Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

Published: August 20, 2019 doi: 10.3791/59658
Automatic Translation
*1, *2, 1,3,4,5, 1,2,4, 1,2,4,5
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את העיצוב ואת הביצועים של ניסויים vivo ב Drosophila ילה melanogaster כדי להעריך את ההשלכות הפונקציונליות של משתנים גנים נדירים הקשורים למחלות האדם.

Abstract

ההתקדמות בטכנולוגיית רצף יש הפכו שלמים-הגנום ואת כל-exome datasets נגיש יותר עבור האבחון הקליני והן חדשני המחקר גנטיקה אנושית. למרות מספר אלגוריתמים סיליקו פותחו כדי לחזות את הפתוגניות של משתנים המזוהים אלה ערכות נתונים, מחקרים פונקציונליים הם קריטיים כדי לקבוע כיצד משתנים גנומית ספציפיים להשפיע על תפקוד החלבון, במיוחד עבור חוסר הגיון גרסאות. ברשת מחלות לא מאובחנים (UDN) ועוד מחקר נדיר קונסורציומים מחלות, אורגניזמים מודל (MO) כולל Drosophila ילה, ג. אלגיה, zebrafish, ועכברים משמשים באופן פעיל כדי להעריך את התפקוד של מחלת האדם הפיוטי הגורם גרסאות. פרוטוקול זה מתאר שיטה להערכת תפקודית של משתנים אנושיים נדירים המשמשים את מודל אורגניזמים ההקרנה מרכז Drosophila ילה ליבה של udn. זרימת העבודה מתחילה עם איסוף מידע אנושי ו-MO ממסדי נתונים ציבוריים מרובים, באמצעות משאב האינטרנט MARRVEL כדי להעריך אם המשתנה עשוי לתרום למצבו של המטופל, כמו גם לעצב ניסויים יעילים המבוססים על זמין ידע ומשאבים. הבא, כלים גנטיים (למשל, T2A-GAL4 ו-UAS-האדם קווי cDNA) נוצרות כדי להעריך את הפונקציות של משתנים של עניין Drosophila. לאחר התפתחות של אלה ריאגנטים, שני שניתן פונקציונלי הפונקציונליות המבוססת על הצלה וניסויים overexpression יטוי ניתן לבצע כדי להעריך את הפונקציה variant. בענף ההצלה, הגנים האנדוגניים של הזבוב הם "הומניזציה" על-ידי החלפת הגן האורטו-סטריהאלי עם התייחסות או שינוי הטרנסגנים האנושיים. בענף של ביטוי יתר, ההתייחסות והחלבונים האנושיים המשתנה מונעים באופן מוגזם במגוון של רקמות. בשני המקרים, כל הפנוטיפ (למשל, הלליות, מורפולוגיה של העין, אלקטרופיזיולוגיה) יכול לשמש כקריאה-out, ללא קשר למחלת הריבית. הבדלים שנצפו בין התייחסות לאלה של המשתנה מצביעים על האפקט הספציפי למשתנה, ולכן כנראה פתוגניות. פרוטוקול זה מאפשר מהיר, בהערכות vivo של מחלת האדם האנושי הגורמת למחלות של גנים עם פונקציות ידועות ובלתי ידועות.

Introduction

חולים עם מחלות נדירות עוברים לעתים קרובות מסע מפרך המכונה "אודיסיאה האבחון" כדי לקבל אבחנה מדויקת1. מחלות נדירות ביותר הם חשבו שיש מוצא גנטי חזק, מה שהופך גנטית/גנומית מנתח אלמנטים קריטיים של הבדיקות הקליניות. בנוסף על רצפי המועמדים של פאנל הגן ולהעתיק ניתוח וריאציה מספר מבוסס על מיקרו מערכים כרומוזומלית, exome שלמה (ווס) ו-רצף הגנום כולו (WGS) טכנולוגיות הפכו כלים יקרי ערך יותר ויותר בעשור האחרון2, 3. שלוש. כיום, שיעור אבחון לזיהוי משתנה פתוגניים ידוע ב ווס ו-wgs הוא ~ 25% (גבוה יותר במקרים של ילדים)4,5. עבור רוב המקרים שנשארים לא מאובחנים לאחר ווס קליני/WGS, בעיה נפוצה היא שיש גנים מועמדים רבים ומשתנים. רצפי הדור הבא לעתים קרובות מזהה משתנים חדשניים או אולטרה נדירים בגנים רבים, ולפרש אם אלה גרסאות לתרום פנוטיפים למחלות הוא מאתגר. לדוגמה, למרות שרוב השטויות או מוטציות frameshift בגנים נחשבים אובדן של פונקציה (lof) אללים בשל השטויות בתיווך ריקבון של תעתיק מקודד, לחתוך מוטציות למצוא את exons האחרון לברוח תהליך זה עשוי לתפקד כ שפיר או רווח של הפונקציה (gof) אללים6.

יתר על כן, חיזוי ההשפעות של אלל מוטעית היא משימה מרתיעה, שכן הוא יכול לגרום למספר תרחישים גנטיים שונים כפי שמתואר לראשונה על ידי הרמן מולר בשנות ה -30 (כלומר, amorph, hypורפולוגיה, מורף, מורף, נאואומph, או isomorph)7 . רבים בתוכניות סיליקו ומתודולוגיות פותחו כדי לחזות את הפתוגניות של משתנים מוטעית מבוסס על שימור אבולוציוני, סוג של שינוי חומצת אמינו, מיקום בתוך תחום פונקציונלי, תדר אלל באוכלוסיה הכללית, ופרמטרים אחרים8. עם זאת, תוכניות אלה אינן פתרון כולל כדי לפתור את הבעיה המורכבת של פרשנות משתנה. מעניין, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי חמש השתמשו באופן נרחב באלגוריתמים לחיזוי משתנה (Polyphen9, סינון10, cadd11, provean12, טועם מוטציה) מסכימים על פתוגניות ~ 80% מהזמן8 . בעיקר, גם כאשר כל האלגוריתמים מסכימים, הם מחזירים חיזוי שגוי של הפתוגניות עד 11% מהזמן. זה לא רק מוביל פרשנות קלינית פגומה אלא גם יכול להניא חוקרים מפני בעקבות משתנים חדשים על ידי רישום כוזב להם כמו שפיר. אחת הדרכים להשלים את המגבלה הנוכחית של מידול סיליקו היא לספק נתונים ניסיוניים המדגימה את ההשפעה של פונקציה משתנה בתוך מבחנה, לשעבר vivo (g., תאים מתורבתים, אורגנואידים), או בvivo.

ב vivo מחקרים פונקציונליים של מחלות נדירות הקשורות למשתנים ב-MO יש כוחות ייחודיים13 ואומצו על ידי יוזמות רבות נדיר מחקר מחלות ברחבי העולם, כולל רשת מחלות לא מאובחנים (udn) בארצות הברית נדיר מחלות מודלים & מנגנונים (RDMM) רשתות בקנדה, יפן, אירופה, ואוסטרליה14. בנוסף מאמצים אלה מתואמים לשלב חוקרים MO לתוך זרימת העבודה של אבחון מחלות נדירות ולימודי מכניסטיים בקנה מידה לאומי, מספר מחקרים שיתופי בודדים בין חוקרים קליניים ו-MO הובילו את התגלית ואפיון של גנים רבים הגורמים למחלות האדם החדש ומשתנים82,83,84.

ב UDN, מרכזי מודל אורגניזמים ההקרנה מרכז (MOSC) מקבל הגשות של גנים המועמדים ומשתנים עם תיאור של המצב של המטופל ומעריך אם המשתנה עשוי להיות פתוגניים באמצעות כלים אינפורמטיקה ובvivo ניסויים. בשלב I (2015-2018) של UDN, MOSC המורכבת של דרוזוהילה ליבה [ביילור המכללה לרפואה (bcm)] ו Zebrafish Core (אוניברסיטת אורגון) כי עבד בשיתוף פעולה כדי להעריך את המקרים. באמצעות ניתוח אינפורמטיקה ומספר אסטרטגיות ניסיוני שונות ב Drosophila ילה ו zebrafish, MOSC יש עד כה תרם לאבחנה של 132 חולים, זיהוי של 31 תסמונות חדשות55, גילוי של מספר אנשים חדשים גנים של מחלות (לדוגמה, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) והתרחבות פנוטינית של המחלה הידועה גנים (לדוגמה, CACNA1A21, ACOX122).

בנוסף לפרויקטים בתוך UDN, MOSC Drosophila ילה ליבה חוקרים תרמו תגליות גנים מחלות חדשות בשיתוף פעולה עם המרכזים לגנומיקה של Mendelian ויוזמות אחרות (למשל, ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, ogdhl25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) באמצעות אותה קבוצה של אינפורמטיקה וגנטית אסטרטגיות שפותחו עבור UDN. בהתחשב במשמעות של מחקרי מו על אבחון מחלות נדירות, MOSC הורחב כדי לכלול C. אלגיה ליבה וליבת Zebrafish השני (הן באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס) עבור שלב II (2018-2022) של udn.

כתב יד זה מתאר בפרוטוקול המחקר vivo פונקציונלי המשמש באופן פעיל ב-UDN MOSC Drosophila Core כדי לקבוע אם משתנים מוטעית יש השלכות פונקציונליות על חלבון העניין באמצעות זבובים טרנסגניים המבטאים את האדם חלבונים. המטרה של פרוטוקול זה היא לעזור לחוקרים MO לעבוד בשיתוף פעולה עם קבוצות מחקר קליני כדי לספק ראיות ניסיוני כי משתנה מועמד בגן של עניין יש השלכות פונקציונליות, ובכך להקל על אבחנה קלינית. פרוטוקול זה הוא שימושי ביותר בתרחיש שבו חוקר דרוזוהילה מתקרב לחוקר קליני בעל חולה מחלות נדיר עם משתנה מועמד ספציפי בגן של עניין.

פרוטוקול זה ניתן לשבור לשלושה אלמנטים: (1) איסוף מידע כדי להעריך את הסבירות של משתנה העניין להיות אחראי על הטיפול המטופל ואת הכדאיות של מחקר פונקציונלי בדרוסופילה, (2) איסוף כלים גנטיים קיימים והקמת חדשים, ו (3) ביצוע מחקרים פונקציונליים בvivo. האלמנט השלישי יכול עוד להיות מחולק לשני תת רכיבי מבוסס על איך הפונקציה של וריאציה של עניין יכול להיות מוערך (ניסוי הצלה או ביטוי יתר אסטרטגיות מבוססות). חשוב לציין כי פרוטוקול זה יכול להיות מותאם וממוטב לתרחישים רבים מחוץ למחקר נדיר מחלות מונוגניים (למשל, מחלות נפוצות, אינטראקציה גנטית-סביבה, ו תרופתי/גנטי מסכים לזיהוי מטרות טיפוליות). היכולת לקבוע את הפונקציונליות ואת הפתוגניות של משתנים לא רק להועיל החולה של עניין על ידי מתן אבחנה מולקולרית מדויק, אבל יהיו גם השפעות רחבות יותר על המחקר המדעי הבסיסי ובסיסי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. איסוף מידע אנושי ו-MO כדי להעריך: הסבירות של משתנה של עניין להיות אחראי על פנוטיפים למחלות והיתכנות של לימודים פונקציונליים בדרוסופילה

  1. בצע חיפושים נרחבים במסד הנתונים ובספרות כדי לקבוע אם הגנים והמשתנים הספציפיים של הריבית הם מועמדים טובים כדי להסביר את הפנוטיפ של המטופל לעניין. באופן ספציפי, אסוף את המידע הבא.
    1. להעריך אם הגן של העניין היה מעורב בעבר בהפרעות גנטיות אחרות (פנוטימית הרחבה של גן מחלה ידוע) או זה גן מועמד חדש לחלוטין הגן [גנטי וריאציה של משמעות בלתי ודאות (גבול)].
    2. להעריך את תדירות אלל של וריאציה של עניין מחלות או מסדי נתונים של אוכלוסיית השליטה.
    3. להעריך אם יש מספר העתקה וריאציות (CNVs) הכוללים גן זה במחלה או מסדי נתונים של אוכלוסיית השליטה.
    4. להעריך את הגנים האורתוולוגיים הנמצאים במינים שונים של מינים, כולל עכבר, דג, דרוסוהילה, ס. אלאנים ושמרים, ואחר כך לחקור את הפונקציות ודפוסי הביטוי המוכרים של הגנים האורתוולוגיים הללו.
    5. העריכו אם משתנה הריבית קיים בתחום פונקציונלי של החלבון, ואם חומצת העניין האמינית מקיימת באופן אבולוציונית.
      הערה: תשובות לחמש שאלות אלה (שלבים 1.1.1-1.1.5) ניתן להשיג על ידי גישה למספר מסדי נתונים אנושיים ו-MO בנפרד או באמצעות MARRVEL (אורגניזם מודל משאבים צבורים לחקר משתנה נדיר) משאב אינטרנט (ראה טבלה 1 עבור משאבים מקוונים)30, המתואר לעומק בסעיף31ליווי. לקבלת דוגמאות ספציפיות, עיין בסעיף התוצאות המייצג. האתר של יוזמת המונרך32 ו Gene2Function33 גם לספק מידע שימושי.
  2. אסוף מידע נוסף כדי להעריך עוד אם המשתנה הוא מועמד טוב למחלה מתפקוד חלבון ומבנה נקודת מבט.
    1. העריכו אם משתנה הריבית צפוי להזיק בהתאם לאלגוריתמים של חיזוי סיליקו.
      הערה: אלגוריתמים פתוגניות משתנים פותחו על ידי קבוצות מחקר רבות בעבר ~ 15 שנים, וחלקם גם מוצגים תוצאות החיפוש MARRVEL. תוכניות עדכניות יותר, כולל שני המפורטים להלן, לשלב אלגוריתמים מרובים של משתנים פתוגניות וגישות למידה של מחשב כדי ליצור ניקוד פתוגניות. לקבלת מידע נוסף על אלגוריתמי חיזוי משתנים והביצועים שלהם, עיין גוש, ואח '8. (בתוך) CADD (משולב התלויות ביאור התלויים): כלי ביאור אינטגרטיבי מובנה יותר מ 60 תכונות גנומית, אשר מספק ציונים עבור האדם SNVs, כמו גם הוספות קצרות מחיקות11. (ii) התענג (לומד האנסמבל exome נדירה): משלבת אלגוריתמים מרובים של משתנים פתוטיביים (מורדים, פסטריד, גופיה, פוליפן, סינון, PROVEAN, מוסיקה, מדבקות, הקלה, GERP, SiPhy, phyloP, ו phastCons) כדי לספק ציון משולב לכל האפשרויות האפשריות האנושיות לחוסר הגיון34.
    2. לקבוע אם הגן האנושי/חלבון של עניין או המו שלו הראו יומנים הוכחו גנטית או פיזית אינטראקציה עם גנים/חלבונים מקושרים בעבר למחלות גנטיות. אם כן, להעריך אם המטופל של הריבית מציג פנוטיפים חופפים עם הפרעות אלה.
      הערה: מספר כלים פותחו כדי לנתח אינטראקציות גנטיות חלבונים חלבון בהתבסס על פרסומי מו, כמו גם פרוטאומטיקה בקנה מידה גדול של מסכי מינים מרובים. מחרוזת (כלי חיפוש עבור מופעים חוזרים של גנים שכנים)35: מסד נתונים עבור אינטראקציות חלבונים-חלבון ידועות וצפויות. הוא משלב אינטראקציה גנטית ושיתוף ביטוי datasets כמו גם כלים הכרייה טקסט כדי לזהות גנים וחלבונים שעשויים לתפקד יחד במגוון של אורגניזמים. ערפל (כלי החיפוש המולקולריים)36: מסד נתונים המשלב אינטראקציה גנטית חלבון חלבון הנתונים מ-core גנטי הליבה (שמרים, C. אלגיה, drosophila ילה, דג zebrafish צפרדע, חולדה, עכבר) ובני אדם. מוצגים גם החיזוי של אינטראקציות הנגזרת מגנים אורתוולוגיים/חלבונים (בעלי יומנים).
    3. קבע אם המבנה התלת-ממדי של חלבון הריבית נפתר או עוצב. אם כן, קבע היכן משתנה מפת הריבית יחסית לתחומים פונקציונליים של מפתח.
      הערה: מבני חלבון שנפתרו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית (nmr), ו-מיקרוסקופ ההקפאה אלקטרון ניתן למצוא במסדי נתונים ציבוריים כולל PDB (הבנק נתונים חלבון) ו EMDatabank37. למרות שאין מסד נתונים יחיד עבור מבנים חזוי/המודל חלבון, מספר אלגוריתמים (כלומר, שוויצרי דגם38, modeller39, ו phyre240) זמינים עבור משתמשים לבצע דוגמנות חלבונים.
  3. התקשר עם משתפי פעולה קליניים כדי לדון במידע שנאסף מניתוח האינפורמטיקה בסעיפים 1.1-1.2. אם משתפי פעולה קליניים גם מרגישים כי הגרסה והגן של עניין הם מועמדים טובים כדי להסביר את פנוטיפים לראות את החולה, להמשיך בסעיף 2. אם יש שאלות ספציפיות על הגנוטיפ ופנוטיפ של המטופל, דונו עמם עם משתפי הפעולה הקליניים לפני המעבר קדימה.
    הערה: אם התחושה היא שמשתנה העניין לא סביר להסביר את הפנוטיפ של עניין (למשל, משתנה זהה שנמצא בתדר גבוה באוכלוסיית השליטה), דונו עם משתפי פעולה קליניים כדי לקבוע אם המשתנה הוא טוב מועמד, כי לא יכול להיות המומחיות המתאימה לפרש פנוטיפים קליניים.

2. איסוף כלים גנטיים קיימים והקמת ריאגנטים חדש לחקר וריאציה מסוימת של עניין

הערה: ברגע שהמשתנה של עניין נקבע מועמד טוב להמשיך בניסויים, לאסוף או לייצר ריאגנטים לבצע במחקרים vivo פונקציונליים. עבור מחקרים פונקציונליים המתוארים בפרוטוקול זה, כמה מפתח Drosophila ילה מלאנוגסטר יש צורך: 1) ההפעלה הפעלה רצף מוסדר האדם cdna זנים הנושאים את ההפניה או רצף משתנה, 2) אובדן של פונקציה אלל של גן זבוב של עניין, ו 3) קו GAL4 שניתן להשתמש בהם עבור ניסויים הצלה.

  1. הדור של מבנים UAS האדם cDNA וזבובים טרנסגניים
    1. לזהות ולהשיג את מבנים האדם המתאים cDNA. שיבוטים רבים זמינים מ MGC (אוסף גנים היונקים)43 וניתן לרכוש מתוך venders נבחרים. עבור גנים כי הם לחילופין משולבים, לבדוק איזה isoform cDNA מתאים להשתמש Ensembl או מגנטי.
      הערה: cdnas רבים זמינים recombinase-תיווך שיבוט מערכת תואם ריאגנטים44, אשר מפשט את הצעד שיבוט המשנה. cDNAs עשוי לבוא "פתוח (לא לעצור codon)" או "סגור (עם אנדודוגני או עצירה מלאכותית)" פורמט. בעוד שיבוטים פתוחים לאפשר c'-תיוג של חלבונים השימושיים עבור הביוכימי (למשל, כתם המערבי) ותא ביולוגי (למשל, חיסוני) בחני לפקח על ביטוי של חלבון הריבית, זה עלול להפריע לתפקוד החלבון במקרים מסוימים.
    2. תת-שיבוט ההפניה והמשתנה cDNA לתוך הווקטור Drosophila טרנסגניים. השתמש במערכת φC31-בתיווך טרנסגנזה, מאז זה מאפשר הפניה cDNAs משתנה להיות משולבים באותו מיקום בגנום45. עבור פרויקט זה, MOSC Drosophila ילה ליבה באופן שגרתי משתמשת pgw-HA. attb וקטור46.
      הערה: אם cdna האדם הוא ב recombinase-תיווך שיבוט וקטורים תואמים (למשל, PDONR221, pENTR221), לדלג על סעיף 2.1.4, מה שמסביר את התגובות LR כדי לשכפל את cdnas לתוך pgw-HA. attb.
      1. אם ה-Dna האנושי אינו נמצא במערכת השכפול הrecombinase-מתווכת, משנה את ה-cDNAs האנושי לתוך וקטור הכניסה לשער באמצעות טכניקות ביולוגיות סטנדרטיות מולקולריות (דוגמה לפרוטוקול כזה מתועדת להלן).
        1. בצע משיכת PCR כדי להחדיר attB1 ו attB2 arms. פריימר הקדמי צריך את רצף attB1 5 '-GGGGACAAGTGCTTACAC-3 ' ואחריו 22 נוקלאוטידים הראשון של cdna היעד. ההילוך ההפוך צריך להיות attB2 רצף 5 '-GGGGACCACCTTAAGגנול-3 ' ואחריו את ההשלמה הפוכה של 25 נוקלאוטידים האחרון של cdna של ריבית. לא לכלול את קודון לעצור של cdna, לאחר מכן להוסיף ג ' תג אם זה רצוי "לפתוח" שיבוט, או להוסיף לעצור קודון לסגור "שיבוט.
        2. להכין 100 μL של שילוב PCR באיכות גבוהה המורכב 50 μL של באיכות גבוהה PCR מיקס מאסטר, 36 μL של מים מזוקקים, 5 μL של כל אחד קדימה והפוך התחל המפורטים בשלב 2.1.2.1.1 מדולל עד 10 μM, ו 4 μL של היעד cDNA (150 ng/μL).
        3. השתמש ב-PCR באמצעות פרוטוקול מוטגנזה רגיל כדי להוסיף attB1 ו- attB2 Arms אל ה-cdna של הריבית. התנאים ישתנו בהתאם למבנה ולווריאנטים של הריבית.
        4. לבודד את cDNA היעד עם הוסיף זרועות הומולוגיה באמצעות אלקטרופורזה ג'ל חילוץ ג'ל. צור 1% העלה ג'ל ולבצע אלקטרופורזה באמצעות שיטות סטנדרטיות. בלו את הלהקה המקבילה לגודל cDNA בתוספת אורך נוסף של הזרועות הומולוגיה. לחלץ דנ א מהג דרך שיטות סטנדרטיות95. ערכות הפקת ג'ל מסחריות זמינות ממספר חברות.
        5. בצע התגובה recombinase מחוץ גופית מבוסס על פרוטוקול שיבוט recombinase בתיווך על פי המערכת המשמשת.
        6. להפוך את התגובה BP לערבב בתאי E. coli כימית המוסמכת. תאים מוכשרים יכולים להתבצע בתוך הבית או לרכוש מספקים מסחריים. תרבות התאים שעברו שינוי לילה על צלחת LB המכיל אנטיביוטיקה הולמים עבור בחירת המושבה. למחרת, בחר מספר מושבות וגדל אותם בתרבויות הנוזלים העצמאיות בן לילה.
        7. בידוד דנ א מתרבויות הלילה באמצעות miniprep. Sanger רצף את שיבוטים חיוביים כדי להבטיח כי cDNA יש את הרצף הנכון96. שמרו על תאים מהתרבויות החיוביות לרצף הרצוי ב -25% גליצרול שאוחסנו ב-80 ° c.
    3. לבצע מוטסיס בבימויו של האתר כדי להציג את הווריאציה של העניין לתוך פלמיד השער עם התייחסות האדם cDNA97. פרוטוקול מפורט עבור שיטה זו ניתן למצוא באתר האינטרנט של הספק48,49. לאמת את נוכחותו של המשתנה בפלססיס המוטציה דרך רצף הקריאה הפתוח של המסגרת הפתוחה כולה (ORF) כדי להבטיח שאין גרסאות נוספות שהוצגו באמצעות שלב זה של מוטגנזה.
    4. שיבוט משנה את ההפניה ו cDNAs האדם האנושי בתוך הפלסטיות התורם (השער פלמידים עם attL1 ו attL2 אתרים) אל הפלסטיות הטרנסגניים (למשל, Pgw-HA. attb עם attR1 ו attR2 אתרים) באמצעות התגובה הקלאז LR.
      הערה: ישנם Uas φC31 וקטורים שנועדו הגבלה קונבנציונאלי מבוסס האנזים שכפול משנה (למשל, puast. attb50) אם הוא מעדיף לשכפל משנה cdnas האדם באמצעות שיטות אנזים הגבלה.
    5. בחר אתרי עגינה φC31 שבהם יש לשלב את הטרנסגנים האנושיים של UAS-cDNA. מספר אתרי עגינה נוצרו על ידי מספר מעבדות והינם זמינים באתר מרכזי מניות50,52,53.
      הערה: מכיוון שנוח לקבל את הטרנסגנים האנושיים על כרומוזום שאינו מכיל את היומן המשמש לטיסה של הגן של עניין, מומלץ להשתמש באתר עגינה השני של כרומוזום [VK37 (bdsc מניות #24872] כאשר לטוס אורתולוג על X , שלישי, או הרביעי כרומוזומים, ולהשתמש באתר עגינה כרומוזום שלישי [VK33 (BDSC מניות #24871] כאשר היומן השני לטוס הוא על כרומוזום השנייה.
    6. הכנס את UAS-האדם cDNA מבנים לתוך זבובים המבטא φC31 שילובים ב germline שלהם (למשל, vas-φC31, nos-φC31).
      הערה: ניתן לבצע מיקרוהזרקה בתוך הבית או להישלח למתקני הליבה או לישויות מסחריות עבור הטרנסגנזה. פרוטוקול מפורט להפקת זבובים טרנסגניים ניתן למצוא בספר המצוטט פרק51.
    7. להקים זנים הטרנסגניים יציבה מן העוברים הזריקו. הכנס ~ 100-200 עוברים לכל מבנה94. תוכנית מעבר ייצוגית להכנסת החדרת גנים לאתר עגינה שני של כרומוזום (VK37) מתוארת באיור 1א. עיין בספרים המצוטטים54,55 עבור המידע הבסיסי של drosophila ילה גנטיקה.
  2. להשיג או ליצור קו T2A-GAL4 שמקל על הצלה מבוסס בחני (ראה איור 2 וסעיף 3.1).
    הערה: קו זה ישמש שתי מטרות. ראשון, רוב T2A-GAL4 הקווים שנבדקו להתנהג כמו lof אללים חזק על ידי תפקוד כמו מלכודת גנים אללים. שנית, T2A-GAL4 שורות לתפקד כמנהל התקן GAL4 המאפשר ביטוי של מבנים uas (g. uas-gfp, כלומר-cdnas) תחת רכיבי רגולציה אנדודוגני של הגן של עניין56,57 (איור 2א-ג).
    1. חיפוש באוספים של מניות ציבוריות עבור שורות T2A-GAL4 הזמינות כולל את הפרויקט הפרעות בפרוייקט " דרוזוהילה " (התמ ג)58 שבו ~ 1,000 T2A-GAL4 שורות נוצרו59. זנים אלה זמינים כרגע מרכז המניות של בלומינגטון דרוסופילה (bdsc) והם ניתנים לחיפוש דרך אתרי האינטרנט של התל ג ו-bdsc.
    2. אם קו T2A-GAL4 עבור הגן לטוס של עניין אינו זמין, בדוק אם קידוד מתאים מחקה (מינוסמתווך שילוב קלטת) קו זמין עבור המרה לתוך קו T2A GAL4 באמצעות החלפת הקלטת recombinase בתיווך (rmce )60 (איור 2א).
      הערה: rmce מאפשר לחקות רכיבים שנמצאים בין שני exons קידוד להיות מומרים לתוך קו T2A-GAL4 באמצעות מיקרוהזרקה של המבנה תורם (דוגמה של ערכת מעבר מוצג באיור 1B) או סדרה של חוצה, כפי שמתואר בפירוט57,59.
    3. אם קו T2A-GAL4 אינו זמין והקידוד המתאים אינו קיים, חקור את האפשרות ליצור קו T2A-GAL4 באמצעות מערכת האינטגרציה CRIMIC (CRISPR-תיווך) במערכת59.
      הערה: מתודולוגיה זו משתמשת במחשוף ה-DNA של crispr-תיווך ובתיקון הומולוגיה (HDR) כדי לשלב קלטת כמו חיקוי לתוך קידוד אינטרון בגן של עניין.
    4. אם הגן של העניין חסר אינטרון גדול (> 150 bp) או אין introns, לנסות להקיש ב-GAL4 transgene לתוך גן לטוס עם מערכת crispr/Cas9 באמצעות HDR כמתואר20,61,62.
      הערה: אם הדור של T2A-GAL4 או GAL4 טוק-ב אלל קשה, לנסות לבצע ניסויים הצלה באמצעות אלה טרום לפני הזמן או שורות rnai או מקום אחר או רקמות מנהלי GAL4 ספציפיים כמתואר92 (REF).

3. ביצוע אנליזה פונקציונלית של המשתנה האנושי בVivo בדרוזוהילה

הערה: בצע ניתוח המבוסס על הצלה (סעיף 3.1) וכן לימודי היתר (סעיף 3.2) באמצעות הכלים שנאספו או שנוצרו בסעיף 2 כדי להעריך את ההשלכות של משתנה העניין בvivo בדרוסופילה. שקול לנצל את שתי הגישות, שכן השניים הם משלימים.

  1. ביצוע ניתוח פונקציונלי באמצעות ניסויים מבוססי הצלה
    הערה: ניסויים הטרוולוגי המבוססים על הצלה בDrosophilaשימוש בחלבונים אנושיים קובעים אם התפקוד המולקולרי של שני הגנים האורתוולוגיים שמרו מעל ~ 500,000,000 שנים של אבולוציה. הם גם להעריך את הפונקציה של המשתנה בהקשר של החלבון האנושי63. למרות שניתוח שיטתי הלומד מאות זוגות גנים לא דווח, כמה עשרות בני אדם ויונקים (למשל, עכבר) הגנים מסוגלים להחליף את הפונקציה שלDrosophilaגנים13.
    1. בגישה המבוססת על הצלה, ראשית לקבוע אם יש ברורים, מאוד, ופנוטיפים הניתנים לזיהוי ב-LOF המוטנטים ביומן לטוס אורתולוג לפני הערכת פונקציות של המשתנים.
      הערה: הספרות הקודמות על הגן לטוס הוא מקום טוב הנתונים שלי הראשון, והוא ניתן למצוא באמצעות מסדי נתונים כולל flybase ו-פומד. מסדי נתונים נוספים כגון MARRVEL, יוזמת המונרך וGene2Funcion שימושיים גם באיסוף מידע זה.
    2. לבצע סקר גלובלי של פנוטיפים scorable ב homozygous ו hemizygous (T2A-GAL4 אלל על פני בעלי חיים חוסר כרומוזומלית מוגדר, במיוחד אם T2A-GAL4 אלל הוא המוטציה הראשונה להיות מאופיין גן ספציפי. הערכת פנוטיפים כגון הסטלאליות, עקרות, אריכות-חיים, מורפולוגיים (למשל, גודל ומורפולוגיה של העין) והתנהגות (למשל, חיזור, טיסה, טיפוס ופגמים במפץ רגישות).
      הערה: אם אין פנוטיפים עיקריים המזוהים מהמסך הראשי הזה, פנוטיפים עדינים יותר כגון פגמים נוירולוגיים הנמדדים על-ידי הקלטות אלקטרופיזיולוגיות ניתן להשתמש אם הם מאוד מוגדרים וספציפיים. כדוגמה, מחקרים פונקציונליים המשתמשים באלקטורגרמה (ERG) מתוארים בשלב 3.2.3. אם יש כישלון לזהות כל הפנוטיפים scorable, לעבור לסעיף 3.2 ולבצע את המחקר הפונקציונלי המבוסס על ביטוי יתר.
    3. פעם פנוטיפ הניקוד מזוהה ב-LOF מוטציה לטוס, לבדוק אם ההפניה האנושית cDNA יכול להחליף את הפונקציה של לטוס אורתולוג על ידי ניסיון להשתמש cDNA האדם כדי להציל את הקו לטוס מוטציה. שיטת הפנוטימית להתבצע כאן תלויה בתוצאות משלב 3.1.2 ותהיה ספציפית לחקר הגנים.
      הערה: אם "הומניזציה" של הגן לטוס הוא מוצלח, יש כעת פלטפורמה כדי להשוות את היעילות של ההצלה עבור וריאציה של עניין בהשוואה למקביל התייחסות. החילוץ נראה עם התייחסות האדם cDNA לא חייב להיות מושלם. הצלה חלקית של המוטציות לטוס פנוטיפ באמצעות cDNA האדם עדיין מספק נקודת התייחסות לבצע מחקרים השוואתיים באמצעות זן האדם variant cDNA.
    4. באמצעות מערכת שיטה שנבחרה בשלב 3.1.2, להשוות את ההצלה נצפתה עם התייחסות האנושית cDNA להצלה נצפתה עם המשתנה האנושי cDNA כדי לקבוע אם הגרסה של העניין יש השלכות על הגן של עניין.
      הערה: אם המשתנה cdna האדם מבצעת גרוע יותר מאשר allele התייחסות, זה מרמז כי המשתנה של העניין הוא מדלטרזה לתפקוד החלבון. אם המשתנה והייחוס לא יכול להיות מכובד מבחינה פונקציונלית, אז 1) ה-אלל עשוי להיות isomorph (משתנה שאינו משפיע על פונקציית החלבון) או 2) האפשרות אינה רגישה מספיק כדי לזהות חילוקי דעות עדינים.
    5. אם המשתנה נמצא allele למחיקה, אז עוד להעריך את הביטוי ואת לוקליזציה תאיים של התייחסות וחלבונים משתנה של עניין vivo דרך הכתם המערבי, immunofluorescence כתמים, או שיטות אחרות93.
      הערה: אם cdna האדם מופק שיבוט פתוח ב PGW-Ha. attb וקטור, השתמש בנוגדן נגד HA לבצע אלה ביוכימיים והסלולר assays. אם השכפול המקורי הוא שיבוט סגור, לבדוק אם נוגדנים מסחריים נגד חלבונים אנושיים ניתן להשתמש עבור אלה מספר. הבדל ברמות ביטויים ולוקליזציה תאיים עשוי לגלות כיצד המשתנה של הריבית משפיע על תפקוד החלבון.
  2. ביצוע ניתוח פונקציונלי באמצעות לימודי יתר
    הערה: ביטוי מופרז או מוגזם לרקמות של cdnas האנושי באופן אחר, בעלי סוג פראי, יכול לספק מידע המשלים לניסויים המבוססים על הצלה הנדונים בסעיף 3.1. בעוד הצלה מבוסס בחני מתוכננים בעיקר כדי לזהות את משתני lof (מורפית, hypomophic), overexpression יטוי מבוסס בחני עשוי גם לחשוף את הזכות של פונקציה (gof) משתנים כי הם קשים יותר להעריך (היפרמורפי, אנטימורפית, neomorphic ורפיים).
    1. בחר ערכה של מנהלי התקנים GAL4 כדי לבטא את ה-cDNAs האנושי של הריבית. מספר רב של מנהלי התקנים GAL4 ספציפיים לרקמות/רקמה-/stacapas זמינים ממרכזי מניות ציבוריים (לדוגמה, BDSC), שחלקם משמשים לעתים קרובות יותר מאחרים. המוקד הראשון על מנהלי התקנים בכל מקום ובקלות לפנוטיפים (הלאליות, עקרות, פנוטיפים מורפולוגיים), ולאחר מכן לעבור מנהלי התקנים ספציפיים לרקמות ופנוטיפים ספציפיים יותר.
      הערה: אמת את הביטוי של מנהלי התקנים GAL4 עם קו עיתונאי (לדוגמה, UAS-GFP) כדי לאשר דפוסי ביטוי לפני השימוש בניסויים.
    2. בטא את ההפניה ושינוי cDNAs האדם באמצעות אותו מנהל תחת אותו מצב (למשל, טמפרטורה) על ידי חציית 3-5 נקבות הבתולה מן הקו GAL4 (g. ey-GAL4 עבור הביטוי דיסק ביטוי העין) עם 3-5 גברים זבובים מקווי uas [למשל, Uas-TBX2 (+) או UAS-TBX2 (עמ' R305H) לדוגמה המוצגת בסעיף 4.2] בבקבוקון אחד.
      1. להעביר את הצלבים כל 2-3 ימים כדי להיות בעלי חיים רבים לאבד מצלב אחד.
    3. לבחון את צאצאי ולזהות כל הבדלים בין התייחסות וזנים משתנה (למשל, מורפולוגיה עין) תחת מיקרוסקופ ניתוח. תמונה זבובים באמצעות מצלמה המצורפת מיקרוסקופ לנתיחה כדי פנוטיפים.
      הערה: אם הפנוטיפ מראה רק בהפניה אך לא בשורה המשתנה, אז המשתנה עשוי להיות מורפית או אלאואומוראומלה חזק. אם הפנוטיפים נראים בשני הגנוטיפ, אבל ההתייחסות גורמת לפגם חזק יותר, אז המשתנה עשוי להיות מיאלואומורפית קלה לחולשה. אם ההפניה אינה מראה פנוטיפ או מציג רק פנוטיפ חלש, אבל המשתנה מראה פגם חזק, אז המשתנה יכול להיות GOF allele.
    4. אם פנוטיפ לא נראה בתנאים סטנדרטיים התרבות (RT או ב 25 ° c, ולאחר מכן להגדיר את הצלבים בטמפרטורות שונות החל 18-29 ° c, מאז uas/GAL4 מערכת ידוע להיות טמפרטורה רגיש64,65). בדרך כלל, הביטוי של הטרנסגנים של UAS גבוה יותר בטמפרטורות גבוהות יותר.
  3. בצע מחקרים פונקציונליים נוספים הקשורים לגנים ולחלבון הריבית.
    הערה: בנוסף לבדיקת פגמים כלליים, ניתן לבחור מערכת שיטה לחקור את התפקודים המולקולריים של הגן והמשתנה. בדוגמה אחת הנדונה בתוצאות הנציגים (TBX2case), הקלטות erg שימשו כדי לקבוע את ההשפעות של המשתנה על הפונקציה תא קולט אור, מאז הגן לטוס של עניין (bifid) נחקרו בהרחבה בהקשר של פיתוח מערכת חזותית. פרוטוקולים מפורטים עבור ERG בDrosophilaניתן למצוא כפי שפורסם בעבר66,67,68.
    1. צור זבובים כדי לבדוק פגמים פונקציונליים במערכת החזותית. לחצות נקבות הבתולה מן הרודופסין 1 (Rh1)-קו GAL4 לזכרים עם התייחסות או variant uas-האדם הטרנסגנים כדי לבטא את החלבונים האנושיים של עניין של R1-R6 photoreceptors.
      הערה: צלב 3-5 נקבות הבתולה כדי 3-5 גברים זבובים בבקבוקון אחד ולהעביר את הצלבים כל 2-3 ימים כדי להיות בעלי חיים רבים מאבדים מצלב אחד. יש לשמור על כל הצלבים בחממה שנקבעה בטמפרטורה הניסיונית כדי להשיג תוצאות עקביות.
    2. פעם אחת זבובים מתחילים לאבד (ב -25 ° c, ~ 10 ימים לאחר הגדרת הצלב הראשון), לאסוף את צאצאי (Rh1-GAL4/+; UAS-האדם cDNA/+) לתוך מבחנות טרי ולמקם אותם בחזרה לתוך החממה להגדיר בטמפרטורה ניסיוני עבור 3 ימים נוספים עבור המערכת החזותית בוגרת.
      הערה: למרות erg ניתן לבצע על 1-2 הישן היום זבובים, זבובים החדש של eclosed יכול להיות תנודות גדולות באות erg שלהם. אם רצוי לבחון פנוטיפ תלויי-גיל, זבובים אלה יכולים להזדקן במשך מספר שבועות, כל עוד הם באופן קבוע (למשל, כל ~ 5 ימים) הועברו למבחנה חדשה כדי להימנע מטביעה במזון רטוב.
    3. הכינו את הזבובים להקלטת ERG על ידי ההרדמה הראשונה של זבובים באמצעות CO2 או הצבת אותם לתוך בקבוקון על הקרח. להדביק בעדינות צד אחד של הזבוב על מיקרוסקופ זכוכית מחליק כדי לשתק אותם.
      הערה: ניתן לדבוק בשקופית אחת ובמספר זבובים של הפניות ומשתנים. מניחים את כל הזבובים בתוך כיוון זהה עם עין אחת נגיש עבור האלקטרודות ההקלטה. היזהרו לא לקבל דבק על העין ולהשאיר את החוטם הוא חופשי.
    4. הכן את ההקלטה ואת האלקטרודות להפניה. מניחים לתוך מחטים מ1.2. לשבור את שפופרת קפילר כדי להשיג שתי אלקטרודות מחודדות חדים. האלקטרודות הנובעות צריך להיות חלול יש קטרים הסופי של < 0.5 מ"מ.
    5. ממלאים את נימים עם תמיסת מלח (100 מ"מ היום), וודא כי אין בועות אוויר. החלק את נימי הזכוכית מעל אלקטרודות התיל הכסוף (הן האלקטרודות ההקלטה והן התייחסות אלקטרודה, ראה איור 4) ולאבטח את נימים במקום.
    6. קביעת התצורה של מגבר הגירוי והמגבר. הגדרת מפורטת ניתן למצוא בLauwers, ואח '.67. ה-UDN Drosophila ילה MOSC הגדרת מורכב של ציוד המפורטים בסעיף חומרים.
      1. הגדר את המגבר למסנן ברמה גבוהה של 0.1 Hz, 300 מסנן למעבר נמוך ב-Hz ו-100 מרוויחים.
      2. הגדר את הגירוי לתקופה של 1, 500 ms רוחב הדופק, 500 ms עיכוב הדופק, מצב הפעלה, ו-7 Amp.
      3. הכינו את מקור האור לגירוי התמונה. השתמש במקור אור הלוגן כדי להפעיל את הפוטורפקטורים העפים.
      4. הכן את תוכנת ההקלטה במחשב המחובר להגדרת ה-ERG. צור פרוטוקול גירוי עם מודל רכישה "אירועים באורך קבוע" ו-20 המשך.
    7. Acclimate זבובים כדי להשלים את החושך לפני ייזום הקלטות ERG. מניחים את הזבובים לתוך חשכה מוחלטת לפחות 10 דקות לפני תחילת הניסוי.
      הערה: מכיוון שזבובים אינם יכולים לזהות אור אדום, השתמש במקור אור אדום בתקופת ההרגלה הכהים.
    8. הצב את השקופית המכילה את הזבובים על מכשיר ההקלטה והעבר את המיקרומניפולציה הנושאת את ההפניה ואת אלקטרודות ההקלטה לנקודה הקרובה לזבוב הריבית בשקופית. שימו לב לקצה האלקטרודה והציבו בזהירות את האלקטרודות המפנות לבית החזה של הזבוב (חודרים לקוטיקולה). לאחר אלקטרודה התייחסות מוכנס באופן סביר, מניחים את האלקטרודות ההקלטה על פני השטח של העין.
      הערה: המיקום המדויק של אלקטרודה התייחסות זו אינו בעל השפעה מרכזית על האות erg. אלקטרודה ההקלטה יש להציב על פני השטח של העין מאז ERG היא הקלטה פוטנציאלית שדה ולא הקלטה תאיים. כמות נאותה של לחץ להחיל את האלקטרודות ההקלטה גורמת גומת קטן מבלי לחדור את העין.
    9. כבה את כל האורות עבור אחר 3 דקות כדי התאקלם את הזבובים לסביבה כהה.
    10. הגדר את תוכנת ההקלטה והתחל בהקלטת האות. אם השימוש במקור אור הלוגן עם תריס ידני, הפעל את מקור האור עם סגר סגור. . התחל להקליט את האות
    11. לחשוף את העיניים לטוס לאור על ידי פתיחת ולסגור את התריס כל 1 עבור המשך 20 s של לרוץ בודד.
      הערה: הפעלה/כיבוי של מקור האור הלוגן יכול להיות נשלט באופן ידני או מתוכנת כדי להפוך אוטומטית באמצעות מקור אור LED לבן. ERG עמיד יותר ואמין ניתן להשיג באמצעות מקור אור הלוגן לעומת נורית אור לבן, כנראה בשל ספקטרום אור רחב יותר הנפלט ממקור אור הלוגן.
    12. הקלט את כל הזבובים הנטענים על מגלשת הזכוכית. לבצע ERGs מ 15 זבובים לכל מסוג גנוטיפ לכל תנאי.
      הערה: פרמטרים מסוימים שניתן לשנות כדי למצוא תנאי המציג הבדלים חזקים בין הפניה לבין משתנה cdnas עשויים לכלול טמפרטורה, גיל, או תנאים סביבתיים (למשל, גדל במחזור אור כהה או אור קבוע/חושך).
    13. בצע ניתוח נתונים: השווה את ה-ERGs מההפניה, המשתנה והפקדים כדי לקבוע אם קיימים הבדלים. להעריך את נתוני erg עבור שינויים ב-ארעיות, depolorization, off-ארעיות, ו רה-פולריזציה69 (איור 4ב).
      הערה: הדפולריזציה והראוליריזציה משקפים את ההפעלה וההפעלה של מדרג הפוטופרקציה בתוך photoreceptors, ואילו ב-ו-מחוץ לארעיות הם מדדים של פעילויות של תאים פוסט סינפטית המקבלים אותות מ . הפוטורפקטורים משרעת ירידה וקינטיקה שונה של רה-פולריזציה משויכים לעתים קרובות פגמים עם הפונקציה תא קולט אור ובריאות, בעוד פגמים ב-ו-מחוץ לארעיות נמצאים מוטציות עם פיתוח הסינפסה פגום, תפקוד, או תחזוקה 70.
    14. לאחר זיהוי של הבדלים בפנוטיפים של erg עם ביטוי יתר של התייחסות לעומת cdnas האדם האנושי, לקבוע אם הפנוטיפ האלקטרו-פיסיולוגי הזה קשור לפגמים מבניים ואולטרה-מבניים ב-photoreceptors וה סינפסות על ידי ביצוע ניתוח היסטולוגית והעברת אלקטרון מיקרוסקופ.
      הערה: דיון נוסף על פרשנות של פגמים erg וניתוח מבנית/ultrastructural בניים תוארה בעבר69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המחקר הפונקציונלי של דה נובו מוטעית Variant ב EBF3 מקושרים לפנוטיפים נוירוהתפתחותיים
בזכר בן 7 עם פנוטיפים נוירוטיביים כולל היפוטוניה, אטקסיה, עיכוב התפתחותי גלובלי, והפרעת דיבור הבעה, רופאים וגנטיקאים האדם במכון הלאומי לבריאות לא אובחן מחלות (UDP) זיהה גרסה דה נובו מוטעית (p. R163Q) ב EBF3 (מוקדם ב-Cell פקטור 3)15, גן המקודד קו (קולייר/הריח-1/מוקדם-cell פקטור) שעתוק משפחה. מקרה זה הוגש ל UDN MOSC במרץ 2016 למחקרים פונקציונליים. כדי להעריך אם הגן הזה היה מועמד טוב למקרה זה, MOSC אסף מידע גנטי וגנומית של האדם תאומים, קליבאר, ExAC (מורחב כעת ל-gnomAD), Geno2MP, dgv, ו לפענח. בנוסף, הגנים האורתוולוגיים במיני מפתח של מו ב מזוהים באמצעות הכלי DIOPT. ביטוי גנים ומידע פנוסטימית ממסדי נתונים בודדים של MO (למשל, Wormbase, FlyBase, ZFIN, MGI) התקבלו לאחר מכן. הניתוחים באינפורמטיקה שבוצעו עבור EBF3 ולימודים חלוצי אחרים ב UDN MOSC יצרו את הבסיס לפיתוח מאוחר יותר של משאב MARRVEL30.

המידע שנאסף באמצעות מתודולוגיה זו ציין EBF3 לא היה קשור להפרעה גנטית אנושית ידועה בזמן הניתוח, והגיע למסקנה כי p. R163Q המשתנה היה מועמד טוב מבוסס על המידע הבא. (1) חלופה זו לא דווחה בעבר במסדי נתונים של אוכלוסיית השליטה (ExAC) ובמסד נתונים של אוכלוסיית המחלה (Geno2MP), המציינת כי זהו משתנה נדיר מאוד. (2) מבוסס על ExAC, מורכב (ההסתברות של אי סבילות LOF) הציון של הגן הזה הוא 1.00 (מורכב מטווח של 0.00-1.00). זה מציין כי יש לחץ סלקטיבי נגד LOF משתנים בגן זה באוכלוסייה הכללית, ומציע כי הפלואי של הגן הזה עלול לגרום למחלה. לקבלת מידע נוסף על מורכב ופרשנות שלה, מאמר הדרכה marrvel ליווי ביופיטר31 וניירות קשורים לספק פרטים30,71.

משתנה p. R163Q נחשב גם מועמד טוב, כי (3) הוא ממוקם בתחום המחייב שימור האבולוציונית DNA של חלבון זה, הרומז כי זה עשוי להשפיע על כריכת DNA או פונקציות חלבון אחרות. (4) שאריות p. R163 שמרו בדרך אבולוציונית מ -C. אלגיה ומדרוזולה לבני האדם, ומציע כי ייתכן שיהיה זה קריטי לתפקוד החלבונים ברחבי המינים. (5) EBF3 אורתודלוגים היו מעורבים בפיתוח עצבי במספר מו72 כולל C. אלגיה73, דרוסופילה74, xenopus75, ועכברים76. (6) במהלך התפתחות המוח בעכברים, Ebf3 הוכח לתפקד במורד הזרם של arx (בביתהקשורות aristaless)77, גן המקושר עם מספר אפילפסיה ונכות אינטלקטואלית תסמונות בבני אדם78. מכאן, נתונים אלה יחד מראים כי EBF3 הוא צפוי מאוד להיות קריטי להתפתחות הגוף האנושי וכי משתנה p. R163Q יכול להיות השלכות פונקציונליות.

כדי להעריך אם p. R163Q משפיע על EBF3 פונקציה, קו T2A-GAL4 עבור קשר (kn; the לטוס אורתולוג של האדם EBF379) נוצר באמצעות rmce של קידוד מחקה הכניסה15. השורה knT2A-GAL4 הוא קטלני וכישלון להשלים את הסטלאליות של הקלאסי kn אלל (kncol-1) כמו גם מחסור מוגדר מאוד המכסה kn [Df (2r) BSC429]80 . דפוסי הביטוי של GAL4 גם משתקף דפוסי ביטוי בעבר של kn במוח, כמו גם בדיסק הדפוס הכנף15. הזבובים הטרנסגניים UAS נוצרו לאחר מכן כדי לאפשר את הביטוי של התייחסות ושונות האדם EBF3 cdna כמו גם מסוג פראי לטוס kn cdna. כל שלושת החלבונים תויגו עם תג C-טרמינל 3xHA. חשוב מאוד, uas פראי לטוס kn (kn+) או להפנות EBF3 אנושי (EBF3+) transgenes הציל את האליות של knT2A-GAL4/df (2r) BSC429 במידה דומה ( איור 3ג, פאנל שמאלי)81.

לעומת זאת, UAS-האדם EBF3 transgene עם הגרסה p. R163Q (EBF3p. R163Q) לא היה מסוגל להציל את המוטציה הזאת, מציע שמשתנה p. R163Q משפיע על EBF3 פונקציה ב vivo15. מעניין, כאשר העריכו באמצעות נוגדן אנטי HA, EBF3p. R163Q חלבון בוצע בהצלחה ברקמות לטוס, ואת רמות ולוקליזציה subcellular (בעיקר גרעיני) היו זהים אלה של EBF3+ ו .בסדר. זה מרמז כי המשתנה אינו גורם LOF פנוטיפ עקב אי-יציבות חלבון או אי-לוקליזציה. כדי להעריך עוד אם המשתנה p. R163Q השפיע על פונקציית ההפעלה הטרנססקריפט של EBF3, שיטת לוציפראז המבוססת על הכתב בוצעה בתאים HEK29315. ניסוי זה בתאי האדם התרבותי חשף כי EBF3p. R163Q משתנה נכשל להפעיל שעתוק של מבנים העיתונאי, תמיכה lof מודל שהתקבל ניסויים דרוזוהילה .

במקביל למחקרים הניסיוניים, שיתופי פעולה עם רופאים, גנטיקאים אנושיים ויועצים גנטיים ב-BCM הובילו לזיהוי שני אנשים נוספים בעלי תסמינים דומים. מטופל אחד נשא את R163Q variant זהה, ואחר נשא משתנה מוטעה שהשפיע על אותם שאריות (עמ' R163L). המשתנה p. R163L גם נכשל להציל את לטוס kn מוטציה93 רומז כי אלל זה גם השפיע EBF3 פונקציה. מעניין, עבודה זו פורסמה גב אל גב עם שני מחקרים בעלי גנטיקה אנושית עצמאית שדיווחו על אנשים נוספים עם דה נובו missense, שטויות, frameshift, והחדרת משתנים ב EBF3 המקושרים דומה פנוטיפים התפתחותיים התפתחותית82,83. לאחר מכן, שלושה ניירות נוספים פורסמו דיווח מקרים נוספים של EBF3 משתנים דה נובו ומחיקת מספר מחיקה84,85,86. זו תסמונת נוירוהתפתחותית הרומן ידוע כיום בשם היפוטוניה, אטקסיה, ותסמונת פיתוח מושהה (הדסים, מ#617330) ב הירושה Mendelian באינטרנט האדם (תאומים, מסד נתונים סמכותי עבור מערכות יחסים גנוטיפ-פנוטיפ בבני אדם).

מחקר פונקציונלי של בירושה לגרסה מוטעית Missense ב TBX2 מקושר להפרעת לב וכלי דם Syndromic והשלד התפתחותי
במשפחה קטנה מושפע מנסרה חופפים של הגולגולת דיסמורפיזם, חריגות לב, מומים השלד, חוסר החיסון, חריגות אנדוקריניות, וליקוי התפתחותי, האתר הקליני הדוכס UDN זיהה חלופה שגויה (p. R20Q) ב TBX2 שביניהם פנוטיפים למחלות87. שלושה (בן, בת, אמא) מתוך ארבעת בני המשפחה מושפעים מהמצב הזה, והבן הציג את הפנוטיפים החמורים ביותר. מבחינה קלינית, הוא פגש אבחנה של "תסמונת DiGeorge מלאה", מצב שנגרם לעתים קרובות על ידי הTBX1. אמנם לא היו מוטציות שזוהו ב TBX1 במשפחה זו, קלינאים וגנטיקאים האדם התמקדו גרסה ב TBX2, מאז מחקרים קודמים בעכברים הראו כי גנים אלה יש חופפים פונקציות במהלך פיתוח88 . TBX1 ו TBX2 שניהם שייכים T-box (TBX) משפחת הגורמים שעתוק שיכולים לפעול כrepressors הטרנס כמו גם הפעלות בהתאם להקשר.

בעבר, משתנים ב 12 מתוך 17 חברי הגנים המשפחתיים TBX נקשרו למחלות אנושיות. MOSC החליט לעסוק בגרסה זו על סמך המידע הבא שנאסף באמצעות MARRVEL ומשאבים אחרים. (1) משתנה זה דווח רק פעם אחת בקבוצה של ~ 90,000 "בקרת" אנשים ב-gnomAD (משתנה זה היה מסונן בתצוגת ברירת מחדל, כנראה עקב כיסוי נמוך קורא). בהתחשב המצגת פנוטיפים מתון של האם, זה עדיין יכול להיחשב כמשתנה נדיר שעשוי להיות אחראי על פנוטיפים המחלה. (2) הציונים המקומניים של TBX2 ב-ExAC/gnomAD הם 0.96/0.99, שהוא גבוה (מקסימום = 1.00). בנוסף, o/e (נצפתה/צפוי) LOF ניקוד ב-gnomAD הוא 0.05 (רק 1/29.9 צפוי LOF variant נצפה ב-gnomAD). מספרים אלה מראים כי משתני LOF בגנים זה נבחרים נגד האוכלוסיה הכללית.

בנוסף, (3) ה-p. R20 שמרו על האבולוציונית מג ומדרוזולה לבני האדם, ומרמזת כי הדבר עשוי להיות משקעים חשובים לתפקוד TBX2. (4) תוכניות מרובות לחזות כי המשתנה הוא ככל הנראה מזיק (polyphen: אולי/כנראה מזיק, לנפות: לדלטרש, CADD הציון: 24.4, להתענג על הציון: 0.5). (5) מוטציות של מו להפגין פגמים ברקמות המושפעות בחולים (למשל, עכברים הסתרה מפגין פגמים במערכת לב וכלי דם, מערכות העיכול/הקיבה, הגולגולת, האיברים/הספרה). מכאן, יחד עם הקישורים הביולוגיים בין TBX1 ו TBX2 והקישורים פנוטים בין המטופלים האלה ו digeorge תסמונת, זה היה אופטימלי לבצע מחקרים פונקציונליים של משתנים בגן זה באמצעות drosophila ילה.

כדי להעריך אם ה-p. R20Q variant משפיע על הפונקציה TBX2 , קו T2A-GAL4 בביפיד (Bi; ה-" דרוסופילה " של הTBX2 האנושי), נוצר באמצעות rmce של קידוד מחקה (איור 2)87. Allele זה, biT2A-GAL4, היה באופן שכלי היתה קטלני גולמי והתנהג כמו lof מוטציה חזקה, דומה bi lof allele בעבר (g., biD2, biD4; איור 2 E). ההאליות של אלה allllllllllllllllllllllllllllllllla שנוצרו על ידי 80 מבנה הצלה של המשחק הקלאסי והחדש, המעידים על כך שהריאגנטים האלה אכן נקי תבנית הביטוי של GAL4 בשורה BiT2A-GAL4 התאימה גם עם דפוסים שדווחו בעבר של ביטוי bi ברקמות מרובות, כולל בדיסק המקורי של הכנף (איור 2ד).

במקביל, קווי UAS-טרנזגניים עבור TBX2 הנושאים את ההפניה או את רצפי variant (p. R20Q) נוצרו. למרבה הצער, העבר לא היה מסוגל להציל את הפוטנציאל של BiT2A-GAL4 line. חשוב להניח, מסוג פראי לטוס Uas-bi טרנזגנטי גם נכשל להציל את BIT2A-GAL4 allele, כנראה בשל רגישות המינון של הגן הזה. אכן, הבעת היתר של uas-bi+ ו uas-TBX2+ גרם מידה מסוימת של השפעה כאשר מתבטאת בחיה מסוג פראי. זו השפעה רעילה של bi/TBX2 overexpression היה מנוצל כקביעה תפקודית כדי להעריך אם משתנה p. R20Q עשוי להשפיע על TBX2 פונקציה. מאז הגן הדרוזוהילה bi כבר נחקרו בהרחבה בהקשר של מערכת חזותית [הגן ידוע גם optomotor עיוור (קולומב)], פנוטיפים הקשורים למערכת החזותית נחקרו בהרחבה. כאשר TBX2 התייחסות ביטא באמצעות מנהל התקן ey-GAL4 המבטא uas-טרנסוגנים בעין וחלקים של המוח הרלוונטי למערכת החזותית, ~ 85% הלאליות (איור 3C, הלוח הימני) ומשמעותיים הפחתת גודל העין (איור 4ב) נצפו. הפנוטיפ הזה היה חזק יותר מהפנוטיפים שנצפו כאשר ביטא מסוג פראי -בי-אן-בי- גן, והציע שTBX2 האנושי מזיק יותר לזבוב כאשר הוא מבוטא.

מעניין, p. R20Q TBX2 היה פחות חזק בגרימת הלליות (איור 3ג, הלוח הימני) ובגרימת העין הקטנה פנוטיפ (איור 4ב) באמצעות אותו הנהג תחת המצב זהה87, מציע כי המשתנה משפיע על תפקוד החלבון. יתר על כן, הפונקציה של photoreceptors להביע התייחסות ו variant TBX2 באמצעות מנהל התקן GAL4 שונים, (Rh1-GAL4) כי במפורש מבטא uas טרנסגנים ב R1, R6 photoreceptors, גילה כי המשתנה TBX2 הציגו מתון יותר ERG פנוטיפ לעומת התייחסות TBX2 (איור 4ב)87. מעניין, רוב החלבון p. R20Q TBX2 נמצא עדיין בגרעין, בדומה לחלבון הייחוס, הרומז כי המשתנה לא השפיע על לוקליזציה גרעינית. שיטת הדיכוי המבוססת על לוציפראז בתאי HEK293T הראתה כי p. R20Q לא היה מסוגל לדכא ביעילות את התמלול של העיתונאי בניית מבנה עם palindromic T-box87. בנוסף, פוחתת רמות החלבון של TBX2p. R20Q נצפו לעומת TBX2+, מציע כי המשתנה עשוי להשפיע על יציבות התרגום או החלבון של TBX2, אשר בתורו משפיע על שפע בתוך תא.

חולים נוספים עם גרסאות נדירות ב TBX2 זוהו על ידי מטפלים ב-Udn דיוק קליני באתר במקביל עם המחקרים האלה ניסיוני.  ילד בן 8 עם משתנה דה נובו missense (p. R305H) של משפחה לא קשורה הציגו רבים מהתכונות שנמצאו המשפחה הראשונה87. מחקרים פונקציונליים נוספים ב- Drosophila ילה וקווי התאים האנושיים התגלו כי משתנה p. R305H משפיע גם TBX2 תפקוד ורמות החלבון, מציע בחריפות כי פגמים בגן זה סביר להניח הרבה פנוטיפים רבים שנמצאו בשתי המשפחות. הפרעה זו היתה לאחרונה בתור "חריגות החוליות משתנה אנדוקרינית ו-T בתפקוד תאי" (VETD, חמים #618223) ב תאומים. זיהוי של אנשים נוספים עם משתנים מזיקים ב TBX2 עם פנוטיפים חופפים הוא קריטי כדי להבין את הספקטרום המלא של קשרים גנוטיפ-פנוטיפ עבור הגן הזה במחלה אנושית.

Figure 1
איור 1 : הזרקה מערכת המעבר כדי ליצור UAS-האדם cDNA ו T2A-GAL4 קווים. (א) דור של הטרנסגנים האנושיים של uas-האדם באמצעות מיקרוזריקות וצלבים. מעבר מערכת לשלב את הטרנסגנים לתוך אתר עגינה של כרומוזום שני (VK37) באמצעות זבובים זכרים בדור הראשון והשני מוצגים כדוגמה. עם ההזרקה של המבנה האנושי cdna φC31 הטרנסגניים (pgw-HA. attb) לעוברים מוקדם המכילים מקור germline של φC31 שילובים (עם תוויות 3xp3-gfp ו 3xp3-rfp) ו VK37 אתר עגינה [עם תווית צהוב+ (y+ ), ניתן לעקוב אחר אירועים טרנסגניים עם הלבן + (w+) minigene הקיים בווקטור הטרנסגניים. מומלץ למחוק את שילובי φC31 se על ידי בחירה נגד זבובים עם GFP ו-RFP. מלאי יציבה הסופי ניתן לשמור כמו הומוזיטים או כמניה מאוזנת אם הכרומוזום נושאת באתר השני קטלני/סטרילי מוטציה פגע. נוכחות של האתר השני מוטציות קטלני/סטרילי על מבנים טרנסגניים בדרך כלל אינו משפיע על התוצאה של מחקרים פונקציונליים כל עוד הטרנסגנים אלה משמשים במצב heterozygous (איור 3). (ב) הדור של T2A-GAL4 קווים באמצעות מיקרו הזרקה וצלבים. מעבר לערכת להמיר כרומוזום שני מחקה החדרת לתוך אלמנט T2A-GAL4 מוצג כדוגמה. על-ידי מיקרו-הזרקת וקטור ביטוי עבור φC31 שילובים ו RMCE וקטור עבור T2A-GAL4 (pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70, מסגרת קריאה מתאימה לחיקוי הריבית נבחרה. ראה את הניירות הבאים עבור פרטים57,59 לעוברים נושאת לחקות בקידוד אינטרון בגנים של עניין, אפשר להמיר את החיקוי המקורי לתוך קו T2A-GAL4. איור 2 A הצגת דיאגרמה סכמטית של המרת rmce. האירוע ההמרה ניתן לבחור על ידי הקרנה נגד y+ סמן בקלטת לחקות המקורי60. מאז RMCE יכול להתרחש בשני כיוונים, רק 50% של אירוע ההמרה מוצלחת מוביל לייצור מוצלח של GAL4, אשר ניתן לזהות על ידי העיתונאי UAS-GFP בדור הבא. מלאי יציבה הסופי ניתן לשמור כמו הומוזיטים או כמניה מאוזנת אם LOF הגן הוא קטלני/סטרילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : המרה של אלמנטים לחיקוי לתוך T2A-GAL4 קווים באמצעות RMCE. (A) φC31 שילובים מקלה על השילוב בין שני האתרים attp בזבוב (למעלה) ושני האתרים attp החוצה מחסנית T2A-GAL4 המוצגת כווקטור מעגלי (למטה). (ב) אירועי rmce מוצלחים מובילים לאובדן של סמן לבחירה (צהוב +) והחדרת הקלטת T2A-GAL4 באותה כיוון של גן הריבית. מאז האירוע RMCE יכול לקרות בשני כיוונים, רק 50% מתגובת RMCE התשואות מוצר רצוי. מוצר rmce שנוסף בכיוון ההפוך לא יתפקד כמו אלל מלכודת גנים או express GAL4. הכיווניות של המבנה חייבת להיות מאושרת באמצעות רצף סנגר. (ג) תמלול (למעלה) ותרגום (למטה) של הגן של הריבית מוביל ליצירת mrna וחלבון חתוכים עקב האות polya להציג בסוף 3 ' הקלטת T2A-GAL4. T2A הוא ריבוכמה מדלג על אות, אשר מאפשר הריבוחלק לעצור וליזום מחדש את התרגום אחרי האות הזה. זה משמש להפקת אלמנט GAL4 שאינו מחובר בעקשנות לתוצר הגנטי הנחתך של ריבית. GAL4 ייכנס לגרעין ויקל על שעתוק הטרנסגנים שנמצאים תחת שליטה של יסודות UAS. UAS-GFP יכול לשמש ככתב גנים ביטוי, ו-UAS-האדם cDNA ניתן להשתמש עבור ניסויים הצלה דרך גן "הומניזציה". (ד) המוצג הוא דוגמה לרכיב T2A-GAL4 בביטוי הנהיגה BI של UAS-gfp (למעלה). תבנית ביטוי זו דומה לקו ההשמנה שנוצר בעבר עבור אותו גן (bi-GAL4; למטה). (ה) השוואה בין T2A-GAL4 אלל של bi עם דיווח קודם ל-lof bi אלס. דמות זו אומצה והשתנתה מפרסומים קודמים57,87. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : ניתוח פונקציונלי של משתנים אנושיים באמצעות הצלה מבוסס (משמאל) ו overexpression יטוי מבוסס (מימין) לימודים. (A) (הפאנל השמאלי): הפונקציה של משתנים EBF3 הוערך עם ניתוח מבוסס ההצלה של קשר לעוף (kn) lof אלל התמקדות בלליות/הכדאיות; (הפאנל הימני): הפונקציה של משתנים ב TBX2 הוערך על ידי ביצוע ביטוי יתר של האדם TBX2 transgenes בזבובים מסוג פראי, התמקדות בהאליות/כדאיות, מורפולוגיה העין, ופנוטיפים אלקטרופיזיולוגיה (איור 4) . (ב) הצלבת מערכות כדי להשיג את הזבובים להיבדק במחקרים פונקציונליים. מומלץ תמיד להשתמש באלמנט UAS נייטרלי (למשל, uas-lacZ, UAS-gfp) כניסוי בקרה. (ג) הנציג נובע ממחקרים פונקציונליים של EBF3p. R163Q ו TBX2p. R20Q גרסאות, בהתאמה, יחד עם ניסויים שליטה הולמים הנחוצים כדי לפרש את התוצאות. שני הניתוחים המבוססים על הצלה ומחקרים ביטוי יתר מגלים שהמשתנים מתנהגים כמו מורפיים או אלואומוראומורפיים. הנתונים הלטבליות/הכדאיות המוצגים כאן מבוססים על נתונים ניסיוניים המוצגים בפרסומים הקודמים15,87. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : ניתוח פונקציונלי של משתנה מוטעה נדיר ב- TBX2 האדם מבוסס על מורפולוגיה העין ואלקטורגרם בדרוזופילה. (א) דימוי סכמטי המציג את המיקום האופייני של הקלטה והתייחסות של אלקטרודות על עין הזבוב, יחד עם הקלטת מייצגת של ההקלטה האלקטורגרמה עם ארבעה רכיבים עיקריים (על-ארעי, depolarization, off-ארעי, ראוליריזציה). (ב) TBX2 variant (p. R20Q) פונקציות כחלק lof אלל מבוסס על המחקרים overexpression יטוי בעין לטוס באמצעות מנהלי התקנים GAL4 ספציפיים למערכת החזותית (ey-GAL4 ו Rh1-GAL4). זה הראה כי הייחוס TBX2 גרם לפנוטיפ חזק מורפולוגיים ואלקטרופיזיולוגיה בהשוואה לחלבון המשתנה. (לוחות העליון): ירידה חמורה בגודל העין הוא ראה על יתר ביטוי של uas-TBX2+ עם ey-GAL4. Uas-TBX2p. R20Q. מונחה עם ey-GAL4 גם גורם לעין קטנה יותר, אבל פנוטיפ הוא הרבה יותר מתון. (בתחתית הפאנלים): כאשר uas-TBX2+ מתבטאת בליבת R1 R6 photoreceptors באמצעות Rh1-GAL4, יש אובדן של ב-ו-מחוץ לארעיות, depolarization מופחתת, וגדול חריג ממושך depolarization לאחר הפוטנציאל (PDA) פנוטיפ, שאינו נראה בזבובי שליטה. פנוטיפים אלה אינם חמורים כמו כאשר UAS-TBX2p. R20Q מבוטא באמצעות אותו Rh1-GAL4. דמות זו אומצה והשתנתה מפרסומים קודמים69,87. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מטרה כלי URL
פונקציית Variant
אלגוריתמים לחיזוי		 פוליפן-2
נפות
מיכל מוסף
PROVEAN
מוסיקה טועם
התענג		 http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2
https://sift.bii.a-star.edu.sg
https://cadd.gs.washington.edu
http://provean.jcvi.org/index.php
http://www.mutationtaster.org
https://sites.google.com/site/revelgenomics
נדיר ולא אובחן
חקר המחלות
קונסורציומים		 בעלי ה, UDN
RDMM
מיכל ברוד
לפתור-RD
מיכל כהן		 https://undiagnosed.hms.harvard.edu
http://www.rare-diseases-catalyst-network.ca
https://irudbeyond.nig.ac.jp/en/index.html
http://solve-rd.eu
https://www.functionalgenomics.org.au
מסד נתונים אינטגרטיבי עבור
אדם ומודל
אורגניזם מידע		 מרגרט לוול
יוזמת המונרך
Gene2Function
פנויומנים		 http://marrvel.org
https://monarchinitiative.org
http://www.gene2function.org
http://www.phenologs.org
האדם הגנטי ו
מאגרי מידע גנומיקה		 תאומים
מיכל קליבאר
ExAC
גנאואדה
GenoMP
מיכל שייב
פענח		 https://www.omim.org/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
http://exac.broadinstitute.org/
http://gnomad.broadinstitute.org/
http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/#/
http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home
https://decipher.sanger.ac.uk/
כלי זיהוי אורתולוג הוראות הצטרפות https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
אורגניזם מודל
מאגרים וביורפואיים
חיפוש בספרות		 וורמבאז(מג)
פליי בסיס (דרוזופילה)
ZFIN (דג זברה)
MGI (עכבר)
Pubmed		 https://www.wormbase.org
http://flybase.org
https://zfin.org
http://www.informatics.jax.org
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
גנטית וחלבון
מאגרי מידע אינטראקציית		 חרוזת
ערפל		 https://string-db.org
http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/
מבנה החלבון
מאגרי מידע ו
כלי דוגמנות		 בעלי מקלדת
שוויץ-מודל
דגמן
פיר2 		http://www.wwpdb.org
https://swissmodel.expasy.org/
https://salilab.org/modeller/
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2
השידוכים מטופל
פלטפורמות		 שדכן חליפין
מיכל מרדכי
ארכיון אגא
גפרורים
פענח
מיג'ין2
פנדום סנטרל		 http://www.matchmakerexchange.org
https://www.genematcher.org
https://mme.australiangenomics.org.au/#/home
https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox
https://decipher.sanger.ac.uk
https://www.mygene2.org/MyGene2
https://phenomecentral.org
תעתיק אנושי
ביאור ו-cDNA
מידע שכפול		 אוסף גנים ממאני
Ensembl
רפלseq		 https://genecollections.nci.nih.gov/MGC
http://useast.ensembl.org
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

טבלה 1: משאבים מקוונים הקשורים לפרוטוקול זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקרים ניסיוניים המשתמשים בדרוסופילה מלאנוסטר מספקים מערכת שיטה איתנה להערכת ההשלכות של מחלות אנושיות הקשורות למחלות. זאת בשל הגוף הגדול של ידע וכלים גנטיים מגוונים שנוצרו על ידי חוקרים רבים בשדה לטוס במהלך המאה האחרונה89. עם זאת, בדיוק כמו בכל מערכת ניסיונית אחרת, חשוב להכיר באזהרות ובמגבלות הקיימות.

אזהרות הקשורות לכריית נתונים
למרות שהצעד הראשון בפרוטוקול זה הוא למסד הנתונים שלי למידע הנוגע לגנים המעניינים, חשוב להשתמש בו רק כנקודת התחלה. לדוגמה, למרות שבחיזוי של פונקציה משתנה מספק תובנות יקרות, על הנתונים האלה להתפרש תמיד בזהירות. ישנם מקרים שבהם כל האלגוריתמים המרכזיים מראים שמשתנה אנושי הוא שפיר, אך מחקרים פונקציונליים בדרוזוהילה הפגינו בבירור את האופי המזיק של משתנה כזה24. באופן דומה, למרות האינטראקציות חלבון חלבון, ביטוי משותף, ונתוני מידול מבניים הם כל פיסות תובנה של מידע, ייתכנו מידע מדומה ומדומה-שלילי הנמצאים אלה מערכות נתונים גדולים omics. לדוגמה, חלק מאינטראקציות החלבון המזוהות או הצפויות שזוהו בעבר עשויות להיות מלאכותיות או להיראות רק בסוגי תאים ורקמות מסוימים.

בנוסף, ייתכנו אינטראקציות שליליות רבות שלא נלכדו בערכות נתונים אלה, מאחר שאינטראקציות חלבון-חלבון מסוימות הן זמניות (לדוגמה, אינטראקציות של מצע אנזימים). אימות ניסיוני הוא קריטי כדי להוכיח כי גנים מסוימים או חלבונים מסוימים מבחינה גנטית או פיזית אינטראקציה בvivo בהקשר הביולוגי של עניין. באופן דומה, מבנים החזוי בהתבסס על מידול הומולוגיה יש להתייחס כמודל ולא פתרו מבנה. למרות שמידע זה עשוי להיות שימושי אם נמצא כי חומצת אמינו של עניין נוכחת בחלק חשוב מבחינה מבנית של החלבון, נתונים שליליים אינם משלול את האפשרות כי המשתנה עלול להזיק. לבסוף, חלק מהמידע שדווח בעבר על-ידי ה-גנוטיפ, צריך גם להיות מטופל בזהירות, כיוון שמידע מסוים המאוחסן בארכיון במסדי נתונים ציבוריים אינו מדויק. לדוגמה, מידע מסוים במסדי נתונים של MO מבוסס על ניסויים שהיו מבוקרים היטב וביצעו בקפדנות, בעוד שאחרים עשויים לבוא מנייר מסך גדול ללא מחקרים נוספים ובקרות מחמירות.

ניסויים "הומניזציה" באמצעות T2A-GAL4 אסטרטגיה לא תמיד מוצלחת
בעוד מחקרים פונקציונליים המבוססים על הצלה ומוגזם באמצעות cDNAs האנושיים מאפשרים הערכה של משתנים בהקשר של החלבון האנושי, גישה זו לא תמיד מוצלחת. אם התייחסות האדם cDNA לא יכול להציל את המוטציות לטוס פנוטיפ, ישנם שני הסברים סביר. האפשרות הראשונה היא שהחלבון האנושי אינו מתפקד או שהוא הצטמצם באופן משמעותי בהקשר של תא מעופף. זה יכול להיות בגלל 1) חלבון מופחת ביטוי, יציבות, פעילות ו/או לוקליזציה או 2) חוסר תאימות עם חלבונים לטוס כי עובד בקומפלקס רב חלבון. מאז UAS/GAL4 מערכת הוא רגיש לטמפרטורה, הזבובים ניתן לגדל בטמפרטורה גבוהה יחסית (למשל, 29 ° c) כדי לראות את האפשרות של הצלה במצב זה. בנוסף, מבנה UAS-לטוס cDNA לבנות וטרנסגנים כמו שליטה חיובית ניתן ליצור. אם המשתנה של הריבית משפיע על חומצת אמינו שימור, המשתנה האנלוגי ניתן להציג ב-cDNA לטוס למחקר פונקציונלי של המשתנה בהקשר של לטוס אורתוקאבול. למרות שזה לא הכרחי, זה מאוד עוזר למחקר במקרים שמשתמשים בקווים הטרנסגניים האנושיים cDNA לתת תוצאות שליליות או לא חד-משמעית (איור 3).

האפשרות השנייה היא שהביטוי של החלבון האנושי גורם לרעילות ברמת הסלולר או האורגניזם. זה יכול להיות בגלל אנטימורפי (למשל, מתנהג כחלבון שלילי דומיננטי), היפרמורפי (למשל, יותר מדי פעילות), או neomorphic ורפית (למשל, הרווח של פונקציה רעילה הרומן כגון צבירת חלבון כי לא תמיד קשור לפונקציה אנדוגניים של הגן של ריבית). במקרה זה, שמירה על הזבובים בטמפרטורה נמוכה (למשל, 18 ° c) עלולה להקל על חלק מהבעיות הללו. לבסוף, ישנם כמה תרחישים בהם ביטוי יתר של cDNA לטוס לא יכול להציל את T2A-GAL4 לטוס כמו שניתן לראות בדוגמה TBX2 , כנראה בשל התלות המינון trict של המוצר הגן. כדי למנוע ביטוי יתר של חלבון של עניין, הגן לטוס של עניין יכול להיות שונה ישירות דרך crispr, בניית הצלה גנומית ניתן לתכנן כי מכיל את המשתנה של עניין, או ניסויים הצלה ניתן לבצע באמצעות lof אלל21. עבור גנים קטנים, "הומניזציה" מבנה ההצלה גנומית לטוס יכול להיחשב לבחון משתנים אנושיים המשפיעים על חומצות אמינו שאינן שימור שימור24. לסיכום, יש לשקול אסטרטגיות חלופיות כאשר ניסוי ההומניזציה אינו מאפשר הערכה פונקציונלית של משתנה הריבית.

פענוח תוצאות שליליות וחיוביות
אם 1) הן ההפניה ו-cdnas האנושי האדם להציל את הפנוטיפים לטוס מוטציה במידה דומה 2) אין הבדל נצפתה בכל התנאים נבדק, אז זה יכול להיות הניח כי המשתנה הוא באופן מבחינה פונקציונלית בדרוזוהילה ב vivo. עם זאת, חשוב לציין, כי מידע זה אינו מספיק כדי לשלול כי משתנה העניין הוא לא פתוגניים, מאחר שהטיפול בהדרוזולה אינו רגיש מספיק או ללכוד את כל הפונקציות הפוטנציאליות של הגן/חלבון הריבית רלוונטיים לבני אדם. נתונים חיוביים, מצד שני, הוא אינדיקציה חזקה כי המשתנה יש השלכות מזיקות על תפקוד החלבון, אבל הנתונים האלה לבד עדיין לא מספיק כדי לתבוע פתוגניות. המכללה האמריקנית לגנטיקה רפואית וגנומיקה (acmg) פרסמה ערכה של תקנים והנחיות לסווג משתנים במחלות האדם הקשורים גנים לתוך "שפיר", "סביר להניח", "המשתנה של משמעות לא ידוע (בוס)", "סביר להניח", ו "פתוגניים"90 למרות שסיווג זה חל אך ורק על גנים הקשורים למחלות שנוצרו ואינו מתאים באופן ישיר למשתנים ב "גנים של משמעות בלתי ודאות" (גאס), כל האנשים המעורבים במחקרים המשתנים במשתנים אנושיים מעודדים מאוד ל דבוק להנחיה זו בעת דיווח על פונקציית המשתנה.

חילוץ מידע ביולוגי שימושי כאשר הפנוטיפים MO לא מודל מצב המחלה האנושית
חשוב לזכור כי ביטוי יתר פונקציונלי מבוססי מוגבלת יש מגבלות, במיוחד מאז כמה פנוטיפים להיות הבקיע יכול להיות קצת רלוונטיות למצב המחלה של עניין. באופן דומה, פנוטיפים כי הם העריכו באמצעות ניסויים הצלה לא יכול להיות כל רלוונטיות ישירה מחלת הריבית. מאחר שניסויים אלה מתנהלים מחוץ להקשרים האנדוגניים במערכת חסרי חוליות, הם לא אמורים להיחשב למודלים של מחלות אלא כבדיקת התפקוד הגנטי באמצעות דרוסוהילה כ "מבחנה חיה".

גם אם אורגניזם המודל אינו מחקה מצב של מחלות אנושיות, פנוטיפים מסוג scorable המשמשים בניסויי הצלה יכולים לעתים קרובות לספק תובנות ביולוגיות שימושיות לתנאי המחלה. המושג של "פנוטיפים (לא ברור פנוולוגי הומוולוגיים)"91 יכול לשמש כדי לקבוע עוד הקשר המולקולרי הבסיסי בין דרוזוהילה ופנוטיפים אנושיים. לדוגמה, פנוטיפים מורפולוגיים בכנף הזבוב, בית החזה, הרגליים והעיניים הם מספר פנוטיפים מצוינים לפגמים במסלול האיתות החריץ, מסלול שאינו שימור אבולוציונית המקושר להפרעות מולדות רבות, כולל פגמים קרדיווסתיים בבני אדם62. על ידי הבנת ההיגיון המולקולרי מאחורי פנוטיפים מסוימים בדרוזופילה, ניתן לזהות קישורים ביולוגיים נסתרים בין גנים ופנוטיפים בבני אדם שעדיין לא הבינו.

תקשורת רציפה עם משתפי פעולה קליניים
כאשר עובדים עם רופאים כדי ללמוד את הפונקציה של משתנה נדיר נמצא החולה, חשוב להקים מערכת יחסים חזקה ושיתופית. למרות החוקרים ביו רפואי ובסיסי עשויים לשתף אינטרסים באותו גנים/מסלולים גנטיים, יש תרבות גדולה לשונית (למשל, בז רפואי, מודל אורגניזם ספציפי המינוח) פער בין השדות הקליניים והמדעיים. ניתן לבנות מערכת יחסים חזקה ומבוססת אמון בין שני הצדדים באמצעות תקשורת נרחבת. יתרה מזאת, תקשורת דו-כיוונית היא קריטית לביסוס ולתחזוקה של מערכת יחסים זו. לדוגמה, בשני המקרים המתוארים בסעיף תוצאות הנציג, זיהוי של חולים נוספים עם גנוטיפים דומים ופנוטיפים, כמו גם מחקר פונקציונלי לאחר מכן, היו קריטיים כדי להוכיח פתוגניות של המשתנים של עניין. גם עם נתונים פונקציונליים חזק, חוקרים ומטפלים לעתים קרובות יש קשיים משכנעים גנטיקאים אנושי כי variant מזוהה "n = 1" המקרים הוא הגורם האמיתי של המחלה.

לאחר חוקר המו מזהה כי משתנה של עניין הוא מזיק, זה קריטי כדי לתקשר בחזרה משתפי פעולה קליניים בהקדם האפשרי, כך שהם יכולים באופן פעיל לנסות לזהות מקרים תואמים על ידי רישות עם מטפלים אחרים גנטיקאים אנושי. כלים כגון geno2MP [גנוסוגים לפנוטיפים mendelian: מאגר נתונים מזוהה של 9,650 אנשים שנרשמו במרכז האוניברסיטה של וושינגטון למחקר גנומיקה של mendelian41; כולל חולים ובני משפחה החשודים ב נתקל הפרעות גנטיות] ניתן לחפש כדי להעריך אנשים שעלולים להיות באותה הפרעה. לאחר מכן, ניתן ליצור קשר עם המטפל הראשי באמצעות תכונת העברת הודעות.

לחילופין, GeneMatcher יכול לשמש, אשר הוא אתר השידוכים עבור מטפלים, חוקרים בסיסיים, וחולים אשר חולקים אינטרסים באותו גנים כדי לזהות חולים נוספים הנושאים גרסאות נדירות. מאז GeneMatcher הוא חלק רשת אינטגרטיבית גדולה יותר של אתרי אינטרנט שידוך שנקרא שדכן Exchange42, מסדי נתונים נוספים ברחבי העולם ניתן לחפש, כולל בארכיון הברית של בריאות הגנומיקה האוסטרלי, קופסת גפרורים רחבה , לפענח, MyGene2, ו PhenomeCentral בהגשת גן יחיד GeneMatcher. למרות השתתפות GeneMatcher אפשרי כמו "חוקר", מומלץ כי מדענים בסיסיים לנצל את האתר הזה עם משתפי פעולה קליניים שלהם, מאז תקשורת עם מטפלים אחרים לאחר התאמה דורש רמות מסוימות של רפואי ומחיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים לחוסה סלזאר, ג'וליה וואנג וד ר קרן שולץ על הקריאה הקריטית של כתב היד. אנו מכירים בד. נינג ליו ו-Xi לואו על האפיון התפקודי של משתני TBX2 שנדונו כאן. לא אובחן מחלות רשת מודל אורגניזמים מרכז הקרנה נתמכת באמצעות המכון הלאומי לבריאות (NIH) הקרן המשותפת (U54 NS093793). H. T. C היה נתמך עוד יותר על ידי NIH [CNCDP-K12 ו NINDS (1K12 NS098482)], האקדמיה האמריקנית לנוירולוגיה (מחקר במחקר מדעי המוח), בורוז בראש קרן (פרס קריירה עבור מדענים רפואיים), הילד נוירולוגיה החברה ונוירולוגיה הילד הקרן ( מענק PERF אלטרמן), ופרס העצמאות המוקדמת של מנהל NIH (DP5 OD026426). מסיה פ. ו. נתמך עוד יותר על ידי קרן סימונס (פרס הספרי: 368479). ס. י. הייתה נתמכת עוד יותר על ידי ה-NIH (R01 DC014932), קרן סימונס (פרס הספרי: 368479), אגודת האלצהיימר (מלגת מחקר לחוקרים חדשים: 15-364099), קרן משפחת נאמאן למחקר בסיסי, והקרן קרוליין ווילס למחקר ב . רפואה מולקולרית מיקרוסקופ confocal וקדי ב BCM נתמך בחלקו על ידי NIH גרנט U54HD083092 למרכז המחקר האינטלקטואלי וההתפתחותי לקויות (IDDRC) ליבה נוירוהדמיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l, Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , Forthcoming (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , Forthcoming (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer's Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , Forthcoming (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), Cambridge, England. 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, Clifton, N.J. 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, Clifton, N.J. 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , Forthcoming (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), Cambridge, England. 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE--Collier/Olf1/EBF--transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing and Wiley-Interscience. New York. (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

גנטיקה סוגיה 150 גנטיקה אנושית וגנומיקה מחלות Mendelian מחלות נדירות ולא מאובחנים הרשת מחלות לא אובחן Drosophila ילה מלאנוגסטר וריאציה של משמעות לא ידוע בוס גן של משמעות בלתי ודאות גאס פונקציונלי גנומיקה זבובים טרנסגניים UAS/GAL4 מערכת T2A-GAL4 אלקטורגרמה ERG
במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות <em>Drosophila ילה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao,… More

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H. T., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter