Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

In vivo funksjonell studie av sykdom-Associated sjeldne Human varianter bruke Drosophila

Published: August 20, 2019 doi: 10.3791/59658
Automatic Translation
*1, *2, 1,3,4,5, 1,2,4, 1,2,4,5
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne protokollen er å skissere design og ytelse av in vivo eksperimenter i Drosophila melanogaster å vurdere funksjonelle konsekvenser av sjeldne gen varianter knyttet til menneskelige sykdommer.

Abstract

Fremskritt i sekvensering teknologi har gjort hele-Genova og hel-exome datasett mer tilgjengelig for både klinisk diagnose og banebrytende menneskelig genetikk forskning. Selv om en rekke i silisiummangan algoritmer er utviklet for å forutsi patogenitet av variantene identifisert i disse datasettene, er funksjons studier avgjørende for å avgjøre hvordan spesifikke genomisk varianter påvirker protein funksjonen, spesielt for missense Varianter. I udiagnostisert sykdommer Network (UDN) og andre sjeldne sykdom forskning konsortier, modell organismer (MO) inkludert Drosophila, C. elegans, sebrafisk, og mus er aktivt brukes til å vurdere funksjonen av antatte menneskelig sykdom-forårsaker Varianter. Denne protokollen beskriver en metode for funksjonell vurdering av sjeldne menneskelige varianter som brukes i modellen organismer screening Center Drosophila kjernen i UDN. Arbeidsflyten begynner med å samle menneskelig og MO informasjon fra flere offentlige databaser, ved hjelp av MARRVEL webressurs for å vurdere om varianten er sannsynlig å bidra til pasientens tilstand, samt design effektive eksperimenter basert på tilgjengelige kunnskap og ressurser. Neste, genetiske verktøy (f. eks, T2A-GAL4 og UAS-Human cDNA linjer) er generert for å vurdere funksjonene til varianter av interesse i Drosophila. Ved utvikling av disse reagensene, kan to-kanter funksjonelle analyser basert på redning og overuttrykte eksperimenter utføres for å vurdere variant funksjon. I rednings grenen, den endogene fly gener er "humanisert" ved å erstatte orthologous Drosophila genet med referanse eller variant menneskelig transgenes. I overuttrykte grenen er referanse og variant humane proteiner exogenously drevet i en rekke vev. I begge tilfeller kan enhver scorable fenotype (f. eks, dødelighet, øye morfologi, elektrofysiologi) brukes som en lese-ut, uavhengig av sykdom av interesse. Forskjeller observert mellom referanse og variant alleler foreslå en variant-spesifikk effekt, og dermed sannsynlig patogenitet. Denne protokollen tillater raske, in vivo vurderinger av antatte menneskelige sykdom-forårsaker varianter av gener med kjente og ukjente funksjoner.

Introduction

Pasienter med sjeldne sykdommer ofte gjennomgår en krevende reise referert til som "diagnostiske Odyssey" for å få en nøyaktig diagnose1. De fleste sjeldne sykdommer antas å ha en sterk genetisk opprinnelse, noe som gjør genetisk/genomisk analyser kritiske elementer av klinisk workup. I tillegg til kandidat gen panel sekvensering og kopiere nummer variasjon analyse basert på kromosom Microarrays, hel-exome (WES) og hele-Genova sekvensering (WGS) teknologier har blitt stadig mer verdifulle verktøy i løpet av det siste tiåret2, 3i denne. For tiden er diagnostisk rate for å identifisere en kjent sykdomsfremkallende variant i Wes og WGS er ~ 25% (høyere i pediatric tilfeller)4,5. For de fleste tilfeller som forblir udiagnostisert etter klinisk WES/WGS, er et vanlig problem at det er mange kandidat gener og varianter. Neste generasjons sekvensering identifiserer ofte romanen eller Ultra-sjeldne varianter i mange gener, og tolke om disse variantene bidra til sykdom fenotyper er utfordrende. For eksempel, selv om de fleste tull eller frameshift mutasjoner i gener antas å være tap-of-Function (LOF) alleler på grunn av tull-mediert forfall av kodet transkripsjon, å avkorte mutasjoner funnet i den siste exoner unnslippe denne prosessen og kan fungere som godartet eller gevinst-av-funksjon (GOF) alleler6.

Videre er det å forutsi virkningene av en missense allel en skremmende oppgave, siden det kan resultere i en rekke forskjellige genetiske scenarioer som først beskrevet av Herman Muller på 1930-tallet (dvs. amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph eller isomorph)7 . Tallrike i silisiummangan programmer og metoder er utviklet for å forutsi patogenitet av missense varianter basert på evolusjonære bevaring, type aminosyre endring, posisjon innenfor et funksjonelt domene, allel frekvens i den generelle befolkningen, og andre parametre8. Men disse programmene er ikke en omfattende løsning for å løse det kompliserte problemet med variant tolkning. Interessant, en fersk studie viste at fem bredt brukt variant patogenitet prediksjon algoritmer (Polyphen9, sile10, CADD11, PROVEAN12, mutasjon forsmak) enige om patogenitet ~ 80% av tiden8 . Spesielt, selv når alle algoritmer er enige, returnerer de en feil prediksjon av patogenitet opp til 11% av tiden. Dette ikke bare fører til feil klinisk tolkning, men også kan fraråde forskere fra å følge opp nye varianter av feilaktig liste dem som godartet. En måte å utfylle den nåværende begrensningen av i silisiummangan modellering er å gi eksperimentelle data som demonstrerer effekten av varianten funksjon in vitro, ex vivo (f. eks, kulturperler celler, organoids), eller in vivo.

I vivo funksjonelle studier av sjelden sykdom assosierte varianter i MO har unike styrke13 og har blitt vedtatt av mange sjeldne sykdoms forskning initiativer rundt om i verden, inkludert udiagnostisert sykdommer Network (UDN) i USA og sjeldne Sykdommer modeller & mekanismer (RDMM) nettverk i Canada, Japan, Europa og Australia14. I tillegg til disse koordinerte tiltakene for å integrere MO-forskere i arbeidsflyten av sjeldne sykdoms diagnoser og mekanistisk studier i nasjonal målestokk, har en rekke individuelle samarbeids studier mellom kliniske og MO-forskere ført til oppdagelsen og karakterisering av mange nye menneskelig sykdom-forårsaker gener og varianter82,83,84.

I UDN, en sentralisert modell organismer screening Center (MOSC) mottar innleveringer av kandidat gener og varianter med en beskrivelse av pasientens tilstand og vurderer om varianten er sannsynlig å være patogene ved hjelp av informatikk verktøy og in vivo Eksperimenter. I fase i (2015-2018) av UDN, MOSC består av en Drosophila Core [Baylor College of MEDICINE (bcm)] og sebrafisk Core (University of Oregon) som jobbet sammen for å vurdere tilfeller. Ved hjelp av informatikk analyse og en rekke ulike eksperimentelle strategier i Drosophila og sebrafisk, har MOSC så langt bidratt til diagnostisering av 132 pasienter, identifisering av 31 nye syndromer55, oppdagelsen av flere nye menneskelige sykdoms gener (f. eks EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) og fenotypiske utvidelse av kjent sykdom gener (f.eks. CACNA1A21, ACOX122).

I tillegg til prosjekter innenfor UDN, har MOSC Drosophila kjerne forskere bidratt til nye sykdoms gen funn i samarbeid med Centers for mendelsk Genomics og andre initiativer (f. eks ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) med samme sett av informatikk og genetisk strategier utviklet for UDN. Gitt betydningen av MO studier på sjelden sykdom diagnose, MOSC ble utvidet til å omfatte en C. elegans Core og andre sebrafisk kjerne (begge ved Washington University i St. Louis) for fase II (2018-2022) av UDN.

Dette manuskriptet beskriver en in vivo funksjonell studie protokoll som brukes aktivt i UDN MOSC Drosophila Core for å avgjøre om missense varianter har funksjonelle konsekvenser for protein av interesse ved hjelp av transgene fluer som uttrykker menneskelig Proteiner. Målet med denne protokollen er å hjelpe MO forskere samarbeider med kliniske forskningsgrupper for å gi eksperimentelle bevis på at en kandidat variant i et gen av interesse har funksjonelle konsekvenser, og dermed tilrettelegge klinisk diagnose. Denne protokollen er mest nyttig i et scenario der en Drosophila forsker er nærmet av en klinisk etterforsker som har en sjelden sykdom pasient med en bestemt kandidat variant i et gen av interesse.

Denne protokollen kan brytes ned i tre elementer: (1) samle informasjon for å vurdere sannsynligheten for den varianten av interesse å være ansvarlig for pasienten fenotype og muligheten for en funksjonell studie i Drosophila, (2) samle eksisterende genetiske verktøy og etablere nye, og (3) utfører funksjonelle studier in vivo. Det tredje elementet kan videre deles inn i to underelementer basert på hvordan funksjonen til en variant av interesse kan vurderes (redning eksperiment eller overuttrykte strategier). Det er viktig å merke seg at denne protokollen kan tilpasses og optimaliseres til mange scenarier utenfor sjeldne monogenic sykdom forskning (for eksempel vanlige sykdommer, gen-miljø interaksjoner, og farmakologiske/genetiske skjermer for å identifisere terapeutiske mål). Evnen til å bestemme funksjonaliteten og patogenitet av variantene vil ikke bare gagne pasienten av interesse ved å gi nøyaktig molekylær diagnose, men vil også ha bredere virkninger på både translational og grunnleggende vitenskapelig forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Gathering Human og MO informasjon å vurdere: sannsynligheten for en variant av interesse å være ansvarlig for sykdom fenotyper og gjennomførbarhet av funksjonelle studier i Drosophila

  1. Utføre omfattende database og litteratursøk for å finne ut om de spesifikke gener og varianter av interesse er gode kandidater til å forklare fenotype av pasienten av interesse. Nærmere bestemt, samle følgende informasjon.
    1. Vurdere om genet av interesse har vært tidligere innblandet i andre genetiske lidelser (fenotypiske utvidelse av kjent sykdom genet) eller dette er en helt ny sykdom kandidat gen [Gen variant av usikker betydning (GVUS)].
    2. Vurdere allel frekvensen av varianten av interesse for sykdom eller kontroll befolknings databaser.
    3. Vurdere om det er kopier nummer variasjoner (CNVs) som inkluderer dette genet i sykdom eller kontroll befolkningen databaser.
    4. Vurdere hva orthologous gener er i forskjellige MO arter inkludert mus, sebrafisk, Drosophila, C. elegans, og gjær, deretter videre undersøke kjente funksjoner og uttrykk mønstre av disse orthologous gener.
    5. Vurdere om varianten av interesse er til stede i et funksjonelt domene av proteinet og hvis aminosyren av interesse er evolutionarily bevart.
      Merk: svar på disse fem spørsmålene (trinn 1.1.1-1.1.5) kan fås ved å få tilgang til en rekke menneskelige og Mo databaser individuelt eller ved hjelp av MARRVEL (modell organisme aggregert Resources for sjelden variant Exploration) webressurs (se tabell 1 for online ressurser)30, som er beskrevet i dybden i en med følgende artikkel31. Se delen for representative resultater for spesifikke eksempler. The Monarch Initiative nettsted32 og Gene2Function33 også gi nyttig informasjon.
  2. Samle ytterligere informasjon for å vurdere om varianten er en god sykdoms kandidat fra en protein funksjon og struktur punkt-of-View.
    1. Vurdere om varianten av interesse er spådd å være skadelig basert på i silisiummangan prediksjon algoritmer.
      Merk: variant patogenitet algoritmer har blitt utviklet av mange forskningsgrupper i løpet av de siste ~ 15 år, og noen er også vist i MARRVEL søkeresultater. Nyere programmer, inkludert de to som er oppført nedenfor, kombinerer flere variant patogenitet rediction algoritmer og maskinlæring tilnærminger til å generere en patogenitet score. Hvis du vil ha mer informasjon om algoritmer for variant forutsigelse og resultatene deres, kan du se Ghosh, et al.8. (i) CADD (kombinert merknad-avhengig tømming): integrerende merknadsverktøy bygget fra mer enn 60 genomisk funksjoner, som gir resultater for menneskelig SNVs samt korte innsettinger og slettinger11. (II) REVEL (sjelden exome variant ensemble eleven): kombinerer flere variant patogenitet algoritmer (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, sile, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP, og phastCons) for å gi en integrert poengsum for alle mulige menneskelige missense varianter34.
    2. Bestem om det menneskelige genet/protein av interesse eller dens MO orthologs har vist seg å genetisk eller fysisk samhandle med gener/proteiner tidligere knyttet til genetiske sykdommer. Hvis ja, vurdere om pasienten av interesse utstillinger overlappende fenotyper med disse lidelsene.
      Merk: flere verktøy har blitt utviklet for å analysere genetiske og protein-protein interaksjoner basert på Mo publikasjoner samt stor skala Proteomikk fra flere arter skjermer. STRING (søkeverktøy for regelmessige forekomster av nærliggende gener)35: en database for kjente og spådde protein-protein interaksjoner. Den integrerer genetisk samspill og co-Expression datasett samt tekst-Mining verktøy for å identifisere gener og proteiner som kan fungere sammen i en rekke organismer. MIST (molekylær interaksjon søkeverktøy)36: en database som integrerer genetisk og protein-protein interaksjon data fra kjernen genetiske MOs (gjær, C. elegans, Drosophila, sebrafisk, frosk, rotte, mus) og mennesker. Prediksjon av interaksjoner avledet fra orthologous gener/proteiner (interlogs) vises også.
    3. Bestem om 3-D strukturen av protein av interesse har blitt løst eller modellert. I så fall må du finne ut hvor varianten av interesse tilordningen er i forhold til viktige funksjons domener.
      Merk: protein strukturer løst av røntgen crystallography, kjernefysisk magnetisk RESONANS (NMR), og mikroskopi for fryse-elektron kan bli funnet i offentlige databaser, inkludert pdb (protein data bank) og EMDatabank37. Selv om det ikke finnes noen enkelt database for spådd/modellerte proteinstrukturer, en rekke algoritmer (dvs. SWISS-modell38, modeller39, og Phyre240) er tilgjengelig for brukere å utføre protein modellering.
  3. Kommuniser med kliniske samarbeidspartnere for å diskutere informasjon innhentet fra informatikk analysene i seksjoner 1.1-1.2. Hvis de kliniske samarbeidspartnerne også føler at varianten og genet av interesse er gode kandidater til å forklare fenotyper som er sett hos pasienten, går du videre til del 2. Hvis det er konkrete spørsmål om pasientens genotype og fenotype, kan du diskutere dem med de kliniske samarbeidspartnerne før du går videre.
    Merk: Hvis det er følt at den varianten av interesse er usannsynlig å forklare fenotype av interesse (f. eks, identisk variant som finnes i høy frekvens i kontroll befolkningen), diskutere dette med kliniske samarbeidspartnere for å avgjøre om varianten er en god kandidat, da det ikke kan være hensiktsmessig ekspertise for å tolke klinisk fenotyper.

2. samle eksisterende genetiske verktøy og etablere nye reagenser for å studere en bestemt variant av interesse

Merk: når den varianten av interesse har blitt bestemt en god kandidat til å forfølge eksperimentelt, samle eller generere reagenser for å utføre in vivo funksjonelle studier. For funksjonelle studier beskrevet i denne protokollen, noen viktige Drosophila melanogaster reagenser er nødvendig: 1) oppstrøms aktivisering sekvens-regulert menneskelige cDNA transgene stammer som bærer referanse eller variant sekvens, 2) en tap-av-funksjon allel av et fly gen av interesse, og 3) en GAL4 linje som kan brukes til rednings eksperimenter.

  1. Generering av UAS-Human cDNA konstruerer og transgene fluer
    1. Identifisere og skaffe de riktige menneskelige cDNA konstruksjoner. Mange kloner er tilgjengelige fra MGC (pattedyr gen samling)43 og kan kjøpes fra utvalgte Venders. For gener som er alternativt skjøtes, sjekk hvilke isoformen cDNA svarer til ved hjelp av Ensembl eller RefSeq.
      Merk: mange cDNAs er tilgjengelige i recombinase-mediert kloning System kompatible reagenser44, noe som forenkler det subcloning trinnet. cDNAs kan komme i en "åpen (ingen stopp Codon)" eller "lukket (med endogene eller kunstige stopp Codon)" format. Mens åpne kloner tillate C'-merking av proteiner som er nyttige for biokjemiske (f. eks Western Blot) og celle biologiske (f. eks immunostaining) analyser for å overvåke uttrykk for protein av interesse, kan det forstyrre protein funksjon i noen tilfeller.
    2. Sub-klone referanse og variant cDNA i Drosophila transgene vektor. Bruk φC31-mediert transgenesis system, siden dette gjør at referanse og variant cDNAs å bli integrert i samme sted i Genova45. For dette prosjektet bruker MOSC Drosophila -kjernen rutinemessig PGW-ha. attB-vektoren46.
      Merk: Hvis den menneskelige cDNA er i recombinase-mediert kloning System kompatible vektorer (f. eks PDONR221, pENTR221), hopp til § 2.1.4, som forklarer LR reaksjoner å subclone CDNAs i PGW-ha. attB.
      1. Hvis det Human cDNA er ikke inne en recombinase-mediert Klon system forenlig plasmider, subclone mennesket cDNAs i en portrom komme inn vektor benytter målestokk molekylær Biological teknikker (en eksempel av slik protokollen er dokumentert neden).
        1. Utfør en overheng PCR for å innføre attB1 og attB2 armer. Den fremre primer bør ha attB1 sekvensen 5 '-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACC-3 ' etterfulgt av de første 22 nukleotider av målet cDNA. Omvendt primer bør ha attB2 sekvens 5 '-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3 ' etterfulgt av omvendt komplement av de siste 25 nukleotider av cDNA av interesse. Ekskluder stopp Codon av cDNA, legg deretter til en C ' tag hvis det er ønskelig å "åpne" en klone, eller legge til en stopp Codon å "lukke" en klone.
        2. Forbered en 100 μL med høykvalitets PCR-blanding bestående av 50 μL med høykvalitets PCR-Master mix, 36 μL av destillert vann, 5 μL av hver forover og omvendt grunning listet i trinn 2.1.2.1.1 fortynnet til 10 μM, og 4 μL av mål cDNA (150 ng/μL).
        3. Utfør PCR ved hjelp av standard mutagenese protokoll for å legge til attB1 og AttB2 armer på cDNA av interesse. Forholdene vil variere avhengig av konstruksjon og varianter av interesse.
        4. Isoler målet cDNA med ekstra homologi armer via gel-elektroforese og gel-ekstraksjon. Lag 1% agarose gel og utføre elektroforese ved hjelp av standard metoder. Avgiftsdirektoratet bandet som tilsvarer størrelsen på cDNA pluss den ekstra lengden på homologi armer. Ekstrakt DNA fra gelen gjennom standard metoder95. Kommersielle gel utvinning kits er tilgjengelig fra flere selskaper.
        5. Utfør en in vitro recombinase reaksjon basert på recombinase-mediert kloning protokollen i henhold til systemet som brukes.
        6. Forvandle BP reaksjonen bland i kjemisk kompetent E. coli celler. Kompetente celler kan gjøres internt eller kjøpt fra kommersielle leverandører. Kultur de forvandlet cellene over natten på en LB plate som inneholder passende antibiotika for kolonien valg. Neste dag, velger flere kolonier og dyrke dem i uavhengige flytende kulturer over natten.
        7. Isoler DNA fra over natten kulturer gjennom miniprep. Sanger sekvensen de positive kloner for å sikre at cDNA har riktig rekkefølge96. Oppretthold celler fra kulturer som er positive for den ønskede sekvensen i 25% glyserol lagret ved-80 ° c.
    3. Utfør site-regissert mutagenese å innføre den varianten av interesse i gateway plasmider med referanse menneskelige cDNA97. En detaljert protokoll for denne metoden finner du på leverandørens webområde48,49. Valider tilstedeværelsen av varianten i mutert plasmider via sanger sekvensering av hele åpne lese RAM men (ORF) for å sikre at det ikke er flere varianter innført gjennom dette mutagenese trinnet.
    4. Subclone referanse og variant humant cDNAs i giver plasmider (gateway plasmider med attL1 og attL2 sider) inn i transgene plasmider (f. eks, PGW-ha. AttB med attR1 og attR2 sites) via en LR clonase reaksjon.
      Merk: det er UAS φC31 vektorer designet for konvensjonell begrensning enzym-basert subcloning (f. eks, PUAST. attB50) hvis det er foretrukket å subclone menneskelig cDNAs via restriksjon enzym metoder.
    5. Velg φC31 docking områder der å integrere UAS-menneskelige cDNA transgenes. En rekke docking nettsteder har blitt generert av flere laboratorier og er offentlig tilgjengelig fra lager sentre50,52,53.
      Merk: siden det er praktisk å ha den menneskelige transgene på et kromosom som ikke inneholder fly ortholog av genet av interesse, er det anbefalt å bruke en andre kromosom docking nettsted [VK37 (BDSC lager #24872] når fly ortholog er på X , tredje eller fjerde kromosomer, og bruke et tredje kromosom docking site [VK33 (BDSC lager #24871] når fly ortholog er på det andre kromosom.
    6. Injiser UAS-Human cDNA konstruerer i fluer uttrykker φC31 integrase i deres germline (f. eks, vas-φC31, NOS-φC31).
      Merk: Microinjection kan utføres internt eller sendes til kjerne anlegg eller kommersielle enheter for transgenesis. Detaljert protokoll for generering av transgene fluer finnes i den siterte boken kapittel51.
    7. Etablere stabile transgene stammer fra injisert embryo. Injiser ~ 100-200 embryo per konstruere94. En representativ kryssing ordning for en transgene innsetting i et andre kromosom docking nettsted (VK37) er avbildet i figur 1a. Se de siterte bøkene54,55 for grunnleggende Drosophila genetikk informasjon.
  2. Skaffe eller generere en T2A-GAL4-linje som forenkler rednings BAS ert funksjonell analyser (se figur 2 og avsnitt 3,1).
    Merk: denne linjen vil tjene to formål. Først de fleste T2A-GAL4 linjer testet oppføre seg som sterk LOF alleler ved å fungere som et gen felle allel. Sekund, T2A-GAL4 linjer fungere som en GAL4 driver som tillater uttrykk for UAS konstruksjoner (f. eks UAS-GFP, UAS-menneskelig cDNAs) under endogene regulering elementer av genet av interesse56,57 (figur 2a-C).
    1. Søk offentlige lager samlinger for tilgjengelige T2A-GAL4 linjer inkludert Drosophila Gene avbrudd Project (bnp)58 der ~ 1 000 T2A-GAL4 linjer har blitt generert59. Disse stammer er for tiden tilgjengelig fra Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) og er søkbare gjennom både BNP og BDSC nettsteder.
    2. Hvis en T2A-GAL4 linje for fly genet av interesse ikke er tilgjengelig, sjekk om en passende koding intronic etterligne (Minos-mediert integrering kassett) linje er tilgjengelig for konvertering til en T2A-GAL4 linje ved hjelp av recombinase-mediert kassett UTVEKSLING (RMCE )60 (figur 2A).
      Merk: RMCE lar intronic etterligne elementer som er i mellom to koding exoner som skal konverteres til en T2A-GAL4 linje gjennom microinjection av en donor konstruere (et eksempel på en kryssing ordningen er vist i figur 1B) eller serie av krysser, som beskrevet i detalj57,59.
    3. Hvis en T2A-GAL4 linje ikke er tilgjengelig og en hensiktsmessig koding intronic etterligne ikke eksisterer, utforske muligheten for å generere en T2A-GAL4 linje via CRIMIC (CRISPR-mediert integrasjon kassett) system59.
      Merk: denne metodikken bruker CRISPR-mediert DNA-kløft og homologi reparasjon (HDR) for å integrere en etterligne-lignende kassett i en kodings Intronets opprinnelse i et gen av interesse.
    4. Dersom genet av interesse mangler en stor Intronets opprinnelse (> 150 BP) eller har ingen introns, forsøk på å banke-i en GAL4 transgene inn i fly genet med CRISPR/Cas9 system ved hjelp av HDR som beskrevet20,61,62.
      Merk: Hvis generering av en T2A-GAL4 eller GAL4 knock-in allel er vanskelig, forsøk på å utføre rednings eksperimenter ved hjelp av disse eksisterende alleler eller RNAi linjer og allestedsnærværende eller vev-spesifikke GAL4 drivere som beskrevet92 (Ref).

3. utføre funksjonell analyse av menneskelig variant av interesse i vivo i Drosophila

Merk: Utfør en rednings BAS ert analyse (avsnitt 3,1) i tillegg til overuttrykte studier (avsnitt 3,2) ved hjelp av verktøyene som er samlet inn eller generert i del 2 for å vurdere konsekvensene av den varianten av interesse in vivo i Drosophila. Vurder å benytte begge tilnærminger, siden de to er komplementære.

  1. Utføre funksjonell analyse gjennom rednings eksperimenter
    Merk: Heterologous redning-baserte eksperimenter iDrosophilabruke menneskelige proteiner avgjøre om molekyl funksjon av de to orthologous gener har blitt bevart over ~ 500 000 000 år av evolusjon. De vurderer også funksjonen av varianten i sammenheng med den menneskelige protein63. Selv om en systematisk analyse med å studere hundrevis av gen par ikke har blitt rapportert, er flere dusin mennesker og pattedyr (f.eks. mus) gener i stand til å erstatte funksjonen tilDrosophilaGener13.
    1. I rednings BAS ert tilnærming, først avgjøre om det er åpenbare, scorable, og reproduserbar fenotyper i LOF mutanter i fly ortholog før vurdere funksjoner av variantene.
      Merk: tidligere litteratur på fly genet er et godt sted å data mine først, og det kan bli funnet ved hjelp av databaser, inkludert FlyBase og PubMed. Flere databaser som MARRVEL, Monarch Initiative og Gene2Funcion er også nyttige når du skal samle inn denne informasjonen.
    2. Utføre en global undersøkelse av scorable fenotyper i homozygote og hemizygous (T2A-GAL4 allel over en Molecularly definert kromosom mangel dyr, spesielt hvis T2A-GAL4 allel er den første mutasjonen å bli karakterisert for et bestemt gen. Vurdere fenotyper som dødelighet, sterilitet, lang levetid, morfologiske (f. eks størrelse og morfologi av øyet) og atferd (f. eks frieri, fly, klatring, og bang følsomhet defekter).
      Merk: Hvis det ikke er noen store fenotyper identifisert fra denne hovedskjermen, kan mer subtile fenotyper, for eksempel nevrologiske defekter målt ved elektrofysiologisk innspillinger, brukes hvis de er svært reproduserbar og spesifikk. Som et eksempel er funksjonelle studier som bruker elektroretinogrammet (ERG) beskrevet i trinn 3.2.3. Hvis det ikke oppdages noen scorable fenotype, går du til seksjon 3,2 og utfører den overuttrykte funksjons studien.
    3. Når en scorable fenotype er identifisert i fly LOF mutant, test om referansen menneskelige cDNA kan erstatte funksjonen til fly ortholog ved å forsøke å bruke menneskelig cDNA å redde mutant fly linje. Den fenotypiske analysen skal utføres her avhenger av resultatene fra trinn 3.1.2 og vil være spesifikke for genet blir studert.
      Merk: Hvis "menneskeliggjøring" av flue genet er vellykket, er det nå en plattform for å sammenligne effektiviteten av redning for varianten av interesse i forhold til referanse motpart. Redningen sett med referanse menneskelige cDNA trenger ikke å være perfekt. Delvis redning av fly mutant fenotype bruker en menneskelig cDNA fortsatt gir et referansepunkt for å utføre komparative studier ved hjelp av varianten menneskelige cDNA belastning.
    4. Bruke analysen systemet valgt i trinn 3.1.2, sammenligne redning observert med referanse menneskelige cDNA til unnsetning observert med varianten menneskelige cDNA å avgjøre om varianten av interesse har konsekvenser på genet av interesse.
      Merk: Hvis varianten menneskelige cDNA utfører verre enn referansen allel, tyder dette på at varianten av interesse er skadelige til protein funksjonen. Hvis varianten og referansen ikke kan kjennetegnes funksjonelt, deretter 1) kan allel være en isomorph (en variant som ikke påvirker protein funksjonen) eller 2) analysen ikke er følsom nok til å oppdage subtile forskjeller.
    5. Hvis varianten er funnet å være en skadelige allel, deretter videre vurdere uttrykket og intracellulære lokalisering av referanse og variant proteiner av interesse i vivo via Western Blot, immunofluorescence farging, eller andre metoder93.
      Merk: Hvis UAS-Human cDNA er generert fra en åpen klone i en PGW-ha. attB vektor, bruke en anti-ha antistoff å utføre disse biokjemiske og cellulære analyser. Hvis den opprinnelige klone er en lukket klone, teste om kommersielle antistoffer mot humane proteiner kan brukes til disse analysene. En forskjell i uttrykks nivåer og intracellulære lokalisering kan avdekke hvordan varianten av interesse påvirker protein funksjon.
  2. Utføre funksjonell analyse gjennom overuttrykte studier
    Merk: allestedsnærværende eller vev-spesifikke overuttrykte av menneskelig cDNAs i ellers vill-type fluer kan gi informasjon som er komplementære til redning-baserte eksperimenter diskutert i § 3,1. Selv om rednings BAS ert analyser primært er utformet for å oppdage LOF-variantene (amorphic, hypomophic), kan overuttrykte analyser også avdekke varianter av gevinst-av-funksjon (GOF) som er vanskeligere å vurdere (hypermorphic, antimorphic, neomorphic).
    1. Velg et sett med GAL4-drivere for å overekspresjon den menneskelige cDNAs av interesse. En rekke allestedsnærværende og vev-/Stage-Specific GAL4 drivere er tilgjengelig fra offentlige lager sentre (f. eks, BDSC), hvorav noen er mer hyppig brukt enn andre. Første fokus på allestedsnærværende drivere og lett scorable fenotyper (dødelighet, sterilitet, morfologiske fenotyper), og deretter gå videre til vev-spesifikke drivere og mer spesifikke fenotyper.
      Merk: Valider uttrykket for GAL4-drivere med en reporter-linje (for eksempel UAS-GFP) for å bekrefte uttrykks mønstre før bruk i eksperimentene.
    2. Uttrykke referanse og variant menneskelige cDNAs bruker samme driver under samme tilstand (f. eks temperatur) ved å krysse 3-5 jomfru kvinner fra GAL4 linje (f. eks ey-GAL4 for øye imaginal plate uttrykk) med 3-5 mannlige FLUER fra UAS linjer [f. eks UAS-TBX2 (+) eller UAS-TBX2 (p. R305H) for eksempelet vist i avsnitt 4,2] i et enkelt hetteglass.
      1. Overfør krysser hver 2-3 dager å ha mange dyr eclosing fra et enkelt kors.
    3. Undersøk avkom og oppdage eventuelle forskjeller mellom referanse og variant stammer (f. eks, øye morfologi) under et disseksjon mikroskop. Bilde av fluene ved hjelp av et kamera festet til et disseksjon mikroskop for å dokumentere fenotype.
      Merk: Hvis en fenotype bare ses i referansen, men ikke i variant linjen, kan varianten være en amorphic eller en sterk hypomorphic allel. Hvis fenotype ses i begge genotyper men referansen forårsaker en sterkere defekt, kan varianten være en mild til svak hypomorphic allel. Hvis referansen ikke viser en fenotype eller bare viser en svak fenotype, men varianten indikerer en sterk defekt, kan varianten være en GOF-allel.
    4. Hvis en fenotype ikke er sett i standard kultur forhold (RT eller ved 25 ° c, og deretter sette krysser ved forskjellige temperaturer varierer 18-29 ° c, siden UAS/GAL4 systemet er kjent for å være temperaturfølsomme64,65). Vanligvis er uttrykket av UAS transgenes høyere ved høyere temperaturer.
  3. Utføre flere funksjonelle studier knyttet til gener og protein av interesse.
    Merk: I tillegg til å undersøke generelle defekter, kan et analysesystem velges for å granske molekylære funksjoner av genet og varianten. I ett eksempel diskutert i representative resultater (TBX2tilfelle), ble ERG-innspillinger brukt til å bestemme effekten av varianten på Foto reseptoren funksjon, siden fly genet av interesse (bifid) hadde blitt studert omfattende i forbindelse med visuell systemutvikling. Detaljerte protokoller for ERG iDrosophilakan bli funnet som tidligere publisert66,67,68.
    1. Generer fluer å teste for funksjonelle defekter i det visuelle systemet. Cross jomfru kvinner fra rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 linje til menn med referanse eller variant UAS-Human cDNA transgenes å uttrykke den menneskelige proteiner av interesse i R1-R6 fotoreseptorene.
      Merk: Cross 3-5 Virgin kvinner til 3-5 mannlige fluer i en enkelt hetteglass og overføre krysser hver 2-3 dager å ha mange dyr eclosing fra et enkelt kors. Alle kors må oppbevares i en inkubator satt på eksperimentell temperatur for å oppnå konsistente resultater.
    2. Når fluene begynner å Eclose (ved 25 ° c, ~ 10 dager etter innstilling av første kryss), samle avkom (Rh1-GAL4/+; UAS-Human cDNA/+) i frisk hetteglass og plassere dem tilbake i inkubator satt ved eksperimentell temperatur for ytterligere 3 dager for det visuelle systemet til å modnes.
      Merk: selv om ERG kan utføres på 1-2 dager gamle fluer, kan nylig eclosed fluer ha store svingninger i sitt ERG-signal. Hvis det er ønskelig å undersøke en alders avhengig fenotype, kan disse fluene være alderen i flere uker så lenge de er regelmessig (for eksempel hver ~ 5 dager) overført til et nytt hetteglass for å unngå drukning i våt mat.
    3. Klargjør fluene for ERG-opptak ved først å anesthetizing fluene med CO2 eller plassere dem i et hetteglass på isen. Lim forsiktig den ene siden av fly på et glass mikroskop lysbilde for å nakkens dem.
      Merk: flere referanse og variant fluer kan limes på et enkelt lysbilde. Plasser alle fluer i omtrent samme retning med ett øye er tilgjengelig for innspillingen elektroden. Vær forsiktig så du ikke får lim på øyet og å forlate snabel gratis.
    4. Klargjør opptaks-og referanse elektrodene. Plasser en 1,2 mm glass kapillær i en nål avtrekker og aktivere. Bryt kapillærrøret for å oppnå to skarpe koniske elektroder. De resulterende elektrodene skal være hul og har endelig diameter på < 0,5 mm.
    5. Fyll blodkar med saltoppløsning (100 mM NaCl), noe som gjør at det ikke er noen luftbobler. Skyv glass blodkar over sølvtråd elektrodene (både opptaks elektroden og referanse elektroden, se Figur 4) og fest blodkar på plass.
    6. Konfigurer stimulator og forsterkeren. Et detaljert oppsett finner du i Lauwers, et al.67. UDN Drosophila MOSC-oppsett består av utstyr som er oppført i material delen.
      1. Sett forsterkeren til 0,1 Hz High-pass filter, 300 Hz low-pass filter, og 100 gevinst.
      2. Angi stimulator til 1 s periode, 500 MS pulsbredde, 500 MS puls forsinkelse, kjøremodus og 7 amp.
      3. Klargjør lyskilden for photostimulation. Bruk en Halogen lyskilde for å aktivere flue fotoreseptorene.
      4. Klargjør opptaksprogramvaren på en datamaskin som er koblet til ERG-oppsettet. Opprett en stimulering protokoll med oppkjøpet modell "fast lengde Events" og 20 s varighet.
    7. Acclimate fluene for å fullføre mørket før du starter ERG-innspillinger. Plasser fluene i fullstendig mørke i minst 10 min før eksperimentet begynner.
      Merk: siden fluer ikke kan oppdage rødt lys, bruk en rød lyskilde i løpet av mørke tilvenning.
    8. Plasser lysbildet som inneholder fluene på opptaks apparatet, og Flytt micromanipulators som bærer referanse-og opptaks elektrodene, til et punkt i nærheten av interessen på lysbildet. Pass på tuppen av elektroden og sett referanse elektroden forsiktig inn i thorax (trenger inn i cuticle). Når referanse elektroden er stabilt satt inn, plasserer du opptaks elektroden på øyets overflate.
      Merk: den nøyaktige posisjonen til denne referanse elektroden har ikke en stor innvirkning på ERG-signalet. Innspillings elektroden bør plasseres på øyets overflate siden ERG er et felt potensial innspilling i stedet for en intracellulære innspilling. Riktig mengde trykk påført opptaks elektroden forårsaker en liten Dimple uten å trenge inn i øyet.
    9. Slå av alle lysene for en annen 3 min å acclimate fluene til det mørke miljøet.
    10. Sett opp innspillingen programvare og starte innspillingen signalet. Hvis du bruker en Halogen lyskilde med manuell utløser, slår du på lyskilden med lukkeren lukket. Start innspillingen av signalet.
    11. Utsett fly øynene for lys ved å åpne og lukke lukkeren hver 1 s for 20 s varigheten av en enkelt løpe.
      Merk: på/av av halogen lyskilden kan styres manuelt eller programmeres til å bli automatisert ved hjelp av en hvit LED-lyskilde. Mer robust og pålitelig ERG kan fås ved å bruke en Halogen lyskilde sammenlignet med en hvit LED-lampe, sannsynligvis på grunn av det bredere lysspekteret som slippes ut fra halogen lyskilden.
    12. Record Erg fra alle fluer som er montert på glasset lysbildet. Utfør Erg fra 15 fluer per genotype per tilstand.
      Merk: noen parametre som kan endres for å finne en tilstand som viser robuste forskjeller mellom referanse og variant cDNAs kan omfatte temperatur, alder eller miljømessige forhold (f. eks, oppdratt i lys-mørk syklus eller konstant lys/mørke).
    13. Utfør dataanalyse: Sammenlign Erg fra referansen, varianten og kontrollene for å finne ut om det er forskjeller. Vurder ERG-dataene for endringer i on-transienter, depolorization, off-transienter og repolarisasjon69 (Figur 4B).
      Merk: Depolarization og repolarisasjon reflekterer aktiveringen og deaktivering av phototransduction Cascade innen fotoreseptorene, mens på-og off-transienter er tiltak av aktivitetene til post-Synaptic celler som mottar signaler fra fotoreseptorene. Redusert amplitude og endrede Kinetics av repolarisasjon er ofte forbundet med defekter med foto reseptoren funksjon og helse, mens defekter i on-og off-transienter finnes i mutanter med defekt synapse utvikling, funksjon eller vedlikehold i 70.
    14. Ved identifisering av forskjeller i ERG-fenotyper med overuttrykte av referanse kontravariant humant cDNAs, fastslår du om denne elektrofysiologisk fenotype er forbundet med strukturelle og ultrastructural defekter i fotoreseptorene og deres synapser ved å utføre histologiske analyse og overføring elektron mikroskopi.
      Merk: videre diskusjon om TOLKNING av ERG-defekter og strukturelle/ultrastructural analyser har tidligere blitt beskrevet69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Funksjonell studie av de Novo missense variant i EBF3 knyttet til neurodevelopmental fenotyper
I en 7 år gammel mann med neurodevelopmental fenotyper inkludert hypotoni, ataksi, global utviklingsmessige forsinkelse, og uttrykksfulle tale uorden, leger og menneskelig Genetikere ved National Institutes of Health udiagnostisert sykdommer Project (UDP) identifiserte en de Novo missense variant (p. R163Q) i EBF3 (tidlig b-Cell faktor 3)15, et gen som koder en Coe (Collier/olfactory-1/Early B-celle Factor) familie transkripsjon faktor. Denne saken ble sendt til UDN MOSC i mars 2016 for funksjonell studier. For å vurdere om dette genet var en god kandidat for denne saken, MOSC samlet menneskelig genetisk og genomisk informasjon fra OMIM, ClinVar, ExAC (nå utvidet til gnomAD), Geno2MP, DGV, og dechiffrere. I tillegg ble orthologous gener i viktige MO-arter identifisert ved hjelp av DIOPT-verktøyet. Genuttrykk og fenotypiske informasjon fra individuelle MO databaser (f. eks, Wormbase, FlyBase, ZFIN, MGI) ble deretter innhentet. Informatikk-analysene som ble utført for EBF3 og andre banebrytende studier i UDN MOSC, dannet grunnlaget for senere utvikling av MARRVEL-ressursen30.

