulturen an.
         7. Isolieren Sie die DNA von den Nachtkulturen durch Miniprep. Sanger sequenzieren die positiven Klone, um sicherzustellen, dass die cDNA die richtige Sequenz⁹⁶hat. Bewahren Sie Zellen aus den Kulturen, die für die gewünschte Sequenz positiv sind, in 25% Glycerin, das bei -80 °C gespeichert ist.
   3. Führen Sie eine standortgesteuerte Mutagenese durch, um die Variante des Interesses in das Gateway-Plasmid mit der Referenz human cDNA⁹⁷einzuführen. Ein detailliertes Protokoll für diese Methode finden Sie auf der Website des Anbieters^48,49. Bestätigen Sie das Vorhandensein der Variante im mutierten Plasmid über Sanger-Sequenzierung des gesamten offenen Leserahmens (ORF), um sicherzustellen, dass durch diesen Mutageneseschritt keine zusätzlichen Varianten eingeführt werden.
   4. Subklonieren Sie die Referenz- und Varianten-Human-CDNAs im Spenderplasmid (Gateway-Plasmide mit attL1- und attL2-Standorten) über eine LR-Clonasereaktion in das transgene Plasmid (z.B. pGW-HA.attB mit attR1 und attR2-Standorten).
      ANMERKUNG: Es gibt UAS-C31-Vektoren, die für die konventionelle Beschränkung sonenzymbasierter Subklonierung (z. B. pUAST.attB⁵⁰) entwickelt wurden, wenn es vorzuziehen ist, menschliche cDNAs über Restriktionsenzymmethoden zu unterklonen.
   5. Wählen Sie die Docking-Sites für die UAS-Human-cDNA-Transgene aus. Eine Reihe von Docking-Sites wurden von mehreren Laboratorien generiert und sind öffentlich verfügbar von Lagerzentren^50,52,53.
      ANMERKUNG: Da es bequem ist, das menschliche Transgen auf einem Chromosom zu haben, das nicht den Fliegenortholog des Gens von Interesse enthält, wird empfohlen, eine zweite Chromosom-Docking-Stelle [VK37 (BDSC-Bestand #24872] zu verwenden, wenn sich der Fliegenortholog auf dem X befindet. , dritte oder vierte Chromosomen, und verwenden Sie eine dritte Chromosom-Docking-Stelle [VK33 (BDSC-Bestand #24871], wenn sich der Fliegenortholog auf dem zweiten Chromosom befindet.
   6. Injizieren Sie UAS-Human-cDNA-Konstrukte in Fliegen, die in ihrer Keimbahn C31-Integrase exdrücken (z. B. Vas-C31, nos-C31).
      HINWEIS: Mikroinjektionen können intern durchgeführt oder zur Transgenese an Kerneinrichtungen oder kommerzielle Einrichtungen gesendet werden. Detailliertes Protokoll zur Erzeugung transgener Fliegen finden Sie im zitierten Buch Kapitel⁵¹.
   7. Stellen Sie stabile transgene Stämme aus den injizierten Embryonen fest. Injizieren Sie 100-200 Embryonen pro Konstrukt⁹⁴. In Abbildung 1Aist ein repräsentatives Kreuzungsschema für eine transgene Einfügung in eine zweite Chromosom-Dockingstelle (VK37) dargestellt. Siehe die zitierten Bücher^54,55 für grundlegende Drosophila Genetik Informationen.
2. Abrufen oder Generieren einer T2A-GAL4-Leitung, die rettungsbasierte Funktionstests ermöglicht (siehe Abbildung 2 und Abschnitt 3.1).
   HINWEIS: Diese Zeile dient zwei Zwecken. Erstens verhalten sich die meisten getesteten T2A-GAL4-Linien als starke LOF-Allele, indem sie wie ein Genfallen-Allel funktionieren. Zweitens fungieren T2A-GAL4-Linien als GAL4-Treiber, der die Expression von UAS-Konstrukten (z. B. UAS-GFP, UAS-Human cDNAs) unter den endogenen Regulationselementen des Gens von Interesse^56,57 (Abbildung 2A-C) ermöglicht.
   1. Durchsuchen Sie öffentliche Bestandssammlungen nach verfügbaren T2A-GAL4-Linien, einschließlich des Drosophila Gene Disruption Project (GDP)^58, in dem 1.000 T2A-GAL4-Leitungen generiert wurden⁵⁹. Diese Stämme sind derzeit im Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) erhältlich und können sowohl über die BIP- als auch über die BDSC-Websites durchsucht werden.
   2. Wenn keine T2A-GAL4-Leitung für das fliegende Gen von Interesse verfügbar ist, prüfen Sie, ob eine geeignete codierte MiMIC-Leitung (Minos-vermittelte Integrationskassette) für die Umwandlung in eine T2A-GAL4-Leitung mittels rekombinantem Kassettenaustausch (RMCE) verfügbar ist. )⁶⁰ (Abbildung 2A).
      ANMERKUNG: RMCE ermöglicht die Umwandlung von intronischen MiMIC-Elementen, die sich zwischen zwei Codierungsexons befinden, in eine T2A-GAL4-Leitung durch Mikroinjektion eines Spenderkonstrukts (ein Beispiel für ein Kreuzungsschema ist in Abbildung 1B)oder eine Reihe von Kreuze, wie im Detail beschrieben^57,59.
   3. Wenn keine T2A-GAL4-Leitung verfügbar ist und keine entsprechende Codierung intronic MiMIC vorhanden ist, erkunden Sie die Möglichkeit, eine T2A-GAL4-Leitung über das CRIMIC-System (CRISPR-vermittelte Integrationskassette) zu erzeugen⁵⁹.
      ANMERKUNG: Diese Methode verwendet CRISPR-vermittelte DNA-Spaltung und homologiegesteuerte Reparatur (HDR), um eine MiMIC-ähnliche Kassette in ein kodierendes Intron in einem Gen von Interesse zu integrieren.
   4. Wenn dem Gen von Interesse ein großes Intron (>150 bp) fehlt oder keine Introns enthalten sind, versuchen Sie, ein GAL4-Transgen mit dem CRISPR/Cas9-System mit HDR wie^{beschrieben 20,61,62}in das Fliegengen einzuschlagen.
      ANMERKUNG: Wenn die Erzeugung eines T2A-GAL4- oder GAL4-Knock-In-Alldasels schwierig ist, versuchen Sie, Rettungsexperimente mit diesen bereits vorhandenen Allelen oder RNAi-Linien und allgegenwärtigen oder gewebespezifischen GAL4-Treibern wie^{beschrieben 92} (REF) durchzuführen.

3. Durchführung einer funktionellen Analyse der menschlichen Variante des Interesses in Vivo in Drosophila

ANMERKUNG: Führen Sie eine rettungsbasierte Analyse (Abschnitt 3.1) sowie Überexpressionsstudien (Abschnitt 3.2) mit den in Abschnitt 2 gesammelten oder generierten Werkzeugen durch, um die Folgen der Interessenvariante in vivo bei Drosophilazu bewerten. Erwägen Sie, beide Ansätze zu verwenden, da die beiden einander ergänzen.

1. Durchführung funktionaler Analysen durch Rettungsexperimente
   notiz: Heterologe Rettungsexperimente inDrosophilaUnter Verwendung menschlicher Proteine bestimmen Sie, ob die molekulare Funktion der beiden orthologen Gene über 500 Millionen Jahre evolutionär konserviert wurde. Sie bewerten auch die Funktion der Variante im Kontext des menschlichen Proteins⁶³. Obwohl eine systematische Analyse, die Hunderte von Genpaaren untersucht, nicht berichtet wurde, sind mehrere Dutzend menschliche und Säugetiergene (z. B. Mausgene in der Lage, die FunktionDrosophilaGene¹³.
   1. Bestimmen Sie im Rescue-basierten Ansatz zunächst, ob es offensichtliche, brennbare und reproduzierbare Phänotypen in LOF-Mutanten im Fliegenortholog gibt, bevor Sie die Funktionen der Varianten bewerten.
      HINWEIS: Frühere Literatur über das Fly-Gen ist ein guter Ort, um zuerst Daten mine, und es kann mit Datenbanken wie FlyBase und PubMed gefunden werden. Zusätzliche Datenbanken wie MARRVEL, Monarch Initiative und Gene2Funcion sind ebenfalls nützlich, um diese Informationen zu sammeln.
   2. Führen Sie eine globale Untersuchung von verschreibbaren Phänotypen bei homozygoten und hemizygoten (T2A-GAL4-Allel über einem molekular definierten Chromosomenmangeltiere durch, insbesondere wenn das T2A-GAL4-Allel die erste Mutation ist, die für ein bestimmtes Gen charakterisiert wird. Bewerten Sie Phänotypen wie Letalität, Sterilität, Langlebigkeit, morphologische (z. B. Größe und Morphologie des Auges) und Verhalten (z. B. Balz,Flug,Klettern und Bang-Empfindlichkeitsdefekte).
      ANMERKUNG: Wenn von diesem Primärbild keine hauptweisen Phänotypen identifiziert werden, können subtilere Phänotypen wie neurologische Defekte, die durch elektrophysiologische Aufzeichnungen gemessen werden, verwendet werden, wenn sie hoch reproduzierbar und spezifisch sind. Als Beispiel werden funktionelle Studien mit Elektroretinogramm (ERG) in Schritt 3.2.3 beschrieben. Wenn es nicht gelingt, einen versetzbaren Phänotyp zu erkennen, wechseln Sie zu Abschnitt 3.2, und führen Sie die überexpressionbasierte Funktionsstudie durch.
   3. Sobald ein versetzbarer Phänotyp in der LOF-Mutation identifiziert wurde, testen Sie, ob die Referenz-Human-cDNA die Funktion des Fliegenorthologs ersetzen kann, indem sie versucht, menschliche cDNA zur Rettung der mutierten Fliegenlinie zu verwenden. Der hier durchzuführende phäotypische Assay hängt von den Ergebnissen aus Schritt 3.1.2 ab und ist spezifisch für das untersuchte Gen.
      ANMERKUNG: Wenn die "Humanisierung" des Fliegengens erfolgreich ist, gibt es jetzt eine Plattform, um die Effizienz der Rettung für die Variante des Interesses im Vergleich zum Referenz-Gegenstück zu vergleichen. Die Rettung mit Referenz menschliche cDNA gesehen muss nicht perfekt sein. Die teilweise Rettung des fliegenmutierten Phänotyps mit einer menschlichen cDNA bietet immer noch einen Bezugspunkt für vergleichende Studien mit der Variante des humanen cDNA-Stamms.
   4. Vergleichen Sie mit dem in Schritt 3.1.2 ausgewählten Assay-System die beobachtete Rettung mit dem Referenz-Human-cDNA-Wert auf die mit der Variante Human cDNA beobachtete Rettung, um festzustellen, ob die Variante des Interesses Auswirkungen auf das Gen von Interesse hat.
      ANMERKUNG: Wenn die Variante human cDNA schlechter abschneidet als das Referenzallel, deutet dies darauf hin, dass die Variante von Interesse schädlich für die Proteinfunktion ist. Wenn die Variante und der Bezug nicht funktionell unterschieden werden können, dann kann das Allel ein Isomorph sein (eine Variante, die die Proteinfunktion nicht beeinflusst) oder 2) der Test ist nicht empfindlich genug, um subtile Unterschiede zu erkennen.
   5. Wenn sich herausstellt, dass es sich bei der Variante um ein schädliches Allel handelt, dann bewerten Sie die Expression und intrazelluläre Lokalisierung der Referenz- und Variantenproteine von Interesse in vivo über Western Blot, Immunfluoreszenzfärbung oder andere Methoden⁹³.
      HINWEIS: Wenn die UAS-Human cDNA aus einem offenen Klon in einem pGW-HA.attB-Vektor erzeugt wird, verwenden Sie einen Anti-HA-Antikörper, um diese biochemischen und zellulären Assays durchzuführen. Wenn es sich bei dem ursprünglichen Klon um einen geschlossenen Klon handelt, prüfen Sie, ob kommerzielle Antikörper gegen die menschlichen Proteine für diese Assays verwendet werden können. Ein Unterschied in den Expressionsniveaus und der intrazellulären Lokalisierung kann zeigen, wie sich die Variante des Interesses auf die Proteinfunktion auswirkt.
2. Durchführung funktionaler Analysen durch Überexpressionsstudien
   ANMERKUNG: Ubiquitous oder gewebespezifische Überexpression menschlicher cDNAs in ansonsten Wildtypfliegen können Informationen liefern, die die in Abschnitt 3.1 erörterten Rettungsexperimente ergänzen. Während rettungsbasierte Assays in erster Linie dazu bestimmt sind, LOF-Varianten (amorph, hypomoophisch) zu erkennen, können überexpressionbasierte Assays auch Gain-of-Function (GOF)-Varianten aufdecken, die schwieriger zu beurteilen sind (hypermorph, antimorph, neomorph).
   1. Wählen Sie einen Satz von GAL4-Treibern aus, um die menschlichen cDNAs von Interesse zu überprimiert. Eine Reihe von allgegenwärtigen und gewebe-/stufenspezifischen GAL4-Treibern sind in öffentlichen Lagerzentren (z. B. BDSC) erhältlich, von denen einige häufiger als andere verwendet werden. Konzentrieren Sie sich zunächst auf allgegenwärtige Treiber und leicht verserbare Phänotypen (Letalität, Sterilität, morphologische Phänotypen), dann gehen Sie zu gewebespezifischen Treibern und spezifischeren Phänotypen über.
      HINWEIS: Validieren Sie den Ausdruck von GAL4-Treibern mit einer Reporterzeile (z. B. UAS-GFP), um Expressionsmuster vor der Verwendung in den Experimenten zu bestätigen.
   2. Geben Sie die Referenz- und Variante der menschlichen cDNAs mit demselben Treiber unter der gleichen Bedingung (z. B. Temperatur) an, indem Sie 3-5 jungfräuliche Weibchen aus der GAL4-Linie (z. B. ey-GAL4 für die imaginale Scheibenexpression des Auges) mit 3-5 männlichen Fliegen aus den UAS-Linien [z. B. UAS-TBX2(+) oder UAS-TBX2(p.R305H) für das in Abschnitt 4.2 gezeigte Beispiel in einer einzigen Durchstechflasche.
      1. Übertragen Sie die Kreuze alle 2-3 Tage, um viele Tiere aus einem einzigen Kreuz zu schließen.
   3. Untersuchen Sie die Nachkommenschaft und entdecken Sie Unterschiede zwischen den Referenz- und Variantenstämmen (z. B. Augenmorphologie) unter einem Seziermikroskop. Bildnis die Fliegen mit einer Kamera, die an einem Seziermikroskop befestigt ist, um phänotyp zu dokumentieren.
      ANMERKUNG: Wenn ein Phänotyp nur in der Referenz, aber nicht in der Variantenlinie zu sehen ist, kann die Variante ein amorphes oder ein starkes hypomorphes Allel sein. Wenn der Phänotyp in beiden Genotypen gesehen wird, aber der Verweis einen stärkeren Defekt verursacht, dann kann die Variante ein leicht bis schwaches hypomorphes Allel sein. Wenn die Referenz keinen Phänotyp oder nur einen schwachen Phänotyp aufweist, aber die Variante einen starken Defekt aufweist, kann die Variante ein GOF-Allel sein.
   4. Wenn ein Phänotyp unter Standardkulturbedingungen (RT oder bei 25 °C) nicht gesehen wird, dann stellen Sie die Kreuze auf unterschiedliche Temperaturen von 18-29 °C, da das UAS/GAL4-System bekanntermaßen temperaturempfindlich^{ist 64,65}). Typischerweise ist die Expression von UAS-Transgenes bei höheren Temperaturen höher.
3. Führen Sie zusätzliche funktionelle Studien im Zusammenhang mit den Genen und Proteinen von Interesse.
   notiz: Neben der Untersuchung allgemeiner Defekte kann ein Assay-System ausgewählt werden, um molekulare Funktionen des Gens und der Variante zu untersuchen. In einem Beispiel, das in den repräsentativen Ergebnissen (TBX2ERG-Aufnahmen verwendet wurden, um Die Wirkungen der Variante auf die Photorezeptorfunktion zu bestimmen, da das Fliegengen von Interesse (bifid) im Rahmen der Entwicklung visueller Systeme eingehend untersucht worden. Detaillierte Protokolle für ERG inDrosophilafinden Sie wie zuvor veröffentlicht^66,67,68.
   1. Generieren Sie Fliegen, um auf Funktionsfehler im visuellen System zu testen. Kreuzvirgin Weibchen aus der Rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 Linie zu Männchen mit Referenz oder Variante UAS-Human cDNA Transgenes, um die menschlichen Proteine von Interesse in den R1-R6 Photorezeptoren auszudrücken.
      ANMERKUNG: Kreuz3-5 jungfräuliche Weibchen zu 3-5 männlichen Fliegen in einer einzigen Durchstechflasche und übertragen Sie die Kreuze alle 2-3 Tage, um viele Tiere aus einem einzigen Kreuz zu schließen. Alle Kreuze müssen in einem Inkubator aufbewahrt werden, der auf der Versuchstemperatur eingestellt ist, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
   2. Sobald die Fliegen zu schließen beginnen (bei 25 °C, 10 Tage nach dem Setzen des ersten Kreuzes), sammeln Sie die Nachkommen (Rh1-GAL4/+; UAS-Human cDNA/+) in frische Fläschchen und legen Sie sie wieder in den Inkubator, der bei der Experimentellen Temperatur für weitere 3 Tage eingestellt ist, damit das visuelle System reifen kann.
      HINWEIS: Obwohl ERG auf 1-2 Tage alten Fliegen durchgeführt werden kann, können neu geschlossene Fliegen große Schwankungen in ihrem ERG-Signal haben. Wenn es gewünscht wird, einen altersabhängigen Phänotyp zu untersuchen, können diese Fliegen mehrere Wochen lang gereift werden, solange sie regelmäßig (z. B. alle 5 Tage) in eine neue Durchstechflasche übertragen werden, um nicht in nassen Lebensmitteln zu ertrinken.
   3. Bereiten Sie die Fliegen für die ERG-Aufnahme vor, indem Sie die Fliegen zunächst mit CO₂ bezähnen oder in eine Durchstechflasche auf Eis legen. Kleben Sie vorsichtig eine Seite der Fliege auf ein Glasmikroskop-Dia, um sie zu immobilisieren.
      HINWEIS: Mehrere Referenz- und Variantenfliegen können auf eine einzelne Folie geklebt werden. Platzieren Sie alle Fliegen in etwa der gleichen Ausrichtung, wobei ein Auge für die Aufnahmeelektrode zugänglich ist. Achten Sie darauf, nicht Kleber auf das Auge zu bekommen und die Proboscis frei zu lassen.
   4. Bereiten Sie die Aufnahme- und Referenzelektroden vor. Legen Sie eine 1,2 mm Glaskapillare in einen Nadelzieher und aktivieren Sie sie. Brechen Sie das Kapillarrohr, um zwei scharf verjüngte Elektroden zu erhalten. Die resultierenden Elektroden sollten hohl sein und einen Enddurchmesser von <0,5 mm aufweisen.
   5. Füllen Sie die Kapillaren mit einer Salinelösung (100 mM NaCl), um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Schieben Sie die Glaskapillaren über die Silberdrahtelektroden (sowohl die Aufnahmeelektrode als auch die Referenzelektrode, siehe Abbildung 4) und sichern Sie die Kapillaren an Ort und Stelle.
   6. Konfigurieren Sie den Stimulator und Verstärker. Eine detaillierte Aufstellung finden Sie in Lauwers, et al.⁶⁷. Die Einrichtung von UDN Drosophila MOSC besteht aus Geräten, die im Materialbereich aufgeführt sind.
      1. Stellen Sie den Verstärker auf 0,1 Hz-Hochpassfilter, 300 Hz-Tiefpassfilter und 100 Gain ein.
      2. Stellen Sie den Stimulator auf 1 s Periode, 500 ms Pulsbreite, 500 ms Pulsverzögerung, Laufmodus und 7 Amp ein.
      3. Bereiten Sie die Lichtquelle für die Photostimulation vor. Verwenden Sie eine Halogenlichtquelle, um die Fliegenphotorezeptoren zu aktivieren.
      4. Bereiten Sie die Aufzeichnungssoftware auf einem Computer vor, der mit dem ERG-Setup verbunden ist. Erstellen Sie ein Stimulationsprotokoll mit Erfassungsmodell "Ereignisse fester Länge" und 20 s Dauer.
   7. Akklimatisieren Sie die Fliegen, um Dunkelheit zu vollenden, bevor Sie ERG-Aufnahmen einführen. Platzieren Sie die Fliegen mindestens 10 min in völliger Dunkelheit, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
      HINWEIS: Da Fliegen rotes Licht nicht erkennen können, verwenden Sie eine rote Lichtquelle während der Periode der dunklen Gewöhnung.
   8. Legen Sie die Folie mit den Fliegen auf das Aufnahmegerät und bewegen Sie die Mikromanipulatoren, die die Referenz- und Aufzeichnungselektroden tragen, an einen Punkt, der nahe an der Fliege des Interesses auf der Folie liegt. Beobachten Sie die Spitze der Elektrode und legen Sie die Referenzelektrode vorsichtig in den Thorax der Fliege (durchdringen Sie die Nagelhaut). Sobald die Referenzelektrode stabil eingesetzt wurde, legen Sie die Aufnahmeelektrode auf die Oberfläche des Auges.
      ANMERKUNG: Die genaue Position dieser Referenzelektrode hat keinen großen Einfluss auf das ERG-Signal. Die Aufnahmeelektrode sollte an der Oberfläche des Auges platziert werden, da ERG eine Feldpotentialaufzeichnung und keine intrazelluläre Aufzeichnung ist. Die richtige Druckmenge, die auf die Aufnahmeelektrode ausgeübt wird, verursacht ein kleines Grübchen, ohne in das Auge einzudringen.
   9. Schalten Sie alle Lichter für weitere 3 min aus, um die Fliegen in die dunkle Umgebung zu akklimatisieren.
   10. Richten Sie die Aufnahmesoftware ein und beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Signals. Wenn Sie eine Halogen-Lichtquelle mit manuellem Verschluss verwenden, schalten Sie die Lichtquelle mit geschlossenem Verschluss ein. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Signals.
   11. Setzen Sie die Fliegenaugen dem Licht aus, indem Sie den Verschluss für die Dauer von 20 s eines einzelnen Laufs alle 1 s öffnen und schließen.
       HINWEIS: Das Ein-/Ausschalten der Halogenlichtquelle kann manuell gesteuert oder so programmiert werden, dass es mit einer weißen LED-Lichtquelle automatisiert wird. Robustere und zuverlässigere ERG kann durch die Verwendung einer Halogenlichtquelle im Vergleich zu einer weißen Licht-LED erreicht werden, wahrscheinlich aufgrund des breiteren Lichtspektrums, das von der Halogenlichtquelle emittiert wird.
   12. Zeichnen Sie ERGs von allen Fliegen auf, die auf der Glasrutsche montiert sind. Führen Sie ERGs von 15 Fliegen pro Genotyp pro Zustand durch.
       HINWEIS: Einige Parameter, die geändert werden können, um eine Bedingung zu finden, die robuste Unterschiede zwischen Referenz- und Varianten-cDNAs zeigt, können Temperatur-, Alters- oder Umgebungsbedingungen (z. B. im Hell-Dunkel-Zyklus oder bei konstantem Licht/Dunkelheit) aufweisen.
   13. Datenanalyse durchführen: Vergleichen Sie die ERGs aus referenzieren, variante und steuert, um festzustellen, ob Unterschiede bestehen. Bewerten Sie die ERG-Daten für Veränderungen bei Transienten, Depolorisierung, Off-Transienten und Repolarisation⁶⁹ (Abbildung 4B).
       ANMERKUNG: Depolarisation und Repolarisation spiegeln die Aktivierung und Inaktivierung der Phototransduktionskaskade innerhalb von Photorezeptoren wider, während On- und Off-Transienten Messungen der Aktivitäten postsynaptischer Zellen sind, die Signale von photorezeptoren. Verminderte Amplitude und veränderte Kinetik der Repolarisation sind häufig bei Defekten mit Photorezeptorfunktion und Gesundheit verbunden, während Defekte an On- und Off-Transienten bei Mutanten mit defekter Synapsenentwicklung, Funktion oder Wartung ^{gefunden werden. 70}.
   14. Bei der Identifizierung von Unterschieden in ERG-Phänotypen mit Überexpression von Referenz- vs. Varianten menschlicher cDNAs bestimmen Sie, ob dieser elektrophysiologische Phänotyp mit strukturellen und ultrastrukturellen Defekten in Photorezeptoren und deren durch histologische Analyse und Transmissionselektronenmikroskopie.
       ANMERKUNG: Weitere Diskussionen über die Interpretation von ERG-Defekten und struktur-/ultrastrukturelle Analysen wurden bereits beschrieben⁶⁹.

Representative Results

Funktionelle Studie von de novo Missense Variant in EBF3 Verbunden mit neuroentwicklungsbedingten Phänotypen
Bei einem 7-jährigen Mann mit neuroentwicklungsbedingten Phänotypen wie Hypotonie, Ataxie, globaler Entwicklungsverzögerung und ausdrucksstarker Sprachstörung, Ärzte und Humangenetiker am National Institutes of Health Undiagnosed Diseases Project (UDP) identifizierte eine de novo missense Variante (p.R163Q) in EBF3 (Early B-Cell Factor 3)¹⁵, ein Gen, das einen COE -Transkriptionsfaktor (Collier/Olfactory-1/Early B-Cell Factor) kodiert. Dieser Fall wurde im März 2016 dem UDN MOSC für Funktionelle Studien vorgelegt. Um zu beurteilen, ob dieses Gen ein guter Kandidat für diesen Fall war, sammelte das MOSC menschliche genetische und genomische Informationen von OMIM, ClinVar, ExAC (jetzt erweitert auf gnomAD), Geno₂MP, DGV und DECIPHER. Darüber hinaus wurden die orthologen Gene in wichtigen MO-Arten mit dem DIOPT-Tool identifiziert. Anschließend wurden Genexpression und phänotypische Informationen aus einzelnen MO-Datenbanken (z.B. Wormbase, FlyBase, ZFIN, MGI) erhalten. Die für EBF3 durchgeführten Informatikanalysen und weitere wegweisende Studien im UDN MOSC bildeten die Grundlage für die spätere Entwicklung der MARRVEL-Ressource³⁰.

Die mit dieser Methode gesammelten Informationen deuteten darauf hin, dass EBF3 zum Zeitpunkt der Analyse nicht mit einer bekannten menschlichen genetischen Störung in Verbindung gebracht wurde, und es wurde der Schluss gezogen, dass die P.R163Q-Variante auf der Grundlage der folgenden Informationen ein guter Kandidat war. (1) Diese Variante war zuvor nicht in den Datenbanken der Kontrollpopulation (ExAC) und der Datenbank der Krankheitspopulations (Geno₂MP) gemeldet worden, was darauf hindeutet, dass es sich um eine sehr seltene Variante handelt. (2) Basierend auf ExAC beträgt der pLI-Wert (Wahrscheinlichkeit der LOF-Intoleranz) dieses Gens 1,00 (pLI-Scores reichen von 0,00-1,00). Dies deutet darauf hin, dass es selektiven Druck gegen LOF-Varianten in diesem Gen in der allgemeinen Bevölkerung gibt und deutet darauf hin, dass Haploinsuffizienz dieses Gens Krankheiten verursachen kann. Für weitere Informationen über pLI-Score und seine Interpretation, ein begleitender MARRVEL Tutorial Artikel in JoVE³¹ und verwandte Papiere enthalten Details^30,71.

Die p.R163Q-Variante wurde auch als ein guter Kandidat angesehen, da (3) sie sich in der evolutionär konservierten DNA-Bindungsdomäne dieses Proteins befindet, was darauf hindeutet, dass sie die DNA-Bindung oder andere Proteinfunktionen beeinflussen kann. (4) Der Rückstand p.R163 wird evolutionär von C. elegans und Drosophila an den Menschen konserviert, was darauf hindeutet, dass er für proteinfunktionelle speziesfunktionelles Protein entscheidend sein kann. (5) EBF3-Orthologs wurden in die neuronale Entwicklung in mehreren MO⁷² einschließlich C. elegans⁷³, Drosophila⁷⁴, Xenopus⁷⁵und Mäuse⁷⁶verwickelt. (6) Während der Entwicklung des Gehirns bei Mäusen hat sich gezeigt, dass Ebf3 nach dem Arx (Aristaless-bezogener Homebox)⁷⁷ funktioniert, ein Gen, das mit mehreren Epilepsien und geistigen Behinderungen assoziiert ist. Syndrome beim Menschen⁷⁸. Daher deuten diese Daten zusammen darauf hin, dass EBF3 sehr wahrscheinlich für die menschliche Neuroentwicklung entscheidend ist und dass die p.R163Q-Variante funktionelle Folgen haben kann.

Um zu beurteilen, ob p.R163Q die EBF3-Funktion beeinflusst, wurde eine T2A-GAL4-Leitung für Knoten (kn; der Fliegenortholog des Menschen EBF3⁷⁹) über RMCE einer codierenden intronischen MiMIC-Einfügung¹⁵erzeugt. Die kn^T2A-GAL4 Linie ist rezessiv tödlich und konnte die Letalität eines klassischen Kn-Alleels (kn^col-1) sowie einen molekular definierten Mangel, der kn abdeckt, nicht ergänzen [Df(2R)BSC429]⁸⁰ . Expressionsmuster des GAL4 spiegelten auch zuvor berichtete Muster des kn-Ausdrucks im Gehirn sowie in der Flügel-Aginalscheibe¹⁵wider. UAS transgene Fliegen wurden dann erzeugt, um die Expression von Referenz und Variante humanEBF3 cDNA sowie Wildtyp Fly kn cDNA zu ermöglichen. Alle drei Proteine wurden mit einem C-Terminal 3xHA-Tag markiert. Wichtig ist, dass UAS-Wildfliegenmesser (kn⁺) oder Referenzmenschen EBF3 (EBF3⁺) Transgene die Letalität von kn^T2A-GAL4/Df(2R)BSC429 in ähnlichem Umfang gerettet haben ( Abbildung 3C, linkes Panel)⁸¹.

Im Gegensatz dazu war UAS-human EBF3-Transgen mit der p.R163Q-Variante (EBF3^p.R163Q) nicht in der Lage, diese Mutante zu retten, was darauf hindeutet, dass die p.R163Q-Variante die EBF3-Funktion in vivo¹⁵beeinflusst. Interessanterweise wurde das EBF3^{p.R163Q-Protein} bei der Untersuchung mit einem Anti-HA-Antikörper erfolgreich in das Fliegengewebe exprimiert, und seine Konzentrationen und subzelluläre Lokalisation (hauptsächlich nuklear) waren nicht von denen von EBF3⁺ und Kn⁺. Dies deutet darauf hin, dass die Variante keinen LOF-Phänotyp aufgrund von Proteininstabilität oder Fehllokalisierung verursacht. Um weiter zu beurteilen, ob die p.R163Q-Variante die Transkriptionsaktivierungsfunktion von EBF3beeinflusste, wurde in HEK293-Zellen¹⁵ein luziferase-basierter Reporter-Assay durchgeführt. Dieses Experiment in kultivierten menschlichen Zellen zeigte, dass die EBF3^{p.R163Q-Variante} die Transkription der Reporterkonstrukte nicht aktivieren konnte, was das LOF-Modell aus Drosophila-Experimenten unterstützte.

Parallel zu den experimentellen Studien führten Die Zusammenarbeit mit Ärzten, Humangenetikern und genetischen Beratern am BCM zur Identifizierung von zwei weiteren Personen mit ähnlichen Symptomen. Ein Patient trug die identische p.R163Q-Variante und ein anderer eine Missense-Variante, die denselben Rückstand betraf (p.R163L). Die p.R163L-Variante konnte auch nicht die Fliegenkn-Mutante⁹³ retten, was darauf hindeutet, dass dieses Allel auch die EBF3-Funktion beeinträchtigte. Interessanterweise wurde diese Arbeit von hinten zu hinten mit zwei unabhängigen Humangenetik-Studien veröffentlicht, die zusätzliche Personen mit de novo Missense, Unsinn, Frameshift und Spleißvarianten in EBF3 berichteten, die mit ähnlichen neuroentwicklungsfördernde Phänotypen^82,83. In der Folge wurden drei weitere Papiere veröffentlicht, die über weitere Fälle von de novo EBF3-Varianten und Kopiernummer Löschung^84,85,86berichteten. Dieses neuartige neuroentwicklungsbasierte Syndrom ist heute als Hypotonie, Ataxie und verzögertes Entwicklungssyndrom (HADDS, MIM #617330) in der Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM, eine maßgebliche Datenbank für Genotyp-Phänotyp-Beziehungen beim Menschen) bekannt.

Funktionelle Studie von dominant vererbt Missense Variant in TBX2 Verbunden mit einem Syndromic Cardiovascular und Skelett-Entwicklungsstörung
In einer kleinen Familie, die von sich überlappenden Spektren von craniofacialdysmorphism, Herzanomalien, Skelettfehlbildungen, Immunmangel, endokrinen Anomalien und Entwicklungsstörungen betroffen ist, identifizierte die UDN Duke Clinical Site eine Missense-Variante (p.R20Q) in TBX2, das sich von den Perhänotypen der Krankheit⁸⁷trennt. Drei (Sohn, Tochter, Mutter) von den vier Familienmitgliedern sind von dieser Erkrankung betroffen, und der Sohn zeigte den schwersten Phänotyp. Klinisch erfüllte er die Diagnose "komplettes DiGeorge-Syndrom", ein Zustand, der oft durch Haploinsuffizienz von TBX1verursacht wird. Während in tbX1 in dieser Familie keine Mutationen identifiziert wurden, konzentrierten sich die Kliniker und Humangenetiker auf eine Variante in TBX2, da frühere Studien an Mäusen zeigten, dass diese Gene während der Entwicklung überlappende Funktionen haben⁸⁸ . TBX1 und TBX2 gehören beide zur T-box (TBX)-Familie von Transkriptionsfaktoren, die je nach Kontext als Transkriptionsrepressoren und Aktivatoren fungieren können.

Zuvor waren Varianten in 12 von 17 Mitgliedern der GENE der TBX-Familie mit menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht worden. Das MOSC beschloss, diese Variante auf der Grundlage der folgenden Informationen, die durch MARRVEL und andere Ressourcen gesammelt wurden, experimentell weiterzuverfolgen. (1) Diese Variante wurde nur einmal in einer Kohorte von 90.000 "Kontrollpersonen" in gnomAD gemeldet (diese Variante wurde in einer Standardansicht herausgefiltert, wahrscheinlich aufgrund niedriger Abdeckungslesevorgänge). In Anbetracht der milderen phänotypischen Darstellung der Mutter kann dies immer noch als eine seltene Variante betrachtet werden, die für die Krankheit Phänotypen verantwortlich sein kann. (2) Die pLI-Werte von TBX2 in ExAC/gnomAD sind 0,96/0,99, was hoch ist (maximal = 1,00). Darüber hinaus beträgt der o/e (beobachtet/erwartete) LOF-Score in gnomAD 0,05 (nur 1/18,6 erwartete LOF-Variante wird in gnomAD beobachtet). Diese Zahlen deuten darauf hin, dass LOF-Varianten in diesem Gen in der allgemeinen Bevölkerung ausgewählt werden.

Zusätzlich (3) wird die p.R20 evolutionär von C. elegans und Drosophila an den Menschen konserviert, was darauf hindeutet, dass dies ein wichtiger Rückstand für die TBX2-Funktion sein kann. (4) Mehrere Programme sagen voraus, dass die Variante wahrscheinlich schädlich ist (Polyphen: möglicherweise/wahrscheinlich schädlich, SIFT: schädlich, CADD-Score: 24,4, REVEL-Score: 0,5). (5) MO-Mutationen weisen Defekte an Geweben auf, die bei Patienten betroffen sind (z. B. Knockout-Mäuse, die Defekte im Herz-Kreislauf-System, Verdauungs-/Nahrungssystemen, craniofaziale, Gliedmaßen/Ziffern aufweisen). Daher war es zusammen mit den biologischen Verbindungen zwischen TBX1 und TBX2 und phänotychen Verbindungen zwischen diesen Patienten und dem DiGeorge-Syndrom optimal, funktionelle Studien von Varianten in diesem Gen mit Drosophiladurchzuführen.

Um zu beurteilen, ob die p.R20Q-Variante die TBX2-Funktion beeinflusst, wurde eine T2A-GAL4-Linie in bifid (bi; der Drosophila-Ortholog des menschlichen TBX2) über RMCE einer codierenden intronischen MiMIC (Abbildung 2)⁸⁷erzeugt. Dieses Allel, bi^T2A-GAL4, war rezessiv pupal tödlich und verhielt sich wie ein starker LOF-Mutant, ähnlich wie zuvor berichteten Bi-LOF-Allelen (z. B. bi^D2, bi^D4; Abbildung 2 E). Die Letalität dieser klassischen und neu generierten Bi-Allele wurde durch ein genomisches Rettungskonstrukt von 80 kb gerettet, das den gesamten Bi-Lokus trägt, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesen Reagenzien tatsächlich um saubere LOF-Allele handelt. Das Expressionsmuster von GAL4 in der ^{Bi-T2A-GAL4-Linie} passte ebenfalls gut zu den zuvor berichteten Mustern der Bi-Expression in mehreren Geweben, einschließlich in der Flügel-Aginalscheibe (Abbildung 2D).

Parallel dazu wurden UAS-transgene Linien für TBX2 mit referenz- oder Variantensequenzen (p.R20Q) erzeugt. Leider war keine transgene in der Lage, die Tödlichkeit der bi^T2A-GAL4 Linie zu retten. Wichtig ist, dass ein Wildtyp-Fliegen-UAS-Bi-Transgen auch das Bi^{T2A-GAL4-Allel} nicht retten konnte, wahrscheinlich aufgrund der Dosierungsempfindlichkeit dieses Gens. Tatsächlich verursachte die Überexpression von UAS-bi⁺ und UAS-TBX2⁺ einen gewissen Grad an Letalität, wenn sie in einem Wildtier überexprimiert wurde. Diese toxische Wirkung von Bi/TBX2-Überexpression wurde als funktioneller Test verwendet, um zu beurteilen, ob die p.R20Q-Variante die TBX2-Funktion beeinflussen kann. Da das Drosophila-Bi-Gen im Kontext des visuellen Systems ausgiebig untersucht wurde [Gen ist auch als optomotor blind (omb)] bekannt, wurden Phänotypen, die mit dem visuellen System zusammenhängen, ausgiebig untersucht. Wenn die Referenz TBX2 mit einem ey-GAL4-Treiber ausgedrückt wurde, der UAS-Transgene im Auge und Teilen desGehirns, die für das visuelle System relevant sind, ausdrückt, Verringerung der Augengröße (Abbildung 4B) beobachtet. Dieser Phänotyp war stärker als der Phänotyp, der beobachtet wurde, als ein Wildtyp-Fliegen-UAS-Bi-Transgen exprimiert wurde, was darauf hindeutet, dass der menschliche TBX2 der Fliege bei Überexprimierung eher schadet.

Interessanterweise war der p.R20Q TBX2 weniger stark bei der Verursachung von Letalität (Abbildung 3C, rechtes Panel) und bei der Induktion eines kleinen Augen-Phänotyps (Abbildung 4B) mit demselben Treiber unter der identischen Bedingung⁸⁷, was darauf hindeutet, dass die Variante die Proteinfunktion beeinflusst. Darüber hinaus ergab die Funktion von Photorezeptoren, die Referenz und Variante TBX2 mit einem anderen GAL4-Treiber (Rh1-GAL4) überexquieren, die speziell UAS-Transgene in R1-R6-Photorezeptoren ausdrückt, dass die Variante TBX2 eine viel milderer ERG-Phänotyp im Vergleich zum Referenz-TBX2 (Abbildung 4B)⁸⁷. Interessanterweise wurde der größte Teil des p.R20Q TBX2-Proteins noch im Kern gefunden, ähnlich dem Referenzprotein, was darauf hindeutet, dass die Variante die nukleare Lokalisierung nicht beeinflusste. Ein auf Luziferase basierender transkriptionsbasierter Repressionstest in HEK293T-Zellen zeigte, dass der p.R20Q nicht in der Lage war, die Transkription eines Reporterkonstrukts mit palindromischen T-Box-Sites effektiv zu unterdrücken⁸⁷. Darüber hinaus wurden im Vergleich zu TBX2⁺eine Abnahme des Proteinspiegels von TBX2^p.R20Q beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Variante die Translation oder Proteinstabilität von TBX2 beeinflussen kann, was wiederum ihre Häufigkeit innerhalb einer Zelle beeinflusst.

Weitere Patienten mit seltenen Varianten in TBX2 wurden von Ärzten am UDN Duke Clinical Site parallel zu diesen experimentellen Studien identifiziert.  Ein 8-jähriger Junge mit einer de novo missense (p.R305H) Variante aus einer nicht verwandten Familie zeigte viele der Merkmale in der ersten Familie^{gefunden 87}. Weitere funktionelle Studien an Drosophila und menschlichen Zelllinien ergaben, dass die p.R305H-Variante auch TBX2-Funktion und Proteinspiegel beeinflusst, was stark darauf hindeutet, dass Defekte in diesem Gen wahrscheinlich vielen Phänotypen zugrunde liegen, die in den beiden Familien gefunden wurden. Diese Störung wurde vor kurzem als "Vertebral Anomalien und variable endokrine und T-Zell-Dysfunktion" (VETD, MIM #618223) in OMIM kuratiert. Die Identifizierung zusätzlicher Personen mit schädlichen Varianten in TBX2 mit überlappenden Phänotypen ist entscheidend für das Verständnis des gesamten Spektrums der Genotyp-Phänotyp-Beziehungen für dieses Gen bei menschlichen Erkrankungen.

Abbildung 1 : Injektions- und Kreuzungssystem zur Erzeugung von UAS-Human cDNA- und T2A-GAL4-Leitungen. (A) Erzeugung von UAS-Human cDNA-Transgenen durch Mikroinjektionen und Kreuze. Als Beispiel werden Kreuzungsschemazurfolge zur Integration der Transgene in eine zweite Chromosom-Dockingstelle (VK37) mit männlichen Fliegen in der ersten und zweiten Generation gezeigt. Bei Injektion des humanen transgenen Konstrukts cDNA C31 (pGW-HA.attB) in frühe Embryonen, die eine Keimbahnquelle von C31-Integrase (mit 3xP3-GFP und 3xP3-RFP) und VK37-Docking-Stelle [mit gelben ⁺ (y⁺ ) Marker], transgene Ereignisse können mit dem weißen⁺ (w⁺) Minigen verfolgt werden, das im transgenen Vektor vorhanden ist. Es wird empfohlen, die Integrase von C31 durch Auswahl gegen Fliegen mit GFP und RFP zu kreuzen. Der endgültige stabile Bestand kann als Homozygoten oder als ausgeglichener Bestand gehalten werden, wenn das Chromosom eine zweite ortliche tödliche/sterile Schlagmutation trägt. Das Vorhandensein von tödlichen/sterilen Mutationen an einem zweiten Standort auf transgenen Konstrukten hat in der Regel keinen Einfluss auf das Ergebnis funktioneller Studien, solange diese Transgene in einem heterozygoten Zustand verwendet werden (Abbildung 3). (B) Erzeugung von T2A-GAL4-Leitungen durch Mikroinjektion und Kreuze. Als Beispiel wird ein Kreuzungsschema zum Konvertieren einer zweiten Chromosom-MiMIC-Einfügung in ein T2A-GAL4-Element gezeigt. Durch mikroinjizierendes Expressionsvektor für C31-Integrase und RMCE-Vektor für T2A-GAL4 (pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70) wird ein geeigneter Leserahmen für die MiMIC von Interesse ausgewählt. Siehe die folgenden Papiere für Details^57,59 in Embryonen tragen eine MiMIC in einem kodierenden Intron in Gen von Interesse, kann man die ursprüngliche MiMIC in eine T2A-GAL4 Linie umwandeln. Abbildung 2 A zeigt ein schematisches Diagramm der RMCE-Konvertierung. Das Konvertierungsereignis kann durch Screening gegen den y⁺ Marker in der originalen MiMIC-Kassette⁶⁰ausgewählt werden. Da RMCE in zwei Richtungen auftreten kann, führen nur 50% des erfolgreichen Conversion-Ereignisses zu einer erfolgreichen Produktion von GAL4, die von einem UAS-GFP-Reporter-Transgen in der nächsten Generation erkannt werden kann. Der endgültige stabile Bestand kann als Homozygoten oder als ausgewogener Bestand gehalten werden, wenn der LOF des Gens tödlich/steril ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2 : Umwandlung von MiMIC-Elementen in T2A-GAL4-Linien über RMCE. (A) Die Integrase ermöglicht die Rekombination zwischen den beiden attP-Standorten im Flug (oben) und zwei attB-Standorten, die eine T2A-GAL4-Kassette flankieren, die als kreisförmiger Vektor (unten) dargestellt wird. (B) Erfolgreiche RMCE-Ereignisse führen zum Verlust eines wählbaren Markers (gelb+) und zum Einsetzen der T2A-GAL4-Kassette in die gleiche Ausrichtung des interessengen Gens. Da das RMCE-Ereignis in zwei Richtungen auftreten kann, ergeben nur 50 % der RMCE-Reaktion ein gewünschtes Produkt. Ein RMCE-Produkt, das in der entgegengesetzten Ausrichtung eingesetzt wird, funktioniert nicht als Gen-Trap-Allel oder Express-GAL4. Die Richtung des Konstrukts muss durch Sanger-Sequenzierung bestätigt werden. (C) Transkription (oben) und Übersetzung (unten) des Gens von Interesse führt zur Erzeugung einer abgeschnittenen mRNA und Protein aufgrund des PolyA-Signals am 3' Ende der T2A-GAL4-Kassette vorhanden. Das T2A ist ein ribosomes Skipping-Signal, das es dem Ribosom ermöglicht, die Übersetzung nach diesem Signal zu stoppen und erneut zu initiieren. Dies wird verwendet, um ein GAL4-Element zu erzeugen, das nicht kovalent an das abgeschnittene Genprodukt von Interesse angefügt ist. Die GAL4 wird in den Kern eindringen und die Transkription von Transgenen erleichtern, die unter der Kontrolle von UAS-Elementen stehen. UAS-GFP kann als Genexpressionsreporter und UAS-Human cDNA für Rettungsexperimente über Gen "Humanisierung" verwendet werden. (D) Gezeigt ist ein Beispiel für ein T2A-GAL4-Element im bi-fahrenden Ausdruck von UAS-GFP (oben). Dieses Expressionsmuster ähnelt einer zuvor generierten Enhancer-Trap-Linie für dasselbe Gen (bi^omb-GAL4; unten). (E) Vergleich des T2A-GAL4-Allels von bi mit zuvor gemeldeten LOF-Bi-Allelen. Diese Zahl wurde aus früheren Veröffentlichungen angenommen und geändert^57,87. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3 : Funktionelle Analyse menschlicher Varianten mit hilfe rettungsbasierter (links) und überausdrucksbasierter (rechts) Studien. (A) (linkes Panel): Die Funktion der EBF3-Varianten wurde mit einer rettungsbasierten Analyse des Fliegenknotens (kn) LOF-Alldasels bewertet, wobei der Schwerpunkt auf Deratoalität/Lebensfähigkeit lag; (rechtes Panel): Die Funktion von Varianten in TBX2 wurde durch überexpressionierte menschliche TBX2-Transgene in Wildfliegen bewertet, wobei der Schwerpunkt auf Letalität/Lebensfähigkeit, Augenmorphologie und elektrophysiologischer Phänotypen lag ( Abbildung4) . (B) Kreuzungssysteme zur Erlangung der fliegenden Fliegen, die in den funktionellen Studien getestet werden sollen. Es wird empfohlen, immer ein neutrales UAS-Element (z.B. UAS-lacZ, UAS-GFP) als Kontrollexperiment zu verwenden. (C) Repräsentative Ergebnisse aus funktionellen Studien der Varianten EBF3^p.R163Q bzw. TBX2^p.R20Q sowie geeigneter Kontrollexperimente, die zur Interpretation der Ergebnisse erforderlich sind. Sowohl rettungsbasierte Analysen als auch Überexpressionsstudien zeigen, dass sich die Varianten wie amorphe oder hypomorphe Allele verhalten. Die hier gezeigten Daten zur Letalität/Lebensfähigkeit basieren auf experimentellen Daten, die in früheren Veröffentlichungen^15,87dargestellt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4 : Funktionelle Analyse einer seltenen Missense-Variante im menschlichen TBX2 basierend auf Augenmorphologie und Elektroretinogramm in Drosophila. (A) Ein schematisches Bild, das die typische Platzierung von Aufnahme- und Referenzelektroden auf dem Fliegenauge zeigt, zusammen mit einer repräsentativen Elektroretinogrammaufzeichnung mit vier Hauptkomponenten (transient, Depolarisation, off-transient, Repolarisation). (B) TBX2-Variante (p.R20Q) fungiert als partielles LOF-Allel auf Basis von Überexpressionsstudien im Fliegenauge mit GAL4-Treibern, die für das visuelle System spezifisch sind (ey-GAL4 und Rh1-GAL4). Dies zeigte, dass die Referenz TBX2 einen starken morphologischen und elektrophysiologischen Phänotyp im Vergleich zum Variantenprotein verursachte. (Top Panels): eine starke Verringerung der Augengröße ist bei Überexpression von UAS-TBX2⁺ mit ey-GAL4zu beobachten. UAS-TBX2^p.R20Q. Angetrieben mit ey-GAL4 verursacht auch ein kleineres Auge, aber der Phänotyp ist viel milder. (Unterteile): Wenn UAS-TBX2⁺ in R1-R6-Kernphotorezeptoren mit Rh1-GAL4 exprimiert wird, gibt es einen Verlust von On- und Off-Transienten, eine reduzierte Depolarisation und eine große abnormale verlängerte Depolarisation nach potenziellem (PDA) Phänotyp, die nicht in Kontrollfliegen gesehen wird. Diese Phänotypen sind nicht so schwerwiegend wie bei der Exprimien von UAS-TBX2^p.R20Q mit demselben Rh1-GAL4. Diese Zahl wurde aus früheren Veröffentlichungen angenommen und geändert^69,87. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

zweck	Werkzeug	Url
Variantenfunktion Vorhersagealgorithmen	Polyphen-2 sieben Cadd PROVEAN MutationTaster feiern	http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 https://sift.bii.a-star.edu.sg https://cadd.gs.washington.edu http://provean.jcvi.org/index.php http://www.mutationtaster.org https://sites.google.com/site/revelgenomics
Selten und nicht diagnostiziert Krankheitsforschung Konsortien	UDN RDMM IRUD SOLVE-RD AFGN	https://undiagnosed.hms.harvard.edu http://www.rare-diseases-catalyst-network.ca https://irudbeyond.nig.ac.jp/en/index.html http://solve-rd.eu https://www.functionalgenomics.org.au
Integrative Datenbank für Mensch und Modell Organismus Informationen	MARRVEL Monarch-Initiative Gene2Funktion Phenologs	http://marrvel.org https://monarchinitiative.org http://www.gene2function.org http://www.phenologs.org
Humangenetik und Genomische Datenbanken	OMIM ClinVar ExAC gnomAD GenoMP DGV entziffern	https://www.omim.org/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ http://exac.broadinstitute.org/ http://gnomad.broadinstitute.org/ http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/#/ http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home https://decipher.sanger.ac.uk/
Ortholog-Identifikationstool	DIOPT	https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
Modellorganismus Datenbanken und Biomedizin Literatursuche	WormBase (C elegans) FlyBase (Drosophila) ZFIN (Zebrafisch) MGI (Maus) Pubmed	https://www.wormbase.org http://flybase.org https://zfin.org http://www.informatics.jax.org https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
Genetik und Protein Interaktionsdatenbanken	Schnur Nebel	https://string-db.org http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/
Proteinstruktur Datenbanken und Modellierungswerkzeuge	WWPBD SWISS-MODELL Modeller Phyre2	http://www.wwpdb.org https://swissmodel.expasy.org/ https://salilab.org/modeller/ http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2
Patienten-Matchmaking Plattformen	Matchmaker Exchange GeneMatcher AGHA Archiv streichholzschachtel entziffern MyGene2 Phenom Central	http://www.matchmakerexchange.org https://www.genematcher.org https://mme.australiangenomics.org.au/#/home https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox https://decipher.sanger.ac.uk https://www.mygene2.org/MyGene2 https://phenomecentral.org
Menschliche sektor Anmerkung und cDNA Kloninformationen	Mammalian Gene Collection Ensembl Refseq	https://genecollections.nci.nih.gov/MGC http://useast.ensembl.org http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

Tabelle 1: Online-Ressourcen im Zusammenhang mit diesem Protokoll.

Discussion

Experimentelle Studien mit Drosophila melanogaster bieten ein robustes Assay-System, um die Folgen von krankheitsassoziierten menschlichen Varianten zu bewerten. Dies ist aufgrund der großen Menge an Wissen und vielfältigen genetischen Werkzeugen, die von vielen Forschern im Fliegenfeld im letzten Jahrhundert⁸⁹erzeugt wurden. Wie jedes andere experimentelle System ist es jedoch wichtig, die Vorbehalte und Grenzen anzuerkennen, die es gibt.

Vorbehalte im Zusammenhang mit Data Mining
Obwohl der erste Schritt in diesem Protokoll darin besteht, Datenbanken für Informationen zu einem Gen von Interesse zu bergen, ist es wichtig, es nur als Ausgangspunkt zu verwenden. Zum Beispiel, obwohl in silico Vorhersage der Variantenfunktion wertvolle Erkenntnisse bietet, sollten diese Daten immer mit Vorsicht interpretiert werden. Es gibt einige Fälle, in denen alle wichtigen Algorithmen vorhersagen, dass eine menschliche Variante gutartig ist, aber funktionelle Studien in Drosophila zeigten deutlich die schädliche Natur einer solchen Variante²⁴. Auch wenn Protein-Protein-Wechselwirkungen, Co-Expression und strukturelle Modellierungsdaten alle aufschlussreiche Informationen sind, können in diesen großen Datensätzen pseudopositive und pseudonegative Informationen vorhanden sein. Beispielsweise können einige der zuvor identifizierten oder vorhergesagten Protein-Protein-Wechselwirkungen künstlich sein oder nur bei bestimmten Zell- und Gewebetypen auftreten.

Darüber hinaus kann es viele falsche negative Wechselwirkungen geben, die in diesen Datensätzen nicht erfasst werden, da bestimmte Protein-Protein-Wechselwirkungen vorübergehend sind (z. B. Enzym-Substrat-Wechselwirkungen). Die experimentelle Validierung ist entscheidend für den Nachweis, dass bestimmte Gene oder Proteine genetisch oder physisch in vivo im biologischen Kontext von Interesse interagieren. In ähnlicher Weise sollten Strukturen, die auf der Homologiemodellierung basieren, als Modell und nicht als gelöste Struktur behandelt werden. Obwohl diese Informationen nützlich sein können, wenn festgestellt wird, dass eine Voninteressee Aminosäure in einem strukturell wichtigen Teil des Proteins vorhanden ist, schließen negative Daten nicht aus, dass die Variante schädlich sein könnte. Schließlich sollten einige der zuvor gemeldeten Genotyp-Phänotyp-Informationen ebenfalls mit Vorsicht behandelt werden, da einige Informationen, die in öffentlichen Datenbanken archiviert werden, möglicherweise nicht korrekt sind. Beispielsweise basieren einige Informationen in MO-Datenbanken auf Experimenten, die gut kontrolliert und rigoros durchgeführt wurden, während andere aus einem großfläantigen Papier ohne weitere Folgestudien und strenge Kontrollen stammen können.

"Humanisierungsexperimente" mit T2A-GAL4-Strategie nicht immer erfolgreich
Während rettungs- und überexpressionbasierte Funktionelle Studien mit humanen cDNAs die Beurteilung von Varianten im Kontext des menschlichen Proteins ermöglichen, ist dieser Ansatz nicht immer erfolgreich. Wenn eine Referenz-Human-cDNA den fliegenmutierten Phänotyp nicht retten kann, gibt es zwei wahrscheinliche Erklärungen. Die erste Möglichkeit ist, dass das menschliche Protein nicht funktional ist oder die Aktivität im Kontext einer Fliegenzelle signifikant reduziert hat. Dies kann auf 1) reduzierte Proteinexpression, Stabilität, Aktivität und/oder Lokalisierung oder 2) einen Mangel an Kompatibilität mit Fliegenproteinen zurückzuführen sein, die in einem Multi-Protein-Komplex wirken. Da das UAS/GAL4-System temperaturempfindlich ist, können die Fliegen bei einer relativ hohen Temperatur (z.B. 29 °C) angehoben werden, um die Möglichkeit einer Rettung in diesem Zustand zu sehen. Darüber hinaus kann ein UAS-fly cDNA-Konstrukt und Transgen als Positivsteuerung erzeugt werden. Wenn die Variante des Interesses eine konservierte Aminosäure betrifft, kann die analoge Variante in die Fly cDNA eingeführt werden, um die Variante im Rahmen des Fliegenorthologs funktionelle zu untersuchen. Obwohl dies nicht notwendig ist, hilft es der Studie in Fällen, in denen die Verwendung menschlicher transgener Transgenlinien negative oder nicht schlüssige Ergebnisse liefert (Abbildung 3).

Die zweite Möglichkeit besteht darin, dass die Expression des menschlichen Proteins eine gewisse Toxizität auf Zell- oder Organismusebene verursacht. Dies kann auf antimorphe (z. B. als dominantes negatives Protein) wirkenden, hypermorphe (z. B. zu viel Aktivität) oder neomorphe (z. B. Gewinn einer neuartigen toxischen Funktion wie Proteinaggregation, die nicht immer mit der endogenen Funktion des Gens von Zinsen) Auswirkungen. In diesem Fall kann es einige dieser Probleme lindern, die Fliegen bei niedriger Temperatur (z. B. 18 °C) zu halten. Schließlich gibt es einige Szenarien, in denen Überexpression einer Fliege cDNA kann nicht die Fliege T2A-GAL4 Linie zu retten, wie im TBX2-Beispiel gesehen, wahrscheinlich aufgrund der Trict-Dosierung Abhängigkeit des Genprodukts. Um eine Überexpression eines von Interesse sindden Proteins zu vermeiden, kann das von Interesse beinterestende Fliegengen direkt über CRISPR modifiziert werden, es kann ein genomisches Rettungskonstrukt entwickelt werden, das die Variante von Interesse enthält, oder Rettungsexperimente können mit einem LOF-Allel²¹durchgeführt werden. Bei kleinen Genen kann das genomische Rettungskonstrukt der Fliege als Test menschlicher Varianten betrachtet werden, die nicht konservierte Aminosäuren beeinflussen²⁴. Zusammenfassend sollten alternative Strategien in Betracht gezogen werden, wenn das Humanisierungsexperiment keine funktionelle Bewertung der Interessenvariante zulässt.

Interpretieren negativer und positiver Ergebnisse
Wenn sowohl die Referenz- als auch die Variante human cDNAs die fliegenmutierten Phänotypen in einem ähnlichen Ausmaß retten und 2) kein Unterschied in allen getesteten Bedingungen beobachtet wird, kann davon ausgegangen werden, dass die Variante in Drosophila in Vivo. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Informationen nicht ausreichen, um auszuschließen, dass die Variante von Interesse nicht pathogen ist, da der Drosophila-Assay möglicherweise nicht empfindlich genug ist oder alle potenziellen Funktionen des Gens/Proteins von Interesse erfasst. für den Menschen relevant. Positive Daten hingegen sind ein starkes Indiz dafür, dass die Variante schädliche Folgen für die Proteinfunktion hat, aber diese Daten allein reichen immer noch nicht aus, um Pathogenität zu behaupten. Das American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) hat eine Reihe von Standards und Richtlinien veröffentlicht, um Varianten in mit menschlichen Krankheiten assoziierten Genen in "gutartige", "wahrscheinlich gutartige", "Variante unbekannter Bedeutung (VUS)", "wahrscheinlich pathogen" und "pathogen"⁹⁰. Obwohl diese Klassifikation nur für etablierte krankheitsassoziierte Gene gilt und nicht direkt auf Varianten in "Genen von ungewisser Bedeutung" (GUS) anwendbar ist, werden alle Personen, die an humanen Varianten-Funktionsstudien beteiligt sind, bei der Meldung der Variantenfunktion an diese Richtlinie halten.

Extrahieren nützlicher biologischer Informationen, wenn MO-Phänotypen keine menschliche Krankheit modellieren
Es ist wichtig zu bedenken, dass überexpressionbasierte funktionelle Assays Einschränkungen haben, zumal einige der bewerteten Phänotypen wenig Relevanz für den Krankheitszustand von Interesse haben können. Ebenso haben Phänotypen, die durch Rettungsexperimente bewertet werden, möglicherweise keine direkte Relevanz für die Krankheit von Interesse. Da diese Experimente außerhalb der endogene Kontexte in einem wirbellosen System durchgeführt werden, sollten sie nicht als Krankheitsmodelle betrachtet werden, sondern als Genfunktionstest mit Drosophila als "lebendes Reagenzglas".

Auch wenn der Modellorganismus eine menschliche Krankheit nicht imitiert, können in Rettungsexperimenten verwendete koronable Phänotypen oft nützliche biologische Einblicke in Krankheitszustände liefern. Das Konzept der "Phenologs (nicht offensichtliche homologe Phänotypen)"⁹¹ kann verwendet werden, um die zugrunde liegenden molekularen Verbindungen zwischen Drosophila und menschlichen Phänotypen weiter zu bestimmen. Zum Beispiel sind morphologische Phänotypen im Fliegenflügel, Thorax, Beine und Augen ausgezeichnete phänotypische Auslesungen für Defekte im Notch-Signalweg, einem evolutionär konservierten Weg, der mit vielen angeborenen Störungen verbunden ist, einschließlich Herz-Kreislauf-Defekten. beim Menschen⁶². Durch das Verständnis der molekularen Logik hinter bestimmten Phänotypen in Drosophilaist es möglich, versteckte biologische Verbindungen zwischen Genen und Phänotypen beim Menschen zu identifizieren, die noch nicht verstanden sind.

Kontinuierliche Kommunikation mit klinischen Mitarbeitern
Bei der Zusammenarbeit mit Ärzten, um die Funktion einer seltenen Variante beim Patienten zu untersuchen, ist es wichtig, eine starke kollaborative Beziehung aufzubauen. Obwohl klinische und grundlegende biomedizinische Forscher die Interessen an denselben Genen/genetischen Pfaden teilen können, gibt es eine große kulturelle und sprachliche (z. B. medizinischer Jargon, modellspezifische, organismusspezifische Nomenklatur) zwischen dem klinischen und dem wissenschaftlichen Bereich. Durch eine umfassende Kommunikation kann eine starke, vertrauensvolle Beziehung zwischen den beiden Parteien aufgebaut werden. Darüber hinaus ist die bidirektionale Kommunikation entscheidend für den Aufbau und die Aufrechterhaltung dieser Beziehung. In den beiden im Abschnitt repräsentativen Ergebnissen beschriebenen Fällen war beispielsweise die Identifizierung weiterer Patienten mit ähnlichen Genotypen und Phänotypen sowie nachfolgende funktionelle Studien entscheidend, um die Pathogenität der Interessenvarianten nachzuweisen. Selbst bei starken funktionellen Daten haben Forscher und Kliniker oft Schwierigkeiten, menschliche Genetiker davon zu überzeugen, dass eine in "n = 1" identifizierte Variante die wahre Krankheitsursache ist.

Sobald der MO-Forscher feststellt, dass eine Variante von Interesse schädlich ist, ist es wichtig, den klinischen Mitarbeitern so schnell wie möglich zu kommunizieren, damit sie aktiv versuchen können, passende Fälle zu identifizieren, indem sie sich mit anderen Klinikern und Humangenetikern vernetzen. Werkzeuge wie Geno₂MP [Genotypes zu mendelian Phenotypes: eine nicht identifizierte Datenbank von 9.650 Personen, die in der Center for Mendelian Genomics Study⁴¹der University of Washington eingeschrieben sind; umfasst Patienten und Familienmitglieder, die mit genetischen Störungen] kann durchsucht werden, um Personen zu beurteilen, die die gleiche Störung haben können. Dann kann der leitende Arzt über eine Messaging-Funktion kontaktiert werden.

Alternativ kann GeneMatcher verwendet werden, eine Matchmaking-Website für Kliniker, Grundlagenforscher und Patienten, die Interessen an denselben Genen teilen, um zusätzliche Patienten zu identifizieren, die seltene Varianten tragen. Da GeneMatcher Teil eines größeren integrativen Netzwerks von Matchmaking-Websites namens Matchmaker Exchange⁴²ist, können zusätzliche Datenbanken auf der ganzen Welt durchsucht werden, darunter das Australian Genomics Health Alliance Patient Archive, Broad Matchbox , DECIPHER, MyGene2 und PhenomeCentral in einer einzigen GeneMatcher-Genunterwersetzung. Obwohl die Teilnahme an GeneMatcher als "Forscher" möglich ist, wird empfohlen, dass grundlegende Wissenschaftler diese Website mit ihren klinischen Mitarbeitern nutzen, da die Kommunikation mit anderen Ärzten nach einem Spiel ein bestimmtes Maß an medizinischem sachverstand.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster)	BDSC	#24871	Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster)	BDSC	#24872	Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector	Thermo Fisher	#12536-017	Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector	Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS)		Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose	Sigma-Aldrich	#A2790	Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli)	Thermo Fisher	#18265017	Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit	Thermo Fisher	#K210012	Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit	Qiagen	#27104	Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase	NEB	#M0491	Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system	Thermo Fisher	#11789020	Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system	Thermo Fisher	#11791100	Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit	Agilent	#200523	Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis	Molecular Devices	N/A	Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection	LabX	#R150358	Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator	Astro-Med	#S48	Specific Reagent: Square Pulse Stimulator