Summary
Detta protokoll beskriver installation och användning av ElectroMap, en MATLAB-baserad mjukvaruplattform med öppen källkod för analys av kardiella optiska kartdata. ElectroMap ger ett mångsidigt verktyg med hög genomflöde för analys av optisk kart spänning och kalcium datamängder i ett brett spektrum av hjärt-experimentella modeller.
Abstract
Optisk mappning är en etablerad teknik för hög spatio-temporal upplösning studie av kardiell elektrofysiologi i multi-cellulära preparat. Här presenterar vi, i en steg-för-steg-guide, användning av ElectroMap för analys, kvantifiering, och kartläggning av högupplöst spänning och kalcium dataset förvärvas av optisk kartläggning. ElectroMap analysalternativ täcker en mängd olika viktiga elektrofysiologiska parametrar, och det grafiska användargränssnittet möjliggör enkel modifiering av pre-Processing och parameterdefinitioner, vilket gör ElectroMap gäller för ett brett spektrum av experimentella modeller. Vi visar hur inbyggd pacing frekvens detektering och signalsegmentering möjliggör hög genomströmning analys av hela experimentella inspelningar, akuta svar och Single Beat-to-beat variation. Dessutom, Elekton inlemmar automatiserat många--slag genomsnitt till förbättra signalen kvalitet av bullersam datauppsättningarna, och här vi demonstrera hur den här huvudnummer kanna hjälp belysa elektrofysiologiska förändringen så pass makt annars gå oupptäckt när användande enkel Beat-analys. Anpassade moduler ingår i programvaran för detaljerad utredning av ledning, enstaka filanalys, och alternans, som visas här. Denna mjukvaruplattform kan användas för att möjliggöra och påskynda bearbetning, analys, och kartläggning av komplexa kardiell elektrofysiologi.
Introduction
Optisk mappning använder fluorescerande reportrar av spänning och/eller kalciumkoncentration att förhöra kardiell elektrofysiologi (EP) och kalcium hantering i flercelliga preparat, med större rumslig upplösning än möjligt med traditionella tekniker1,2,3. Därför har optisk kartläggning vuxit fram som en viktig och alltmer utnyttjad teknik, vilket ger viktiga insikter i fysiologiska och patofysiologiska elektriska beteenden i hjärtat3,4,5 ,6,7,8. Effektiv bearbetning och analys av data som erhållits från optiska kartläggnings experiment kompliceras av flera faktorer. Den höga spatiotemporal upplösning av optisk mappning datauppsättningar resulterar i RAW-videor filer som består av tusentals bildramar, var och en består av ett antal enskilda pixlar, vilket ger upphov till stora datafiler som kräver hög genomströmning och automatiserad bearbetning9. Små pixel storlekar, dålig och ojämn färgning lastning och små fraktionerad förändringar i fluorescens resultera i optiska signaler med låg signal-brus-förhållande (SNR), som kräver förbehandling innan effektiv analys är uppnåeligt10. Bearbetning och analys kan kompliceras ytterligare genom användning av optogenetiska pacing protokoll som utnyttjar ljus för att initiera aktivering, potentiellt förvränga den inspelade signalen från fluorescerande sensorer11,12. När uppgifter har behandlats kan dessutom flera icke-konsekventa tekniker och definitioner tillämpas för att mäta ränte parametrar, med de mest tillämpliga teknikerna som varierar beroende på experimentellt installation, modell och fråga 2. 10,13. Dessa begränsningar förhindrar ytterligare användning av tekniken och hindrar en verkligt objektiv analys.
För att övervinna dessa begränsningar har flera forskargrupper utformat anpassade bearbetningspipelines skräddarsydda mot deras experimentella modell, fråga och hårdvara7,14,15,16. Andra utnyttjar kommersiell proprietär programvara där underliggande algoritmer kan vara svåra att få tillgång till4,17. Det finns därför ett tydligt behov av en fritt tillgänglig programvaruplattform med öppen källkod för bearbetning och analys av optiska mappningsdata. Det är viktigt att denna programvara är öppen källkod, lätt att använda, flexibel till parameter justering, som gäller för en rad experimentella modeller med distinkta EP egenskaper och avgörande möjliggör enkel och avstämbara kvantifiering av utbudet av hjärt parametrar som kan studeras med optisk mappning.
Vi har nyligen publicerat och släppt en omfattande mjukvaruplattform, ElectroMap, för hög-hela, halvautomatiserad bearbetning, analys och kartläggning av kardiell optisk kartläggning dataset13. Här presenterar vi en video handbok för användning av ElectroMap och visar hur den kan användas för att bearbeta, analysera och kartlägga flera optiska kartläggningsdata uppsättningar. Vi fokuserar på användning av electromap att kvantifiera standard EP och kalcium hantering variabler och demonstrera användningen av fristående överledning hastighet, enda filanalys och Auktor moduler.
Protocol
1. insamling av optisk kartdata
- Utför kardiell optisk kartläggning med en av ett brett spektrum av experimentella modeller inklusive intakt och isolerad hela hjärtan6,18, isolerade Atria14,19, ventrikulär kilar20, hjärt skivor 21 , 22, och cellulära enskiktslager23. Se tillhörande referenser för experimentell design för att samla in rå optisk kartläggning data från dessa preparat. Förutsatt att data som erhålls kan konverteras till en TIFF-stack eller sparas i a. MAT-fil bör den analyseras med ElectroMap. Detta inkluderar data av varierande dimensioner (kvadrat/rektangulär) och upplösningar (maximalt testade för närvarande 2048 pixlar x 2048 pixlar).
2. installation och uppstart av programvara
Nedan beskrivs de två metoderna för att installera och köra ElectroMap – antingen i MATLAB kör från källkoden (. m) eller som en fristående körbar fil (. exe för Windows). Den slutliga programvaran och dess funktionalitet är invariant mellan de två inställningsalternativen (andra än några skillnader i katalog navigeringen). Därför är de viktigaste övervägandena för att välja version att installera tillgång till MATLAB och nödvändiga verktygslådor och om tillgång till källkod önskas. Där det är möjligt rekommenderas att använda MATLAB-versionen för snabbare starttider, kortare handläggningstider och enklare felrapportering.
-
Setup 1: att köra electromap inom MATLAB
- Installera MATLAB. ElectroMap designades i MATLAB 2017a, men programvaran har testats för användning i alla efterföljande utgåvor av MATLAB (upp till 2018b vid skrivande stund). Följande verktygslådor krävs: bildbehandling, signal behandling, statistik och maskininlärning samt kurva passning.
- Hämta/klona alla filer från den senaste "källkoden" release av Electromap från GitHub-lagringsplatsen (https://github.com/CXO531/ElectroMap). Packa upp det nedladdade innehållet till en önskad plats.
- Öppna MATLAB och navigera till mappen plats som är värd för ElectroMap källkoden. Öppna sedan filen electromap. m och tryck på Run i editorn, alternativt Skriv electromap i kommandofönstret och tryck på returtangenten. Detta kommer att starta ElectroMap-användargränssnittet, figur 1a.
-
Setup 2: standalone. exe arkivera
- Hämta installationsfilen: https://drive.google.com/open?id=1nJyI07w9WIt5zWcit0aEyIbtg31tANxI.
- Följ instruktionerna i installationsprogrammet, som kommer att hämta krävs MATLAB runtime från webben tillsammans med ElectroMap programvara.
- Kör Electromap. exe.
Obs: start tid för den fristående versionen kan vara flera minuter.
3. bildinläsning och förbehandling
- Tryck på Välj mapp och navigera till platsen för den eller de data fil (er) som ska analyseras. Detta kommer att fylla den vänstra listrutan med alla filer i den katalogen som är av rätt filtyp (. tif eller. MATTA). . MAT-filer får endast innehålla variabeln image stack.
Obs: endast mappar och inte enskilda filer visas när du navigerar genom katalog väljaren. - Välj den fil som ska läsas in inifrån gränssnittet och tryck på Ladda bilder.
- När den första bildrutan är laddad visas den och den röda dispositionen indikerar automatisk tröskel för bilden. Om det behövs, ladda om tidigare använda ROIs genom att välja Spara/Ladda ROI. I det här fallet hoppar du över steg 3,3.
- Som standard baseras tröskelvärde på pixel intensiteterna i den första bildrutan. Om du vill, ändra detta till ett tröskelvärde baserat på signalen tid kursen amplitud genom att ändra alternativet i den bild för tröskel nedrullningsbara menyn. Observera att när du har valt tröskelvärde tillämpas det sedan för hela bildstapeln.
- Om du vill, ändra tröskelvärdet alternativet till manuell, vilket kommer att aktivera reglaget för att manuellt justera bildens tröskel. Dessutom Beskär bilder (beskära bilden) och/eller rita en anpassad region av intresse (anpassad ROI) för analys genom att välja lämplig kryssruta (er) under tröskelvärdet alternativ. Observera att avancerade alternativ för val av intresseområde, till exempel antal områden, är tillgängliga från ROI-val från toppmenyn.
- När en lämplig tröskel har tillämpats, tryck på process bilder för att tillämpa bearbetningen. Inställningar för bearbetning beskrivs nedan (steg 3.4.1-3.4.5). Vid denna punkt, se till att rätt kamerainställningar har angetts. Dessa är pixelstorlek i ΜM (viktigt: Detta är bildens pixelstorlek, och inte storleken på de pixlar som utgör chip eller motsvarande hårdvara i Imaging Device) och framerate i kHz.
- För signal inversion, markera kryssrutan Invertera data för att aktivera. Om rapporterad fluorescerande signal är omvänt proportionell mot parametern av intresse (som med vanliga potentiometriska färgämnen) kan signalen inverteras.
- För spatial filtrering väljer du Gaussian eller Average på kernel-menyn. Storleken på det rumsligt genomsnittliga området styrs av storleks inmatningen intill kernel -rullgardinsmenyn (d.v.s. 3 resultat i 3 pixel x 3 pixel filter kernel). Vid applicering av ett Gaussiskt filter kan standardavvikelsen också ställas in från Sigma -ingången.
- Vid baslinjekorrektion väljer du Top-Hat24 eller polynom (4: e eller 11: e graden) korrigering25 från baslinje menyn. Korrigering kan tillämpas på varje pixel individuellt (lång bearbetningstid) eller som ett genomsnitt av hela bilden (snabbare men förutsätter homogena baseline-förändringar). Korrigering av Top-Hat kan också ändras genom att ange den övre hattens längd i millisekunder, intill den nedrullningsbara menyn för baslinje val. Längden på den övre hatt kärnan bör vara större än tidsskalan för enskilda åtgärder potentialer/kalcium transienter.
- För temporala filtrering, Välj Savitzky-Goaly eller oändlig impuls (IIR) filtrering från filtrering menyn.
Obs: annat än för den genomsnittliga vävnaden signalen som visas i det nedre vänstra, temporala filtrering tillämpas på varje pixel individuellt vid tidpunkten för parameter kvantifiering från Ensemble genomsnittliga bildintervall. Detta har implementerats för att minska bearbetningstiden genom att filtrera små delar av data när det behövs i stället för hela filer. - Observera att om alternativet ta bort ramar är markerat för bild Rute borttagning kan stora toppar med amplitud som är större än signalen av intresse tas bort från bild uppsättningen. Detta kan vara användbart i optiskt tempo dataset som optogenetic pacing där depolarisering initieras av optisk aktivering av opsins såsom channelrhodopsin 211,12.
Anmärkning: som ram avlägsnande kommer potentiellt införa ofysiologiska steg förändringar i bildsignaler, temporala filtrering kan införa artefakter till data och så rekommenderas inte här.
- Observera att signalen kommer att segmenteras när process bilder har valts enligt alternativen under Segmenteringsalternativ, men detta kan snabbt ändras utan att bearbeta hela datauppsättningen (se avsnitt 4).
4. data segmentering och Ensemble medelvärdes
Anmärkning: när filen har bearbetats, toppar i vävnaden genomsnitt signalen (nedre högra spåret, figur 1a) kommer att ha upptäckts och märkts av röda cirklar. Endast toppar över ett inställt tröskelvärde (blå linje på spår som anges av högsta tröskelvärde) räknas. Dessutom räknas toppar endast om de är tillräckligt försenade jämfört med föregående toppar, som anges av min topp distans inmatning. Sedan segmenteras signalen baserat på de upptäckta topparna. För det första beräknas den effektiva cykellängden (CL) för varje topp genom att mäta tiden mellan den och nästa topp. Om ett antal toppar (uppsättning av min antal toppar indata) har liknande CLs (tröskelvärde som anges av minsta gräns indata) då de grupperas och genomsnittliga cl för dessa toppar beräknas.
- För ytterligare segmentering av data, tryck på segment signal. Sub-segmentering alternativ är: ingen – alla toppar med samma cl grupperade tillsammans; Alla – segment av ntoppar inom konstant cl gånger (ntoppar anges av segmentet storlek input) identifieras; Sista – sista ntoppar innan en cl förändring identifieras och grupperas, och alla andra inte analyseras; och Single Beat – detta motsvarar att tillämpa alla segmentering med nPeaks = 1, och så ingen gruppering eller Ensemble medelvärdes (se 4,5) tillämpas. Detta kan tillämpas genom att välja Single Beat -knappen.
- Använd anpassad segmentering av signalen genom att zooma in en tid av intresse och välja segment signal. Detta kommer att lägga till ett ytterligare alternativ med titeln zoomad sektion till avsnitts listrutan, vilket motsvarar de valda tids punkterna.
- Resultaten av segmenteringen kommer att visas i listan-rutan intill vävnaden genomsnitt signalen, och kommer att Visa avsnittsnummer och uppskattad CL. Alla segmenterade tidsavsnitt betecknas med olika färger. Markera ett segment i listrutan om du vill markera avsnittet i rött. Detta utlöser också automatiskt analyser av detta avsnitt, som om knappen producera kartor valdes (se avsnitt 5).
- Analyser av grupperade toppar kommer att utföras på data i "Ensemble-medelvärdet". Detta innebär i genomsnitt topparna i ett segment tillsammans, med referens tiderna är de toppar som identifierats i steg 4,2. Uppdatera tidsfönstret till genomsnittet genom att ändra före -och efter ingångarna och trycka på segment signalen.
5. åtgärd potential/kalcium övergående varaktighet och ledning hastighets analys
- När bilderna har bearbetats blir knappen producera kartor aktiv. Tryck på ta fram kartor för att tillämpa actionpotentiell varaktighet (APD), aktiveringstid, överlednings hastighet och SNR-analys. Som standard kommer analysen att tillämpas på det första signal segmentet. Välj andra segment i listrutan kommer att tillämpa analys på valt segment.
Anmärkning: resultat av analys visas i resultattabellen, inklusive medelvärde, standardavvikelse, standardfel, avvikelse och 5: e till 95-percentilanalys. Varaktighet kartor kallas "APD" kartor men kalcium signaler bearbetas med samma inställningar kommer att mäta kalcium övergående varaktighet. - Välj Hämta pixel information om du vill se en detaljerad visning av signalen från en pixel i bilden och jämföra pixlar för att samtidigt plotta signaler från upp till 6 platser.
- Använd panelen signal behandling för att justera inställningarna för varaktighets analys. Dessa är: varaktighet – tid för procentuell repolarisering/förfall för att mäta från topp; "APD" baseline – tidsperiod för signal som definieras som referensbas linje för amplitud mätningar; och "APD" starttid – starttid för varaktighets mätningar. Dessa är samma alternativ för att bestämma aktiveringstiden för isochronal kartor (diskuteras nedan) och betecknas: Start (d2F/DT2Max), upstroke (DF/DTMax), depolarisering mittpunkt (tid på 50% amplitud), Peak (tid för maximal amplitud). Dessa definitioner tillämpade på mus-och marsvin-åtgärdspotentialer visas i figur 2A.
Om du ändrar något av dessa alternativ uppdateras varaktighets kartan och resultattabellen automatiskt. Det finns också alternativ för att ta bort kartskala och avvikare.
- Använd panelen signal behandling för att justera inställningarna för varaktighets analys. Dessa är: varaktighet – tid för procentuell repolarisering/förfall för att mäta från topp; "APD" baseline – tidsperiod för signal som definieras som referensbas linje för amplitud mätningar; och "APD" starttid – starttid för varaktighets mätningar. Dessa är samma alternativ för att bestämma aktiveringstiden för isochronal kartor (diskuteras nedan) och betecknas: Start (d2F/DT2Max), upstroke (DF/DTMax), depolarisering mittpunkt (tid på 50% amplitud), Peak (tid för maximal amplitud). Dessa definitioner tillämpade på mus-och marsvin-åtgärdspotentialer visas i figur 2A.
- Överlednings hastigheten mäts också automatiskt i huvudprogram gränssnittet. Detta uppnås med hjälp av multi-Vector-metoden i Bayly et al26 från den isochronala kartan som definieras av den valda aktiverings åtgärden (diskuteras i steg 5,4). Tryck på aktiveringspunkter för att återge en 3D-representation av aktiverings kartan.
- Multi-Vector ledning hastighets Mätningsmetoden segment rumsligt den isochronala kartan i regioner av n x n pixlar. Ange värdet för n med hjälp av den lokala fönsterstorleken indata och ange intervallet för Aktiveringstider att tillämpa analys till att använda anpassning Aktiveringstider ingångar.
Anmärkning: för varje lokal region, en polynom yta, f, monteras som bäst beskriver förhållandet mellan aktiveringstid och rumslig position, (x,y). Gradienten vektor, CVlokal, av denna yta beräknas sedan som:
1
där
betecknar den tvådimensionella kartesiska rumsliga differential operatören26. - För varje pixel i den isochronala kartan beräknas en lokal vektor som representerar hastighet och riktning för överledning. Välj Isochronal karta med vektorer från den nedrullningsbara menyn Visa för att visa den här analysen.
- SNR beräknas som förhållandet mellan den maximala amplituden jämfört med standardavvikelsen för signalen vid baseline. Den här analysen utförs bokför alla bearbetningssteg. Tryck på SNR-beräkning i den översta menyn för att redigera inställningar för den period av signalen som definierats som baslinje.
1
betecknar den tvådimensionella kartesiska rumsliga differential operatören26.6. modul för lednings analys
- Press ledning för att få tillgång till mer detaljerad analys av överledning hastighet. Detta öppnar en separat modul där överledning kan kvantifieras med hjälp av Bayly multi-Vector metod som i huvudgränssnittet, enda vektor metoder, och som en aktiverings kurva.
- Tryck på Single Vector för att analysera överledning med metoden Single Vector, där CV beräknas från fördröjningen i aktiveringstiden mellan två punkter. Detta kan göras med hjälp av automatiska eller manuella metoder, valbara under den enda vektor -knappen.
- För automatisk enkel vektor metod, Välj en sträcka och startpunkt från vilken du vill mäta överledning. Programvaran kommer sedan att utföra en 360-graders Svep från den valda punkten, mäta tidsfördröjningen och beräkna den tillhörande överlednings hastigheten längs alla riktningar i 1-graders steg. Resultaten av denna analys visas i grafen intill kartan, och riktningen för långsammast ledning visas i rött.
- För manuell enkel vektor metod, Välj både en start-och slutpunkt från den isochronala kartan för att beräkna överlednings hastighet. Om du vill välja en ny startpunkt trycker du på Clear start Point.
- Tryck på lokal vektor för att tillämpa multi Vector metoden, med de inställningar som matchar de från huvudgränssnittet. Inom lednings-modulen kan fördelningen av överlednings hastigheter, liksom den vinkel fördelningen av beräknade vektorer och vinkel beroende av lednings hastighet visas.
- Tryck aktiverings kurva för att rita den procentuella andelen vävnad som aktiveras som en funktion av tiden. Tiden till 100% aktiveringen visas automatiskt, medan anpassade värden för minimum (blå) och maximum (röd) aktivering procentsatser mellan vilka att mäta kan också väljas.
7. ytterligare analyser och moduler
- Bortsett från automatiskt utförda varaktighet och ledning hastighets analyser, flera andra parametrar kan kvantifieras med hjälp av ElectroMap. Dessa analyser kan väljas från rullgardinsmenyn ovanför visnings kartan. Välj ett av dessa alternativ för att utföra analysen och resultaten visas i den 4: e raden i resultattabellen: 1) diastoliskt intervall – tid från 90% repolarisering till aktiveringstiden för nästa åtgärd potential; 2) dominerande frekvens – frekvensspektrum för varje pixel beräknas med hjälp av fast Fourier Transform, och frekvensen med mest effekt definieras som den dominerande frekvensen. Avancerade intervall-och fönsterinställningar för dominant frekvensanalys finns tillgängliga genom att välja frekvens mappning; 3) tid till topp – den stiga tid emellan två förbrukaren valde procenten (försummelsen 10 till 90%) av depolariseringsfasen av åtgärdens potential eller frisättningen av kalcium. Procentvärden kan ändras genom att välja TTP-inställningar; och 4) avslappnings konstant (τ) – avslappnings konstant beräknas genom montering av ett mono-exponentiellt sönderfall av formen:
2
där fluorescensnivån vid tiden t beror på toppfluorescensen, F0, och efterföljande sönderfall (C är en konstant)27. Värdet mellan som passar ekvation 2 är valbara inom de viktigaste ElectroMap användargränssnitten, samt en godhet av Fit uteslutningskriterier baserat på r2 -värdet. - Tryck på en enda filanalys för att öppna en dedikerad modul för hög dataflöde varaktighet och överledning analys av varje identifierat segment i en fil. Analys kan utföras på antingen hela bilden (varaktighet, överledning och aktiveringstid) eller på utvalda regioner eller intressepunkter (för närvarande endast varaktighet). Resultaten skickas till en CSV-fil.
ANMÄRKNINGAR: för APD-värden från hela bilden är den första kolumnen i. csv-filen medelvärdet, medan den andra kolumnen är standardavvikelsen. - Tryck på alternans för att initiera en fristående modul för dedikerad analys och kartläggning av Beat-to-beat variation. Se o ' Shea et al. 201913 för detaljer om Auktor bearbetnings-och analysalternativ. Specifikt är denna modul utformad för att identifiera två period svängningar, kallas alternans. Både varaktighet och amplitud Auktor beräknas och outputted.
Obs: varaktighets alternerna mäts genom att jämföra varaktighets mätningen från en topp till nästa; dvs om Peak One respektive Two och APD1 respektive APD2 , så är varaktigheten alternan (δapd) beräknad som
3
Varaktighets mätningen utförs med inställningarna i huvudgränssnittet. Samtidigt kan amplitud Auktor kvantifieras och mappas över flera cellulära preparat som absoluta förändringen (definierad som en procentsats där 0% = samma amplitud mellan ett beat och nästa). Dessutom kan effekterna av fenomen som kalcium belastning undersökas ytterligare genom att mäta och jämföra belastnings -och frigöringalterner, som tidigare har rapporterats28. Om L definieras som den högsta amplituden för de stora Beats (dvs. där amplituden är större än den tidigare takten), S amplituden av de små
beats, ochD den diastoliska belastningen av de små beats, frisättningen Auktor ( 
) definieras som:
4
Däremot definieras load Auktor (
) som:
5
Alternans mätningar kan göras över hela vävnaden, och resultaten av analysen visas i nedre högra delen av modulen. När du först använder modulen, analysen utförs över hela experimentella filen och resultaten visas är en genomsnittlig Beat-Beat skillnad över hela filen. Analysen kan dock begränsas till specifika tider i filen genom att avmarkera Håll zoom, zooma in en viss tidsperiod och välja analysera zoomad sektion. Detta kommer att uppdatera Resultatpanelen för att Visa analys från den valda tidsperioden.- Välj spela för att visa en Beat-to-beat video av Auktor analys. Dessutom väljer skapa medelvärde karta för att exportera en karta över Auktor beteende i genomsnitt från att välja tidspunkter, som anges i popupmenyn när du använder den här funktionen.
- Tryck på fas karta för att initiera fas mappnings modulen. En Hilbert-transformering utförs för att beräkna den momentana fasen (mellan-π och + π) av signalerna vid varje tidpunkt. Tryck på spela upp eller dra reglaget för att visualisera fasens beteende över tid och klicka på en pixel för att återge ett fasdiagram.
2
3
beats, ochD den diastoliska belastningen av de små beats, frisättningen Auktor ( 
) definieras som:
4
) som:
58. exportera data
- Data exporteras från ElectroMap i olika former. Tryck på Exportera värden för att spara värdena för den karta som visas i det huvudsakliga använda gränssnittet. Uppmätta värden kan sparas som antingen en karta (bevara pixel platser) eller kondenseras till en enda lista, och kan sparas som. csv,. txt eller. MAT-filer.
- Tryck på Exportera karta för att visa ett popup-fönster som innehåller den karta som visas och som sedan kan sparas i en mängd olika bildformat. Visningsalternativen för kartan styrs genom att välja Kartinställningar men kan också redigeras när export kartan har valts. Till exempel kan en färgstapel läggas till genom att välja den här ikonen från den översta menyn och skalan kan ställas in genom att välja redigera ≫ colormap.
- Tryck på aktiverings video för att återge en animering av aktiveringssekvensen, som kan sparas som en animerad GIF-fil.
- Tryck på segment video om du vill spara en AVI-videofil av den aktuella parametern för varje identifierat segment.
Representative Results
Allt arbete som utförts som en del av denna studie genomfördes i enlighet med etiska riktlinjer som anges i lagen om brittiska djur (vetenskapliga förfaranden) 1986 och Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål. Experiment godkändes av hemmakontor (mus: PPL 30/2967 och PFDAAF77F, marsvin: PPL PF75E5F7F) och de institutionella gransknings nämnderna vid University of Birmingham (Mouse) och King ' s College London (marsvin). Detaljerade metoder för insamling av rådata som har analyserats här finns i våra tidigare publikationer5,6,14,19.
Det huvudgränssnitt som ElectroMap styrs från visas i figur 1a. De åtgärder som krävs för att analysera en datauppsättning styrs främst av knapparna Ladda bilder, bearbeta bilderoch skapa kartor och visas markerade i grönt, blått och rött, respektive i figur 1a. Figur 1b-D visar de åtgärder som sker vid val av var och en av dessa knappar. Läs in bilder använder de alternativ för bild tröskel som valts av användaren (figur 1b), medan process bilder (figur 1c) tillämpar filtrering och baslinjekorrigering. Slutligen, producera kartor kommer första genomsnittliga data enligt tidsfönstret och segmentering inställningar (om inte Single Beat segmentering väljs) och sedan utföra analyser som beskrivs ovan.
En viktig aspekt av ElectroMap är dess flexibilitet med avseende på kameratyp och experimentell modell. Detta är avgörande för nyttan av en optisk kartprogramvara på grund av den distinkta hjärt-EP och anatomiska egenskaper som finns mellan allmänt använda modeller. Figur 2A visar till exempel den actionpotentiella morfologin hos murina Atria jämfört med marsvin ventrikeln, inspelad med spänningskänsliga färgämnen som tidigare rapporterats6,14. Trots den distinkta formen av åtgärdens potential, och användningen av två separata optiska kartläggnings kameror med olika ram-och pixel storlekar, kan ElectroMap utnyttjas för att framgångsrikt analysera båda datauppsättningarna. Detta kräver dock modifiering av vissa parametrar i användargränssnittet (figur 2b). Observera att den förlängda marsvin-actionpotentialen kräver ett större tidsfönster. Dessutom, för att förhindra Top-Hat baslinjen korrigering ofysiologiskt modifiera optiskt inspelade signaler, dess tidslängd måste ökas så att det är större än tidsförloppet för åtgärden potential.
ElectroMap erbjuder en mängd Bearbetningsalternativ för att förbättra SNR av optiskt inspelade signaler som kan krävas för att effektivt återhämta EP parametrar. Ett exempel är automatiserad Ensemble medelvärde av toppar efter data segmentering. Figur 3a-C visar hur tillämpningen av Ensemble medelvärdes, i stället för andra metoder, kan förbättra SNR från isolerad murin vänster Atria (n = 13). Detta minskar mätningens heterogenitet och sannolikheten för analys fel (figur 3D). Till exempel, en förändring av pacing frekvens från 3 Hz till 10 Hz inte ändra APD50, när ingen Ensemble medelvärdes utförs, men en förväntad29 minskning i APD50 vid 10 Hz pacing observerades när mätt från Ensemble genomsnittliga data ( Figur 3E).
Figur 4 visar effekten och nyttan av automatiserad pacing frekvens detektering och segmentering som erbjuds av electromap. Här, mus vänster Atria (n = 5) var tempo på en 120 MS cykel längd och cykel längd var stegvis förkortas med 10 MS tills den nådde 50 ms. ElectroMap identifierade automatiskt pacing cykel längd och grupperade vävnad genomsnitt toppar därefter (figur 4a ). Detta uppnåddes med hög noggrannhet i alla dataset (figur 4b). Automatiserad segmentering av data får enkel och hög genomströmning analys av uppbromsning av överledning hastighet med ökad pacing frekvens/förkortad cykel längd (figur 4c, D). Samtidigt, APD50 (figur 4e) och diastoliskt intervall (figur 4F) förkortas. Amplituden av de optiskt uppmätta topparna minskade, medan tiden till maximal ökning (figur 4G, H). Dessa är återigen de förväntade återlämnings svaren i hjärtvävnad29,30 och användning av elekton kan bidra till att belysa förändringar som svar på pacing-frekvensen i närvaro av farmakologiska agens, genetisk modifiering, eller sjukdomstillstånd.
En viktig faktor i användningen av en programvara som ElectroMap är förekomsten av artefakter i underliggande data. Figur 5, till exempel visar att rörelse artefakter (förvrängningen av den optiskt inspelade signalen genom vävnadens rörelse) kan utesluta noggranna mätningar av aktivering och särskilt repolarisering inom electromap. Se diskussionen för ytterligare överväganden.
Bild 1: de viktigaste bearbetningsstegen för ElectroMap. (A) grafiskt användargränssnitt för electromap, med load images (grön), process bilder (blå), och producera kartor (röd) knappar markerade. (B) alternativ för bild tröskel som kan användas för att välja Läs in bilder. (C) signal behandlingsalternativ tillgängliga för användaren inkluderar spatial och temporala filtrering och baslinjekorrigering och kan tillämpas på bilden stacken genom att trycka på process bilder. (D) Ensemble medelvärde och kvantifiering av parametrar (visad APD-mätning) som aktiveras genom att välja producera kartor. Figur anpassad från o ' Shea et al., 201913. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: analys av data från mus och marsvin med hjälp av ElectroMap. A) optiskt registrerad actionpotential från mus-Atria och marsvin ventriklar, tillsammans med både den första (DF/DT) och andra (d2f/DT2) derivat av dessa signaler. De olika definitionerna för aktiverings-och repolariseringstider anställbara inom ElectroMap markeras. (B) skärmdumpar av inställningar för bild-och signalbehandling som används i electromaps Interface. Röda rutor markerar inställningar som krävde modifiering mellan analyser av data från mus och marsvin. Figur anpassad från o ' Shea et al., 201913. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ensemble medelvärdes matchning för att lösa APD-ändringar. (A) APD50 karta och exempel single pixel signal från Single Beat optiska åtgärder potentialer. (B) APD50 karta och exempel single pixel signal från optiska åtgärder potentialer genereras av Ensemble genomsnitt av 10 successiva Beats (Peak Method). (C) SNR av singelslag jämfört med 10-takt i genomsnitt. (D) APD50 heterogenitet (i) och antal mätfel (II) som en funktion av SNR för Single Beat och 10 beat i genomsnitt APD50 kartor. (E) APD50 vid 3 och 10 Hz pacing frekvens, mätt från Single Beat och 10 Beat kartor. (Data som visas som medelvärde ± standardfel, n = 13 vänster Atria, * * * *p < 0,001 av elevens Parade t-test). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: användning av ElectroMap för att studera pacing frekvenssvar i hjärtvävnad. (A) exempel electromap skärmdump av pacing frekvens erkännande och segmentering. B) jämförelse av kända och elekturuppmätta tempo längder. (C) aktiverings kartor på 120 ms och 60 MS pacing cykellängder. (D-H) Grupperade data för överledning hastighet (D), APD50 (E), diastoliskt intervall (F), amplitud (G), och tid till topp (H) som en funktion av pacing cykel längd minskar från 120 ms till 60 MS i 10 MS steg. (Data som visas som medelvärde ± standardfel, n = 5 Left Atria) Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: effekt av rörelse artefakter. (A) APD50 karta. (B) aktiverings karta. (C) exempel signaler från platser markerade (korsar) på APD och aktiverings kartor. I det område av vävnaden som är märkt med röda korset har kontraktion inte framgångsrikt kopplats bort, vilket snedvrider den uppmätta optiska signalen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Här presenterar vi en steg-för-steg-guide för användning av öppen källkod ElectroMap för flexibel och multi variabel analys av kardiell optisk kartläggning DataSet. För lyckad användning av ElectroMap krävs bild data för att vara i. tif eller. MAT format. ElectroMap innehåller flera modifierbara användarinställningar. Som framgår i figur 2A, detta är nödvändigt på grund av den stora heterogenitet som finns mellan experimentella modeller och Imaging hårdvara. Detta innebär dock att standardinställningarna i programvaran inte alltid kommer att vara optimala, så ett kritiskt steg i att använda programvaran är för användaren att finjustera inställningarna för deras särskilda experimentella setup. Dessa inkluderar kamerainställningar och tidsskalor, som visas i figur 2b. När optimala inställningar har hittats, kan dessa sparas och laddas vid senare tillfällen genom att välja konfigurationsfil.
Införlivandet av automatiserad CL mätning och signalsegmentering är viktiga fördelar med programvaran. Dessa funktioner gör det möjligt att analysera akuta reaktioner i experimentella inspelningar och bredda analysen från att fokusera på isolerade singelbeats. När önskad segmentering har uppnåtts, den enda filanalys modul möjliggör automatiserad analys av varje enskilt segment (inklusive Single beats), insåg hög genomströmning analys av flera variabler över inspelningen utdata i en en CSV-fil. I samband med detta är Ensemble medelvärdes av grupperade toppar en effektiv metod för att förbättra kvaliteten på bullriga signaler som automatiskt utförs i Elekton. Emellertid, Ensemble genomsnitt är inte ubiquitously fördelaktigt, till exempel i studier av Beat-to-beat variation. Därför integrerar ElectroMap Single Beat segmentering för att undvika Ensemble medelvärdes, alternativ bearbetning alternativ för att förbättra SNR (spatial och temporala filtrering) och inkluderar alternans analysmodul för att ytterligare utreda och kartlägga Beat-to-beat variation.
Datauppsättningar för optisk mappning uppvisar ofta artefakter som baslinjedrift och rörelse artefakter. Likaså kan de genererade signalerna vara låg kvalitet på grund av små pixel storlekar, korta exponeringstider och låga fraktionerad fluorescerande förändringar2. Dessa faktorer förhindrar en effektiv och korrekt analys av det underliggande EP-beteendet. Som beskrivits har ElectroMap flera bearbetningsstrategier för att övervinna dessa frågor. Men tillämpningen av dessa algoritmer till fundamentalt dålig kvalitet/förvrängd data kommer fortfarande att förhindra effektiv analys. SNR är därför en av parametrarna som mäts och visas i ElectroMap. Likaså kan användaren välja och jämföra signalerna från specifika regioner från provet med hjälp av pixel information och jämföra moduler, vilket möjliggör identifiering av fenomen som rörelse artefakter som visas i figur 5, och lämpliga uteslutning av data.
För närvarande stöder ElectroMap inte borttagning av rörelse artefakter från rådata på samma sätt som baslinjekorrigering. Därför är en eventuell framtida utveckling av programvaran inkludering av rörelse artefakt avlägsnande av beräkningsmetoder som har rapporterats31,32. Dessutom är ElectroMap för närvarande begränsat till studier av en optisk signal. Men för ratiometriska färgämnen och samtidig användning av spänning och kalcium färgämnen27, krävs Samtidig bearbetning av två våglängdskanaler. Integrationen av Dual signal Analysis är därför ett viktigt framtida tillägg till programvaran. Utvidgning av analysalternativ som gäller för arytmiska DataSet, såsom fas singularitetsspårning, skulle lika bredda omfattningen av programvaran33,34. Slutligen kan flera av de beskrivna analys alternativen också vara användbara vid analys av data för elektrod mappning. Faktum är att electromap har använts för att analysera elektrod kartläggning data trots den kontrasterande elektrogramvågform20,35, och ytterligare optimering kommer att utvidga dess användning för denna modalitet.
Disclosures
P.K. får forskningsstöd från flera läkemedels-och enhetsföretag verksamma inom förmaksflimmer och har fått arvoden från flera sådana företag. L.F. har erhållit institutionella forskningsanslag från EU, BHF, MRC, DFG och Gilead. P.K. och L.F. är listade som uppfinnare på två patent som innehas av University of Birmingham (förmaksflimmer terapi WO 2015140571, markörer för förmaksflimmer WO 2016012783).
Alla andra författare förklarar ingen potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av EPSRC student Ship (SCI-PHY-4-Health Centre for forskarutbildning L016346) till DP, K.R. och L.F., Wellcome Trust Seed Award Grant (109604/Z/15/Z) till DP, British Heart Foundation bidrag (PG/17/55/33087, RG/17/15/33106) till DP Europeiska unionen (bidragsöverenskommelsen nr 633196 [CATCH ME] till P.K. och L.F.), British Heart Foundation (FS/13/43/30324 till P.K. och L.F.; PG/17/30/32961 till P.K. och A.H.) och Leducq Foundation till P.K.. JW stöds av British Heart Foundation (FS/16/35/31952).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB and Simulink R2018a | Mathworks, Inc, Natick, MA | MATLAB software |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical Imaging of the Heart. Circulation Research. 94, 21-33 (2004).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110, 609-623 (2012).
- Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE Reviews in Biomedical Engineering. 7, 115-125 (2014).
- Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. Local β-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia. Circulation Research. 110, 1454-1464 (2012).
- Syeda, F., et al. PITX2 Modulates Atrial Membrane Potential and the Antiarrhythmic Effects of Sodium-Channel Blockers. Journal of the American College of Cardiology. 68, 1881-1894 (2016).
- Winter, J., et al. Sympathetic nervous regulation of cardiac alternans in the intact heart. Frontiers in Physiology. 9, 1-12 (2018).
- Faggioni, M., et al. Suppression of spontaneous ca elevations prevents atrial fibrillation in calsequestrin 2-null hearts. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7, 313-320 (2014).
- Sato, P. Y., et al. Loss of Plakophilin-2 Expression Leads to Decreased Sodium Current and Slower Conduction Velocity in Cultured Cardiac Myocytes. Circulation Research. 105, 523-526 (2009).
- Yu, T. Y., et al. Optical mapping design for murine atrial electrophysiology. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering: Imaging & Visualization. 5, 368-378 (2017).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 303, H753-H765 (2012).
- Crocini, C., Ferrantini, C., Pavone, F. S., Sacconi, L. Optogenetics gets to the heart: A guiding light beyond defibrillation. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 132-139 (2017).
- Entcheva, E., Bub, G. All-optical control of cardiac excitation: Combined high-resolution optogenetic actuation and optical mapping. The Journal of Physiology. 9, 2503-2510 (2016).
- O’Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
- Yu, T. Y., et al. An automated system using spatial oversampling for optical mapping in murine atria. Development and validation with monophasic and transmembrane action potentials. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 340-348 (2014).
- Jaimes, R., et al. Functional response of the isolated, perfused normoxic heart to pyruvate dehydrogenase activation by dichloroacetate and pyruvate. Pflugers Archiv. 468, 131-142 (2016).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308, H1112-H1125 (2015).
- Parrish, D. C., et al. Transient denervation of viable myocardium after myocardial infarction does not alter arrhythmia susceptibility. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory. , (2017).
- Ihara, K., et al. Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping. Journal of Visualized Experiments. (132), e56478 (2018).
- Holmes, A. P., et al. A Regional Reduction in Ito and IKACh in the Murine Posterior Left Atrial Myocardium Is Associated with Action Potential Prolongation and Increased Ectopic Activity. Plos One. 11, e0154077 (2016).
- Lang, D., et al. Arrhythmogenic remodeling of β
2 versus β1 adrenergic signaling in the human failing heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 8, 409-419 (2015). - Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
- Wen, Q., et al. Transverse cardiac slicing and optical imaging for analysis of transmural gradients in membrane potential and Ca2+ transients in murine heart. The Journal of Physiology. 596, 3951-3965 (2018).
- Houston, C., et al. Characterisation of re-entrant circuit (or rotational activity) in vitro using the HL1-6 myocyte cell line. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 119, 155-164 (2018).
- Yu, T. Y., et al. Optical mapping design for murine atrial electrophysiology. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering: Imaging and Visualization. 5, 368-376 (2017).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 303, H753-H765 (2012).
- Bayly, P. V., et al. Estimation of Conduction Velocity Vector Fields from Epicardial Mapping Data. IEEE Transactions on Bio-Medical Engineering. 45, 563-571 (1998).
- Jaimes, R., et al. A technical review of optical mapping of intracellular calcium within myocardial tissue. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 310, H1388-H1401 (2016).
- Wang, L., et al. Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: Ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation. Circulation Research. 114, 1410-1421 (2014).
- Winter, J., Shattock, M. J. Geometrical considerations in cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis. Europace. , (2016).
- Mironov, S., Jalife, J., Tolkacheva, E. G. Role of conduction velocity restitution and short-term memory in the development of action potential duration alternans in isolated rabbit hearts. Circulation. 118, 17-25 (2008).
- Khwaounjoo, P., et al. Image-Based Motion Correction for Optical Mapping of Cardiac Electrical Activity. Annals of Biomedical Engineering. 43, 1235-1246 (2014).
- Christoph, J., Luther, S. Marker-Free Tracking for Motion Artifact Compensation and Deformation Measurements in Optical Mapping Videos of Contracting Hearts. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Umapathy, K., et al. Phase Mapping of Cardiac Fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 3, 105-114 (2010).
- Tomii, N., et al. Detection Algorithm of Phase Singularity Using Phase Variance Analysis for Epicardial Optical Mapping Data. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 63, 1795-1803 (2016).
- Cantwell, C. D., et al. Techniques for automated local activation time annotation and conduction velocity estimation in cardiac mapping. Computers in Biology and Medicine. 65, (2015).
