O laser de femtossegundo firmemente-focalizado pode entregar a estimulação precisa às pilhas acoplando em uma microscopia confocal permitindo a observação e a fotoestimulação tempo real. A fotoestimulação pode ativar eventos moleculares celulares, incluindo via de sinalização ERK e flashes mitocondriais de espécies reativas de oxigênio.
O controle direto de eventos moleculares definidos celulares é importante para a ciência da vida. Recentemente, os estudos demonstraram que a estimulação do laser do femtossegundo pode simultaneamente ativar várias vias moleculares celulares da sinalização. Neste protocolo, nós mostramos que através do acoplamento do laser do femtossegundo em um microscópio confocal, as pilhas podem ser estimuladas precisamente pelo laser firmemente-focalizado. Alguns processos moleculares que podem ser observados simultaneamente são subsequentemente ativados. Nós apresentamos protocolos detalhados da fotoestimulação para ativar a via de sinalização regulada do sinal extracelular da quinase (Erk) em pilhas de Hela. Os flashes mitochondrial de espécies reactivas do oxigênio (ROS) e outros eventos mitochondrial podem igualmente ser estimulados se focalizando o pulso do laser do femtossegundo em uma determinada estrutura tubular mitochondrial. Este protocolo inclui o pré-tratamento de células antes da fotoestimulação, entregando a fotoestimulação por um flash laser femtossegundo no alvo, e observando/identificando alterações moleculares depois. Este protocolo representa uma ferramenta toda ótica para pesquisas biológicas relacionadas.
A tecnologia de controlar moléculas de sinalização celular é uma parte importante do desenvolvimento da ciência da vida. Tradicionalmente, o método mais comumente utilizado é o tratamento bioquímico por drogas ou materiaisbiológicos 1,2,3. Ao longo da última década, a invenção da optogenética abre uma nova era para a modulação celular de sinais moleculares. O transfection com proteínas sensíveis claras pela engenharia do gene faz a luz transformar-se uma ferramenta poderosa para modular várias atividades da proteína na pilha do alvo. Esta tecnologia tem feito avanços encorajadores, tais como excitação e inibição do sinal neural, promovendo a expressão gênica, manipulando padrões de sinais celulares, conduzindo diferentes destinos celulares e investigação patológica4,5 ,6,7,8,9. No entanto, a luz só pode funcionar através da transfecting células com proteínas optogenéticas. No estágio atual, existem métodos raros que permitem a luz controlar moléculas celulares diretamente além da optogenética.
O laser de Femtosecond tem pesquisas biológicas avançadas fornecendo a excitação eficiente do multifotônica ao manter a boa segurança biológica. Através da implantação de diversas estratégias de processamento de fotos, realizou inúmeras realizações como microscopia multifóton, microcirurgias e aplicações optogenéticas multifótons10,11,12, 12,13 ,14,15,16. As investigações recentes mostram que a estimulação do laser do femtossegundo foi demonstrada como um método ótico altamente eficiente para induzir diretamente eventos de sinalização moleculars. Verificou-se que a irradiação de laser femtossegundo fortemente focada no retículo endoplasmático (er) é capaz de esgotar o cálcio em ER e ativar os canais de cálcio ativado por liberação de cálcio (crac) para formar sinais de cálcio nas células17. Este sinal de cálcio foto-ativado pode se espalhar entre vários tipos de células18,19,20. Além disso, também tem a capacidade de ativar as vias de sinalização celular, como o fator nuclear de células T ativadas (NFAT) e a via de sinalização Erk21,22. Ajustando a intensidade e a localização da exposição do laser de femtossegundo nas pilhas, por exemplo, focalizando o laser em mitocôndria, pode influenciar a morfologia mitochondrial e os eventos moleculars23,24, 25. especificamente, rajadas de geração de Ros mitocondrial podem ser excitadas pela fotoestimulação, que é remarcada como flashes fluorescentes na mitocôndria (mitofcílios).
Assim, a tecnologia de fotoestimulação é de bom potencial para ser amplamente aplicada na pesquisa biológica relacionada. É igualmente uma boa possibilidade estender aplicações do laser do femtossegundo no controlo de moléculas e de funções de sinalização celulares além da microscopia. Aqui, nós fornecemos os detalhes técnicos da fotoestimulação. A fotoestimulação é conseguida acoplando um laser do femtossegundo a um microscópio confocal para fornecer a única pilha do alvo com um photoestimulação instantâneo curto. Pode iniciar a ativação de ERK eficiente e controlável na célula. Se a fotoestimulação está localizada na estrutura tubular mitocondrial, o potencial de membrana mitocondrial, morfologia, ROS e poros de transição de permeabilidade, todos podem ser controlados pela fotoestimulação. Baseado neste esquema da fotoestimulação, nós fornecemos um método detalhado de ativar a via de sinalização de ERK e de influenciar eventos mitochondrial múltiplos em pilhas de Hela. Este protocolo esclarece o processo de entregar a estimulação do laser do femtossegundo em pilhas do alvo.
O sistema da fotoestimulação é estabelecido em um microscópio confocal com um acoplamento do laser do femtossegundo nele para a estimulação simultânea e a microscopia contínua. O laser femtossegundo (comprimento de onda: 1.040 nm, taxa de repetição: 50 MHz, largura de pulso: 120 FS, potência média máxima de saída: 1 W) é dividido em duas vigas antes do acoplamento. Um é guiado através de um telescópio do relé que consiste em um par de lentes. É então diretamente refletida na abertura traseira de um objetivo (60x, N.A. = 1,2, imersão em água) para formar um foco de difração-limite (stim-A). O outro é refletido ao trajeto ótico da exploração do microscópio confocal para trabalhar como um modo da exploração do dois-fotão (stim-B). O stim-A apresenta um ponto de foco fixo no centro do campo de visão (FOV). Stim-B é uma área de exploração confocal parcial pre-projetada no FOV. Stim-A e stim-B são mostrados na Figura 1a. Uma câmera do CCD o espelho dichroic (DM) fornece a imagem latente do brilhante-campo para monitorar o foco do laser do femtossegundo.
Há alguns fundamentos cruciais para os seguintes experimentos. Neste protocolo, uma fonte do laser da fibra do femtossegundo (1040 nanômetro, 50 megahertz, 120 FS) é usada como um exemplo. Na prática, a maioria de osciladores femtossegundo comerciais podem ser usados contanto que a largura de pulso for mais curta do que 200 FS e a densidade de poder máxima deve estar acima do nível de 1011 ~ 1012 W/cm2. Por exemplo, um laser de ti: Sapphire geralmente usado para microscopia multifóton é capaz de substituir o laser femtossegundo mostrado na Figura 1b. O poder do laser e alguns outros parâmetros da fotoestimulação precisam de ser ajustados porque os parâmetros óticos (largura de pulso, comprimento de onda, e taxa da repetição) variam muito em lasers diferentes do femtossegundo que induzem assim eficiências diferentes da excitação do multifotônica.
Junto com a estimulação do laser do femtossegundo, a microscopia confocal fornece a imagem latente contínua da pilha para monitorar a dinâmica molecular no tempo real em ambos os modos de stim-A e de stim-B. Ambos os esquemas de fotoestimulação (stim-A e stim-B) são controlados por um obturador mecânico com resolução de milissegundo (Figura 1).
No modo stim-a, a posição do foco do laser é fixada no centro de FOV. Um telescópio do relé é usado para assegurar o foco do laser do femtossegundo a ser localizado no plano Confocal da imagem latente ajustando a distância entre duas lentes no sentido vertical (o sentido da propagação do laser, vertical ao plano Confocal da imagem latente, como mostrado em Figura 1). Pela imagem latente do brilhante-campo da câmera do CCD, o diâmetro do foco do laser pode ser medido (~ 2 μm, Figura 2b). As durações de estimulação e os tempos de exposição são controlados por um obturador durante o processo de imagem confocal.
Na modalidade de stim-B, a área da estimulação pode pre-ser atribuída manualmente no software de controlo da imagem latente confocal a todo o formulário como a linha, o polígono, ou o círculo. O obturador é sincronizado com o processo de digitalização confocal. Abre no tempo pre-designed que é ajustado com o software de controlo da imagem latente confocal. Em seguida, a área de estimulação é digitalizada pelo laser femtossegundo como microscopia confocal. Assim, a amostra só é estimulada pelo laser femtossegundo quando o processo de digitalização confocal entra em um determinado quadro de imagem.
O sistema da fotoestimulação pode ser estabelecido em Microscópios Metalúrgicos invertidos e eretos de acordo com os assuntos do experimento. As células in vitro cultivadas em placas de Petri são melhores para trabalhar com microscópios invertidos. Animais, especialmente cérebros de animais vivos, são mais adequados com microscópios verticais. Neste estudo, tomamos o microscópio invertido como exemplo. Deve-se notar que a tampa do prato de Petri não é aberta durante todo o experimento.
Nós demonstramos uma estratégia da fotoestimulação combinando um laser do femtossegundo com um sistema confocal do microscópio da exploração do laser. A fotoestimulação pode funcionar diretamente como uma microscopia do dois-fotão definindo stim-B conformemente. Nós fornecemos um protocolo detalhado para utilizar um flash curto do laser do femtossegundo para provocar a sinalização de ERK ou os mitofcílios em pilhas do alvo. Os diferentes modos de estimulação podem ser realizados de acordo com diferentes f…
The authors have nothing to disclose.
O trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81571719 e 81661168014, 81673014 e 81870055), o Comitê Municipal de ciência e tecnologia de Xangai (18QA1402300 e 16XD1403100) e a chave nacional R & D Plan (2017YFA0104600).
inverted microscope | Olympus | ||
femtosecond laser | Fianium | ||
CO2 incubation system | Olympus | MIU-IBC | |
petri dish | NEST | 801002 | |
petri dish with imprinted grid | Ibidi | 81148 | |
ERK-GFP | addgene | 37145 | A gift from Rony Seger's lab |
mt-cpYFP | A gift from Heping Cheng's lab | ||
mito-GFP | Invitrogen | C10508 | |
Tetramethylrhodamine (TMRM) | Invitrogen | T668 | Dilute in DMSO |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | Dilute in PBS |
paraformaldehyde | Solarbio | P8430 | Dilute in PBS |
Triton X-100 | Solarbio | T8200 | Dilute in PBS |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Dilute in PBS |
Tween20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
anti-eIF4E antibody | abcam | ab76256 | |
anti-Bax antibody | abcam | ab53154 | |
anti-cytochrome C antibody | abcam | ab90529 | |
secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 |