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Genetics

Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

Published: August 20, 2019 doi: 10.3791/59658
Automatic Translation
*1, *2, 1,3,4,5, 1,2,4, 1,2,4,5
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

O objetivo deste protocolo é delinear o desenho e o desempenho de experimentos in vivo em Drosophila melanogaster para avaliar as conseqüências funcionais de variantes genéticas raras associadas a doenças humanas.

Abstract

Os avanços na tecnologia de sequenciamento tornaram os conjuntos de dados de todo o genoma e todo-exome mais acessíveis tanto para o diagnóstico clínico quanto para a pesquisa genética humana de ponta. Embora vários algoritmos de silico tenham sido desenvolvidos para prever a patogenicidade das variantes identificadas nesses conjuntos de dados, os estudos funcionais são fundamentais para determinar como as variantes genômica específicas afetam a função protéica, especialmente para o missense Variantes. Na rede de doenças não diagnosticadas (UDN) e outros consórcios de pesquisa de doenças raras, os organismos modelo (MO), incluindo a Drosophila, C. elegans, zebrafish e camundongos, são usados ativamente para avaliar a função da doença putativa humana-causando Variantes. Este protocolo descreve um método para a avaliação funcional de variações humanas raras usadas no núcleo da Drosophila do centro de seleção dos organismos modelo do UDN. O fluxo de trabalho começa com a coleta de informações humanas e de MO de vários bancos de dados públicos, usando o recurso da Web MARRVEL para avaliar se a variante é susceptível de contribuir para a condição de um paciente, bem como projetar experimentos eficazes com base em disponíveis conhecimento e recursos. Em seguida, são geradas ferramentas genéticas (por exemplo, linhas T2A-GAL4 e UAS-Human cDNA) para avaliar as funções de variantes de interesse na Drosophila. Em cima do desenvolvimento destes reagentes, os ensaios funcionais Two-pronged baseados em experimentos do salvamento e da superexpressão podem ser executados para avaliar a função variante. No ramo de resgate, os genes de mosca endógena são "humanizados" substituindo o gene da Drosophila ortologosa por transgenes humanos de referência ou variante. No ramo de superexpressão, as proteínas humanas de referência e variante são conduzidas exogenamente em uma variedade de tecidos. Em ambos os casos, todo o phenotype pontuáveis (por exemplo, letalidade, morfologia do olho, electrophysiology) pode ser usado como uma leitura-para fora, independentemente da doença do interesse. As diferenças observadas entre os alelos de referência e variantes sugerem um efeito variante-específico e, portanto, provável patogenicidade. Este protocolo permite avaliações rápidas, in vivo, de variantes de genes causadores de doenças humanas putativas com funções conhecidas e desconhecidas.

Introduction

Pacientes com doenças raras muitas vezes passam por uma árdua jornada referida como a "Odisseia diagnóstica" para obter um diagnóstico preciso1. A maioria de doenças raras são pensados para ter uma origem genética forte, fazendo análises genéticas/genomic elementos críticos do workup clínico. Além do que o seqüenciamento do painel do gene do candidato e a análise da variação do número da cópia baseadas em Microarrays cromossomáticos, as tecnologias Whole-exome (WES) e do inteiro-genoma que sequenciam (WGS) tornaram-se ferramentas cada vez mais valiosas sobre a década passada2, a 3. Atualmente, a taxa diagnóstica para identificar uma variante patogênica conhecida em Wes e WGS é de ~ 25% (maior em casos pediátricos)4,5. Para a maioria de casos que permanecem undiagnosed após WES/WGS clínico, uma edição comum é que há muitos genes e variants do candidato. O sequenciamento da próxima geração geralmente identifica variantes novas ou ultramodernas em muitos genes, e interpretar se essas variantes contribuem para fenótipos de doença é desafiador. Por exemplo, embora a maioria de mutações do absurdo ou do Frameshift nos genes sejam pensadas para ser perda--função (LOF) alelos devido à deterioração absurdo-negociada da transcrição codificada, as mutações truncando encontradas nos últimos exons escapam este processo e podem funcionar como alelos benignos ou de ganho de função (GOF)6.

Além disso, prever os efeitos de um alelo missense é uma tarefa assustadora, uma vez que pode resultar em um número de diferentes cenários genéticos como descrito pela primeira vez por Herman Muller na década de 1930 (ou seja, amorfo, hipomorfo, hipermorfo, antimorfo, neomorfo, ou isomorph)7 . Numerosos em programas de silico e metodologias foram desenvolvidos para prever a patogenicidade de variantes missense com base na conservação evolutiva, tipo de mudança de aminoácidos, posição dentro de um domínio funcional, alelo freqüência na população geral, e outros parâmetros8. No entanto, esses programas não são uma solução abrangente para resolver o problema complicado de interpretação variante. Curiosamente, um estudo recente demonstrou que cinco algoritmos de predição de patogenicidade variante amplamente utilizados (PolyPhen9, Sift10, CADD11, provean12, provador de mutação) concordam com a patogenicidade ~ 80% do tempo8 . Notavelmente, mesmo quando todos os algoritmos concordam, eles retornam uma predição incorreta de patogenicidade até 11% do tempo. Isto conduz não somente à interpretação clínica defeituada mas igualmente pode dissuadir investigadores de seguir acima em variants novos falsamente alistando os como benignos. Uma forma de complementar a atual limitação da modelagem em silico é fornecer dados experimentais que demonstre o efeito da função variante in vitro, ex vivo (por exemplo, células cultivadas, organóides) ou in vivo.

Estudos funcionais in vivo de variantes associadas a doenças raras em MO têm pontos fortes únicos13 e foram adotados por muitas iniciativas de pesquisa de doenças raras em todo o mundo, incluindo a rede de doenças não diagnosticadas (UDN) nos Estados Unidos e Rare Modelos de doenças & mecanismos (RDMM) redes no Canadá, Japão, Europa e Austrália14. Além desses esforços coordenados para integrar pesquisadores de MO no fluxo de trabalho de diagnóstico de doenças raras e estudos mecanísticos em escala nacional, vários estudos colaborativos individuais entre pesquisadores clínicos e de MO levaram à descoberta e caracterização de muitos novos genes causadores de doenças humanas e variantes82,83,84.

Na UDN, um centro de triagem de organismos modelo centralizado (MOSC) recebe submissões de genes candidatos e variantes com uma descrição da condição do paciente e avalia se a variante é susceptível de ser patogênica usando ferramentas de informática e in vivo Experiências. Na fase I (2015-2018) da UDN, o MOSC é composto por um núcleo de Drosophila [Baylor College of Medicine (BCM)] e zebrafish Core (Universidade do Oregon) que trabalharam colaborativamente para avaliar os casos. Usando a análise informática e um número de estratégias experimentais diferentes na Drosophila e no zebrafish, o Mosc contribuiu até agora ao diagnóstico de 132 pacientes, identificação de 31 síndromes novas55, descoberta de diversos seres humanos novos genes da doença (por exemplo, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) e expansão fenotípica da doença conhecida genes (por exemplo, CACNA1A,21ACOX122).

Além de projetos dentro da UDN, os pesquisadores do núcleo de Drosophila da Mosc contribuíram para novas descobertas genéticas de doenças em colaboração com os centros de genômica mendeliana e outras iniciativas (por exemplo, ANKLE2,23, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) usando o mesmo conjunto de informática e genética estratégias desenvolvidas para a UDN. Dado o significado de estudos do MO no diagnóstico raro da doença, o MOSC foi expandido para incluir um núcleo de C. elegans e o segundo núcleo de zebrafish (ambos na Universidade de Washington em St. Louis) para a fase II (2018-2022) do UDN.

Este manuscrito descreve um protocolo de estudo funcional in vivo que é usado ativamente no núcleo de Drosophila da UDN Mosc para determinar se as variantes de missense têm conseqüências funcionais sobre a proteína de interesse usando moscas transgênicas que expressam Proteínas. O objetivo deste protocolo é ajudar os pesquisadores de MO a trabalharem colaborativamente com grupos de pesquisa clínica para fornecer evidências experimentais de que uma variante candidata em um gene de interesse tem conseqüências funcionais, facilitando assim o diagnóstico clínico. Este protocolo é o mais útil em um Scenario em que um investigador da Drosophila é aproximado por um investigador clínico que tenha um paciente raro da doença com uma variação específica do candidato em um gene do interesse.

Este protocolo pode ser dividido em três elementos: (1) coletar informações para avaliar a probabilidade de a variante de interesse ser responsável pelo fenótipo do paciente e a viabilidade de um estudo funcional em Drosophila, (2) coleta instrumentos genéticos existentes e estabelecer novos, e (3) realizar estudos funcionais in vivo. O terceiro elemento pode ser subdividido em dois subelementos com base em como a função de uma variante de interesse pode ser avaliada (experimento de resgate ou estratégias baseadas em superexpressão). É importante notar que este protocolo pode ser adaptado e otimizado para muitos cenários fora da rara pesquisa de doença monogênica (por exemplo, doenças comuns, interações gene-ambiente e telas farmacológicas/genéticas para identificar alvos terapêuticos). A capacidade de determinar a funcionalidade e a patogenicidade das variantes não só beneficiará o paciente de interesse, fornecendo um diagnóstico molecular preciso, mas também terá impactos mais amplos na pesquisa científica translacional e básica.

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Protocol

1. coleta de informações humanas e MO para avaliar: probabilidade de uma variante de interesse ser responsável por fenótipos de doenças e viabilidade de estudos funcionais em Drosophila

  1. Realize pesquisas extensas de banco de dados e literatura para determinar se os genes e variantes de interesse específicos são bons candidatos para explicar o fenótipo do paciente de interesse. Especificamente, reúna as seguintes informações.
    1. Avalie se o gene do interesse estêve implicado previamente em outras desordens genéticas (expansão fenotípica do gene conhecido da doença) ou este é um gene inteiramente novo do candidato da doença [variação do gene do significado incerto (GVUS)].
    2. Avalie a freqüência do alelo da variação do interesse em bases de dados da doença ou da população do controle.
    3. Avalie se há variações do número de cópia (CNVs) que incluem este gene em bases de dados da população da doença ou do controle.
    4. Avalie o que os genes ortológicos estão em diferentes espécies de MO, incluindo mouse, zebrafish, Drosophila, C. elegans e levedura, em seguida, investigar as funções conhecidas e padrões de expressão desses genes ortológicos.
    5. Avaliar se a variante de interesse está presente em um domínio funcional da proteína e se o aminoácido de interesse é evolutivamente conservado.
      Nota: as respostas a estas cinco perguntas (etapas 1.1.1-1.1.5) podem ser obtidas acessando um número de bases de dados humanas e do mo individualmente ou usando o recurso de Web de Marrvel (recursos agregados do organismo modelo para a exploração rara da variação) (veja a tabela 1 para recursos on-line)30, que é descrita em profundidade em um artigo de acompanhamento31. Consulte a seção de resultados representativos para obter exemplos específicos. O site da iniciativa Monarch32 e Gene2Function33 também fornecem informações úteis.
  2. Reúna informações adicionais para avaliar se a variante é um bom candidato a uma doença de uma função de proteína e uma estrutura de ponto de vista.
    1. Avalie se a variante de interesse está prevista para ser prejudicial com base em algoritmos de predição de silico.
      Nota: os algoritmos Variant da patogenicidade foram desenvolvidos por muitos grupos de pesquisa sobre os anos passados de ~ 15, e alguns são indicados igualmente nos resultados da busca de marrvel. Programas mais recentes, incluindo os dois listados abaixo, combinam múltiplos algoritmos de redição de patogenicidade variante e abordagens de aprendizado de máquina para gerar um escore de patogenicidade. Para obter mais informações sobre os algoritmos de predição de variantes e seu desempenho, consulte Ghosh, et al.8. (i) CADD (depleção combinada de anotação-dependente): ferramenta de anotação Integrativa construída a partir de mais de 60 características genómicas, que fornece escores para SNVs humanos, bem como inserções curtas e deleções11. (II) revel (raro aprendiz de Ensemble variante exoma): combina múltiplos algoritmos de patogenicidade variante (mutpred, fathmm, Vest, PolyPhen, Sift, provean, mutationassessor, mutationtaster, LRT, gerp, siphy, phylop e phastcons) para fornecer uma pontuação integrada para todas as variantes missense humanas possíveis34.
    2. Determine se o gene humano/proteína de interesse ou seus ortologs de MO foram mostrados para interagir geneticamente ou fisicamente com genes/proteínas previamente ligadas a doenças genéticas. Em caso afirmativo, avalie se o paciente do interesse exibe os fenótipos de sobreposição com estas desordens.
      Nota: várias ferramentas foram desenvolvidas para analisar as interações genética e proteína-proteína baseadas em publicações de mo, bem como proteômica em grande escala de múltiplas espécies de telas. STRING (ferramenta de busca para ocorrências recorrentes de genes vizinhos)35: um banco de dados para interações proteína-proteína conhecidas e previstas. Ele integra conjuntos de dados de interação genética e coexpressão, bem como ferramentas de mineração de texto para identificar genes e proteínas que podem funcionar juntos em uma variedade de organismos. MIST (ferramenta de pesquisa de interação molecular)36: um banco de dados que integra dados de interação genética e proteína-proteína de núcleo genética mos (levedura, C. elegans, Drosophila, zebrafish, sapo, rato, rato) e os seres humanos. A predição de interações inferidas de genes/proteínas ortológicas (intertoras) também é exibida.
    3. Determine se a estrutura 3-D da proteína de interesse foi resolvida ou modelada. Em caso afirmativo, determine onde a variação do mapa de interesse relativo aos domínios funcionais chaves.
      Nota: as estruturas proteicas resolvidas por cristalografia de raios X, ressonância magnética nuclear (RMN) e microscopia crioeletrônica podem ser encontradas em bases de dados públicas, incluindo o APO (banco de dados proteico) e o EMDatabank37. Embora não exista um banco de dados único para estruturas proteicas previstas/modeladas, um número de algoritmos (ou seja, suíço-modelo38, modeller39e phyre240) estão disponíveis para os usuários realizarem a modelagem de proteínas.
  3. Comunicar-se com colaboradores clínicos para discutir informações recolhidas a partir das análises informáticas nas secções 1.1-1.2. Se os colaboradores clínicos também sentirem que a variante e o gene de interesse são bons candidatos para explicar os fenótipos observados no paciente, proceder à seção 2. Se houver perguntas específicas sobre o genótipo e o fenótipo do paciente, discuta-as com os colaboradores clínicos antes de avançar.
    Nota: se se sentir que a variante de interesse é improvável para explicar o fenótipo de interesse (por exemplo, variante idêntica encontrada em alta freqüência na população de controle), discutir isso com os colaboradores clínicos para determinar se a variante é uma boa candidato, pois pode não haver o conhecimento adequado para interpretar os fenótipos clínicos.

2. reunindo ferramentas genéticas existentes e estabelecendo novos reagentes para estudar uma variante específica de interesse

Nota: uma vez que a variante de interesse tem sido determinado um bom candidato a perseguir experimentalmente, recolher ou gerar reagentes para realizar in vivo estudos funcionais. Para os estudos funcionais descritos neste protocolo, alguns reagentes chave da Drosophila melanogaster são necessários: 1) estirpes transgênicas de cDNA de ativação a montante, que carregam a sequência de referência ou variante, 2) uma perda de função alelo de um gene da mosca do interesse, e 3) uma linha GAL4 que possa ser usada para experiências do salvamento.

  1. Geração de construções de cDNA UAS-humanas e moscas transgênicas
    1. Identifique e obtenha as construções humanas apropriadas do cDNA. Muitos clones estão disponíveis a partir do MGC (coleção genética de mamíferos)43 e podem ser comprados a partir de Venders selecionados. Para genes que são alternados Alternativamente, verifique qual cDNA isoforma corresponde ao uso de conjuntos ou RefSeq.
      Nota: muitos cDNAs estão disponíveis em reagentes compatíveis com o sistema de clonagem recombinase-negociados44, o que simplifica a etapa de subclonagem. cDNAs pode vir em um "aberto (sem parar Codon)" ou "fechado (com endógena ou artificial Stop Codon)" formato. Enquanto os clones abertos permitem a C' de proteínas que são úteis para ensaios bioquímicos (por exemplo, Western blot) e células biológicas (por exemplo, imunocoloração) para monitorar a expressão da proteína de interesse, ela pode interferir com a função protéica em alguns casos.
    2. Subclone o cDNA da referência e da variante no vetor transgênicas de Drosophila . Use o sistema de transgênese mediada por φC31, pois isso permite que os cDNAs de referência e variantes sejam integrados no mesmo local no genoma45. Para este projeto, o núcleo de Drosophila de Mosc usa rotineiramente o vetor de PGW-ha. attb46.
      Nota: se o cDNA humano estiver em vetores compatíveis com sistema de clonagem com mediação recombinase (por exemplo, PDONR221, pENTR221), pule para a seção 2.1.4, que explica as reações de LR para subclonar os cDNAs em PGW-ha. ATTB.
      1. Se o cDNA humano não está em um plasmídeo compatível com sistema de clonagem recombinase-negociado, leykemidov os cDNAs humanos em um vetor de entrada de gateway usando técnicas biológicas moleculares padrão (um exemplo de tal protocolo é documentado abaixo).
        1. Realize um PCR do saliência para introduzir attB1 e attB2 braços. O primer dianteiro deve ter a seqüência attB1 5 '-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACC-3 ' seguido pelos primeiros 22 nucleotídeos do cDNA alvo. O primer reverso deve ter a seqüência attB2 5 '-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3 ' seguido pelo complemento reverso dos últimos 25 nucleotídeos do cDNA de interesse. Exclua o Codon de parada do cDNA, em seguida, adicione um C ' tag se ele é desejado para "abrir" um clone, ou adicionar um Codon parar para "fechar" um clone.
        2. Prepare um 100 μL de mistura de PCR de alta fidelidade consistindo de 50 μL de mistura mestre de PCR de alta fidelidade, 36 μL de água destilada, 5 μL de cada primers para frente e verso listados na etapa 2.1.2.1.1 diluído para 10 μM e 4 μL de cDNA alvo (150 ng/μL).
        3. Execute o PCR usando o protocolo padrão da mutagenese para adicionar attB1 e AttB2 braços no cDNA do interesse. As condições variam de acordo com a construção e variantes de interesse.
        4. Isole o cDNA alvo com os braços adicionados da homologia através da electroforese do gel e da extração do gel. Criar 1% gel de agarose e realizar eletroforese usando métodos padrão. Extirpar a faixa que corresponde ao tamanho do cDNA mais o comprimento adicional dos braços da homologia. Extraia o DNA do gel através dos métodos padrão95. Kits de extração de gel comercial estão disponíveis em várias empresas.
        5. Realize uma reação de recombinase in vitro com base no protocolo de clonagem mediada por recombinase de acordo com o sistema que é usado.
        6. Transforme o mix de reação de BP em células de E. coli quimicamente competentes. As células competentes podem ser feitas em casa ou compradas de vendedores comerciais. Cultura as células transformadas durante a noite em uma placa LB contendo antibióticos apropriados para a seleção de colônia. No dia seguinte, selecione várias colônias e cresça-as em culturas líquidas independentes durante a noite.
        7. Isole o DNA das culturas durante a noite através da miniprep. Seqüência de Sanger os clones positivos para garantir que o cDNA tem a seqüência correta96. Manter as células das culturas que são positivas para a seqüência desejada em 25% glicerol armazenado em-80 ° c.
    3. Realize o mutagênese local-dirigido para introduzir a variação do interesse no plasmídeo da passagem com o cDNA humano da referência97. Um protocolo detalhado para este método pode ser encontrado no site do fornecedor48,49. Valide a presença da variante no plasmídeo mutado via sequenciação de Sanger de todo o quadro de leitura aberto (ORF) para garantir que não existam variantes adicionais introduzidas através desta etapa de mutagenese.
    4. Subclone os cDNAs humanos da referência e da variante no plasmídeo fornecedor (plasmídeos da passagem com attL1 e attL2 locais) no plasmídeo transgênicas (por exemplo, PGW-ha. ATTB com attR1 e attR2 locais) através de uma reação do clonase de LR.
      Nota: existem UAS φC31 vetores projetados para a restrição convencional baseado em enzima subclonagem (por exemplo, Puast. attb50) se for preferível Subclonar cDNAs humanos através de métodos enzimáticos de restrição.
    5. Selecione φC31 docking sites em que para integrar o UAS-Human cDNA transgenes. Um número de locais de encaixe foi gerado por diversos laboratórios e é publicamente disponível dos centros de estoque50,52,53.
      Nota: desde que é conveniente ter o transgene humano em um cromossoma que não contenha o ortólogo da mosca do gene do interesse, recomenda-se usar um segundo local de encaixe do cromossoma [VK37 (estoque de bdsc #24872] quando o ortólogo da mosca está no X , terceiro, ou quarto cromossomas, e use um terceiro local de encaixe do cromossoma [VK33 (estoque de bdsc #24871] quando o ortólogo da mosca está no segundo cromossoma.
    6. Injete construções de cDNA UAS-humanas em moscas expressando a integrase de φC31 em sua linha germinal (por exemplo, Vas-φC31, nos-φC31).
      Nota: a microinjeção pode ser realizada em casa ou enviada para instalações centrais ou entidades comerciais para a transgênese. O protocolo detalhado para gerar moscas transgênicas pode ser encontrado no capítulo do livro citado51.
    7. Estabeleça cepas transgênicas estáveis dos embriões injetados. Injetar ~ 100-200 embriões por construção94. Um esquema de cruzamento representativo para uma inserção do transgene em um segundo local de encaixe do cromossoma (VK37) é representado na Figura 1a. Refira os livros citados54,55 para a informação básica da genética da Drosophila .
  2. Obter ou gerar uma linha T2A-GAL4 que facilite ensaios funcionais baseados em resgate (ver Figura 2 e secção 3,1).
    Nota: esta linha servirá duas finalidades. Primeiramente, a maioria de linhas T2A-GAL4 testadas comportam-se como alelos fortes de LOF funcionando como um alelo da armadilha do gene. Segundo, as linhas T2A-GAL4 funcionam como um driver de GAL4 que permite a expressão de construções de UAS (por exemplo, UAS-GFP, cDNAs UAS-humanas) os elementos de regulação endógena do gene de juros56,57 (Figura 2a-C).
    1. Pesquise coleções de ações públicas para as linhas T2A-GAL4 disponíveis, incluindo o projeto de ruptura do gene da Drosophila (pib)58 em que as linhas ~ 1.000 T2A-GAL4 foram geradas59. Estas cepas estão atualmente disponíveis a partir do centro de ações de Bloomington Drosophila (bdsc) e são pesquisáveis através do PIB e bdsc websites.
    2. Se uma linha T2A-GAL4 para o gene da mosca do interesse não está disponível, verific se uma linha intronic codificando apropriada da codificação (gavetaMinos-negociada da integração) está disponível para a conversão em uma linha T2A-GAL4 usando a troca recombinase-negociada da gaveta (RMCE )60 (Figura 2A).
      Nota: RMCE permite elementos mímicos intrônicos que estão entre dois exons de codificação a serem convertidos em uma linha T2A-GAL4 através da microinjeção de uma construção de doadores (um exemplo de um esquema de cruzamento é mostrado na Figura 1B) ou série de Cruzes, conforme descrito em detalhe57,59.
    3. Se uma linha T2A-GAL4 não estiver disponível e um imitador intrônico de codificação apropriado não existir, explore a possibilidade de gerar uma linha T2A-GAL4 através do sistema CRIMIC (Cassette de integração mediada por CRISPR)59.
      Nota: esta metodologia usa clivagem de DNA mediada por crispr e reparação dirigida por homologia (HDR) para integrar uma fita imitadora em um intron de codificação em um gene de interesse.
    4. Se o gene do interesse faltar um intron grande (> 150 BP) ou não tem nenhum introns, tentativa de bater-em um transgene GAL4 no gene da mosca com o sistema de crispr/Cas9 usando o HDR como descrito20,61,62.
      Nota: se a geração de um alelo de Knock-in T2A-GAL4 ou GAL4 for difícil, tente realizar experimentos de resgate usando esses alelos pré-existentes ou linhas RNAi e drivers de GAL4 onipresentes ou específicos do tecido, conforme descrito92 (ref).

3. realizando análise funcional da variante humana de interesse in vivo na Drosophila

Nota: realize uma análise baseada em resgate (seção 3,1), bem como estudos de superexpressão (seção 3,2) usando as ferramentas coletadas ou geradas na seção 2 para avaliar as conseqüências da variante de interesse in vivo na Drosophila. Considere a utilização de ambas as abordagens, uma vez que os dois são complementares.

  1. Realizando análises funcionais através de experimentos baseados em resgate
    Nota: Experimentos heterologosos baseados em resgate emDrosophilausando proteínas humanas determinam se a função molecular dos dois genes ortológicos foram conservadas sobre ~ 500 milhões anos de evolução. Eles também avaliam a função da variante no contexto da proteína humana63. Embora não tenha sido relatada uma análise sistemática estudando centenas de pares de genes, várias dúzias de humanos e mamíferos (por exemplo, mouse) são capazes de substituir a função deDrosophilaGenes13.
    1. Na aproximação salvamento-baseada, determine primeiramente se há os fenótipos óbvios, scorable, e reprodutíveis em mutantes de LOF no ortolog da mosca antes de avaliar funções das variações.
      Nota: a literatura precedente no gene da mosca é um bom lugar à mina dos dados primeiramente, e pode ser encontrada usando as bases que incluem FlyBase e PubMed. Bancos de dados adicionais como MARRVEL, Monarch Initiative e Gene2Funcion também são úteis na coleta dessas informações.
    2. Realize uma pesquisa global de fenótipos pontuáveis em homozygous e hemizygous (T2A-GAL4 alelo sobre uma deficiência cromossomática definida molecularmente animais, especial se o alelo T2A-GAL4 é a primeira mutação a ser caracterizada para um gene específico. Avalie os fenótipos como letalidade, esterilidade, longevidade, morfológica (por exemplo, tamanho e morfologia do olho) e comportamento (por exemplo, corte, fuga, escalada e defeitos de sensibilidade do estrondo).
      Nota: se não houver fenótipos principais identificados a partir desta tela primária, fenótipos mais sutis, como defeitos neurológicos medidos por gravações eletrofisiológicas, podem ser usados se forem altamente reprodutíveis e específicos. Como exemplo, os estudos funcionais que utilizam o electrorretinograma (ERG) são descritos na etapa 3.2.3. Se houver falha na detecção de qualquer fenótipo pontuáveis, mova-se para a seção 3,2 e realize o estudo funcional baseado em superexpressão.
    3. Uma vez que um phenotype pontuáveis é identificado no mutante da mosca LOF, teste se o cDNA humano da referência pode substituir a função do ortólogo da mosca tentando usar o cDNA humano para resgatar a linha da mosca do mutante. O ensaio fenotípico a ser realizado aqui depende dos resultados da etapa 3.1.2 e será específico para o gene que está sendo estudado.
      Nota: se a "humanização" do gene Fly é bem sucedida, há agora uma plataforma para comparar a eficiência de resgate para a variante de interesse em comparação com a contraparte de referência. O salvamento visto com o cDNA humano da referência não tem que ser perfeito. O salvamento parcial do phenotype do mutante da mosca usando um cDNA humano ainda fornece um ponto de referência para executar estudos comparativos usando a tensão humana variante do cDNA.
    4. Usando o sistema do ensaio selecionado na etapa 3.1.2, compare o salvamento observado com o cDNA humano da referência ao salvamento observado com o cDNA variante do ser humano para determinar se a variação do interesse tem conseqüências no gene do interesse.
      Nota: se o cDNA variante humano executa pior do que o alelo de referência, isso sugere que a variante de interesse é deletéria para a função protéica. Se a variante e a referência não puderem ser distinguidas funcionalmente, então 1) o alelo pode ser um isomorph (uma variante que não afete a função proteica) ou 2) o ensaio não é suficientemente sensível para detectar diferenças sutis.
    5. Se a variante for encontrada como um alelo deletério, avalie ainda mais a expressão e a localização intracelular das proteínas de referência e variantes de interesse in vivo via Western blot, coloração por imunofluorescência ou outros métodos93.
      Nota: se o cDNA UAS-Human é gerado de um clone aberto em um vetor de PGW-ha. ATTB, use um anticorpo anti-ha para executar estes ensaios bioquímicos e celulares. Se o clone original é um clone fechado, teste se os anticorpos comerciais de encontro às proteínas humanas podem ser usados para estes ensaios. Uma diferença nos níveis de expressão e localização intracelular pode revelar como a variante de interesse afeta a função protéica.
  2. Realizando análises funcionais através de estudos de superexpressão
    Nota: a superexpressão Ubiquitous ou tecido-específica de cDNAs humanos em moscas do tipo Wild-Type pode fornecer a informação que é complementar às experiências salvamento-baseadas discutidas na seção 3,1. Enquanto os ensaios baseados em resgate são projetados principalmente para detectar variantes de LOF (amorphic, hipomófico), os ensaios baseados em superexpressão também podem revelar variantes de ganho de função (GOF) que são mais difíceis de avaliar (hipermórficas, antimórfica, neomórfica).
    1. Selecione um conjunto de drivers GAL4 para sobre-expressão os cDNAs humanos de interesse. Um número de motoristas onipresente e tecido-/Stage-specific GAL4 está disponível dos centros de estoque públicos (por exemplo, bdsc), alguns de que são usados mais freqüentemente do que outro. Primeiro foco em motoristas onipresentes e fenótipos facilmente pontuáveis (letalidade, esterilidade, fenótipos morfológicos), em seguida, passar para os condutores específicos do tecido e fenótipos mais específicos.
      Observação: valide a expressão de drivers GAL4 com uma linha de repórter (por exemplo, UAS-GFP) para confirmar os padrões de expressão antes de usar nos experimentos.
    2. Expresse os cDNAs humanos de referência e variantes usando o mesmo driver a mesma condição (por exemplo, temperatura) cruzando 3-5 fêmeas virgens da linha GAL4 (por exemplo, ey-GAL4 para expressão de disco imaginal do olho) com 3-5 moscas masculinas das linhas UAS [por exemplo, UAS-TBX2 (+) ou UAS-TBX2 (p. R305H) para o exemplo mostrado na secção 4,2] num único frasco para injetáveis.
      1. Transfira as cruzes cada 2-3 dias para ter muitos animais que eclosing de uma única Cruz.
    3. Examine a progêia e detecte quaisquer diferenças entre as cepas de referência e variante (por exemplo, morfologia ocular) um microscópio de dissecção. A imagem voa usando uma câmera unida a um microscópio da dissecção para documentar o phenotype.
      Nota: se um phenotype é visto somente na referência mas não na linha variante, a seguir a variação pode ser um alelo bloqueia ou um amorfos forte. Se o phenotype é visto em ambos os genótipos mas a referência causa um defeito mais forte, a seguir a variação pode ser um alelo bloqueia suave-à-fraco. Se a referência não mostra um phenotype ou exibe somente um phenotype fraco mas a variação mostra um defeito forte, a seguir a variação pode ser um alelo de GOF.
    4. Se um fenótipo não é visto em condições de cultura padrão (RT ou a 25 ° c, em seguida, definir as cruzes em diferentes temperaturas variando 18-29 ° c, uma vez que o sistema UAS/GAL4 é conhecido por ser sensível à temperatura64,65). Normalmente, a expressão de transgenes UAS é maior em temperaturas mais elevadas.
  3. Realizar estudos funcionais adicionais relacionados com os genes e proteínas de interesse.
    Nota: Além do que examinar defeitos gerais, um sistema do ensaio pode ser selecionado para sondar em funções moleculars do gene e da variação. Em um exemplo discutido nos resultados representativos (TBX2caso), as gravações do ERG foram usadas para determinar efeitos da variação na função do fotorreceptor, desde que o gene da mosca do interesse (bifid) foram estudados extensivamente no contexto do desenvolvimento do sistema visual. Protocolos detalhados para o ERG emDrosophilapode ser encontrado como publicado anteriormente66,67,68.
    1. Gere moscas para testar defeitos funcionais no sistema visual. Cruze fêmeas virgens da linha rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 para machos com transgenes de referência ou variante de cDNA UAS-Human para expressar as proteínas humanas de interesse nos fotorreceptores R1-R6.
      Nota: Cross 3-5 Virgin fêmeas para 3-5 macho voa em um único frasco e transferir as cruzes a cada 2-3 dias para ter muitos animais eclosing de uma única Cruz. Todas as cruzes devem ser mantidas em uma incubadora ajustada na temperatura experimental para obter resultados consistentes.
    2. Uma vez que as moscas começam a Eclose (a 25 ° c, ~ 10 dias após a definição da Cruz inicial), reúna a progêia (Rh1-GAL4/+; UAS-Human cDNA/+) em frascos frescos e colocá-los de volta para a incubadora definido na temperatura experimental para um adicional de 3 dias para o sistema visual para amadurecer.
      Nota: embora o ERG possa ser executado em 1-2 moscas velhas do dia, as moscas recentemente pupários podem ter grandes flutuações em seu sinal do ERG. Se for desejado examinar um fenótipo dependente da idade, essas moscas podem ser envelhecidas por várias semanas, desde que sejam regularmente (por exemplo, a cada ~ 5 dias) transferidas para um novo frasco para evitar o afogamento em alimentos molhados.
    3. Prepare as moscas para a gravação de ERG, primeiro anestesiando as moscas usando CO2 ou colocando-os em um frasco no gelo. Cole delicadamente um lado da mosca em uma corrediça de vidro do microscópio para imobilizá-los.
      Nota: as moscas múltiplas da referência e da variação podem ser coladas sobre a um único slide. Coloque todas as moscas em aproximadamente a mesma orientação com um olho sendo acessível para o eletrodo de gravação. Tenha cuidado para não obter cola no olho e deixar o Proboscis livre.
    4. Prepare os eletrodos de gravação e referência. Coloc um capilar de vidro de 1,2 milímetros em um extrator da agulha e ative-o. Quebre o tubo capilar para obter dois eletrodos cônicos afiados. Os eletrodos resultantes devem ser ocos e ter diâmetros finais de < 0,5 mm.
    5. Encha os capilares com solução salina (100 mM NaCl), certificando-se de que não há bolhas de ar. Deslize os capilares de vidro sobre os eletrodos de fio de prata (tanto o eletrodo de gravação e eletrodo de referência, ver Figura 4) e fixar os capilares no lugar.
    6. Configure o estimulador e o amplificador. Um set-up detalhado pode ser encontrado em Lauwers, et al.67. A UDN Drosophila Mosc set-up consiste em equipamentos listados na seção de materiais.
      1. Defina o amplificador para 0,1 Hz Filtro passa-alta, 300 Hz Filtro passa-baixa, e 100 ganho.
      2. Defina o estimulador para 1 s período, 500 MS largura de pulso, 500 MS pulso atraso, modo de execução, e 7 amp.
      3. Prepare a fonte luminosa para a fotoestimulação. Use uma fonte luminosa do halogênio para ativar os photoreceptors da mosca.
      4. Prepare o software de gravação em um computador conectado à set-up do ERG. Crie um protocolo de estimulação com o modelo de aquisição "eventos de comprimento fixo" e duração de 20 s.
    7. ACCLIMATE as moscas para completar a escuridão antes de iniciar gravações ERG. Coloque as moscas em escuridão completa por pelo menos 10 min antes de iniciar o experimento.
      Nota: uma vez que as moscas não conseguem detectar luz vermelha, use uma fonte de luz vermelha durante o período de habituação escura.
    8. Coloque o slide contendo as moscas no aparelho de gravação e mova os Micromanipuladores carregando os eletrodos de referência e de gravação para um ponto próximo à mosca de interesse no slide. Observe a ponta do eletrodo e coloque cuidadosamente o eletrodo de referência no tórax da mosca (penetre a cutícula). Uma vez que o eletrodo de referência está estavelmente inserido, coloque o eletrodo de gravação na superfície do olho.
      Nota: a posição exata deste eletrodo de referência não tem um impacto importante no sinal ERG. O eletrodo de gravação deve ser colocado na superfície do olho, uma vez que o ERG é uma gravação em potencial de campo, em vez de uma gravação intracelular. A quantidade adequada de pressão aplicada ao eletrodo de gravação provoca uma pequena ondulação sem penetrar no olho.
    9. Desligue todas as luzes por mais 3 min para aclifazer as moscas para o ambiente escuro.
    10. Configurar o software de gravação e iniciar a gravação do sinal. Se usar uma fonte luminosa do halogênio com obturador manual, gire sobre a fonte luminosa com o obturador fechado. Comece a gravar o sinal.
    11. Expor os olhos da mosca à luz abrindo e fechando o obturador cada 1 s para a duração de 20 s de uma única corrida.
      Nota: o on/off da fonte luminosa do halogênio pode ser controlado manualmente ou programado para tornar-se automatizado usando uma fonte luminosa branca do diodo emissor de luz. O ERG mais robusto e de confiança pode ser obtido usando uma fonte luminosa do halogênio comparada a um diodo emissor de luz branco, provável devido ao espectro claro mais largo emitido da fonte luminosa do halogênio.
    12. Registre ERGs de todas as moscas que são montadas na corrediça de vidro. Realize ERGs a partir de 15 moscas por genótipo por condição.
      Nota: alguns parâmetros que podem ser alterados para encontrar uma condição que mostra diferenças robustas entre os cDNAs de referência e variantes podem incluir temperatura, idade ou condições ambientais (por exemplo, criados em ciclo claro-escuro ou luz/escuridão constante).
    13. Executar a análise de dados: Compare os ERGs da referência, variante e controles para determinar se há diferenças. Avalie os dados do ERG para mudanças em transientes, depolorization, off-Transients, e repolarização69 (Figura 4B).
      Nota: a despolarização e a repolarização refletem a ativação e a inativação da cascata de fototransdução dentro dos FOTORRECEPTORES, enquanto que em-e off-transientes são medidas das atividades das células pós-sinápticas que recebem sinais de os fotorreceptores. A diminuição da amplitude e a cinética alterada de repolarização estão frequentemente associadas a defeitos com a função e a saúde do fotorreceptor, enquanto os defeitos em e fora-transientes são encontrados em mutantes com defeito no desenvolvimento, função ou manutenção da sinapse 70.
    14. Em cima da identificação das diferenças em fenótipos do ERG com superexpressão da referência contra cDNAs humanos variantes, determine se este phenotype eletrofisiológicos é associado com os defeitos estruturais e ultrastructural nos fotorreceptores e em seus sinapses realizando análise histológica e microscopia eletrônica de transmissão.
      Nota: uma discussão mais adicional na interpretação de defeitos do ERG e da análise estrutural/ultrastructural foi descrita previamente69.

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Representative Results

Estudo funcional de de novo variante missense em EBF3 ligado a fenótipos de neurodesenvolvimento
Em um macho dos anos de idade 7 com os fenótipos do neurodesenvolvimento que incluem a hipotonia, a ataxia, o atraso desenvolvente global, e a desordem de discurso expressivo, os médicos e os geneticistas humanos nos institutos nacionais da saúde projeto das doenças undiagnosed (UDP) identificou uma variante de missense de novo (p. R163Q) em EBF3 (Early b-Cell factor 3)15, um gene que codifica um fator de transcrição da família Coe (Collier/olfactory-1/Early b-Cell factor). Este caso foi submetido ao MOSC de UDN em março 2016 para estudos funcionais. Para avaliar se este gene era um bom candidato para este caso, o MOSC recolheu a informação genética e genomic humana de OMIM, de ClinVar, de ExAC (expandido agora a gnomAD), de Geno2MP, de DGV, e de Decipher. Além disso, os genes ortológicos nas principais espécies de MO foram identificados por meio da ferramenta DIOPT. A expressão gênica e a informação fenotípica de bases de dados individuais do MO (por exemplo, Wormbase, FlyBase, ZFIN, MGI) foram obtidas. As análises de informática realizadas para EBF3 e outros estudos pioneiros na UDN Mosc formaram a base para o desenvolvimento posterior do recurso marrvel30.

As informações coletadas utilizando essa metodologia indicaram que EBF3 não estava associada a qualquer distúrbio genético humano conhecido no momento da análise, e concluiu-se que a variante p. R163Q foi um bom candidato com base nas seguintes informações. (1) Esta variante não havia sido relatada anteriormente em bancos de dados populacionais de controle (ExAC) e na base de dados populacionais de doenças (Geno2MP), indicando que esta é uma variante muito rara. (2) com base no ExAC, a pontuação de pLI (probabilidade de intolerância ao LOF) deste gene é 1, 0 (os escores de pLI variam de 0,00-1,00). Isto indica que há uma pressão seletiva de encontro às variações de LOF neste gene na população geral e sugere que o haploinsuficiência deste gene possa causar a doença. Para obter mais informações sobre a Pontuação do PLI e sua interpretação, um artigo do tutorial marrvel que acompanha o Jove31 e artigos relacionados fornece detalhes30,71.

A variante p. R163Q também foi considerada um bom candidato porque (3) está localizada no domínio de ligação do DNA evolutivamente conservado desta proteína, sugerindo que pode afetar a ligação ao DNA ou outras funções protéicas. (4) o resíduo de p. R163 é conservado evolutivamente de C. elegans e de Drosophila aos seres humanos, sugerindo que possa ser crítico para a proteína funcional através das espécies. (5) EBF3 ortólogos foram implicados no desenvolvimento neuronal no mo Múltiplo72 including C. elegans73, Drosophila74, Xenopus75, e ratos76. (6) durante o desenvolvimento cerebral em camundongos, Ebf3 foi mostrado para funcionar a jusante de ARX (aristaless-Related Homebox)77, um gene associado com várias epilepsia e deficiência intelectual síndromes em seres humanos78. Daqui, estes dados junto sugerem que EBF3 seja altamente provável ser crucial ao neurodesenvolvimento humano e que a variação de p. R163Q pode ter conseqüências funcionais.

Para avaliar se p. R163Q afeta a função EBF3, uma linha T2A-GAL4 para o nó (KN; o ortólogo da mosca do EBF3humano79) foi gerada através do RMCE de uma inserção mímica intronic da codificação15. A linha kNT2A-GAL4 é recessiva letal e não complementa a letalidade de um alelo kN clássico (kNCol-1), bem como deficiência definida molecularmente que abrange kN [DF (2R) BSC429]80 . Os testes padrões da expressão do GAL4 refletiram também testes padrões previamente relatados da expressão do kN no cérebro as well as no disco imaginal15da asa. As moscas transgênicas de UAS foram geradas para permitir a expressão de referência e variante EBF3 cDNA humana, bem como o tipo Wild-Fly kN cDNA. Todas as três proteínas foram marcadas com um C-terminal 3xHA tag. Importante, UAS Wild-tipo Fly kN (kN+) ou referência Human EBF3 (EBF3+) transgenes resgatou a letalidade de kNT2A-GAL4/DF (2R) BSC429 a uma extensão semelhante ( Figura 3C, painel esquerdo)81.

Em contraste, UAS-Human EBF3 transgene com a variante p. R163Q (EBF3p. R163Q) não foi capaz de resgatar este mutante, sugerindo que a variante de p. R163Q afete a função EBF3 in vivo15. Curiosamente, quando avaliados usando um anticorpo anti-HA, a proteína EBF3p. R163Q foi expressa com sucesso nos tecidos de mosca, e seus níveis e localização subcelular (principalmente nuclear) foram indistinguíveis dos de EBF3+ e KN+. Isto sugere que a variação não está causando um phenotype de LOF devido à instabilidade da proteína ou ao mis-Localization. Para avaliar ainda mais se a variante p. R163Q afetou a função de ativação transcricional de EBF3, foi realizado um ensaio de repórter com base em luciferase em HEK293 células15. Este experimento em células humanas cultivadas revelou que a variante EBF3p. R163Q não ativou a transcrição dos construtos do repórter, apoiando o modelo de LOF obtido a partir de experimentos de Drosophila .

Paralelamente aos estudos experimentais, colaborações com médicos, geneticistas humanos e conselheiros genéticos no BCM levaram à identificação de dois indivíduos adicionais com sintomas semelhantes. Um paciente carregava a variante de p. R163Q idêntica, e outra carregava uma variante missense que afetou o mesmo resíduo (p. R163L). A variante p. R163L também não conseguiu resgatar a mosca kN mutante93 sugerindo que este ALELO também afetou EBF3 função. Curiosamente, este trabalho foi publicado back-to-back com dois estudos independentes de genética humana que relataram indivíduos adicionais com de novo missense, nonsense, Frameshift, e variantes de splicing em EBF3 ligado a similares fenótipos de neurodesenvolvimento82,83. Posteriormente, foram publicados três artigos adicionais relatando casos adicionais de variantes de de novo EBF3 e exclusão de número de cópia84,85,86. Esta novela síndrome do neurodesenvolvimento é conhecida agora como a hipotonia, a ataxia, e a síndrome atrasada do desenvolvimento (HADDS, MIM #617330) na herança Mendelian em linha no homem (OMIM, uma base de dados autoritária para relacionamentos do genótipo-phenotype nos seres humanos).

Estudo funcional da variante missense dominantemente herdada em TBX2 vinculado a um distúrbio do desenvolvimento cardiovascular e esquelético sindrômico
Em uma família pequena afetada com os espectros de sobreposição do dysmorphism craniofacial, das anomalias cardíacas, da malformação esqueletal, da deficiência imune, das anomalias da glândula endócrina, e do prejuízo desenvolvente, o local clínico do Duque de UDN identificou uma variação missense (p. R20Q) em TBX2 que segreca com fenótipos de doença87. Três (filho, filha, mãe) fora dos quatro membros da família são afetados por esta circunstância, e o filho exibiu o phenotype o mais severo. Clìnica, encontrou um diagnóstico da "Síndrome completa de DiGeorge", uma circunstância causada frequentemente pelo haploinsuficiência de TBX1. Quando não havia nenhuma mutação identificada em TBX1 nesta família, os clínicos e os geneticistas humanos focalizaram em uma variação em TBX2, desde que os estudos precedentes nos ratos mostraram que estes genes têm funções de sobreposição durante o desenvolvimento88 . TBX1 e TBX2 ambos pertencem à família T-Box (TBX) de fatores de transcrição que podem atuar como repressores transcripcionais, bem como ativadores, dependendo do contexto.

Anteriormente, variantes em 12 dos 17 membros dos genes da família TBX estavam ligadas a doenças humanas. O MOSC decidiu prosseguir experimentalmente esta variante com base nas seguintes informações recolhidas através de MARRVEL e outros recursos. (1) Esta variante foi relatada apenas uma vez em uma coorte de ~ 90.000 "controle" indivíduos em gnomAD (esta variante foi filtrada em uma visão padrão, provavelmente devido a baixa cobertura leituras). Considerando a apresentação fenotípica mais suave da mãe, isto pode ainda ser considerado como uma variação rara que possa ser responsável para os phenotypes da doença. (2) os escores de pLI de TBX2 em exac/gnomad são 0,96/0,99, que é alto (máximo = 1, 0). Além disso, o o/e (observado/esperado) LOF Pontuação em gnomAD é 0, 5 (apenas 1/18.6 esperada variante LOF é observada em gnomAD). Estes números sugerem que as variações de LOF neste gene estejam selecionadas de encontro na população geral.

Adicionalmente, (3) o p. R20 é conservado evolutivamente de C. elegans e de Drosophila aos seres humanos, sugerindo que este possa ser um resíduo importante para a função TBX2. (4) vários programas prevêem que a variante é provavelmente prejudicial (poliphen: possivelmente/provavelmente prejudicial, SIFT: deletério, Pontuação CADD: 24,4, REVEL Pontuação: 0,5). (5) os mutantes do MO exibem defeitos nos tecidos afetados nos pacientes (por exemplo, ratos do Knockout que exibem defeitos no sistema cardiovascular, sistemas digestivos/gastrary, craniofacial, membros/dígito). Daqui, junto com as ligações biológicas entre TBX1 e TBX2 e as ligações fenotípicas entre estes pacientes e a síndrome de DiGeorge, era óptima executar estudos funcionais das variações neste gene usando a Drosophila.

Para avaliar se a variante de p. R20Q afeta a função TBX2 , uma linha T2A-GAL4 em bífida (bi; a Drosophila ortólogo de Human TBX2), foi gerada via RMCE de uma codificação imitando intrônico (Figura 2)87. Este alelo, biT2A-GAL4, era pupal recessive letal e comportado como um mutante forte do LOF, similar aos alelos de bi LOF previamente relatados (por exemplo, bid2, biD4; Figura 2 E). a letalidade destes alelos bi clássicos e recém-gerados foi resgatada por uma construção de resgate genómico ~ 80 KB carregando todo o locus bi , indicando que esses reagentes são realmente limpos LOF alelos. O padrão de expressão de GAL4 na linhabi T2A-GAL4 também combinou bem com padrões previamente relatados de expressão de bi em vários tecidos, inclusive no disco imaginal da asa (Figura 2D).

Paralelamente, foram geradas linhas UAS-transgênicas para TBX2 carregando as sequências de referência ou variante (p. R20Q). Infelizmente, nem transgene foi capaz de resgatar a letalidade da linha biT2A-GAL4 . Importante, um selvagem-tipo mosca UAS-bi transgene também não conseguiu resgatar o biT2A-GAL4 alelo, provavelmente devido à dosagem-sensibilidade deste gene. Na verdade, a superexpressão de UAS-bi+ e UAS-TBX2+ causou algum grau de letalidade quando superexpressa em um animal de tipo selvagem. Este efeito tóxico da superexpressão bi/TBX2 foi utilizado como ensaio funcional para avaliar se a variante p. R20Q pode afetar a função TBX2. Desde que o gene da Drosophila bi tem sido extensivamente estudado no contexto do sistema visual [o gene também é conhecido como cego optomotor (OMB)], os fenótipos relacionados ao sistema visual foram investigados extensivamente. Quando a referência TBX2 foi expressa usando um driver ey-GAL4 que expressa UAS-transgenes no olho e partes do cérebro relevantes para o sistema visual, ~ 85% letalidade (Figura 3C, painel direito) e significativa redução do tamanho dos olhos (Figura 4B). Este phenotype era mais forte do que o phenotype observado quando um selvagem-tipo transgene do UAS-bi da mosca foi expressado, sugerindo que o TBX2 humano fosse mais prejudicial à mosca quando overexpressado.

Curiosamente, o p. R20Q TBX2 foi menos potente em causar letalidade (Figura 3C, painel direito) e induzir um fenótipo ocular pequeno (Figura 4B) utilizando o mesmo condutor a condição idêntica87, sugerindo que a variante afeta a função protéica. Além disso, a função dos FOTORRECEPTORES que superexpressam a referência e a variante TBX2 usando um excitador GAL4 diferente, (Rh1-GAL4) que expresse especificamente transgenes de UAS em fotorreceptores R1-R6, REVELARAM que a variação TBX2 exibiu um muito o phenotype mais suave do ERG comparado ao TBX2 da referência (Figura 4B)87. Curiosamente, a maior parte da proteína p. R20Q TBX2 ainda foi encontrada no núcleo, semelhante à proteína de referência, sugerindo que a variante não afetou a localização nuclear. Um ensaio da repressão do transcricional de luciferase-baseado em pilhas de HEK293T mostrou que o p. R20Q não podia reprisificar eficazmente a transcrição de um constructo do repórter com os locais palindromic da T-caixa87. Além disso, reduções nos níveis proteicos de TBX2p. R20Q foram observadas em comparação com TBX2+, sugerindo que a variante pode afetar a tradução ou estabilidade protéica de TBX2, o que, por sua vez, afeta sua abundância dentro de uma célula.

Os pacientes adicionais com variações raras em TBX2 foram identificados por clínicos no local clínico do Duque de UDN paralelamente com estes estudos experimentais.  Um menino dos anos de idade 8 com uma variação de de novo missense (p. R305H) de uma família não relacionada exibiu muitas das características encontradas na primeira família87. Os estudos funcionais adicionais em Drosophila e em linhas de pilha humanas revelaram que a variação de p. R305H igualmente afeta TBX2 a função e os níveis da proteína, sugerindo fortemente que os defeitos neste gene fundamentam provavelmente muitos fenótipos encontrados nas duas famílias. Esta desordem foi curadoria recentemente como "anomalias vertebrais e deficiência orgânica variável da pilha do endócrino e do T" (VETD, mim #618223) em OMIM. A identificação de indivíduos adicionais com variações prejudiciais em TBX2 com fenótipos de sobreposição é crítica a compreender o espectro cheio de relações do genótipo-phenotype para este gene na doença humana.

Figure 1
Figura 1 : Esquema de injeção e cruzamento para gerar linhas UAS-Human cDNA e T2A-GAL4. (A) geração de transgenes de cDNA UAS-humanos através de microinjeções e cruzes. O esquema de cruzamento para integrar os transgenes em um segundo local de encaixe do cromossoma (VK37) usando moscas masculinas na primeira e na segunda geração é mostrado como um exemplo. Após a injeção do cDNA humano φc31 construção transgênica (PGW-ha. ATTB) em embriões precoces que contenham uma fonte de germline de φc31 integrase (rotulado com 3xp3-GFP e 3xp3-RFP) e VK37 docking site [rotulado com um amarelo+ (y+ ), os eventos transgênicos podem ser seguidos com o minigeno branco+ (w+) que está presente no vetor transgênico. Recomenda-se cruzar para fora o φC31 integrase selecionando de encontro às moscas com GFP e RFP. O estoque estável final pode ser mantido como homozigotos ou como um estoque equilibrado se o cromossoma carreg um segundo local-mutação de batida letal/estéril. A presença de mutações letais/estéreis do segundo local em construções transgênicas geralmente não afeta o desfecho dos estudos funcionais, desde que estes transgenes sejam utilizados em um estado heterozoszygous (Figura 3). (B) geração de linhas T2A-GAL4 através de microinjeção e cruzes. O esquema do cruzamento para converter uma segunda inserção do mímico do cromossoma em um elemento T2A-GAL4 é mostrado como um exemplo. Por microinjetar um vetor de expressão para φC31 integrase e RMCE vector para T2A-GAL4 (pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-HSP70, um quadro de leitura apropriado para o mímico de interesse é selecionado. Veja os seguintes papéis para detalhes57,59 em embriões que carreg um mímico em um intron de codificação no gene do interesse, um pode converter o mímico original em uma linha T2A-GAL4. Figura 2 A mostra um diagrama esquemático da conversão RMCE. O evento de conversão pode ser selecionado por triagem contra o marcador y+ no original imitar Cassette60. Uma vez que RMCE pode ocorrer em duas direções, apenas 50% do evento de conversão bem-sucedida leva à produção bem-sucedida de GAL4, que pode ser detectada por um transgene de repórter UAS-GFP na próxima geração. O estoque estável final pode ser mantido como homozigotos ou como um estoque equilibrado se o LOF do gene é letal/estéril. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Conversão de elementos mímicos em linhas T2A-GAL4 via RMCE. (A) a integrase de φc31 facilita o recombinação entre os dois locais do attp na mosca (parte superior) e os dois locais de ATTB que flanqueam uma gaveta T2A-GAL4 mostrada como um vetor circular (parte inferior). (B) eventos de RMCE bem-sucedidos levam a uma perda de um marcador selecionável (amarelo +) e a inserção da gaveta T2A-GAL4 na mesma orientação do gene de interesse. Uma vez que o evento RMCE pode acontecer em duas orientações, apenas 50% da reação RMCE produz um produto desejado. Um produto RMCE inserido na orientação oposta não funcionará como um alelo gene-Trap ou expressar GAL4. A direcionalidade do constructo deve ser confirmada através do sequenciamento de Sanger. (C) a transcrição (parte superior) e a tradução (parte inferior) do gene do interesse conduzem à geração de um mRNA truncado e de uma proteína devido ao sinal de Polya atual na extremidade 3 ' da gaveta T2A-GAL4. O T2A é um sinal de salto Ribossome, que permite que o Ribossome para parar e reiniciar a tradução após este sinal. Isso é usado para gerar um elemento GAL4 que não está covalentemente anexado ao produto de gene truncado de interesse. O GAL4 entrará no núcleo e facilitará a transcrição de transgenes que estão o controle de elementos de UAS. UAS-GFP pode ser usado como um repórter da expressão de Gene, e o cDNA UAS-humano pode ser usado para experiências do salvamento através do gene "humanization". (D) mostrado é um exemplo de um elemento T2A-GAL4 na expressão de condução bi de UAS-GFP (parte superior). Esse padrão de expressão se assemelha a uma linha de armadilha de potenciador gerada anteriormente para o mesmo gene (biOMB-GAL4; Bottom). (E) comparação do ALELO T2A-GAL4 de bi com ALELOS de bi LOF previamente relatados. Este número foi adotado e modificado a partir de publicações anteriores57,87. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Análise funcional de variantes humanas usando estudos baseados em resgate (à esquerda) e com base em superexpressão (direita). (A) (painel esquerdo): a função de EBF3 variants foi avaliada com uma análise salvamento-baseada do alelo da mosca Knot (KN) LOF que focalizam na letalidade/viabilidade; (painel direito): a função de variantes em TBX2 foi avaliada pela realização de superexpressão de transgenes TBX2 humanos em moscas selvagens, com foco na letalidade/viabilidade, morfologia ocular e fenótipos de eletrofisiologia (Figura 4) . (B) esquemas de cruzamento para obtenção das moscas a serem testadas nos estudos funcionais. É aconselhável usar sempre um elemento UAS neutro (por exemplo, UAS-lacZ, UAS-GFP) como um experimento de controle. (C) resultados representativos de estudos funcionais de EBF3p. R163Q e TBX2p. R20Q variantes, respectivamente, juntamente com os experimentos de controle adequados que são necessários para interpretar os resultados. Tanto a análise baseada em resgate quanto os estudos de superexpressão revelam que as variantes se comportam como alelos amorfos ou hipomórficos. Os dados de letalidade/viabilidade mostrados aqui são baseados em dados experimentais apresentados em publicações anteriores15,87. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Análise funcional de uma variação missense rara no TBX2 humano baseado na morfologia e no electrorretinograma do olho em Drosophila. (A) uma imagem esquemática que mostra a colocação típica de eletrodos de registro e de referência no olho mosca, juntamente com um registro de electrorretinograma representativo com quatro componentes principais (em-transiente, despolarização, off-transiente, repolarização). (B) TBX2 Variant (p. R20Q) funciona como um alelo parcial de LOF baseado em estudos da sobreexpressão no olho da mosca usando GAL4 excitadores específicos ao sistema visual (ey-GAL4 e Rh1-GAL4). Isto mostrou que a referência TBX2 causou um phenotype morfológico e eletrofisiológicos forte comparado à proteína variante. (Painéis superiores): uma redução severa no tamanho do olho é considerada em cima da expressão excessiva de UAS-TBX2+ com ey-GAL4. UAS-TBX2p. R20Q. Conduzido com ey-GAL4 igualmente causa um olho menor, mas o phenotype é muito mais suave. (Painéis inferiores): quando UAS-TBX2+ é expressado nos fotorreceptores R1-R6 do núcleo usando Rh1-GAL4, há uma perda de em-e fora-transientes, de despolarização reduzida, e de grande despolarização prolongada anormal após o phenotype potencial (PDA), que não é visto em moscas de controle. Estes fenótipos não são tão severos quanto quando UAS-TBX2p. R20Q é expressado usando o mesmo Rh1-GAL4. Este número foi adotado e modificado a partir de publicações anteriores69,87. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Raros e não diagnosticados
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http://exac.broadinstitute.org/
http://gnomad.broadinstitute.org/
http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/#/
http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home
https://decipher.sanger.ac.uk/
Ferramenta de identificação ortologar O DIOPT https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
Modelo de organismo
Bancos de dados e biomédicos
Pesquisa de literatura		 WormBase (C elegans)
FlyBase (Drosophila)
ZFIN (zebrafish)
MGI (mouse)
Pubmed		 https://www.wormbase.org
http://flybase.org
https://zfin.org
http://www.informatics.jax.org
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
Genética e proteínas
bancos de dados de interação		 String
Névoa		 https://string-db.org
http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/
Estrutura proteica
bancos de dados e
ferramentas de modelagem		 A WWPBD
SWISS-MODELO
Modeller
Phyre2 		http://www.wwpdb.org
https://swissmodel.expasy.org/
https://salilab.org/modeller/
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2
Matchmaking paciente
Plataformas		 Troca de matchmaker
O GeneMatcher
Arquivo AGHA
Matchbox
Decifrar
MyGene2
Fenome central		 http://www.matchmakerexchange.org
https://www.genematcher.org
https://mme.australiangenomics.org.au/#/home
https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox
https://decipher.sanger.ac.uk
https://www.mygene2.org/MyGene2
https://phenomecentral.org
Transcrição humana
anotação e cDNA
informações de clone		 Coleção gene mamífero
Ensembl
RefSEQ		 https://genecollections.nci.nih.gov/MGC
http://useast.ensembl.org
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

Tabela 1: recursos on-line relacionados a este protocolo.

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Discussion

Estudos experimentais utilizando Drosophila melanogaster proporcionam um sistema de ensaio robusto para avaliar as consequências das variantes humanas associadas à doença. Isto é devido ao grande corpo do conhecimento e das ferramentas genéticas diversas que foram geradas por muitos investigadores no campo da mosca sobre o século passado89. Assim como qualquer outro sistema experimental, no entanto, é importante reconhecer as advertências e limitações que existem.

ADVERTÊNCIAS associadas à mineração de dados
Embora a primeira etapa neste protocolo seja para minar bases de dados para a informação que pertence a um gene do interesse, é importante usá-la somente como um ponto começar. Por exemplo, embora na predição de silico da função Variant forneça insights valiosos, esses dados sempre devem ser interpretados com cautela. Há alguns exemplos em que todos os algoritmos principais prevêem que uma variação humana é benigna, contudo os estudos funcionais em Drosophila demonstraram claramente a natureza prejudicial de tal variação24. Similarmente, embora as interações proteína-proteína, a coexpressão, e os dados de modelagem estrutural sejam todas as partes de informação perspicazes, pode haver a informação pseudo-positiva e pseudo-Negative atual nestes conjuntos de dados do grande-Omics. Por exemplo, algumas das interações proteína-proteína previamente identificadas ou previstas podem ser artificiais ou apenas observadas em determinados tipos de células e tecidos.

Além disso, pode haver muitas interações falsas negativas não capturadas nesses conjuntos de dados, uma vez que certas interações proteína-proteína são transitórias (por exemplo, interações enzima-substrato). A validação experimental é fundamental para demonstrar que certos genes ou proteínas geneticamente ou fisicamente interagem in vivo no contexto biológico de interesse. Da mesma forma, as estruturas previstas com base na modelagem de homologia devem ser tratadas como um modelo em vez de estrutura resolvida. Embora esta informação pode ser útil se se descobrir que um aminoácido de interesse está presente em uma parte estruturalmente importante da proteína, dados negativos não exclui a possibilidade de que a variante pode ser prejudicial. Finalmente, algumas das informações previamente relatadas do genótipo-phenotype também devem ser tratadas com cautela, uma vez que algumas informações arquivadas em bancos de dados públicos podem não ser exatas. Por exemplo, algumas informações em bancos de dados de MO baseiam-se em experimentos que foram bem controlados e executados rigorosamente, enquanto outros podem vir de um papel de tela grande sem mais estudos de acompanhamento e controles rigorosos.

"Humanização" experimentos usando T2A-GAL4 estratégia nem sempre bem sucedida
Embora os estudos funcionais baseados em resgate e superexpressão usando cDNAs humanos permitam a avaliação de variantes no contexto da proteína humana, essa abordagem nem sempre é bem-sucedida. Se um cDNA humano da referência não pode resgatar o phenotype do mutante da mosca, há duas explanações prováveis. A primeira possibilidade é que a proteína humana é não funcionais ou reduziu significativamente a atividade no contexto de uma pilha da mosca. Isso pode ser devido a 1) redução da expressão protéica, estabilidade, atividade e/ou localização ou 2) uma falta de compatibilidade com proteínas de mosca que trabalham em um complexo multiprotéico. Uma vez que o sistema UAS/GAL4 é sensível à temperatura, as moscas podem ser levantadas a uma temperatura relativamente alta (por exemplo, 29 ° c) para ver a possibilidade de um resgate nesta condição. Além disso, uma construção de cDNA UAS-Fly e transgene como um controle positivo pode ser gerada. Se a variante de interesse afeta um aminoácido conservado, a variante análoga pode ser introduzida no cDNA mosca para o estudo funcional da variante no contexto do ortolog mosca. Embora isso não seja necessário, ajuda muito o estudo nos casos em que o uso de linhas transgênicas de cDNA humanas dá resultados negativos ou inconclusivos (Figura 3).

A segunda possibilidade é que a expressão da proteína humana cause alguma toxicidade do celular-ou do organismo-nível. Isto pode ser devido à antimórfica (por exemplo, agindo como uma proteína negativa dominante), hipermórfica (por exemplo, demasiada atividade), ou neomorphic (por exemplo, ganho de uma função tóxica nova tal como a agregação da proteína que não está sempre relacionada à função endógena do gene de interesse) efeitos. Neste caso, manter as moscas em uma temperatura baixa (por exemplo, 18 ° c) pode aliviar alguns destes problemas. Finalmente, existem alguns cenários em que a superexpressão de um cDNA mosca não pode resgatar a linha Fly T2A-GAL4 como visto no exemplo TBX2 , provavelmente devido à dependência de dosagem de trito do produto genético. Para evitar a superexpressão de uma proteína de interesse, o gene Fly de interesse pode ser modificado diretamente através de CRISPR, uma construção de resgate genômica pode ser projetada que contenha a variante de interesse, ou experimentos de resgate podem ser realizados usando um alelo LOF21. Para os genes pequenos, "humanizar" a construção de resgate genômica de mosca pode ser considerada para testar variantes humanas que afetam os aminoácidos não conservados24. Em síntese, estratégias alternativas devem ser consideradas quando o experimento de humanização não permite a avaliação funcional da variante de interesse.

Interpretar resultados negativos e positivos
Se 1) tanto a referência e variante humanos cDNAs resgatar os fenótipos mutantes mosca a um grau semelhante e 2) não há diferença observada em todas as condições testadas, então pode-se supor que a variante é funcionalmente indistinguível em Drosophila em vivo. É importante notar, no entanto, que esta informação não é suficiente para descartar que a variante de interesse é não-patogênica, uma vez que o ensaio de Drosophila pode não ser suficientemente sensível ou capturar todas as funções potenciais do gene/proteína de interesse relevantes para os seres humanos. Os dados positivos, por outro lado, são uma forte indicação de que a variante tem consequências prejudiciais na função protéica, mas esses dados sozinhos ainda não são suficientes para reivindicar a patogenicidade. O American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) publicou um conjunto de padrões e diretrizes para classificar variantes em genes associados a doenças humanas em "benigno", "provavelmente benigno", "variante de significado desconhecido (VUS)", "provavelmente patogénico", e "patogénicos"90. Embora essa classificação só se aplique a genes associados à doença estabelecidos e não seja diretamente aplicável a variantes em "genes de significância incerta" (GUS), todos os indivíduos envolvidos em estudos funcionais variantes humanos são fortemente incentivados a aderir a esta diretriz ao relatar a função variante.

Extração de informações biológicas úteis quando fenótipos MO não modelar uma condição de doença humana
É importante ter em mente que os ensaios funcionais baseados em superexpressão têm limitações, especialmente porque alguns dos fenótipos marcados podem ter pouca relevância para a condição de doença de interesse. Da mesma forma, os fenótipos que estão sendo avaliados por meio de experimentos de resgate podem não ter qualquer relevância direta para a doença de interesse. Uma vez que estes experimentos são conduzidos fora dos contextos endógenos em um sistema de invertebrados, eles não devem ser considerados modelos de doença, mas sim como um teste de função gênica usando a Drosophila como um "tubo de ensaio vivo".

Mesmo se o organismo modelo não imitar uma condição de doença humana, fenótipos pontuáveis usados em experimentos de resgate muitas vezes podem fornecer insights biológicos úteis em condições de doença. O conceito de "phenologs (fenótipos homólogos não-óbvios)"91 pode ser usado para determinar ainda mais as conexões moleculares subjacentes entre a Drosophila e os fenótipos humanos. Por exemplo, os fenótipos morfológicos na asa de mosca, tórax, pernas e olhos são excelentes leituras fenotípicos para defeitos na via de sinalização Notch, uma via evolutivamente conservada ligada a muitas desordens congênitas, incluindo defeitos cardiovasculares em seres humanos62. Compreendendo a lógica molecular atrás de determinados fenótipos em Drosophila, é possível identificar as ligações biológicas escondidas entre genes e fenótipos nos seres humanos que não são compreendidos ainda.

Comunicação contínua com colaboradores clínicos
Ao trabalhar com clínicos para estudar a função de uma variante rara encontrada no paciente, é importante estabelecer um forte relacionamento colaborativo. Embora os investigadores biomédicos clínicos e básicos possam compartilhar interesses nos mesmos genes/vias genéticas, há um grande fosso cultural e lingüístico (por exemplo, jargão médico, modelo organismo-específico da Nomenclatura) entre os campos clínicos e científicos. Uma relação forte, baseada na confiança entre os dois partidos pode ser construída com a comunicação extensiva. Além disso, a comunicação bidirecional é fundamental para estabelecer e manter essa relação. Por exemplo, nos dois casos descritos na seção de resultados representativos, a identificação de pacientes adicionais com genótipos e fenótipos semelhantes, bem como o estudo funcional subsequente, foram fundamentais para comprovar a patogenicidade das variantes de interesse. Mesmo com dados funcionais fortes, os investigadores e os clínicos têm frequentemente dificuldades convencer geneticistas humanos que uma variação identificada em "n = 1" casos é a causa verdadeira da doença.

Uma vez que o pesquisador de MO identifica que uma variante de interesse é prejudicial, é fundamental para se comunicar de volta para os colaboradores clínicos o mais rapidamente possível para que eles possam ativamente tentar identificar casos de correspondência por Networking com outros médicos e geneticistas humanos. Ferramentas como Geno2MP [genótipos para fenótipos mendelianos: um banco de dados desidentificado de 9.650 indivíduos matriculados no centro da Universidade de Washington para o estudo de genômica mendeliana41; inclui pacientes e membros da família suspeitos de ter distúrbios genéticos] podem ser pesquisados para avaliar indivíduos que podem ter o mesmo distúrbio. Em seguida, o clínico principal pode ser contatado usando um recurso de mensagens.

Alternativamente, o GeneMatcher pode ser usado, que é um site de matchmaking para clínicos, pesquisadores básicos e pacientes que compartilham interesses nos mesmos genes para identificar pacientes adicionais que carregam variantes raras. Desde que GeneMatcher faz parte de uma maior rede Integrativa de sites de matchmaking chamado Matchmaker Exchange42, bancos de dados adicionais em todo o mundo podem ser pesquisados, incluindo o Australian Genomics Health Alliance paciente Archive, Broad Matchbox , DECIPHER, MyGene2, e PhenomeCentral em uma única submissão do gene de GeneMatcher. Embora a participação no GeneMatcher seja possível como um "pesquisador", recomenda-se que os cientistas básicos utilizem este site com seus colaboradores clínicos, uma vez que a comunicação com outros médicos após um jogo requer certos níveis de Experiência.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a José Salazar, Julia Wang e a Dra Karen Schulze pela leitura crítica do manuscrito. Reconhecemos os Drs. Ning Liu e XI Luo para a caracterização funcional das variantes TBX2 discutidas aqui. O centro de triagem de organismos do modelo de rede de doenças não diagnosticadas foi apoiado pelo fundo comum dos institutos nacionais de saúde (NIH) (U54 NS093793). H. T. C. foi apoiado ainda pelo NIH [CNCDP-K12 e NINDS (1K12 NS098482)], Academy americano do Neurology (concessão da pesquisa do Neuroscience), fundo do Wellcome de Burroughs (concessão da carreira para cientistas médicos), sociedade da neurologia da criança e Fundação da neurologia da criança ( PERF Elterman), e o prêmio de independência antecipada do diretor da NIH (DP5 OD026426). M. F. W. foi apoiado pela Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. foi apoiado pela NIH (R01 DC014932), a Fundação Simons (SFARI Award: 368479), a associação de Alzheimer (novo investigador Research Grant: 15-364099), naman família fundo para a investigação básica, e Caroline Wiess lei fundo para a investigação em Medicina molecular. A microscopia confocal em BCM é apoiada na parte por NIH Grant U54HD083092 ao núcleo do Neurovisualization do centro de pesquisa das inabilidades intelectuais e desenvolventes (IDDRC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator

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Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando <em>Drosophila</em>
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Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H. T., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).

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