Informasjonen som samles inn ved hjelp av denne metodikken indikerte EBF3 var ikke forbundet med noen kjente menneskelige genetiske lidelser på tidspunktet for analysen, og det ble konkludert med at p. R163Q varianten var en god kandidat basert på følgende informasjon. (1) denne varianten hadde ikke vært tidligere rapportert i kontroll befolkningen databaser (ExAC) og sykdom befolkningen database (Geno2MP), som indikerer at dette er en svært sjelden variant. (2) basert på ExAC, den pLI (sannsynligheten for LOF intoleranse) score på dette genet er 1,00 (pLI score varierer fra 0.00-1.00). Dette indikerer at det er selektiv press mot LOF-variantene i dette genet i befolkningen generelt, og antyder at haploinsufficiency av dette genet kan forårsake sykdom. For mer informasjon om pLI score og dets tolkning, en med følgende MARRVEL tutorial artikkel i JoVE31 og relaterte papirer gir detaljer30,71.

Den p. R163Q varianten ble også betraktet som en god kandidat fordi (3) det ligger i evolutionarily bevart DNA bindende domene av dette proteinet, noe som tyder på at det kan påvirke DNA bindende eller andre protein funksjoner. (4) p. R163 rester er evolutionarily bevart fra C. elegans og Drosophila til mennesker, noe som tyder på at det kan være avgjørende for protein funksjonell på tvers av arter. (5) EBF3 orthologs har vært innblandet i neuronal utvikling i flere Mo72 inkludert C. elegans73, Drosophila74, Xenopus75og mus76. (6) under hjernens utvikling hos mus, har Ebf3 vist å fungere nedstrøms for Arx (Aristaless-relaterte Homebox)77, et gen assosiert med flere epilepsi og intellektuell uførhet syndromer hos mennesker78. Derfor, disse dataene sammen tyder på at EBF3 er svært sannsynlig å være avgjørende for menneskelig neurodevelopment og at p. R163Q varianten kan ha funksjonelle konsekvenser.

For å vurdere om p. R163Q påvirker EBF3 funksjon, en T2A-GAL4 linje for knute (KN; fly ortholog av menneskelig EBF379) ble generert via RMCE av en koding intronic etterligne innsetting15. Den KNT2A-GAL4 linjen er resessivt dødelig og klarte ikke å utfylle dødeligheten av en klassisk KN allel (KNCol-1) samt Molecularly definert mangel som dekker KN [DF (2R) BSC429]80 . Uttrykks mønstrene til GAL4 reflekterte også tidligere rapporterte mønstre av KN -uttrykk i hjernen så vel som i vinge imaginal platen15. UAS transgene fluer ble deretter generert for å tillate uttrykk for referanse og variant menneskelige EBF3 cDNA samt vill-type fly KN cDNA. Alle tre proteiner ble merket med en C-terminal 3xHA-kode. Viktigst, UAS vill-type fly KN (KN+) eller referanse Human EBF3 (EBF3+) transgenes reddet dødeligheten av KNT2A-GAL4/DF (2R) BSC429 til en tilsvarende grad ( Bilde 3C, venstre panel)81.

I kontrast, UAS-Human EBF3 transgene med p. R163Q variant (EBF3p. R163Q) var ikke i stand til å redde denne mutant, noe som tyder på at p. R163Q varianten påvirker EBF3 funksjon in vivo15. Interessant, når vurdert ved hjelp av en anti-HA antistoff, den EBF3p. R163Q protein ble vellykket uttrykt i fly vev, og dens nivåer og subcellulære lokalisering (hovedsakelig kjernefysiske) var skille fra de av EBF3+ og KN+. Dette tyder på at varianten ikke forårsaker en LOF fenotype grunn av protein ustabilitet eller mis-lokalisering. For ytterligere å vurdere om p. R163Q variant påvirket transcriptional aktivering funksjon av EBF3, en luciferase-basert reporter analysen ble utført i HEK293 celler15. Dette eksperimentet i kulturperler menneskelige celler avslørte at EBF3p. R163Q variant ikke klarte å aktivere transkripsjon av reporteren konstruksjoner, støtter LoF modellen innhentet fra Drosophila eksperimenter.

Parallelt med den eksperimentelle studier, samarbeid med leger, menneskelige Genetikere, og genetiske rådgivere i BCM førte til identifisering av to ekstra personer med lignende symptomer. En pasient bar identiske p. R163Q variant, og en annen gjennomført en missense variant som påvirket samme rester (p. R163L). P. R163L varianten også klarte ikke å redde fly KN mutant93 antyder at dette allel også påvirket EBF3 funksjon. Interessant, ble dette arbeidet publisert back-to-back med to uavhengige menneskelige genetikk studier som rapporterte flere personer med de Novo missense, tull, frameshift og skjøting varianter i EBF3 knyttet til lignende neurodevelopmental fenotyper82,83. Deretter ble tre ekstra papirer publisert rapportering flere tilfeller av de Novo EBF3 varianter og kopiere nummer sletting84,85,86. Denne romanen neurodevelopmental syndrom er nå kjent som hypotoni, ataksi, og forsinket utvikling syndrom (HADDS, MIM #617330) i online Mendelsk arv i man (OMIM, en autoritativ database for genotype-fenotype relasjoner i mennesker).

Funksjonell studie av nesten kun arvet missense variant i TBX2 knyttet til en syndromisk hjerte-og skjelettlidelser utviklingsforstyrrelse
I en liten familie rammet av overlappende spectrums av kraniofacial dysmorphism, CARDIAC uregelmessigheter, skjelettlidelser misdannelse, uimottakelig mangel, endokrine misdannelser, og utviklingsmessige verdifall, UDN Duke Clinical site identifisert en missense variant (p. R20Q) i TBX2 som segregerer med sykdom fenotyper87. Tre (sønn, datter, mor) av de fire familiemedlemmene er berørt av denne tilstanden, og sønnen utstilt de mest alvorlige fenotype. Klinisk, møtte han en diagnose av "komplett DiGeorge syndrom", en tilstand ofte forårsaket av haploinsufficiency av TBX1. Selv om det ikke var noen mutasjoner identifisert i TBX1 i denne familien, fokuserte klinikere og menneske Genetikere på en variant i TBX2, siden tidligere studier hos mus viste at disse genene har overlappende funksjoner under utviklingen88 . TBX1 og TBX2 begge to tilhøre T-bokse med (TBX) slekt av transkripsjon faktorene det kanne fungere som transcriptional repressors likeledes idet aktivator avhenger på sammenhengen.

Tidligere var varianter av 12 av 17 medlemmer av TBX familie gener knyttet til menneskelige sykdommer. Den MOSC besluttet å eksperimentelt forfølge denne varianten basert på følgende informasjon samlet gjennom MARRVEL og andre ressurser. (1) denne varianten ble rapportert bare én gang i en kohort av ~ 90 000 "Control" individer i gnomAD (denne varianten ble filtrert ut i en standardvisning, sannsynligvis på grunn av lav dekning leser). Tatt i betraktning den mildere fenotypiske presentasjonen av moren, kan dette fortsatt betraktes som en sjelden variant som kan være ansvarlig for sykdommen fenotyper. (2) pLI scorene til TBX2 i ExAC/gnomAD er 0.96/0.99, som er høy (maksimum = 1,00). I tillegg, o/e (observert/forventet) LOF score i gnomAD er 0,05 (bare 1/18.6 forventet LOF variant er observert i gnomAD). Disse tallene tyder på at LOF-variantene i dette genet er valgt mot i befolkningen generelt.

I tillegg, (3) p. R20 er evolutionarily bevart fra C. elegans og Drosophila til mennesker, noe som tyder på at dette kan være en viktig rest for TBX2 funksjon. (4) flere programmer spår at varianten er sannsynlig ødeleggende (polyphen: muligens/sannsynligvis skade, sile: skadelige, CADD score: 24,4, REVEL score: 0,5). (5) MO mutanter utstillingen defekter i vev berørt hos pasienter (f. eks, knockout mus viser defekter i kardiovaskulære systemet, fordøyelsesenzymer/fordøyelses systemer, kraniofacial, lemmer/siffer). Derfor, sammen med de biologiske bånd mellom TBX1 og TBX2 og fenotypiske koblinger mellom disse pasientene og DiGeorge syndrom, var det optimalt å utføre funksjonelle studier av varianter i dette genet ved hjelp av Drosophila.

For å vurdere om p. R20Q variant påvirker TBX2 funksjon, en T2A-GAL4 linje i bifid (bi; den Drosophila ortholog av menneskelig TBX2), ble generert via RMCE av en koding intronic etterligne (figur 2)87. Dette allel, biT2A-GAL4, var resessivt puppestadiet dødelige og oppførte seg som en sterk LoF mutant, lik tidligere rapportert bi LoF alleler (f. eks, biD2, biD4; Figur 2 E). dødeligheten av disse klassiske og nylig genererte bi alleler ble reddet av en ~ 80 kb genomisk redning konstruere bære hele bi geometriske, indikerer at disse reagensene er faktisk rene LoF alleler. Uttrykks mønsteret for GAL4 i biT2A-GAL4- linjen matchet også godt med tidligere rapporterte mønstre av bi -uttrykk i flere vev, inkludert i vinge imaginal platen (figur 2D).

Parallelt, UAS-transgene linjer for TBX2 bærer referanse eller variant (p. R20Q) sekvenser ble generert. Dessverre, verken transgene var i stand til å redde dødelighet av biT2A-GAL4 linje. Viktigere, en vill-type fly UAS-bi transgene også unnlatt å redde biT2A-GAL4 allel, sannsynligvis på grunn av dosering-følsomheten til dette genet. Faktisk, overuttrykte av UAS-bi+ og UAS-TBX2+ forårsaket en viss grad av dødelighet når overexpressed i en vill-type dyr. Denne giftige effekten av bi/TBX2 overuttrykte ble benyttet som en funksjonell analysen for å vurdere om p. R20Q varianten kan påvirke TBX2 funksjon. Siden Drosophila bi -genet har blitt grundig studert i konteksten av det visuelle systemet [Gene er også kjent som optomotor blind (OMB)], fenotyper relatert til det visuelle systemet ble undersøkt omfattende. Når referansen TBX2 ble uttrykt ved hjelp av en ey-GAL4 driver som uttrykker UAS-transgenes i øyet og deler av hjernen er relevant for det visuelle systemet, ~ 85% dødelighet (Figur 3C, høyre panel) og betydelige reduksjon av øye størrelse (Figur 4B) ble observert. Denne fenotype var sterkere enn fenotype observert når en vill-type fly UAS-bi transgene ble uttrykt, noe som tyder på at den menneskelige TBX2 er mer skadelig for fly når overexpressed.

Interessant, p. R20Q TBX2 var mindre potent i forårsaker dødelighet (Figur 3C, høyre panel) og i inducing en liten øye fenotype (Figur 4B) ved hjelp av samme driver under identiske tilstand87, antyder at varianten påvirker protein funksjon. Videre funksjonen av fotoreseptorene overexpressing referanse og variant TBX2 bruker en annen GAL4 driver, (Rh1-GAL4) som spesifikt uttrykker UAS Transgenes i R1-R6 fotoreseptorene, avslørte at varianten TBX2 utstilt en mye mildere ERG fenotype sammenlignet med referanse TBX2 (Figur 4B)87. Interessant nok var det meste av p. R20Q TBX2 protein fortsatt funnet i kjernen, ligner på referanse protein, noe som tyder på at varianten ikke påvirker kjernefysisk lokalisering. En luciferase-basert transcriptional undertrykkelse analysen i HEK293T celler viste at p. R20Q var ikke i stand til å effektivt undertrykke transkripsjon av en reporter konstruere med palindromic T-Box nettsteder87. I tillegg ble det observert nedgang i protein nivået av TBX2p. R20Q SAMMENLIGNET med TBX2+, noe som tyder på at varianten kan påvirke oversettelsen eller protein stabiliteten til TBX2, som igjen påvirker dens overflod i en celle.

Flere pasienter med sjeldne varianter i TBX2 ble identifisert av KLINIKERE ved UDN Duke Clinical site parallelt med disse eksperimentelle studiene.  En 8 år gammel gutt med en de Novo missense (p. R305H) variant fra en uavhengig familie utstilt mange av funksjonene som finnes i den første familien87. Ytterligere funksjonelle studier i Drosophila og menneskelige cellelinjer avslørte at p. R305H varianten også påvirker TBX2 funksjon og proteinnivåer, sterkt antyder at defekter i dette genet trolig ligger til grunn mange fenotyper funnet i de to familiene. Denne lidelsen ble nylig vurdert som "vertebrale uregelmessigheter og variabel endokrine og T celle dysfunksjon" (VETD, MIM #618223) i OMIM. Identifisering av ytterligere personer med skadelige varianter i TBX2 med overlappende fenotyper er avgjørende for å forstå hele spekteret av genotype-fenotype forhold for dette genet i menneskelig sykdom.

Figure 1
Figur 1 : Injeksjon og kryssing ordning for å generere UAS-menneskelige cDNA og T2A-GAL4 linjer. (A) GENERERING av UAS-humant cDNA transgenes gjennom microinjections og krysser. Crossing ordning for å integrere transgenes i en andre kromosom docking site (VK37) ved hjelp av mannlige fluer i første og andre generasjon er vist som et eksempel. Ved injeksjon av humant cDNA φC31 transgene konstruere (pGW-ha. attB) i tidlig embryo som inneholder en germline kilde til φC31 integrase (merket med 3xP3-GFP og 3xP3-RFP) og VK37 docking site [merket med en gul+ (y+ ), kan transgene-hendelser følges med hvit+ (w+) minigene som finnes i transgene vektoren. Det anbefales å krysse ut φC31 integrase ved å velge mot fluer med GFP og RFP. Den endelige stabile aksjen kan holdes som homozygoter eller som en balansert lager hvis kromosom bærer en annen side dødelig/steril rammet mutasjon. Tilstedeværelsen av andre site dødelige/sterile mutasjoner på en transgene konstruerer vanligvis ikke påvirker utfallet av funksjonelle studier så lenge disse transgenes brukes i en heterozygot tilstand (Figur 3). (B) GENERERING av T2A-GAL4 linjer gjennom microinjection og krysser. Crossing ordning for å konvertere et annet kromosom etterligne innsetting i et T2A-GAL4 element er vist som et eksempel. Ved microinjecting et uttrykk vektor for φC31 integrase og RMCE vektor for T2A-GAL4 (pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70, en passende lese ramme for etterligne av interesse er valgt. Se følgende papirer for detaljer57,59 i embryo bærer en etterligne i en koding Intronets opprinnelse i Gene av interesse, kan man konvertere den opprinnelige etterligne til en T2A-GAL4 linje. Figur 2 A viser et skjematisk diagram over RMCE-konverteringen. Konverteringen hendelsen kan velges ved screening mot y+ markør i den opprinnelige etterligne kassett60. Siden RMCE kan forekomme i to retninger, bare 50% av den vellykkede konverteringen hendelsen fører til vellykket produksjon av GAL4, som kan oppdages av en UAS-GFP reporter transgene i neste generasjon. Den endelige stabile aksjen kan holdes som homozygoter eller som en balansert lager hvis LOF av genet er dødelig/steril. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Konvertering av etterligne elementer til T2A-GAL4 linjer via RMCE. (A) φC31 integrase forenkler rekombinasjon mellom de to attP nettstedene i fly (øverst) og to ATTB nettsteder flankerer en T2A-GAL4 kassett vist som en sirkulær vektor (nederst). (B) vellykkede RMCE hendelser føre til tap av en valgbar markør (gul +) og innsetting av T2A-GAL4 kassett i samme retning av genet av interesse. Siden RMCE hendelsen kan skje i to retninger, gir bare 50% av RMCE reaksjonen et ønsket produkt. Et RMCE-produkt som er satt inn i motsatt retning vil ikke fungere som en gen-felle allel eller uttrykke GAL4. Retningen av konstruksjonen må bekreftes via sanger sekvensering. (C) transkripsjon (øverst) og oversettelse (nederst) av genet av interesse fører til generering av en avkortet mRNA og protein på grunn av polyA signalet til stede på 3 ' slutten av T2A-GAL4 kassett. Den T2A er en ribosom hoppe signal, som gjør at ribosom å stanse og alletjenestegrener oversettelse etter dette signalet. Dette brukes til å generere et GAL4-element som ikke er covalently knyttet til avkortet gen produkt av interesse. Den GAL4 vil gå inn i kjernen og vil lette transkripsjon av transgenes som er under kontroll av UAS elementer. UAS-GFP kan brukes som et genuttrykk reporter, og UAS-Human cDNA kan brukes til redning eksperimenter via gen "menneskeliggjøring". (D) vist er et eksempel på et T2A-GAL4 element i bi kjøring uttrykk for UAS-GFP (øverst). Dette uttrykks mønsteret ligner på en tidligere generert Enhancer felle linje for det samme genet (bi-OMB-GAL4; Bottom). (E) sammenligning av T2A-GAL4 allel av bi med tidligere rapporterte LoF bi alleler. Dette tallet er vedtatt og modifisert fra tidligere publikasjoner57,87. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Funksjonell analyse av menneskelige varianter ved hjelp av rednings BAS ert (venstre) og overuttrykte (høyre) studier. (A) (venstre panel): funksjonen til EBF3 varianter ble vurdert med en rednings BAS ert analyse av fly knuten (KN) LoF allel med fokus på dødelighet/levedyktighet; (høyre panel): funksjonen av varianter i TBX2 ble vurdert ved å utføre overuttrykte av menneskelig TBX2 transgenes i vill-type fluer, med fokus på dødelighet/levedyktighet, øye morfologi, og elektrofysiologi fenotyper (Figur 4) . (B) krysser ordninger for å få fluene skal testes i funksjonelle studier. Det anbefales å alltid bruke et nøytralt UAS-element (f. eks UAS-lacZ, UAS-GFP) som en kontroll eksperiment. (C) representative resultater fra funksjonelle studier av EBF3p. R163Q og TBX2p. R20Q varianter, henholdsvis, sammen med nødvendige kontroll eksperimenter som er nødvendige for å tolke resultatene. Både rednings BAS ert analyse og overuttrykte studier avslører at variantene oppfører seg som amorphic eller hypomorphic alleler. Dødeligheten/levedyktighet data som vises her er basert på eksperimentelle data presentert i tidligere publikasjoner15,87. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Funksjonell analyse av en sjelden missense variant i humant TBX2 basert på øye morfologi og elektroretinogrammet i Drosophila. (A) et skjematisk bilde som viser den typiske plasseringen av opptak og referanseelektroder på fly øyet, sammen med en representativ elektroretinogrammet innspilling med fire hovedkomponenter (på-transient, depolarization, off-transient, repolarisasjon). (B) TBX2 variant (p. R20Q) fungerer som en delvis LoF-allel basert på overuttrykte studier i fly øyet ved bruk av GAL4-drivere som er spesifikke for det visuelle systemet (ey-GAL4 og Rh1-GAL4). Dette viste at referansen TBX2 forårsaket en sterk morfologiske og elektrofysiologisk fenotype sammenlignet med variant protein. (Top paneler): en alvorlig reduksjon i øye størrelsen ses på overuttrykte av UAS-TBX2+ med ey-GAL4. UAS-TBX2p. R20Q. Drevet med ey-GAL4 fører også til et mindre øye, men fenotype er mye mildere. (Bottom paneler): Når UAS-TBX2+ er uttrykt i kjernen R1-R6 fotoreseptorene bruker Rh1-GAL4, det er et tap på-og off-transienter, redusert depolarization, og store unormale forlenget depolarization etter potensiell (PDA) fenotype, som ikke er sett i kontroll fluer. Disse fenotyper er ikke så alvorlig som når UAS-TBX2p. R20Q uttrykkes ved hjelp av samme Rh1-GAL4. Dette tallet er vedtatt og modifisert fra tidligere publikasjoner69,87. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Formål Verktøyet Url
Variant-funksjon
prediksjon algoritmer		 PolyPhen-2
Sile
CADD
PROVEAN
MutationTaster
Revel		 http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2
https://sift.bii.a-star.edu.sg
https://cadd.gs.washington.edu
http://provean.jcvi.org/index.php
http://www.mutationtaster.org
https://sites.google.com/site/revelgenomics
Sjeldne og udiagnostisert
sykdom forskning
konsortier		 UDN
RDMM
IRUD
LØSE-RD
AFGN		 https://undiagnosed.hms.harvard.edu
http://www.rare-diseases-catalyst-network.ca
https://irudbeyond.nig.ac.jp/en/index.html
http://solve-rd.eu
https://www.functionalgenomics.org.au
Integrerende database for
menneske og modell
organisme informasjon		 MARRVEL
Monarch initiativ
Gene2Function
Phenologs		 http://marrvel.org
https://monarchinitiative.org
http://www.gene2function.org
http://www.phenologs.org
Human genetisk og
Genomics databaser		 OMIM
ClinVar
ExAC
gnomAD
GenoMP
DGV
Dechiffrere		 https://www.omim.org/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
http://exac.broadinstitute.org/
http://gnomad.broadinstitute.org/
http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/#/
http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home
https://decipher.sanger.ac.uk/
Ortholog identifikasjons verktøy DIOPT https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
Modell organisme
Databaser og biomedisinsk
Litteratursøk		 WormBase (C elegans)
FlyBase (Drosophila)
ZFIN (sebrafisk)
MGI (mus)
Pubmed		 https://www.wormbase.org
http://flybase.org
https://zfin.org
http://www.informatics.jax.org
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
Genetisk og protein
samhandling databaser		 Streng
Tåke		 https://string-db.org
http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/
Protein struktur
databaser og
modellering verktøy		 WWPBD
SVEITSISK-MODELL
Modeller
Phyre2 		http://www.wwpdb.org
https://swissmodel.expasy.org/
https://salilab.org/modeller/
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2
Pasient matchmaking
Plattformer		 Matchmaker utveksling
GeneMatcher
AGHA arkiv
Matchbox
Dechiffrere
MyGene2
Phenome sentrum		 http://www.matchmakerexchange.org
https://www.genematcher.org
https://mme.australiangenomics.org.au/#/home
https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox
https://decipher.sanger.ac.uk
https://www.mygene2.org/MyGene2
https://phenomecentral.org
Menneskets transkripsjon
Merknad og cDNA
klone informasjon		 Pattedyr genet Collection
Ensembl
Refseq		 https://genecollections.nci.nih.gov/MGC
http://useast.ensembl.org
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

Tabell 1: elektroniske ressurser som er relatert til denne protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eksperimentelle studier med Drosophila melanogaster gir en robust analysen system for å vurdere konsekvensene av sykdom-assosiert menneskelige varianter. Dette er på grunn av den store kroppen av kunnskap og diverse genetiske verktøy som har blitt generert av mange forskere i fly feltet over det siste århundret89. Akkurat som alle andre eksperimentelle system, men det er viktig å erkjenne de begrensninger og begrensninger som finnes.

Advarsler knyttet til data mining
Selv om det første trinnet i denne protokollen er å utvinne databaser for informasjon vedrørende et gen av interesse, er det viktig å bruke det bare som et utgangspunkt. Selv om for eksempel silisiummangan prediksjon av variant funksjonen gir verdifull innsikt, bør disse dataene alltid tolkes med forsiktighet. Det er noen tilfeller der alle store algoritmer spår at en menneskelig variant er godartet, men funksjonelle studier i Drosophila tydelig demonstrert skadelig karakter av en slik variant24. Selv om protein-protein interaksjoner, co-Expression, og strukturelle modellering data er alle innsiktsfulle opplysninger, kan det være pseudo-positiv og pseudo-negativ informasjon til stede i disse store-omics datasett. For eksempel kan noen av de tidligere identifiserte eller spådde protein-protein interaksjoner være kunstige eller bare sett i visse celle-og vevstyper.

I tillegg kan det være mange falske negative interaksjoner ikke fanget i disse datasettene, siden visse protein-protein interaksjoner er forbigående (f. eks enzym-substrat interaksjoner). Eksperimentell validering er avgjørende for å demonstrere at visse gener eller proteiner genetisk eller fysisk samhandler i vivo i biologisk kontekst av interesse. Tilsvarende strukturer spådd basert på homologi modellering bør behandles som en modell i stedet for løst struktur. Selv om denne informasjonen kan være nyttig hvis det er funnet at en aminosyre av interesse er til stede i et strukturelt viktig del av proteinet, ikke negative data utelukker muligheten for at varianten kan være ødeleggende. Endelig, noen av de tidligere rapporterte genotype-fenotype informasjon bør også behandles med forsiktighet, siden noen informasjon arkivert i offentlige databaser kan ikke være nøyaktig. For eksempel er noe informasjon i MO-databaser basert på eksperimenter som har blitt godt kontrollert og utført grundig, mens andre kan komme fra en stor skjerm papir uten ytterligere oppfølgingsstudier og strenge kontroller.

"Menneskeliggjøring" eksperimenter ved hjelp av T2A-GAL4 strategi ikke alltid vellykket
Mens rednings-og overuttrykte funksjonelle studier ved hjelp av menneskelige cDNAs tillate vurdering av varianter i sammenheng med den menneskelige protein, er denne tilnærmingen ikke alltid vellykket. Hvis en referanse menneskelige cDNA ikke kan redde flue mutant fenotype, er det to sannsynlige forklaringer. Den første muligheten er at menneskets protein er fungerende eller har betydelig redusert aktivitet i sammenheng med en flue celle. Dette kan skyldes 1) redusert protein uttrykk, stabilitet, aktivitet og/eller lokalisering eller 2) mangel på kompatibilitet med fly proteiner som arbeider i et multi-protein kompleks. Siden UAS/GAL4 systemet er temperatur følsom, kan fluene heves ved en relativt høy temperatur (f. eks, 29 ° c) for å se muligheten for en redning i denne tilstanden. I tillegg kan en UAS-fly cDNA konstruere og transgene som en positiv kontroll bli generert. Hvis varianten av interesse påvirker en bevart aminosyre, kan den analoge varianten innføres i fly cDNA for funksjonell studie av varianten i sammenheng med flue ortholog. Selv om dette ikke er nødvendig, hjelper det i stor grad studien i saker som bruker menneskelige cDNA transgene-linjer gir negative eller mangelfulle resultater (Figur 3).

Den andre muligheten er at uttrykk for det menneskelige proteinet forårsaker noen cellulære eller organisme-nivå toksisitet. Dette kan skyldes antimorphic (f.eks. opptrer som et dominerende negativt protein), hypermorphic (for eksempel for mye aktivitet), eller neomorphic (f. eks, gevinst av en roman giftig funksjon som protein aggregering som ikke alltid er relatert til endogene funksjonen av genet av renter) effekter. I dette tilfellet kan det å holde fluene i lav temperatur (f.eks. 18 ° c) lindre noen av disse problemene. Til slutt er det noen scenarier der overuttrykte av en flue cDNA kan ikke redde fly T2A-GAL4 linje sett i TBX2 eksempel, sannsynligvis på grunn av trict dosering avhengighet av genet produktet. For å unngå overuttrykte av et protein av interesse, kan fly genet av interesse endres direkte via CRISPR, en genomisk redning konstruere kan være konstruert som inneholder den varianten av interesse, eller redning eksperimenter kan utføres ved hjelp av en LOF allel21. For små gener, "humanisering" The fly genomisk redning konstruere kan betraktes for å teste menneskelige varianter som påvirker ikke-bevarte aminosyrer24. Oppsummert bør alternative strategier vurderes når menneskeliggjøring eksperimentet ikke tillater funksjonell vurdering av varianten av interesse.

Tolke negative og positive resultater
Hvis 1) både referanse og variant menneskelige cDNAs redde fly mutant fenotyper til en tilsvarende grad og 2) det er ingen forskjell observert i alle forhold testet, så det kan antas at varianten er funksjonelt å skille i Drosophila i Vivo. Det er viktig å merke seg at denne informasjonen ikke er tilstrekkelig til å utelukke at den varianten av interesse er ikke-patogene, siden Drosophila analysen ikke kan være følsom nok eller fange opp alle potensielle funksjoner av genet/protein av interesse relevant for mennesker. Positive data, derimot, er en sterk indikasjon på at varianten har ødeleggende konsekvenser på protein funksjon, men disse dataene alene er fortsatt ikke tilstrekkelig til å kreve patogenitet. The American College of Medical genetikk og Genomics (ACMG) har publisert et sett av standarder og retningslinjer for å klassifisere varianter i menneskelig sykdom knyttet gener til "godartet", "sannsynlig godartet", "variant av ukjent betydning (VUS)", "sannsynlig patogene", og "patogene"90. Selv om denne klassifiseringen bare gjelder for etablerte sykdoms assosierte gener og ikke er direkte gjeldende for varianter i "gener av usikker betydning" (GUS), oppfordres alle personer som er involvert i funksjons studier av menneskelig variant, sterkt til å overholder denne retningslinjen ved rapportering av variant funksjon.

Utdrager nyttig Biological beskjed når MO fenotyper ikke modell en human sykdommen forfatning
Det er viktig å huske på at overuttrykte funksjonelle analyser har begrensninger, spesielt siden noen av fenotyper som scores kan ha liten relevans for sykdomstilstanden av interesse. På samme måte kan det hende at fenotyper som vurderes gjennom rednings eksperimenter ikke har noen direkte relevans for sykdommen. Siden disse eksperimentene er gjennomført utenfor endogene sammenhenger i et virvelløse system, bør de ikke betraktes sykdom modeller, men heller som en gen funksjon test bruker Drosophila som en "levende test tube".

Selv om modellen organisme ikke etterligner en menneskelig sykdom tilstand, scorable fenotyper brukes i redning eksperimenter kan ofte gi nyttig biologisk innsikt i sykdomstilstander. Begrepet "phenologs (ikke opplagt homologe fenotyper)"91 kan brukes til å ytterligere bestemme underliggende molekylære forbindelser mellom Drosophila og Human fenotyper. For eksempel, morfologiske fenotyper i flue fløyen, thorax, ben og øyne er utmerket fenotypiske readouts for defekter i notch signalering veien, en evolutionarily bevart sti knyttet til mange medfødte lidelser, inkludert kardiovaskulære defekter hos mennesker62. Ved å forstå den molekylære logikken bak visse fenotyper i Drosophila, er det mulig å identifisere skjulte biologiske bånd mellom gener og fenotyper hos mennesker som ennå ikke er forstått.

Kontinuerlig kommunikasjon med kliniske samarbeidspartnere
Når du arbeider med klinikere for å studere funksjonen til en sjelden variant som finnes i pasienten, er det viktig å etablere et sterkt samarbeidsforhold. Selv om kliniske og grunnleggende biomedisinsk forskere kan dele interesser i samme gener/genetiske veier, er det en stor kulturell og språklig (for eksempel medisinsk sjargong, modell organisme-spesifikk nomenklatur) gap mellom de kliniske og vitenskapelige felt. Et sterkt, tillits BAS ert forhold mellom de to partiene kan bygges gjennom omfattende kommunikasjon. Videre er toveiskommunikasjon avgjørende for å etablere og opprettholde dette forholdet. I de to tilfellene som er beskrevet i delen for representative resultater, var for eksempel identifisering av flere pasienter med lignende genotyper og fenotyper, i tillegg til påfølgende funksjonell studie, avgjørende for å bevise patogenitet av interesse variantene. Selv med sterke funksjonelle data, forskere og klinikere har ofte vanskeligheter overbevisende menneskelige Genetikere at en variant identifisert i "n = 1" tilfeller er den egentlige årsaken til sykdommen.

Når MO-forskeren identifiserer at en variant av interesse er ødeleggende, er det avgjørende å kommunisere tilbake til kliniske samarbeidspartnere så snart som mulig slik at de aktivt kan prøve å identifisere samsvarende tilfeller ved nettverk med andre klinikere og menneskelig Genetikere. Verktøy som Geno2MP [genotyper to mendelsk fenotyper: en de-identifisert database med 9 650 individer innrullert i University of Washington ' s Center for Mendelsk Genomics Study41; inkluderer pasienter og familiemedlemmer som er mistenkt for å ha genetiske lidelser] kan søkes for å vurdere personer som kan ha samme uorden. Deretter kan kundeemne terapeut kontaktes ved hjelp av en meldingsfunksjon.

Alternativt kan GeneMatcher brukes, som er en matchmaking nettsted for klinikere, grunnleggende forskere, og pasienter som deler interesser i samme gener for å identifisere flere pasienter som bærer sjeldne varianter. Siden GeneMatcher er en del av et større integrerende nettverk av matchmaking nettsteder kalt matchmaker Exchange42, kan flere databaser rundt om i verden søkes, inkludert Australian Genomics Health Alliance pasient arkiv, Broad Matchbox , DECHIFFRERE, MyGene2, og PhenomeCentral i en enkelt GeneMatcher genet innlevering. Selv om deltakelse i GeneMatcher er mulig som en "forsker", anbefales det at grunnleggende forskere bruker dette nettstedet med sine kliniske samarbeidspartnere, siden kommunikasjon med andre klinikere etter en kamp krever visse nivåer av medisinsk Kompetanse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Jose Salazar, Julia Wang, og Dr. Karen Schulze for kritisk lesning av manuskriptet. Vi erkjenner DRS. ning Liu og XI Luo for funksjonell karakterisering av TBX2 varianter diskutert her. Udiagnostisert sykdommer nettverk modell organismer screening Center ble støttet gjennom National Institutes of Health (NIH) Common Fund (U54 NS093793). H. T. C. ble videre støttet av NIH [CNCDP-k12 og NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of nevrologi (nevrovitenskap Research Grant), Burroughs Wellcome Fund (Career Award for medisinske forskere), Child Nevrologi Society og Child Nevrologi Foundation ( Elterman stipend), og NIH Director ' s Early Independence Award (DP5 OD026426). M. F. W. ble ytterligere støttet av Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. ble videre støttet av NIH (R01 DC014932), Simons Foundation (SFARI Award: 368479), Alzheimer ' s Association (ny etterforsker Research Grant: 15-364099), naman Family Fund for Basic Research, og Caroline Wiess Law Fund for Research i Molekylær medisin. Konfokalmikroskopi mikroskopi på BCM støttes delvis av NIH Grant U54HD083092 til Intellectual og utviklingsmessige funksjonshemminger Research Center (IDDRC) Neurovisualization Core.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l, Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , Forthcoming (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , Forthcoming (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer's Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , Forthcoming (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), Cambridge, England. 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, Clifton, N.J. 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, Clifton, N.J. 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , Forthcoming (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), Cambridge, England. 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE--Collier/Olf1/EBF--transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing and Wiley-Interscience. New York. (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

Genetikk Human genetikk og Genomics Mendelsk sykdommer sjeldne og udiagnostisert sykdommer udiagnostisert sykdommer nettverk Drosophila melanogaster variant av ukjent betydning VUS genet av usikker betydning Gus funksjonell Genomics transgene fluer UAS/GAL4 system T2A-GAL4 elektroretinogrammet ERG
In vivo funksjonell studie av sykdom-Associated sjeldne Human varianter bruke <em>Drosophila</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao,… More

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H. T., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter