Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Быстрое и эффективное выражение нескольких белков в птичьих эмбрионах с использованием мРНК Электропорации

Published: June 7, 2019 doi: 10.3791/59664
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

Summary

Мы сообщаем о электронной посыле РНК (мРНК) как метод, позволяющий быстро и эффективно выражать несколько белков в системе модели перепелиного эмбриона. Этот метод может быть использован для флуоресцентно этикетки клеток и записи их виво движений по замедленной микроскопии вскоре после электропорации.

Abstract

Мы сообщаем, что электропорация мРНК позволяет флуоресцентным белкам маркировать клетки в живых перепелиных эмбрионах быстрее и шире, чем электропорация ДНК. Высокая эффективность трансфекции позволяет со-трансфицировать по крайней мере 4 различных мРНК с эффективностью 87%. Большинство электропорированных мРНК деградируют в течение первых 2 ч после электропораации, что позволяет проводить эксперименты, чувствительные к времени, в развивающемся эмбрионе. Наконец, мы описываем, как динамически изображения живых эмбрионов электропоза, с мРНК, которые кодируют различные субклеточные целевые флуоресцентные белки.

Introduction

Электропорация является физическим методом трансфекции, который использует электрический импульс для создания переходных пор в плазменной мембране, позволяя веществам, таким как нуклеиновые кислоты или химические вещества, чтобы пройти в цитозол. Электропорация широко используется для доставки ДНК в бактерии,дрожжи, растения и клетки млекопитающих 1,2,3. Он обычно используется для введения генетических полезных нагрузок в клетки-мишени и ткани в развивающихся птичьего эмбриона для изучения генетического контроля развития или этикетки мигрирующих популяций клеток4,5,6, 7. Однако, несколько экспериментальных ограничений также существуют с электропорированием дна8. Например, электропорация ДНК часто вводит весьма переменное число векторов экспрессии на клетку, а затем мРНК и белки, которые они кодируют. Эта изменчивость может привести к значительной неоднородности клеток, что усложняет анализ изображений и интерпретацию данных9,10. Кроме того, белки от электропорации ДНК только начинают выражать 3 ч после электропораиляции и не достигают максимальной эффективности в количестве клеток и интенсивности флуоресценции до 12 ч, вероятно, из-за времени, необходимого для передачи в ядро и полной как транскрипция, так и перевод in vivo11.

В отличие от этого, трансфекция мРНК эффективно используется в различных модельных системах, включая ооциты Xenopus laevis путем микроинъекции12,13, перепрограммирование стволовых клеток человека с помощью липофекции мРНК14 , и электропопортнетных непокорных нервных стволовых клеток у взрослых мышей15. Мы проверили способность электропорации мРНК эффективно маркировать клетки во время раннего птичьего эмбрионального развития с помощью in vitro синтезированных мРНК, которые кодируют различные флуоресцентные белки (ФП). Для наших исследований мы использовали вектор pCS2, многоцелевой вектор экспрессии, который обычно используется для выражения белков в эмбрионах ксенопусов и зебры. Промоутеры SP6 и T7 РНК-полимераза в pCS2 позволяют синтезировать мРНК и белок из любого клонированного гена при использовании в системе транскрипции/перевода in vitro.

Здесь мы демонстрируем, что электропорация мРНК позволяет быстро и эффективно выражать флуоресцентные белки (ФП) в гаплодирующих перепелиных эмбрионах. Мы разработали и сгенерировали многие из векторов экспрессии, используемых в этих исследованиях. Например, мы подклонили ген LifeAct-eGFP16 в вектор pCS2,17, чтобы выразить от промоутера CMV и промоутера SP6. Вставленный ген лежит вниз по течению промоутера SP6 и вверх по течению хвоста SV40 (A)18. В эмбрионах, совместно связанных с мРНК и ДНК, ФП, закодированные из транскрибированных мРНК in vitro, были впервые обнаружены в течение 20 минут электропорации, в то время как ФП из векторов экспрессии ДНК были обнаружены только после 3 ч. Несколько мРНК, кодирующих для ядерного, Golgi, и мембранные белки могут быть электропоранговывого в эмбрион одновременно, в результате чего быстро ежемое выражение нескольких белков в отдельных клетках. Наконец, используя in vivo флуоресценции восстановления после фотоотбелевания (FRAP) асссе, мы показываем, что большинство электропопованных мРНК распада в течение 2 ч. Таким образом, быстрое первоначальное производство белка в сочетании с ограниченным новым переводом белка делает электропорацию мРНК ценной техникой, когда необходим временный контроль экспрессии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры по уходу за животными были проведены в соответствии с утвержденными руководящими принципами, принятыми Детской больницей Лос-Анджелеса и Комитетами по институциональному уходу и использованию животных ВУЗовского университета.

1. Поколение pCS2 основе Векторов выражения

  1. Чтобы клонировать pCS2.Lifeact-eGFP, подготовить вектор позвоночника путем переваривания 2 мкг pCS2.CycB1-GFP (конструкция, содержащая различные вставки) с BamHI (10 U) и BsrGI (10 U) в соответствующем буфере пищеварения (см. Таблица материалов) разбавленной до 1x в общей реакции объем 50 qL для 1 ч при 37 градусах по Цельсию (см. рисунок 1 для схемы процедуры клонирования).
    1. Дефосфорилат свободные 3'OH концы векторной основы от реакции фермента ограничения, добавив креветки щелочной фосфазы (1 U). Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия.
    2. Запустите всю смесь в 1% агарозный гель/1x Tris Acetate EDTA (TAE) буфер на 90 V в течение 50 мин, а затем пятно гель в 0,5 мкг /мл раствор бромида в 1x TAE буфера в течение 15 минут с нежным качания. Кроме того, убедитесь, что для загрузки молекулярных маркеров веса в свободной полосе, чтобы помочь определить размерЫ ДНК.
    3. Использование ДНК безопасного УФ Transilluminator, чтобы избежать nicking ДНК, вырезать вектор позвоночника (ожидается размер полосы 4kb) из геля агарозы быстро и изолировать фрагмент ДНК из геля кусок с помощью комплекта гель очистки с использованием инструкций производителя.
  2. Одновременно с шагом 1.1, подготовить вставку путем переваривания 2 мкг pEGFP-N1-Lifeact с BglII (10 U) и BsrGI (10 U) в соответствующем буфере пищеварения разбавленной до 1x в общем объеме реакции 50 qL на 1 ч при 37 градусах по Цельсию. Запустите всю смесь в 1% агарозный гель, чтобы изолировать 800 bp диапазон, как ранее объяснялось в шаге 1.1.2-1.3.
  3. После того, как вектор и вставка очищаются и количественно очищаются на спектрофотометре, объедините 50 нг вектора и 38 нг вставки (1:3 молярного соотношения переносицы для вставки) в буфере Лигазы T4 ДНК до добавления T4 ДНК лигазы для катализа реакции ligation. Кроме того, настроить не управление ДНК, вектор только контроль, и вставить только контроль. Инкубировать все реакции при комнатной температуре в течение 30 мин.
    1. Преобразуйте 1 кв. л перевязочной смеси (ы) в компетентный E. coli DH10. Кроме того, преобразовать воду только отрицательный контроль и 20.. pUC19 положительный контроль. Распространение бактерий на Лурия Бульон (LB) агар пластины, содержащие 50 мкг /мл ампициллин и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию.
    2. На следующее утро, рассчитывать колоний на каждой тарелке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, не должно быть колоний на отрицательных контрольных пластин, no gt;100 колоний на векторно-вставокных перевязки пластин, и меньше колоний на векторной пластины.
    3. Выберите по крайней мере 8 бактериальных колоний из агаровой пластины, преобразованной с помощью векторной перевязки смеси и привить их с помощью стерильных зубочисток или кончиков труб в 2 мл жидкого бульона LB, содержащего 50 мкг/мл ампициллин.
    4. Извлеките ДНК из каждого из клонов с помощью коммерческих наборов плазмид мини-препки.
    5. Запустите диагностический дайджест ограничения с использованием 500 нг ДНК от каждого клона с помощью NotI (10 U) и BamHI (10 U) в соответствующем буфере пищеварения, разбавленном до 1x на 1 ч при 37 градусах По Цельсия, и запустите переваренные ДНК на 1% агарозном геле в буфере 1x TAE. Ожидаемые размеры полосы для pCS2.Lifeact-eGFP положительных клонов 3,9 кб и 978 б.п.
    6. Преобразуйте 1 пг-100 нг ДНК из положительного клона в компетентный E. coli DH10 и подготовьте 3-4 реакции мини-подготовки, описанные в предыдущих шагах, чтобы получить достаточное количество ДНК для реакции транскрипции in vitro (минимум 10 мкг).

2. Подготовка мРНК в пробирке

  1. Линейно 10 мкг pCS2.LifeAct-eGFP на 3' конце вставки с NotI (10 U) в соответствующем буфере пищеварения, разбавленном до 1x в общем объеме реакции 50 кл. при 37 градусах Цельсия за одну ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения загрязнения RNase и уменьшения деградации мРНК, носить перчатки при обработке образцов мРНК.
  2. Очистите ДНК с помощью смеси фенола: хлороформа: изоамил-спирт (25:24:1, v/v).
    1. Добавьте 150 кЛ воды без RNase, чтобы общий объем реакции пищеварения был равен 200 зл.. Затем добавьте 200 л фенола: хлороформ: изоамил овый спирт и вихрь смеси на 20 с.
    2. Центрифуга в микрофуге с максимальной скоростью (18 400 х г) в течение 2 мин. Тщательно удалите верхнюю водной фазе, содержащую линейную ДНК. Повторите этот шаг, чтобы удалить дополнительные примеси и будьте осторожны, чтобы не нарушить белый осадок, который может образовываться между нижней и верхней жидкой фаз.
  3. Осадок линейной ДНК путем добавления 1/10 объем 3M ацетат натрия (RNase-бесплатно) и 2,5 тома 100% этанола. Оставьте смесь на уровне -20 градусов по Цельсию в течение 30 мин, затем гранулы ДНК центрифугии на максимальной скорости (18400 х г).
    1. Вымойте ДНК гранулы с 70% этанола, а затем воздух сухой гранулы для йgt;5 мин.
    2. Растворите гранулы ДНК в 5 Зл воды без RNase. Количественная ДНК с помощью спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемая концентрация ДНК составляет 0,5-1 мкг/л со соотношением A260/A280 между 1,7-2,0.
  4. Используйте 1 мкг линейной ДНК pCS2.LifeAct-eGFP для транскрипции in vitro (IVT). Следуйте инструкциям производителя в коммерческом комплекте (см. Таблица материалов), чтобы включить 10 зл ианалогов крышки (окончательная концентрация 0,8 мМ) и NTPs (окончательная концентрация 1 мМ для АТФа, CTP и TTP; 0,2 мМ для GTP), 2 л 10x буфера реакции (окончательная концентрация 10x буфера реакции (окончательная концентрация 1x), 2 л SP6 РНК полимераза, и RNase-свободной воды до 20 Зл.
    1. Инкубировать смесь IVT около 2 ч или дольше, в зависимости от размера стенограммы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 2 ч инкубации хорошо работает для 3 кб стенограммы, но ночь инкубации работает лучше для стенограммы, которые больше, чем 5 кб.
    2. Чтобы удалить свободные нуклеотиды из реакции транскрипции, добавьте 30 л раствора осадков LiCl РНК (7,5 М хлорида лития, 50 мМ EDTA), чтобы осаждать мРНК. Vortex смесь кратко и хранить при -20 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Спин мРНК вниз в течение 15 минут в микрофуге на максимальной скорости (18400 х г) и промыть с 70% этанола (RNase-бесплатно).
  5. Растворите синтезированную мРНК в 15 Л безrизосной воды. Распределите синтезированную мРНК при 5 л/трубка (всего 3 трубки) и поместите при -80 градусов по Цельсию для длительного хранения. Извилите мРНК с помощью спектрофотометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемая урожайность составляет 15-20 мкг мРНК (1 мкг/л). Для эксперимента с эмбрионами в 10 евро достаточно 1 кЛ (1 мкг/л), при условии, что мРНК разбавляется от 1 мкг/л до 500 нг/Л и что каждому эмбриону вводят по 200 нл. Поэтому каждая трубка должна содержать достаточное количество мРНК для экспериментов за 5 евро.
  6. Выполнить 300 нг мРНК на 1% агарозный гель в буфере 1x TAE после очистки всех гель оборудования с RNase обеззараживания решение (например, RNase Away) и убедитесь, что мРНК появляется как одна полоса (несколько полос может присутствовать, если вторичные структуры форме) и что не мазок ppears в гелевом переулке, что указывает на деградацию РНК.

3. Подготовка мРНК Электропорация Mix

  1. Оттепель и разбавление мРНК при нужной концентрации (250-500 нг/Л в безробленной воде, свободной от РНК, хорошо работает для всех мРНК, протестированных в этой работе). Добавьте 1/10 тома цветного красителя (см. Таблицу Материалов, без РНЗа, 0,1% конечной концентрации), чтобы помочь визуализировать место инъекции мРНК и правильно разместить электроды.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Если ДНК и РНК объединены для выполнения коэлектропорации, убедитесь, что ДНК свободна от загрязнения RNases с помощью экстракта фенола хлороформа и осадков этанола до мРНК и ДНК смеси.
    1. Обязательно подготовьте отрицательный контроль с помощью макета (без РНК добавил) электропорации раствора. Если это возможно, подготовить положительный контроль с помощью предварительно проверенных мРНК (мРНК, который был показан для производства FP успешно в предыдущих экспериментах).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательный контроль необходим для всех экспериментов по визуализации для установления фоновых уровней флуоресценции для нормализации данных. Положительный контроль особенно важен при работе с недавно транскрибированной мРНК, помогая подтвердить, что настройки электропорации работали.
  2. Храните раствор электропорации мРНК на ледяной суспензии, чтобы предотвратить деградацию до готовности приступить к электропорации.

4. Электропорат мРНК в живых перепелов эмбрионов

  1. Собирайте свежеотложенные оплодотворенные перепелиные яйца ежедневно и храните при 13 градусах Цельсия в увлажненный холодильник не более 1 недели. Инкубировать перепелиные яйца при 38 градусах Цельсия до желаемых эмбриональных стадий развития19,20,21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: HH3 к HH5 были использованы в этом исследовании для статического и динамического изображения. Для эмбрионов HH3, оставляя яйца при комнатной температуре в течение 2 ч до сбора урожая делает процесс изоляции гораздо проще, как эмбрионы, как правило, более устойчивы к физическим манипуляциям при охлаждении.
  2. Изолировать и подготовить эмбрионы в соответствии с системой культуры ЕС22. Соберите не менее 5 эмбрионов на одно состояние, в том числе по крайней мере один, чтобы служить в качестве отрицательного контроля (не электропораза).
    1. Аккуратно разбейте и вылейте яйцо в 10 см чашку Петри. Удалите большинство толстый альбумин с передачей пипетки и удалить оставшиеся толстые альбумина вокруг эмбриона, осторожно вытирая поверхность желтка салфеткой, чтобы убедиться, что эмбрион плотно прилипает к бумажному кольцу.
    2. Положите предрезеченную фильтровальную бумагу (см. ТаблицуМатериалов) на эмбрион и используйте ножницы, чтобы плавно разрезать по периметру эмбриона.
    3. Используйте пипетку Pasteur, чтобы лежать в основе эмбриона с ПОМОЩЬю PBS, используя нежные потоки, чтобы освободить любой желток, прилипающий к эмбриону.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение при работе с более молодыми (Злт;HH3) эмбрионов, потому что эти эмбрионы, как правило, придерживаться больше желтка и часто отсоединяются от вительлина мембраны во время последующих шагов стирки.
    4. Медленно потяните эмбрион / бумажное кольцо под наклонным углом вверх и от желтка в чашку Петри заполнены PBS для дальнейшей очистки. После того, как большая часть желтка была удалена, поместите эмбрион брюшной стороны вверх на 35 мм Петри блюдо покрыто полутвердой смесью агар / альбомен.
  3. Приготовьте от шести до восьми 10 см стеклянных микрокапилляров (O.D. и 1,2 мм) с помощью стеклянного инструмента для выдвижной микропайпов.
  4. Поместите брюшную сторону эмбриона вверх в электропорационную камеру, заполненную PBS. Используя стеклянный микрокапилляр, вводят в полость между эпибластом и вительлинской мембраной болюс 200 нл мРНК или смешением электропорации ДНК/мРНК в полость между эпибластом и вительлиной мембраной, покрывающей нужную область.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся передняя область для пеллусиды и некоторая область для опаки была электропорена в большинстве экспериментов, показанных в этой рукописи.
  5. Поместите положительные и отрицательные электроды (платиновый плоский квадратный электрод; боковой длина 5 мм) на верхней и нижней части эмбриона соответственно и электропорат, используя следующую последовательность импульса: пять квадратных электрических импульсов 5 V, 50 мс продолжительность с интервалами 100 мс с помощью электропорера in vivo. Убедитесь, что расстояние между электродами составляет 5 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация параметров электропорации имеет решающее значение, чтобы избежать условий, которые могут убить хрупкие эмбриональные клетки. Параметры напряжения, длины пульса, импульсных интервалов, а также количество импульсов для ДНК и мРНК следует учитывать для различных электропорационных устройств.
  6. Инкубировать электропонные эмбрионы при 38 градусах Цельсия до желаемой стадии развития.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный рассечение стереоскопа (см. Таблица материалов) помогает экранировать трансинфицированных по сравнению с нетранспереданными эмбрионами.
  7. Если эмбрионы должны быть статически изображены, зафиксировать их в 4% параформальдегида в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
    1. Удалите эмбрионы из вительлинской мембраны, плавно разрезая по периметру фильтровальной бумаги ножницами и аккуратно снимая блестящую мембрану на поверхности вдовства.
    2. Вымойте фиксированные эмбрионы в PBS/Triton (0.1%) 2x в течение 5 мин и продолжать на месте гибридизации или иммуно-пятно при желании.
    3. Наконец, пятно эмбриона в 0,5 мкг / L DAPI в PBS /Triton (0,1%) не менее 30 мин при комнатной температуре. Вымойте эмбрионы в PBS/Triton 2x в течение 5 минут и очистите эмбрион в растворе SCALE-U2на ночь.
  8. Для анализа эффективности электропорации (см. рисунок2), используйте инструмент анализа двоичных и частиц и канал DAPI на ImageJ для получения ядерных контуров из всех ячеек на изображении.
    1. Чтобы использовать бинарный инструмент на ImageJ, используйте один z-срез в канале DAPI, содержащий большинство ячеек, и нажмите Процесс Чтобы отделить близлежащие клетки, нажмите Процесс Получить очертания клеток, нажав На анализ (анализчастиц, размер установлен до 100-500 (мкм2).
    2. Убедитесь, что большинство ячеек изложены в канале DAPI и сохранить контуры ячейки, нажав Подробнее
    3. Используйте эти контуры для получения значений интенсивности флуоресценции для мРНК и канала ДНК, открыв ранее сохраненный файл на одном z-ломтике в канале mRNA или ДНК, а затем нажмите Measure на менеджерro.
    4. Наконец, фильтруйте эти значения интенсивности, считая клетки с интенсивностью флуоресценции в качестве нетрансражейки и клетки с интенсивностью флуоресценции в качестве трансфициру.

5. Изображение FPs, кодированные электропозарённые мРНК

  1. Выберите самый здоровый и лучший электропоранный эмбрион для экспериментов по динамической визуализации, посмотрев на все электропонные эмбрионы под флуоресцентным рассеиванием стереоскопа.
    1. Продолжайте инкубировать другие электропонные эмбрионы и неэлектропорационный эмбрион (отрицательный контроль) в отдельном инкубаторе во время визуализации выбранного эмбриона в случае смерти эмбриона во время эксперимента.
  2. Для динамической визуализации используйте культуру эмбриона в целом, чтобы смонтировать ex ovo avian эмбрион, как ранее описано24,25,26 с перевернутым конфокальным микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Микроскоп оснащен инкубатором на сцене (см. Таблица материалов), который поддерживает температуру при температуре 36 градусов по Цельсию во время визуализации. Во время установки микроскопа было отмечено, что эмбрионы, инкубированные при температуре 36 градусов По Цельсию, выживают дольше, чем при более высоких температурах, возможно, потому, что лазер может вызвать локальное нагревание эмбриона. Читатели должны определить оптимальную температуру инкубации на сцене для их собственной настройки микроскопа.
    1. Для динамического изображения и визуализации эмбриогенеза, очистить электропорожский эмбрион кратко с PBS, чтобы удалить любые пузырьки, которые могут образовываться на стороне вдовне эмбриона во время процесса электропорации, перемещая эмбрион вокруг с помощью щипке в чистке PBS Решение.
    2. Поместите чистый эмбрион непосредственно на изображение блюдо, содержащее тонкий слой альбумин-агар (150 qL), убедившись, что не генерировать любые пузырьки на царной поверхности эмбриона22.
    3. Чтобы обеспечить выживание для долгосрочной визуализации, добавьте небольшой влажный свернутый кусок бумаги на внутренних краях изображения блюдо и печать блюдо с помощью парафина пленки, чтобы свести к минимуму испарение во время изображения и инкубации.
    4. Быстро переместите это блюдо в предварительно разогретую стадию конфокального микроскопа и найдите цветной краситель в эмбрионе с помощью яркого поля (LASER 20%), который идентифицирует вводимый и электропопотенный регион.
  3. Установите программное обеспечение для визуализации для желаемой цели (10 или 20x), дихроическое зеркало (488 нм для GFP nm, 561 для RFP), спектра выбросов (499-562 нм для GFP, 570-695 нм для RFP) и включите соответствующий лазер (488 нм для GFP, 561 нм для RFP).
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Электропоранная мРНК была переведена на белки, которые были замечены в течение 20 минут (см. Рисунок3). Метаданные изображений, используемые для большинства изображений в этой работе, были: перевернутый конфокальный микроскоп с 20-x целью (см. ТаблицуМатериалов); пиксельное время пребывания, 1,5 евро; среднее 4-линейное сканирование.
    1. Нажмите Live на визуализации программного обеспечения и настроить лазерную мощность для настройки, которая подходит для интенсивности флуоресценции в зависимости от каждой лазерной энергии микроскопа. Начните с изображения эмбриона с помощью 1% лазерной мощности, 800 усиления, и увеличить мощность лазера медленно на 1% шагом до тех пор, пока насыщенные пиксели видны.
    2. Следуйте этому, уменьшая мощность лазера немного, пока не насыщенных пикселей не видно больше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерная сила, выбранная для начала сеанса визуализации эмбриона, может быть хороша для более ранних временных точек, но не идеальна в более поздние временные моменты, если флуоресценция клеток со временем становится намного ярче или тусклее. Для решения этой проблемы изображение эмбриона при несколько более низких настройках мощности изначально, так как электропорированные клетки обычно становятся ярче в течение первых 6 часов после электропорации (см. Рисунок 3A-E для количественной оценки увеличения сигнала). Если более поздние изображения насыщены, продолжайте изображение с исходными настройками изображения, но сразу же после этого с более слабыми настройками изображения (меньше пинхол или слабее лазерная мощность).
    3. Изображение эмбриона каждые 3-5 минут для того, чтобы отслеживать индивидуальную миграцию клеток через различные точки времени. Для этой работы, изображения были z-стеки (50 мкм толщиной) всей электропорированной области, а также некоторые дополнительные места в нижней части z-стек в случае, если эмбрион погружается в агарозную кровать на протяжении всего сеанса изображения.
    4. Обратите внимание на то, как быстро клетки движутся, проверяя первые несколько точек времени первого фильма. Если ячейки движутся быстрыми темпами (имеется в виду, что они выйдут из области изображения в течение нескольких дополнительных точек времени), следует расширить масштаб изображения области (1x и 0,8x) или изображения другой области.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбриональные регионы в области pellucida двигаться гораздо быстрее, чем в области opaca. Кроме того, более молодые эмбрионы (HH3, HH5) часто содержат клетки, которые переживают более быстрое движение по сравнению с более старыми эмбрионами (Зgt;HH7).
    5. После визуализации электропороновой области эмбриона, изображение не-электропопорированной области того же эмбриона, чтобы определить уровни аутофлуоресценции (должен быть минимальным, если низкая мощность лазера йт;10% используется для изображения эмбриона).

6. Восстановление флуоресценции после фотоотбелевания (FRAP) для ассая мРНК целостности

ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановление флуоресценции in vivo после фотоотбелевания (FRAP) может быть использовано для определения того, как долго трансинфицированная мРНК может быть переведена на FPs. В следующем протоколе описывается эксперимент FRAP для определения периодов полураспада H2B. Цитрин мРНК в электропоретом эмбрионе.

  1. Выполните FRAP эксперименты на перевернутой конфокальный микроскоп с помощью 20x 0.8 NA цели и полностью открытой пинхол.
    1. После подтверждения электропорации H2B-Цитрин на стереомикроскопии и установка эмбриона на предварительно подогретой стадии на перевернутой конфокальный микроскоп (см. шаг 5.2.4), photobleach большую часть клеточной флуоресценции от H2B-Цитрин в различные времена точки (45 мин, 2 ч и 5 ч после электропораспорации) с помощью 405 нм лазера с 70% лазерной энергии, 100 итераций, скорость сканирования 4, что оставляет только 5% флуоресценции оставшихся.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс должен занять пару минут.
    2. Продолжайте инкубировать эмбрионы на сцене при 36 градусах Цельсия после фотоотбеления.
  2. Обязательно обратите внимание на активное деление клеток в пределах фотоотражейной области, что указывает на то, что фотоотбеленные клетки не полностью умерли после лечения.
  3. Приобретайте постотексизображения (z-stacks электропопорной области) на срок до 30 минут с регулярными интервалами времени (3 или 5 мин) с помощью конфокального микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии, используйте трансгенную линию H2B-XFP в качестве положительного контроля для обеспечения выживания клеток в фотоотбеленом регионе. Скорость восстановления флуоресценции для FP, кодированного электропопорной мРНК, должна уменьшаться, но для FP, закодированного через трансген, должна оставаться последовательной на протяжении всего фильма.
  4. Для обеспечения того, чтобы условия визуализации не пагубно влияют на выживание эмбрионов, одновременно инкубируют электропоровавшие эмбрионы, которые не являются фотоотраблированными, что может служить элементом контроля для визуализации.
  5. Для количественной оценки результатов фотоотбеления для мРНК распада после электропораспорации, отслеживать флуоресценцию клеток с течением времени (3 или 5 минут) путем измерения интенсивности флуоресценции центра (круг 7,5 мкм) каждой клетки с помощью ImageJ. Измерьте это для всех клеток в фотоотбеленой области, которые не подвергаются митоза и были полностью отбеленные.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность опустить митотические клетки из количественной оценки, так как митотические ядра имеют более сильную флуоресценцию, чем межфазные ядра из-за конденсации хроматина.
  6. Участок флуоресценции интенсивности с течением времени после отбеливателя в различных временных точек (45 мин, 2 ч и 5 ч).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

мРНК электропорация более эффективна, чем электропорация ДНК

Мы использовали pCS2. H2B-Цитрин для подготовки в пробирке транскрибируется мРНК. Так как электропорация ДНК обычно выполняется при 1-2 мкг/Зл, мы использовали эквимолярную концентрацию мРНК (рассчитанную на уровне около 0,25-0,5 мкг/Зл для электропорации МРНК). Сначала мы проверили эффективность электропорации pCS2. H2B-Цитрин ДНК по сравнению с H2B-Цитрин мРНК (в пробирке транскрибируется из SP6 промоутер pCS2 ". H2B-Citrine) путем электропоративной ДНК или мРНК отдельно в HH5 перепелиных эмбрионов затем изучение эффективности электропорации при 12 ч после электропопорации. Хотя электропорация ДНК приводит к более яркой флуоресценции в некоторых электропорированных клетках, эффективность электропорации ДНК была заметно ниже по сравнению с широко выраженной мРНК закодированными FPs(Рисунок 2A и B).

Для учета врожденной изменчивости эмбриона к эмбриону в протоколе электропорации эквимолярная комбинация мРНК, кодирующего H2B-Citrine и ДНК, выражающей H2B-mKate2, была электропотерирована в эктодерм эмбрионов HH5 и наблюдалась 12 ч постэлектропорации. При сравнении ДНК и мРНК коэлектрополяции в том же эмбрионе, ДНК, выражающая FP был также значительно и последовательно менее эффективным, чем у мРНК(рисунок 2C). Путем количественной оценки всех эмбрионов электропогарет только с мРНК, ДНК, или сочетание этих двух, мы обнаружили, что мРНК трансфекты 75% клеток в данном регионе, в то время как ДНК только трансфекты 25% клеток в данной области (Рисунок 2D). Распространение в экспрессии флуоресцентных белков, кодированных мРНК или ДНК, существенно не отличалось во всех коэлектропопонных эмбрионах(рисунок 2E).

Выражение белка быстрее в электропорации мРНК, чем электропорация ДНК

Трансинфицированная мРНК должна привести к более быстрому производству белка, так как она может быть немедленно распознана цитосолическим переводческим механизмом, как видно на рисунке 3. ДНК должна быть перемещена в ядро, транскрибирована, и мРНК транспортируется обратно в цитозол, где он признается цитозолов перевод машины, как ожидается, займет больше времени. Чтобы напрямую сравнить мРНК и показатели экспрессии ДНК производства белка, мы провели серию экспериментов курса времени, в которых мы совместно электрополярно эквимолярной комбинации ДНК (pCMV.H2B-mKate2) и мРНК (H2B-Citrine) в эктодерм эмбрионов HH5. Мы обнаружили mRNA-закодированное выражение FP около 22 мин после электропораспорации, которое продолжает увеличиваться в относительной интенсивности флуоресценции для 6 ч(Рисунок 3A-E, Дополнительный. Фильм S1b). В отличие от этого, ДНК-закодированное выражение FP впервые можно увидеть на уровне 1,5 ч после электропораляции(рисунок 3A'-E', Дополнительный. Фильм S1c) и продолжает увеличиваться в яркости до 6 ч, когда фильм был остановлен. Поскольку электропонные клетки ДНК были насыщены отметкой 6 ч, мы вновь обозначили это условие более слабыми условиями визуализации(рисунок 3F-F''). Через все временные точки этого промежуток времени (22 мин до 6 ч), мРНК трансфекты в несколько раз больше клеток, чем ДНК (Дополнительные. Фильм S1a, общая эффективность электропорации через яркое поле и DAPI не показаны, потому что эти изображения взяты из промежуток времени дикого типа перепелиного эмбриона). Исходя из этого, мы делаем вывод, что электропорация мРНК приводит к более раннему выраженного белка.

Коэлектропосация множественной МРНК высокоэффективна

Далее мы стремились дополнительно проверить эффективность электропорации мРНК путем электропоратива нескольких мРНК в область интереса. Коэлектропосирование нескольких ДНК ранее было показано, что относительно неэффективным, показывая, с числом мульти-маркировки составляет 25%, 14%, и 10% для 2, 3 и 4 ДНК конструкций электропонадутов, рассчитывается как доля от общего числа клеток11 . Сначала мы электропоровали две мРНК, которые кодируют спектрально различные ФП (Turquoise2-Golgi/H2B-Citrine) в эмбрионы HH5 и получили высокую эффективность трансфекции во всех электропорожских регионах. Мы использовали эту двойную электропорацию для захвата фильмов радиального расширения между областью pellucida и opaca в HH4 гартуляции эмбриона, изображение 2 ч после электропораляции (Дополнительный фильм S2a, b, и с). H2B-Цитрин локализован в ядре клетки и позволяет пролиферации клеток, чтобы быть прослеживается27. Бирюзова2-Golgi FP, как представляется, показывают субклеточной полярности в эмбриональных клетках, но, как представляется, не коррелирует со скоростью или направлением движущихся клеток эктодерма in vivo28. Этот фильм (Дополнительный фильм S2) показывает, что клетки электропозавелись с несколькими мРНК может продолжать нормальную клеточную активность без каких-либо видимых дефектов.

Кроме того, коэлектропосация 4 мРНК - Бирюзова2-Голги (для визуализации аппарата Golgi), LifeAct-eGFP (для визуализации F-актина), H2B-Citrine (для визуализации ядра) и мембранно-вишневого FP (для визуализации мембран) - привела к 87% трансфекции эффективность всех 4 мРНК во всех электропонных регионах(рисунок4). LifeAct-EGFP и H2B-Citrine были разделены линейным инструментом обработки несмешиваний в коммерческом программном обеспечении.

FraP ассса показывает быструю деградацию электропозаренной мРНК в течение первых двух часов после электропопора.

Хорошо известно, что голые мРНК быстро деградируют клеточными РНК29. Мы постулировали, что электропорация мРНК может быть полезна для экспериментов по потере или усилению функций, позволяя быстро и эффективно выражать белки в развивающемся эмбрионе. Поэтому было бы полезно количественно дать количественную оценку скорости распада мРНК после электропорации мРНК, так как мРНК деградирует быстрее, чем ДНК в клетках. В предыдущих сообщениях об электропорации мРНК в взрослых мышеловских нервных стволовых клетках, около 80% мРНК было выявлено 2 ч пост-электропорации qRT-PCR, но практически нет мРНК был обнаружен 24 ч после электропораспорации15. Мы стремились к дальнейшей количественной оценке экспрессии мРНК после электропораспорации, разрабатывая ассс в ивио FRAP для обнаружения уровней мРНК в электропорированных клетках.

Фотоотрахинг является необратимым разрушением фторофора, которое может произойти, когда флюорофор (флуоресцентные белки в нашем случае) находится в возбужденном состоянии, которое устраняет флуоресценцию во время наблюдения30,31. Любые испускаемые свет от флуоресцентных белков (ФП), которые могут быть обнаружены в фотоотбеленных клетках выше базовых уровней, должны, таким образом, представлять недавно переведенные FPs, закодированные нетронутыми, трансинфицированными мРНК. Поэтому мы стремились к фотоотрачеванию электропорированных клеток, чтобы устранить все существующие FP-производные флуоресценции в различных точках времени и отслеживать последующее восстановление флуоресценции.

Используя оптимизированные настройки фотоотбелекинга, как описано в разделе протокола, мы обнаружили, что фотоотбеление первоначально снижает интенсивность флуоресценции во всех фотоотбеленных ячейках на 95% при проведении асссесировки сразу после события фотоотбелекинга. Это было сделано на 45 мин, 2 ч, и 5 ч после электропореации(рисунок 5A-C). Восстановление флуоресценции в каждой клетке в фотоотбеленных области отслеживалось в течение 30 минут после фотоотбелевания в каждый момент времени путем визуализации той же области с регулярными интервалами времени (3 или 5 мин). Наши данные свидетельствуют о значительном снижении уровня трансинфицирования мРНК между 45 мин и 5 ч после электропора. Об этом свидетельствует значительное снижение FRAP, измеренное на уровне 5 ч по сравнению с 45 мин после электропораляции. Чтобы подчеркнуть восстановление флуоресценции в обесцвеченных клетках, особенно в точке времени 5 ч, мы улучшили яркость на рисунке 5A-C с помощью инструмента яркости/контрастности в ImageJ и показать эти измененные изображения на рисунке 5D-F. Интересно, что есть большая неоднородность в восстановлении флуоресценции от клетки к клетке в фотоотбеленных области на 2 ч, потому что некоторые клетки восстановить флуоресценцию быстрее, чем другие клетки(Рисунок 5E ', см.наконечники стрел ). Тем не менее, все клетки в 5 h photobleached области восстановить флуоресценцию медленнее(рисунок 5F'),чем photobleached клеток на 2 ч. Мы также обнаруживаем активно делящие клетки в пределах нашей фотоотбеленой области, предполагая, что клетки не умерли в результате процесса фотоотбелевания(рисунок 5E').

Мы количественно эти результаты на рисунке 6A, показывая нормализованную интенсивность сигнала каждой ячейки в фотоотбеленных областях в течение 30 минут после события фотоотбелевания. Для каждой клетки значения флуоресценции нормализовались против интенсивности сигнала этой клетки сразу после фотоотбеления. Эта нормализация была сделана для всех клеток во всех точках времени изображен (45 мин, 2 ч, 5 ч). Нормализованные значения восстановления флуоресценции клеток в одной и той же области, отбеленной фотографией, затем объединялись и со временем составлялись на графике после события фотоотбеления; таким образом, каждая точка на графике представляет 35 ячеек. Ненормализованные данные также показаны на рисунке 6B, в котором каждая линия представляет собой ячейку с восстановлением интенсивности сигнала флуоресценции сразу после фотоотбеления. Эти данные в целом свидетельствуют о том, что на 5 ч, все клетки истощили большую часть своей мРНК, причем большая часть этого падения происходит между 45 мин и 2 ч после электропораспорации.

Figure 1
Рисунок 1: Схема процедуры клонирования, чтобы сделать конструкцию pCS2-LifeAct-eGFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: электропорация мРНК более эффективна, чем электропорация ДНК. (A-A'') ДНК, выражающая pCS2.H2B-Citrine, была электропобита в эктодерм эмбрионов HH5. Флуоресценция наблюдалась 12 ч после электропоболезнований. Шкала бар 50 мкм.(B-B'') мРНК, выражающий H2B-Citrine был электропорам в эктодерм эмбрионов HH5. Флуоресценция наблюдалась 12 часов после электропоболезнований. Шкала бар 50 мкм.(C-C')Эквимолярная комбинация ДНК (pCMV.H2B-mKate2) и мРНК (H2B-Цитрин) была электропорбирована в эмбрионы HH5 и наблюдалась 12 ч после электропора. Три эмбриона были протестированы на условие (n No 2 экспериментов). Шкала бар 50 мкм. (D) Три эмбриона из A, B и C (9 общих эмбрионов) были количественно для эффективности электропорации с помощью инструмента анализа частиц на ImageJ. Была количественно определена область в 200 мкм от каждого эмбриона (на каждый регион было подсчитано не менее 150 клеток). Средний тире представляет среднее значение, в то время как верхние и нижние полосы представляют собой стандартное отклонение от среднего. (E) Три коэлектропора (ДНК и мРНК) эмбрионы анализируются для распространения сигнала по всем электропоранным клеткам в данной области 200 мкм. Каждый эмбрион имел около 100 клеток, положительных для электропорации мРНК и 30 клеток, положительных для электропорации ДНК. Средний тире представляет среднее значение, в то время как верхние и нижние полосы представляют собой стандартное отклонение от среднего. Существенной разницы между распространением мРНК против электронного порации ДНК нет, но электропорация мРНК гораздо эффективнее, чем у ДНК. (A-C) Размеры 425,10 х 425,10 х 55 мкм. Pixel одолеть 2,55 х. Средняя линия 4. Биты на пиксель No 16. Метаданные микроскопа - перевернутый конфокальный микроскоп, 20-кратный объектив (см. ТаблицаМатериалов) (A) Ex: 488 нм (0,05%), Эмиссионный трек S1 - 508-579 нм; (B) Ex - 488 нм (5,0%), Эмиссионный трек S1 - 508-579 нм; (C) Ex - 488 нм (5,0%), 561 нм (5,0%), Эмиссионный трек S1 - 508-579 нм; S2 606-695 нм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: мРНК электропорация показывает выражение 22 мин после электропореации и гораздо быстрее, чем электропорация ДНК. Репрезентативные изображения курса времени после мРНК (H2B-Citrine) и ДНК (pCMV.H2B-mKate2) электропорации с анализом сюжетного профиля на 22 мин(A-A''), 45 мин (B-B'),1.5 h (C-C'),3 h (D-D')и 6 ч (E-E') на начала визуализации (n No 1). Анализ профиля участка предоставляется для каждого времени, указанного в нарисованной стрелке в объединенном изображении. Каждый пик в профиле сюжета представляет собой ядро электропорированной ячейки. Клетки обычно становятся ярче в течение 6 ч интервал фильма, указывая, что мРНК по-прежнему переводится в новый флуоресцентный белок. Для точки 6 часов, изображения той же области, снятые с использованием идентичных условий изображения(E-E')и более слабых условий изображения (F-F')) показаны, потому что изображения электропорных клеток ДНК были очень насыщены с помощью первоначального условия изображения. Шкала бар 20 мкм. Размеры: 425,10 х 425,10 х 55 мкм. Изображение показано как максимальная интенсивность проекции во всех точках времени изображены. Пиксель одолеть 2,55 х. Средняя линия 4. Биты на пиксель No 16. Метаданные микроскопа - перевернутый конфокальный микроскоп, 20-x объектив (см. Таблица материалов) Ex - 488 нм (15%), 594 нм (5,0%) для первоначального; Экс - 488 нм (7,5%), 594 нм (0,5%) за последний момент времени(рисунок 2F), Эмиссионный трек S1 - 499-562 нм; S2 605-661 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Со-электропорация четырех мРНК, нацеленных на различные субклеточные структуры, является высокоэффективной. Эктодерм эмбриона HH3 был электропонасален мРНК, которые кодируют mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Citrine и мембраны-Черри. Эмбрион был зафиксирован и изображен в 4 часа после электропореации. Большинство клеток электропоратные в пределах электрода целевой области со всеми четырьмя мРНК (87%). Представленные цифры (3 эмбриона каждый, n и 2 эксперимента). Шкала бар 50 мкм. (A) Слияние всех четырех мРНК (mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Цитрин, и мембраны-Черри). (B) Только H2B-Цитрин канал (Ex - 488 нм (0,7%), Em 455-499 нм). (C) Только mTurquoise2-Golgi канал (Ex 458 нм (22,0%), Em 455-499 нм). (D) Слияние H2B-Цитрин и mTurquoise2-Golgi показывает, что Golgi конверты одной стороне ядра в большинстве клеток. (E) Только LifeAct-eGFP канал (Ex 488 нм (0,7%), Em: 455-499 нм). (F) Только Membrane-Черри канал (Ex - 594 нм (37,1%), Em S2: 570-695 нм). (G) Слияние LifeAct-eGFP и мембраны-Черри показывает перекрытие в большинстве клеток. Размеры 425.10 x 425.10. Пиксель одолеть 1,58 х. Средняя линия 4. Биты на пиксель No 16. Метаданные микроскопа - перевернутый конфокальный микроскоп, 20x объективный (см. Таблица Материалов) Ex 405 нм (2,4%), 458 нм (22,0%), 488 нм (0,7%), 594 нм (37,1%), Emission Track S1 - 455-499 нм; S2 570-695 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Фотоотражающий асспоказывает быструю деградацию электропопоза мРНК в течение первых пяти часов после электропореации. Фотоотраление области 100 м2, содержащей клетки, электропопорированные с мРНК, выражающей H2B-Citrine, осуществляется при 45 мин, 2 ч и 5 ч после электропораляции. Эмбрион был изображен через регулярные промежутки времени после фотоотбеления (3 или 5 мин). Условия фотоотбелевания следующие: 70% 405 нм лазер, 100 итераций, около 5 мин продолжительность для всей области. Шкала бар 50 мкм. (A-A') 45 мин до и после отбеливателя. B показывает эмбрион сразу после фотоотбелевания и C показывает эмбрион 30 мин после отбеливателя. Шкала бар 50 мкм. (B-B') 2 ч до и после отбеливателя. Периметр площади смещается, потому что ячейки в пределах фотоотбеленного региона немного сместились в период отбеливателя. (C-C'') 5 ч до и после отбеливателя. (D-D'') Те же изображения, что и A-A'' с повышенной яркостью (максимальное значение скорректировано до 11550 для повышения яркости после сбора). (E-E')) Те же изображения, что и B-B'' с повышенной яркостью (максимальное значение скорректировано до 11550 для повышения яркости после сбора). Белые наконечники стрел указывают на клетки, которые имеют более высокое восстановление флуоресценции, чем окружающие клетки. Цианисстрел указывает на фотоотраблированную клетку, которая недавно подверглась митозам. (F-F') Те же изображения, что и C-C'' с повышенной яркостью (максимальное значение скорректировано до 11550 для повышения яркости после сбора). Размеры 425.10 x 425.10 x 42 мкм. Изображение показано как максимальная проекция интенсивности во всех отображаемых точках времени. Пиксель одолеть 1,58 х. Средняя линия 4. Биты на пиксель No 16. Метаданные микроскопа - перевернутый конфокальный микроскоп, 20-кратный объектив (см. Таблица Материалов) Ex 488nm (1,5%), Эмиссионный трек S1 508-553 нм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более крупную версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Количественная оценка восстановления флуоресценции в фотоотбеленных клетках. (A) Интенсивность флуоресценции всех клеток в отбеленных регионах (35 клеток) отслеживались для каждой одной клетки в течение каждого периода после отбеливателя. Наблюдается значительное снижение интенсивности восстановленного сигнала с 45 мин до 2 ч, а затем меньшее падение с 2 ч до 5 ч. Верхняя панель ошибок отображается для каждой точки, что представляет собой стандартное отклонение от среднего. Показанная линия представляет собой линейную регрессионную линию. R2 за 45 мин, 2 ч и 5 ч составляет 0,83, 0,58 и 0,84 соответственно. Верхняя половина панели ошибок отображается для каждой точки. (B) Интенсивность флуоресценции всех клеток в отбеленных регионах (35 клеток) отслеживались для каждой одной клетки в течение каждого периода после отбеливателя и графики без нормализации. Существует большое снижение скорости восстановленной интенсивности сигнала с 45 мин до 2 ч, а затем меньшее падение с 2 ч до 5 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительный фильм 1: мРНК электропорации приводит к более ранней экспрессии белка, чем электропорация ДНК. H2B-Citrine mRNA и H2B-mKate2 ДНК электропонавались в эктодерм эмбриона HH5. Регион, изображенный на границе экстраэмбриональной и эмбриональной ткани. Шкала бар 50 мкм. ()Как H2B-Цитрин и H2B-mKate2 канал показал (Ex - 488 нм (15%), 594 нм (5,0%), Em: 499-562 нм; S2: 605-661 нм). (b) Показан только мРНК H2B-Citrine (Ex - 488 нм (15%), Em 499-562нм. (c) Показан только канал ДНК H2B-mKate2 (Экс- 594 нм (5,0%), Em - 605-661 нм). Размеры 850.19 x 850.19 x 110 мкм. Изображение показано как максимальная проекция интенсивности во всех точках времени изображено. Пиксель одолеть 2,55 х. Средняя линия 4. Биты на пиксель No 16. Метаданные микроскопа: перевернутый конфокальный микроскоп, 20-кратный объектив (см. Таблица Материалов) Ex 488 нм (15%), 594 нм (5,0%), Эмиссионный трек S1 - 499-562 нм; S2 605-661 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный фильм 2: Коэлектропосация мРНК позволяет динамически изучить различные клеточные поведения. Радиальное расширение клеток между эмбриональной и внеэмбриональной границей электропогадляется с помощью мРНК (H2B-Citrine и mTurquoise2-Golgi) и изображением во время внешней миграции. Этот фильм был изображен конфокальной микроскопии от 2 до 5 ч после электропораспорации путем визуализации каждые 6 минут. Шкала бар 50 мкм.  (a) Как H2B-Цитрин и mTurquoise2-Golgi каналы показали (Ex 458 нм (28%), 488 нм (5,0%), Em 446-526 нм; S2: 508-553 нм). (b) Показан только канал H2B-Citrine (Ex 488 нм (5.0%), Em S2: 508-553 нм). (c) Показан только канал mTurquoise2-Golgi (Ex 458 нм (28%), Em 446-526 нм). Размеры 425.10 x 425.10 x 32.5 мкм. Изображение показано как максимальная проекция интенсивности во всех точках времени изображенных. Пиксель обит 0,79 х. Средняя линия 4. Биты на пиксель No 16. Метаданные микроскопа - перевернутый конфокальный микроскоп, 20-кратный объектив (см. Таблица Материалов) Ex 458 нм (28%), 488 нм (5,0%), Эмиссионный трек S1 - 446-526 нм; S2 508-553 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе мы поэтапно давали инструкции о том, как точно вводить микроинъекцию и электропорат мРНК в клетки гаструляционных перепелиных эмбрионов. Мы продемонстрировали, что в пробирке синтезированная электропорация мРНК позволяет быстро и эффективно выражать флуоресцентные белки (ФП) в гастраляющих перепелиных эмбрионах(рисунок 2 и 3). Флуоресценция из белка H2B-цитрин в переводе с электропопорованного мРНК может быть обнаружена с помощью конфокальной микроскопии в течение 20 минут и увеличена флуоресценция FP в течение нескольких часов (Рисунок 3, Дополнительный фильм 1). Это удивительно быстро и близко к предполагаемому времени созревания для цитрин32,33. ФП, выраженные из векторов ДНК, были обнаружены после 2-3 ч(рисунок 3, Дополнительный. Фильм 1), который похож на предыдущие доклады8,34,35. Различные FPs имеют уникальные сроки созревания, поэтому передовое планирование будет гарантировать, что идеальный FP выбран с точки зрения спектрального различия и созревания кинетики желаемого для эксперимента. Кроме того, синтезированные мРНК более эффективно сотрансцируют эмбриональные клетки, чем векторы ДНК11. Более высокая эффективность трансфекции приводит к тому, что больше клеток трансфицируется в интересуемом регионе с одним(рисунок2) или несколькими популяциями мРНК (рисунок4).

Стабильность мРНК строго регулируется и может быть затронута полиаденилацией, сплайсингом, переводом, вторичной структурой и непереведенными регионами, чтобы назвать несколько36,37. Период полураспада как эндогенных, так и синтезированных мРНК в клетках может варьироваться от минут додней 36,38. Мы использовали в виво флуоресценции восстановления после фотоотрубения (FRAP) для отбеливания существующих мРНК-кодированных H2B-цитрин белков и наблюдается наиболее заметных H2B-цитрин флуоресценции восстановления в течение первых 2 часов после электропоречи(Рисунок 5 и 6). Различные мРНК, несомненно, будут иметь различные периоды полураспада в зависимости от их длины, внутренние последовательности, 5' и 3 ' модификации36,37, так что каждый должен быть прослеживается при желании.

Важная визуализация обычно требует компромисса между оптимальными условиями для высококачественной визуализации и быстрой, менее токсичной визуализацией39,40. При визуализации рекомендуется использовать как можно более низкую мощность лазера, чтобы свести к минимуму фотоотбеление и фотоповреждение эмбриональных клеток (см. примечания к шагу 5.3 протокола)40. Изменение настройки микроскопа для быстрых коллекций (например, более быстрые скорости сканирования, меньше усреднения) часто может помочь, не теряя необходимого разрешения изображения41. Наконец, следует принимать меры по обработке и манипулированию эмбрионами во время уборки урожая, электропорации и визуализации (см. шаг 4). Эмбрионы на ранних стадиях являются деликатными и могут быть легко повреждены.

В целом, точное время и точная локализация электропорации мРНК позволяют осуществлять эксперименты по возмущению, которые окунаются в быстрое выражение, эффективность совместного трансфекции и быстрое разрушение транскриптов мРНК. Чрезмерное выражение или неэкспрессия гена интереса может быть достигнуто путем электропорации синтезированных мРНК. Tittering концентрация для каждого мРНК имеет решающее значение, как электропоратив слишком много мРНК может вызвать неспецифическую клеточной токсичности, в то время как слишком мало мРНК не может маркировать желаемые клетки или вызвать фенотипические изменения адекватно. Множество векторов, генерируемых для синтеза в пробирке мРНК, которые кодируют fp-флейфы маркеров для визуализации или измененных генных продуктов для возмущений различных биологических процессов, уже существуют из различных систем моделей животных. Многие из этих конструкций, предназначенных для синтеза in vitro mRNA, могут быть быстро и недорого получены из некоммерческих плазменных хранилищ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конфликта интересов, чтобы объявить.

Acknowledgments

Мы благодарим Дэвида Хасса за полезное понимание этой работы. Эта работа была частично поддержана Фондом Роуз-Хиллз Летний научно-исследовательский стипендий (2016-2018) и USC Проректор аттестации научно-исследовательского стипендий в М.Т., Сабан научно-исследовательский институт intramural Подготовки Предварительной докторской премии в доктора медицинских наук, и Университет Награда программы по исследованию студентов южной Калифорнии, присужденная R.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Garland Science. (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Tags

Биология развития Выпуск 148 электропорация мРНК замедленной микроскопии перепела птичья эмбрион FRAP
Быстрое и эффективное выражение нескольких белков в птичьих эмбрионах с использованием мРНК Электропорации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tran, M., Dave, M., Lansford, R.… More

Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter