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Developmental Biology

Expression rapide et efficace des protéines multiples dans les embryons aviaires à l'aide de l'électroporation de l'ARNm

Published: June 7, 2019 doi: 10.3791/59664

Summary

Nous rapportons l'électroporation d'ARN messager (ARNm) comme méthode qui permet l'expression rapide et efficace des protéines multiples dans le système de modèle d'embryon de caille. Cette méthode peut être utilisée pour étiqueter les cellules fluorescentes et enregistrer leurs mouvements in vivo par microscopie en accéléré peu de temps après l'électroporation.

Abstract

Nous rapportons que l'électroporation d'ARNm permet aux protéines fluorescentes d'étiqueter les cellules dans les embryons vivants de caille plus rapidement et plus largement que l'électroporation d'ADN. L'efficacité de transfection élevée permet à au moins 4 ARNm distincts d'être co-transfectés avec une efficacité de 87 %. La plupart des ARNm électroporated sont dégradés au cours des 2 premiers heures post-électroporation, ce qui permet d'effectuer des expériences sensibles au temps dans l'embryon en développement. Enfin, nous décrivons comment imager dynamiquement les embryons vivants électroporated avec des ARNM qui codent diverses protéines fluorescentes ciblées sous-cellulaires.

Introduction

L'électroporation est une méthode de transfection physique qui utilise une impulsion électrique pour créer des pores transitoires dans la membrane plasmatique, permettant à des substances comme les acides nucléiques ou les produits chimiques de passer dans le cytosol. L'électroporation est largement utilisée pour délivrer de l'ADN dans les bactéries, les levures, les plantes et les cellules de mammifères1,2,3. Il est couramment utilisé pour introduire des charges utiles génétiques dans les cellules cibles et les tissus dans l'embryon aviaire en développement pour étudier le contrôle génétique du développement ou l'étiquetage des populations migrantes de cellules4,5,6, 7. Cependant, plusieurs limitations expérimentales existentégalement avec l'électroporation d'ADN 8. Par exemple, l'électroporation de l'ADN introduit souvent des nombres très variables de vecteurs d'expression par cellule, puis les ARNm et les protéines qu'ils codent. Cette variabilité peut conduire à une hétérogénéité cellulaire considérable qui complique à la fois l'analyse d'image et l'interprétation des données9,10. De plus, les protéines issues de l'électroporation de l'ADN commencent seulement à exprimer 3 h après l'électroporation et n'atteignent pas l'efficacité maximale du nombre cellulaire et de l'intensité de fluorescence jusqu'à 12 h, probablement en raison du temps nécessaire pour le transfert dans le noyau et compléter transcription et traduction in vivo11.

En revanche, la transfection d'ARNm a été effectivement utilisée dans une variété de systèmes modèles, y compris les ovocytes Xenopus laevis par microinjection12,13, reprogrammant les cellules souches humaines par transfection de lipofectamine d'ARNm14 , et électroporating cellules souches neurales récalcitrantes chez les souris adultes15. Nous avons testé la capacité de l'électroporation de l'ARNm à étiqueter efficacement les cellules au cours du développement embryonnaire aviaire précoce à l'aide de mARN synthétisés in vitro qui codent des protéines fluorescentes distinctes (F). Pour nos études, nous avons utilisé le vecteur pCS2MD, un vecteur d'expression polyvalent couramment utilisé pour exprimer des protéines dans les embryons de Xenopus et de poisson zèbre. Les promoteurs de la polymérase d'ARN SP6 et T7 dans le pCS2MD permettent la synthèse de l'ARNm et des protéines de tout gène cloné lorsqu'ils sont utilisés dans un système de transcription/traduction in vitro.

Ici, nous démontrons que l'électroporation d'ARNm permet l'expression rapide et efficace des protéines fluorescentes (FPs) dans les embryons de caille gastrulating. Nous avons conçu et généré de nombreux vecteurs d'expression utilisés dans ces études. Par exemple, nous avons sous-cloné le gène LifeAct-eGFP16 dans le vecteur pCS2MD17 pour l'exprimer du promoteur CMV et du promoteur SP6. Le gène inséré se trouve en aval du promoteur SP6 et en amont de la queue SV40 poly(A)18. Dans les embryons co-électroporated avec l'ARNm et l'ADN, les F codés des ARNm transcrits in vitro ont été détectés pour la première fois dans les 20 minutes de l'électroporation, tandis que les PF des vecteurs d'expression d'ADN n'ont été détectés qu'après 3 h. Plusieurs ARNm codant pour le nucléaire, Golgi, et Les protéines membranaires peuvent être électroporated dans un embryon simultanément, ayant pour résultat l'expression rapide et efficace des protéines multiples dans les cellules individuelles. Enfin, à l'aide d'un rétablissement in vivo de fluorescence après l'essai de photoblanchiment (FRAP), nous montrons qu'une majorité des ARNm électroporated se désintègrent dans les 2 h. Ainsi, la production initiale rapide de protéine combinée avec la nouvelle traduction limitée de protéine fait l'électroporation d'ARNm une technique valable quand le contrôle temporel de l'expression est nécessaire.

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Protocol

Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives approuvées par l'Hôpital pour enfants de Los Angeles et les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Californie du Sud.

1. Vecteurs d'expression à base de pCS2 de génération

  1. Pour cloner pCS2.Lifeact-eGFP, préparez l'épine dorsale vectorielle en digérant 2 g de pCS2.CycB1-GFP (une construction contenant un insert différent) avec BamHI (10 U) et BsrGI (10 U) dans un tampon de digestion approprié (voir Tableau des matériaux) dilué à 1x en réaction totale volume de 50 oL pour 1 h à 37 oC (voir la figure 1 pour le schéma de la procédure de clonage).
    1. Déphosphoryez les extrémités 3'OH libres de l'épine dorsale vectorielle de la réaction enzymatique de restriction en ajoutant la crevette Alkaline Phosphatase (1 U). Incuber pendant 30 min à 37 oC.
    2. Exécuter le mélange entier dans un gel d'agarose de 1% /1x Tris Acetate EDTA (TAE) tampon à 90 V pour 50 min, puis tacher le gel dans une solution de 0,5 g/mL de bromure d'éhidium dans 1x tampon TAE pendant 15 min avec bascule douce. Assurez-vous également de charger des marqueurs de poids moléculaires dans une voie libre pour aider à déterminer la taille de l'ADN.
    3. À l'aide d'un transilluminateur UV sans danger pour l'ADN afin d'éviter de piquer les ADN, découpez rapidement l'épine dorsale vectorielle (taille prévue de la bande de 4 kb) du gel d'agarose et isole zions le fragment d'ADN de la pièce de gel à l'aide d'un kit de purification du gel en utilisant les instructions du fabricant.
  2. Simultanément à l'étape 1.1, préparer l'insert en digérant 2 g de pEGFP-N1-Lifeact avec BglII (10 U) et BsrGI (10 U) dans un tampon de digestion approprié dilué à 1x dans un volume de réaction total de 50 oL pour 1 h à 37 oC. Exécuter l'ensemble du mélange dans un gel d'agarose 1% pour isoler la bande de 800 bp comme expliqué précédemment à l'étape 1.1.2-1.1.3.
  3. Après que le vecteur et l'insert soient purifiés et quantifiés sur le spectrophotomètre, combinez 50 ng du vecteur et 38 ng de l'insert (rapport molaire de 1:3 de vecteur à insérer) dans le tampon de ligase d'ADN T4 avant d'ajouter la ligase d'ADN T4 pour catalyser la réaction de ligature. En outre, mettre en place un contrôle sans ADN, un contrôle vectoriel seulement, et un insert seulement de contrôle. Incuber toutes les réactions à température ambiante pendant 30 min.
    1. Transformer 1 L du mélange de ligature (s) en E. coli DH10 compétent. En outre, transformer l'eau seulement contrôle négatif et 20 pg de pUC19 contrôle positif. Étendre les bactéries sur les plaques d'agar Luria Broth (LB) contenant une ampicilline de 50 g/mL et incuber pendant la nuit à 37 oC.
    2. Le lendemain matin, comptez les colonies dans chaque assiette.
      REMARQUE: Idéalement, il ne devrait pas y avoir de colonies sur les plaques de contrôle négatives, de colonies sur les plaques de ligation vectorielles, et moins de colonies sur la plaque vectorielle seulement.
    3. Choisissez au moins 8 colonies bactériennes de la plaque d'agar transformées avec le mélange de ligature vectorielle et inoculez-les à l'aide de cure-dents stériles ou de pointes de pipet dans 2 ml de bouillon LB liquide contenant 50 g/mL d'ampicilline.
    4. Extraire l'ADN de chacun des clones à l'aide de kits de miniprep plasmiques commerciaux.
    5. Exécuter un digest de restriction diagnostique à l'aide de 500 ng d'ADN de chaque clone à l'aide de NotI (10 U) et BamHI (10 U) dans le tampon de digestion approprié dilué à 1x pour 1 h à 37 oC et exécuter l'ADN digéré sur un gel agarose 1% dans 1x tampon TAE. Les tailles de bande attendues pour les clones positifs pCS2.Lifeact-eGFP sont de 3,9 kb et 978 pb.
    6. Transformez 1 pg-100 ng d'ADN du clone positif en E. coli DH10 compétent, et préparez 3-4 réactions miniprep comme détaillé dans les étapes précédentes pour obtenir une quantité suffisante d'ADN pour la réaction de transcription in vitro (10 'g minimum).

2. Préparation de l'ARNm par In Vitro Transcription

  1. Linéarisez 10 g de pCS2.LifeAct-eGFP à l'extrémité 3' de l'insert avec NotI (10 U) dans un tampon de digestion approprié dilué à 1x dans un volume de réaction total de 50 oL à 37 oC pendant la nuit.
    REMARQUE: Pour prévenir la contamination par la RNase et réduire la dégradation de l'ARNm, portez des gants tout en manipulant des échantillons d'ARNm.
  2. Purifier l'ADN à l'aide d'un mélange de phénol: chloroforme: isoamyl alcool (25:24:1, v/v).
    1. Ajouter 150 l'eau sans RNase pour rendre le volume total de la réaction de digestion égal à 200 l. Ensuite, ajoutez 200 l de phénol: chloroforme: isoamyl alcool et vortex le mélange pour 20 s.
    2. Centrifugeuse dans un microfuge à vitesse maximale (18 400 x g) pendant 2 min. Retirez soigneusement la phase aqueuse supérieure qui contient l'ADN linéaire. Répétez cette étape pour éliminer les impuretés supplémentaires et veillez à ne pas perturber le précipité blanc qui peut se former entre les phases inférieures et supérieures liquides.
  3. Précipitez l'ADN linéaire en ajoutant 1/10 volume 3M d'acétate de sodium (sans RNase) et 2,5 volumes d'éthanol à 100%. Laisser le mélange à -20 oC pendant 30 min, puis pelleter l'ADN en centrifuge antlayant à vitesse maximale (18 400 x g).
    1. Laver le granule d'ADN avec 70% d'éthanol, puis sécher à l'air le granule pour 'gt'5 min.
    2. Dissoudre la pastille d'ADN dans 5 l'eau sans RNase. Quantifier l'ADN par spectrophotomètre.
      REMARQUE: La concentration d'ADN prévue est de 0,5 à 1 g/L avec un rapport A260/A280 entre 1,7 et 2,0.
  4. Utilisez 1 g de l'ADN pCS2.LifeAct-eGFP linéaire pour la transcription in vitro (IVT). Suivez les instructions du fabricant dans le kit commercial (voir Tableau des matériaux) pour inclure 10 L d'analogique de bouchon (concentration finale de 0,8 mM) et de NTP (concentration finale 1 mM pour L'ATP, CTP et TTP; 0,2 mM pour GTP), 2 oL de mémoire tampon de réaction 10x (concentration finale 1x), 2 L de polymérase d'ARN SP6, et eau sans RNase jusqu'à 20 l.
    1. Incuber le mélange IVT pendant environ 2 h ou plus, selon la taille de la transcription.
      REMARQUE : L'incubation de 2 h fonctionne bien pour une transcription de 3 kb, mais l'incubation de nuit fonctionne mieux pour des transcriptions qui sont plus grandes que 5 kb.
    2. Pour enlever les nucléotides libres de la réaction de transcription, ajouter 30 l de la solution de précipitation d'ARN De LiCl (7,5 M de chlorure de lithium, 50 mM EDTA) pour précipiter l'ARNm. Vortex le mélange brièvement et stocker à -20 oC pendant 30 min. Faire tourner l'ARNm vers le bas pendant 15 min dans un microfuge à vitesse maximale (18 400 x g) et rincer à 70 % d'éthanol (sans RNase).
  5. Dissoudre l'ARNm synthétisé dans 15 'L d'eau sans RNase. Distribuer l'ARNm synthétisé à 5 l/tube (3 tubes au total) et le placer à -80 oC pour un stockage à long terme. Quantitate l'ARNm à l'''insévitrice à l'égard d'un spectrophotomètre.
    REMARQUE: Le rendement prévu est de 15 à 20 g d'ARNm (1 g/L). 1 oL (1 g/L) est suffisant pour une expérience avec 10 embryons, en supposant que l'ARNm est dilué de 1 g/L à 500 ng/L et que chaque embryon est injecté avec 200 nL. Chaque tube doit donc contenir suffisamment d'ARNm pour les expériences de 5.
  6. Exécuter 300 ng d'ARNm sur un gel d'agarose de 1 % dans un tampon 1x TAE après avoir nettoyé tout l'équipement de gel avec la solution de décontamination RNase (p. ex., RNase Away) et s'assurer que l'ARNM apparaît sous forme d'une seule bande (plusieurs bandes peuvent être présentes si des structures secondaires se forment) et qu'aucune frottis ppears dans la voie de gel, qui indique la dégradation de l'ARN.

3. Préparation du mélange d'électroporation d'ARNm

  1. Décongeler et diluer l'ARNm à la concentration désirée (250-500 ng/L dans l'eau sans RNase fonctionne bien pour tous les ARNm testés dans ce travail). Ajouter 1/10 volume de colorant coloré (voir Tableau des matériaux, concentration finale sans RNAse, 0,1%) pour aider à visualiser le site d'injection d'ARNm et à placer correctement les électrodes.
    REMARQUE :
    Si l'ADN et l'ARN sont combinés pour effectuer une co-électroporation, assurez-vous que l'ADN est exempt de contamination des RNases en utilisant l'extraction de phénol-chloroforme et la précipitation d'éthanol avant l'ARNm et le mélange d'ADN.
    1. Assurez-vous de préparer un contrôle négatif à l'aide d'une solution d'électroporation simulée (sans AJOUT d'ARN). Si possible, préparez un contrôle positif à l'aide de l'ARNm prévalidé (ARNm qui a été démontré pour produire FP avec succès dans les expériences précédentes).
      REMARQUE: Le contrôle négatif est essentiel pour toutes les expériences d'imagerie afin d'établir des niveaux de fluorescence de fond pour la normalisation des données. Le contrôle positif est particulièrement important lorsque vous travaillez avec l'ARNm nouvellement transcrit en aidant à confirmer que les paramètres d'électroporation ont fonctionné.
  2. Conserver la solution d'électroporation de l'ARNm sur une boue de glace pour éviter la dégradation jusqu'à ce qu'elle soit prête à procéder à l'électroporation.

4. Les ARM electroporate dans les embryons de caille vivante

  1. Recueillir les œufs de caille fécondés fraîchement pondus tous les jours et les conserver à 13 oC dans un réfrigérateur humidifié pendant au plus 1 semaine. Incuber les œufs de caille à 38 oC jusqu'aux stades de développement embryonnaires souhaités19,20,21.
    REMARQUE: HH3 à HH5 ont été utilisés dans cette étude pour la formation image statique et dynamique. Pour les embryons HH3, laisser les œufs à température ambiante pendant 2 h avant la récolte rend le processus d'isolement beaucoup plus facile car les embryons sont généralement plus résistants aux manipulations physiques lorsqu'ils sont refroidis.
  2. Isoler et préparer les embryons selon le système de culture de la CE22. Recueillir au moins 5 embryons par condition, dont au moins un pour servir de contrôle négatif (non électroporated).
    1. Casser délicatement et verser l'œuf dans un plat Petri de 10 cm. Retirer la majorité de l'albumine épaisse avec une pipette de transfert et retirer l'albumine épaisse restante autour de l'embryon en essuyant doucement la surface du jaune avec une lingette de tissu pour s'assurer que l'embryon colle étroitement à l'anneau de papier.
    2. Poser du papier filtre prédécoupé (voir Tableau des matériaux) sur l'embryon et utiliser des ciseaux pour couper en douceur autour du périmètre de l'embryon.
    3. Utilisez une pipette Pasteur pour sous-tendre l'embryon avec PBS, en utilisant des ruisseaux doux pour évacuer tout jaune collant à l'embryon.
      REMARQUE: Cette étape est essentielle lorsqu'on travaille avec des embryons plus jeunes (lt;HH3) parce que ces embryons ont tendance à coller plus au jaune et se détachent souvent de la membrane vitelline lors des étapes de lavage ultérieures.
    4. Tirez lentement l'anneau embryon/papier à un angle oblique vers le haut et hors du jaune dans un plat Petri rempli de PBS pour un nettoyage ultérieur. Une fois que la majeure partie du jaune a été enlevée, placez le côté ventral de l'embryon vers le haut sur un plat Petri de 35 mm recouvert d'un mélange semi-solide d'agar/albumen.
  3. Préparer six à huit microcapillaires en verre de 10 cm de long (O.D. et 1,2 mm) à l'aide d'un instrument de traction micropipette en verre.
  4. Placez le côté ventral de l'embryon vers le haut dans la chambre d'électroporation remplie de PBS. À l'aide d'un microcapillaire en verre, injecter un bolus de 200 nL de l'ARNm ou de l'ADN/arnde mélange d'électroporation dans la cavité entre l'épiblaste et la membrane vitelline couvrant la région désirée.
    REMARQUE: Toute la zone antérieure pour la pellucida et une partie de la zone pour l'opaca ont été électroporated dans la plupart des expériences montrées dans ce manuscrit.
  5. Placer les électrodes positives et négatives (électrode carrée plate de platine; longueur latérale de 5 mm) sur le dessus et le bas de l'embryon respectivement et électroporate en utilisant la séquence d'impulsion suivante : cinq impulsions électriques carrées de 5 V, durée de 50 ms avec des intervalles de 100 ms à l'aide d'un électroporateur in vivo. Assurez-vous que la distance entre les électrodes est de 5 mm.
    REMARQUE: L'optimisation des paramètres d'électroporation est cruciale pour éviter les conditions qui peuvent tuer les cellules embryonnaires fragiles. Les paramètres de tension, la longueur des impulsions, les intervalles d'impulsions et le nombre d'impulsions pour l'ADN et l'ARNm devraient être pris en considération pour divers dispositifs d'électroporation.
  6. Incuber les embryons électroporated à 38 oC jusqu'au stade de développement souhaité.
    REMARQUE: Un stéréoscope de dissection fluorescent (voir Tableau des matériaux)aide à dépister les embryons transfectés par rapport aux embryons non transfectés.
  7. Si les embryons doivent être représentés de façon statique, fixez-les en 4 % de paraformaldéhyde en PBS pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC.
    1. Retirez les embryons de la membrane vitelline en coupant en douceur le périmètre du papier filtre avec des ciseaux et en épluchant la membrane brillante sur la surface dorsal avec des forceps pointus doucement.
    2. Laver les embryons fixes dans PBS/Triton (0,1 %) 2x pendant 5 min et continuer avec l'hybridation in situ ou immunostaining si désiré.
    3. Enfin, tachez l'embryon dans un DAPI de 0,5 g/L dans PBS/Triton (0,1 %) pendant au moins 30 min à température ambiante. Laver les embryons dans PBS/Triton 2x pendant 5 min et effacer l'embryon dans la solution SCALE-U223 pendant la nuit.
  8. Pour analyser l'efficacité de l'électroporation (voir Figure 2), utilisez l'outil d'analyse binaire et particule et le canal DAPI sur ImageJ pour obtenir des contours nucléaires de toutes les cellules de l'image.
    1. Pour utiliser l'outil binaire sur ImageJ, utilisez une seule tranche z dans le canal DAPI contenant une majorité de cellules et cliquez sur Processus 'gt; binaire 'gt; Faire binaire. Pour séparer les cellules voisines, cliquez sur Processus 'gt; binaire 'gt; Watershed. Obtenir les contours des cellules en cliquant sur Analyser les particules, analysez les particules , taille définie à 100-500 (m2).
    2. Assurez-vous qu'une majorité des cellules sont décrites dans le canal DAPI et enregistrer les contours de la cellule en cliquant sur Plus de 'gt; Enregistrer sur le gestionnaire de retour d'investissement fenêtre pop-up.
    3. Utilisez ces contours pour obtenir des valeurs d'intensité de fluorescence pour l'ARNm et le canal d'ADN en ouvrant le fichier précédemment enregistré sur une seule tranche z dans l'ARNm ou le canal d'ADN, puis cliquez sur Mesurer sur le gestionnaire de retour sur investissement.
    4. Enfin, filtrez ces valeurs d'intensité, en comptant les cellules dont l'intensité de fluorescence n'est pas transfectée et les cellules dont l'intensité de fluorescence est transfectée.

5. FPs d'image codés par des ARNm électroporated

  1. Choisissez l'embryon le plus sain et le mieux électroporated pour les expériences d'imagerie dynamique après avoir examiné tous les embryons électroporated sous le stéréoscope fluorescent de dissection.
    1. Continuer à incuber les autres embryons électroporated et l'embryon non électroporated (le contrôle négatif) dans un incubateur séparé tout en imagerie de l'embryon choisi au cas où cet embryon meurt pendant l'expérience.
  2. Pour l'imagerie dynamique, utilisez la culture d'embryons aviaires ex ovo à monture entière telle qu'elle a été décrite précédemment24,25,26 avec un microscope confocal inversé.
    REMARQUE :
    Le microscope est équipé d'un incubateur sur scène (voir Tableau des matériaux)qui maintient la température à 36 oC pendant l'imagerie. On a observé au microscope que les embryons incubés à 36 oC survivent plus longtemps qu'à des températures plus élevées, peut-être parce que le laser peut causer un chauffage local sur l'embryon. Les lecteurs doivent déterminer la température optimale d'incubation sur scène pour leur propre mise en place au microscope.
    1. Pour imager et visualiser dynamiquement l'embryogenèse, nettoyez brièvement l'embryon électroporated avec pbS pour enlever toutes les bulles qui peuvent se former sur le côté dorsal de l'embryon pendant le processus d'électroporation en déplaçant l'embryon autour en utilisant des forceps dans un PBS propre solution.
    2. Placez l'embryon propre directement sur un plat d'imagerie contenant une fine couche d'albumen-agar (150 l) en veillant à ne pas générer de bulles sur la surface dorsale de l'embryon22.
    3. Pour assurer la survie de l'imagerie à long terme, ajoutez un petit morceau de papier de soie roulé humide sur les bords intérieurs du plat d'imagerie et scellez le plat à l'aide d'un film paraffine pour minimiser l'évaporation pendant l'imagerie et l'incubation.
    4. Déplacez ce plat rapidement au stade pré-chauffé d'un microscope confocal et localisez le colorant coloré dans l'embryon à l'aide du canal brightfield (PMT laser 20%), qui identifie la région injectée et électroporated.
  3. Définir le logiciel d'imagerie à l'objectif souhaité (10 ou 20x), miroir dichroic (488 nm pour GFP nm, 561 pour la DP), spectres d'émission (499-562 nm pour GFP, 570-695 nm pour la DP), et allumer un laser approprié (488 nm pour GFP, 561 nm pour la DP).
    REMARQUE :
    L'ARNm électroporated a été traduit en protéines qui ont été observées dans les 20 minutes (voir la figure 3). Les métadonnées d'imagerie utilisées pour la plupart des images de cet article étaient : un microscope confocal inversé avec un objectif 20x (voir Tableau des matériaux); temps d'habiter le pixel, 1,5 's; moyenne des scans à 4 lignes.
    1. Cliquez en direct sur le logiciel d'imagerie et ajustez la puissance laser à un réglage qui convient à l'intensité de fluorescence en fonction de chaque puissance laser microscope. Commencez par l'imagerie de l'embryon en utilisant 1% de puissance laser, 800 gain, et augmenter la puissance laser lentement par 1% incréments jusqu'à ce que les pixels saturés sont vus.
    2. Suivez ceci en diminuant légèrement la puissance du laser jusqu'à ce qu'aucun pixel saturé ne soit plus vu.
      REMARQUE: La puissance laser choisie pour le début d'une séance d'imagerie d'un embryon peut être bonne pour les points de temps plus tôt, mais pas idéale à des moments ultérieurs si la fluorescence des cellules devient beaucoup plus brillante ou plus faible au fil du temps. Pour remédier à cette situation, imagez l'embryon à des réglages de puissance légèrement inférieurs, d'abord, puisque les cellules électroporateds s'éclaircissent généralement au cours des 6 premières heures suivant l'électroporation (voir la figure 3A-E pour la quantification de l'augmentation du signal). Si les images ultérieures sont saturées, continuez à imager avec les paramètres d'imagerie d'origine, mais prenez une image supplémentaire immédiatement après avec des réglages d'imagerie plus faibles (plus petit trou d'épingle ou puissance laser plus faible).
    3. Imagez l'embryon toutes les 3-5 min afin de suivre la migration cellulaire individuelle à travers différents points de temps. Pour ce travail, les images étaient des z-stacks (50 m d'épaisseur) de toute la zone électroporated, plus un peu d'espace supplémentaire vers le bas de la z-pile au cas où l'embryon s'enfonce dans le lit d'agarose tout au long de la séance d'imagerie.
    4. Observez à quelle vitesse les cellules se déplacent en vérifiant les premiers points de temps du premier film. Si les cellules se déplacent à un rythme rapide (ce qui signifie qu'elles quitteront la zone de la région imagedans un délai de quelques points de temps plus), envisagez d'étendre le zoom de la zone d'image (1x à 0,8x) ou d'imaginer une autre région.
      REMARQUE: Les régions embryonnaires de la région pellucida se déplacent beaucoup plus rapidement que celles de la région opaca. En outre, les embryons plus jeunes (HH3, HH5) contiennent souvent des cellules qui subissent un mouvement plus rapide par rapport aux embryons plus âgés (HHH7).
    5. Après l'imagerie de la région électroporated de l'embryon, imagez une région non électroporated du même embryon pour déterminer les niveaux d'autofluorescence (devrait être minime si la faible puissance laser est utilisée pour l'image de l'embryon).

6. Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) pour évaluer l'intégrité de l'ARNm

REMARQUE: Une récupération in vivo de fluorescence après l'essai de photoblanchiment (FRAP) peut être employée pour déterminer combien de temps l'ARNm transfecté pourrait être traduit en FPs. Le protocole suivant décrit une expérience FRAP pour détecter la demi-vie de H2B. ARNm de citrine dans un embryon électroporated.

  1. Effectuez des expériences FRAP sur le microscope confocal inversé à l'aide d'un objectif 20x 0.8 NA et d'un trou d'épingle complètement ouvert.
    1. Après avoir confirmé l'électroporation de H2B-Citrine sur le stéréomicroscope et mis l'embryon sur la scène préchauffée sur le microscope confocal inversé (voir l'étape 5.2.4), photobleach la majeure partie de la fluorescence cellulaire de H2B-Citrine à une variété de temps points (45 min, 2 h et 5 h après l'électroporation) en utilisant le laser 405 nm avec 70% de puissance laser, 100 itérations, vitesse de balayage 4, qui ne laisse que 5% de fluorescence restante.
      REMARQUE: Ce processus devrait prendre quelques minutes.
    2. Continuer à incuber les embryons sur la scène à 36 oC après le photoblanchiment.
  2. Assurez-vous de prêter attention à la division active des cellules dans la région photoblanchie, qui indiquent que les cellules photoblanchies ne sont pas complètement morts après le traitement.
  3. Acquérir des images post-blanchiment (z-piles de la région électroporated) jusqu'à 30 min à intervalles réguliers (3 ou 5 min) à l'aide du microscope confocal.
    REMARQUE: Si disponible, utilisez une ligne transgénique H2B-XFP comme un contrôle positif pour assurer la survie des cellules dans la région photoblanchie. Le taux de récupération de fluorescence pour le FP codé par l'ARNm électroporated devrait diminuer, mais celui pour le FP codé par transgène devrait rester cohérent tout au long du film.
  4. Pour s'assurer que les conditions d'imagerie n'affectent pas de façon diététuse la survie des embryons, en même temps incuber des embryons électroporated qui ne sont pas photoblanchis, ce qui peut servir de contrôle pour l'imagerie.
  5. Pour quantifier les résultats de la carie de l'ARNm après l'électroporation de l'ARNm, suivez la fluorescence cellulaire au fil du temps (3 ou 5 min) en mesurant l'intensité de fluorescence du centre (un cercle de 7,5 m) de chaque cellule à l'aide d'ImageJ. Mesurez ceci pour toutes les cellules dans la région photoblanchie qui ne subissent pas la mitose et ont été complètement photobleached.
    REMARQUE: Envisagez d'omettre les cellules mitotiques de la quantification puisque les noyaux mitotiques ont une fluorescence plus forte que les noyaux interphases en raison de la condensation de chromatine.
  6. Tracer l'intensité de fluorescence au fil du temps après l'eau de Javel à une variété de points de temps (45 min, 2 h et 5 h).

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Representative Results

l'électroporation d'ARNm est plus efficace que l'électroporation d'ADN

Nous avons utilisé pCS2. H2B-Citrine pour préparer l'ARNm transcrit in vitro. Étant donné que l'électroporation de l'ADN est habituellement effectuée à 1-2 g/L, nous avons utilisé une concentration équimolar d'ARNm (calculée pour être d'environ 0,25-0,5 g/L pour l'électroporation de l'ARNm). Nous avons d'abord testé l'efficacité de l'électroporation de pCS2. Adn H2B-Citrine comparé à l'ARNm H2B-Citrine (transcrit in vitro du promoteur SP6 de pCS2MD. H2B-Citrine) en électropotant séparément l'ADN ou l'ARNm dans les embryons de caille HH5, puis en examinant l'efficacité de l'électroporation à 12 h après l'électroporation. Bien que l'électroporation d'ADN mène à la fluorescence plus lumineuse dans quelques cellules électroporated, l'efficacité de l'électroporation d'ADN était visiblement inférieure comparée aux Fcodés codés largement exprimés d'ARNm (figure2A et B).

Pour tenir compte de la variabilité embryon-embryon inhérente dans le protocole d'électroporation, une combinaison équimolar d'ARNm codant H2B-Citrine et d'ADN exprimant H2B-mKate2 a été électroporated dans l'ectoderm des embryons HH5 et a observé 12 h post-électroporation. En comparant la co-électroporation de l'ADN et de l'ARNm dans le même embryon, l'ADN exprimant le FP était également significativement et uniformément moins efficace que celui de l'ARNm (figure 2C). En quantifiant tous les embryons électroporated avec seulement l'ARNm, l'ADN, ou une combinaison des deux, nous avons constaté que les transfects d'ARNm '75% des cellules dans une région donnée, alors que l'ADN ne transfects que 25% des cellules dans une région donnée (figure 2D). La propagation dans l'expression des protéines fluorescentes codées par l'ARNm ou l'ADN n'était pas significativement différente chez tous les embryons coélectropoés (Figure 2E).

L'expression des protéines est plus rapide dans l'électroporation de l'ARNm que l'électroporation de l'ADN

L'ARNm transfecté devrait accélérer la production de protéines puisqu'il peut être immédiatement reconnu par les machines de traduction cytosoliques comme on le voit dans la figure 3. L'ADN doit être translocalisé au noyau, transcrit, et l'ARNm transporté vers le cytosol où il est reconnu par des machines de traduction cytosoliques, devrait prendre plus de temps. Pour comparer directement les taux d'expression de l'ARNm par rapport aux taux d'expression de l'ADN de la production de protéines, nous avons effectué une série d'expériences de cours dans le temps dans lesquelles nous avons co-électroporated une combinaison equimolar de l'ADN (pCMV.H2B-mKate2) et de l'ARNm (H2B-Citrine) dans l'ectoderm des embryons HH5. Nous avons détecté l'expression DE FP mRNA-encodée autour de 22 min post-électroporation, qui continue d'augmenter dans l'intensité relative de fluorescence pendant 6 h (figure3A-E, supplément. Film S1b). En revanche, l'expression FP encodée par l'ADN est vue pour la première fois à 1,5 h après l'électroporation (figure3A'-E', Supplément. Film S1c) et continue d'augmenter en luminosité jusqu'à 6 h lorsque le film a été arrêté. Étant donné que les cellules électroporated de l'ADN étaient saturées par la marque de 6 h, nous avons réimagené cette condition avec des conditions d'imagerie plus faibles (figure3F-F''). Sur tous les points de temps de ce laps de temps (22 min à 6 h), l'ARNm transfects plusieurs fois plus de cellules que l'ADN (Supplément. Film S1a, l'efficacité totale de l'électroporation à travers brightfield et DAPI ne sont pas montrés parce que ces images sont prises à partir d'un time-lapse d'un embryon de caille de type sauvage). Sur cette base, nous concluons que l'électroporation d'ARNm conduit à des protéines exprimées plus tôt.

La co-électroporation de plusieurs ARNm est très efficace

Ensuite, nous avons cherché à tester davantage l'efficacité de l'électroporation de l'ARNm en électropotant plusieurs ARNm dans une région d'intérêt. La co-électroporation de plusieurs ADN s'était déjà avérée relativement inefficace, montrant que le nombre de multi-étiquettes était de 25 %, 14 % et 10 % pour 2, 3 et 4 constructions d'ADN électroporated, calculées en proportion du nombre total de cellules11 . Nous avons d'abord électroporated deux ARNm qui codent des F distinctes sur le plan spectal (Turquoise2-Golgi/H2B-Citrine) en embryons HH5 et obtenu une efficacité de transfection élevée dans toutes les régions électroporated. Nous avons utilisé cette double électroporation pour capturer des films d'expansion radiale entre la région pellucida et opaca dans un embryon de gaztrulation HH4, image 2 h post-électroporation (Film supplémentaire S2a, b, et c). Le H2B-Citrine est localisé dans le noyau cellulaire et permet de retracer la prolifération cellulaire27. Le Turquoise2-Golgi FP semble montrer la polarité subcellulaire dans les cellules embryonnaires, mais ne semble pas être en corrélation avec la vitesse ou la direction des cellules ectoderm en mouvement in vivo28. Ce film (Film supplémentaire S2) montre que les cellules électroporated avec plusieurs ARNm peuvent continuer l'activité cellulaire normale sans aucun défaut apparent.

En outre, la co-électroporation de 4 ARNm - Turquoise2-Golgi (pour visualiser l'appareil Golgi), LifeAct-eGFP (pour visualiser F-actin), H2B-Citrine (pour visualiser le noyau), et membrane-Cherry FP (pour visualiser les membranes) - a abouti à 87% de transfection l'efficacité des 4 ARNm dans toutes les régions électroporated (figure 4). LifeAct-EGFP et H2B-Citrine ont été séparés par l'outil linéaire de traitement de mélange dans le logiciel commercial.

L'évaluation FRAP montre la dégradation rapide de l'ARNm électroporated pendant les deux premières heures après l'électroporation.

Il est bien connu que les ARNm nus sont rapidement dégradés par les RNAases cellulaires29. Nous avons postulé que l'électroporation de l'ARNm pourrait être utile pour les expériences de perte ou de gain de fonction en permettant l'expression rapide et efficace des protéines dans un embryon en développement. Par conséquent, il serait utile de quantifier le taux de carie de l'ARNm après l'électroporation de l'ARNm, puisque l'ARNm se dégrade plus rapidement que l'ADN dans les cellules. Dans les rapports précédents de l'électroporation d'ARNm dans les cellules souches neurales adultes de souris, environ 80% d'ARNm a été identifié 2 h après l'électroporation par qRT-PCR, pourtant peu ou pas d'ARNm a été détecté par 24 h après l'électroporation15. Nous avons cherché à quantifier davantage l'expression de l'ARNM après l'électroporation en concevant un analyse FRAP in vivo pour détecter les niveaux d'ARNm dans les cellules électroporated.

Photobleaching est la destruction irréversible du fluorophore qui peut se produire lorsque le fluorophore (protéines fluorescentes dans notre cas) est dans un état excité, ce qui élimine la fluorescence pendant l'observation30,31. Toute lumière émise par les protéines fluorescentes (F) qui peuvent être détectées dans les cellules photoblanchies au-dessus des niveaux de base devrait, par conséquent, représenter les FP nouvellement traduits codés par des ARNm transfectés intacts. Par conséquent, nous avons cherché à photobleach les cellules électroporated pour éliminer toutes les fluorescences FP-dérivées existantes à une série de points de temps et de suivre le rétablissement suivant de fluorescence.

En utilisant des paramètres de photoblanchiment optimisés tels que décrits dans la section protocole, nous avons constaté que le photoblanchiment réduit d'abord l'intensité de fluorescence dans toutes les cellules photoblanchies de 95 % lorsqu'il est mis en valeur immédiatement après l'événement de photoblanchiment. Cela a été fait à 45 min, 2 h, et 5 h après l'électroporation (Figure 5A-C). La récupération de fluorescence dans chaque cellule dans la région photoblanchie a été suivie sur une période de temps de 30 minutes après le photoblanchiment à chaque moment par l'imagerie de la même région à intervalles réguliers (3 ou 5 min). Nos données suggèrent qu'il y ait une diminution significative des niveaux transfected d'ARNm entre 45 min et 5 h après l'électroporation. Ceci est démontré par la forte diminution du FRAP mesurée à 5 h par rapport à 45 min après l'électroporation. Pour mettre en évidence la récupération de fluorescence dans les cellules blanchies en particulier dans le point de temps de 5 h, nous avons augmenté la luminosité dans la figure 5A-C en utilisant l'outil de luminosité / contraste dans ImageJ et montrer ces images modifiées dans la figure 5D-F. Fait intéressant, il ya une grande hétérogénéité dans la récupération de la fluorescence de la cellule à la cellule dans la zone photoblanchie à 2 h parce que certaines cellules récupérer la fluorescence plus rapidement que d'autres cellules (Figure 5E ', voir pointes deflèches ). Cependant, toutes les cellules de la zone photoblanchie de 5 h récupèrent la fluorescence plus lentement (figure 5F'') que les cellules photoblanchies à 2 h. Nous détectons également les cellules qui se divisent activement dans notre région photoblanchie, ce qui suggère que les cellules ne sont pas mortes à la suite du processus de photoblanchiment (Figure 5E'').

Nous quantifions ces résultats à la figure 6A en montrant l'intensité du signal normalisé de chaque cellule dans les zones photoblanchies sur une période de 30 minutes après l'événement de photoblanchiment. Pour chaque cellule, les valeurs de fluorescence ont été normalisées par rapport à l'intensité du signal de cette cellule immédiatement après le photoblanchiment. Cette normalisation a été faite pour toutes les cellules à travers tous les points de temps représentés (45 min, 2 h, 5 h). Les valeurs normalisées de récupération de fluorescence des cellules dans la même région blanchie de photo ont été alors rassemblées ensemble et graphiques au fil du temps après l'événement de photobleaching ; par conséquent, chaque point du graphique représente 35 cellules. Les données non normalisées sont également indiquées dans la figure 6B, dans laquelle chaque ligne représente une cellule dont l'intensité du signal de fluorescence récupère immédiatement après le photoblanchiment. Ces données globales suggèrent que par 5 h, toutes les cellules ont épuisé la plupart de leur ARNm, avec une grande partie de cette baisse se produisant entre 45 min et 2 h après l'électroporation.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de la procédure de clonage pour faire construire le pCS2-LifeAct-eGFP. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : L'électroporation de l'ARNm est plus efficace que l'électroporation de l'ADN. (A-A'') L'ADN exprimant pCS2.H2B-Citrine a été électroporated dans l'ectoderm des embryons de HH5. La fluorescence a été observée 12 h après l'électroporation. La barre d'échelle de 50 m. (B-B'') arnde exprimant H2B-Citrine a été électroporated dans l'ectoderm des embryons HH5. La fluorescence a été observée 12 heures après l'électroporation. Barre à l'échelle de 50 m . (C-C'') Combinaison equimolar d'ADN (pCMV.H2B-mKate2) et d'ARNm (H2B-Citrine) a été électroporated dans les embryons HH5 et a observé 12 h après l'électroporation. Trois embryons ont été testés par condition (n et 2 expériences). Barre d'échelle de 50 m. (D) Trois embryons de A, B et C (9 embryons totaux) ont été quantifiés pour l'efficacité de l'électroporation à l'aide d'un outil d'analyse des particules sur ImageJ. Une région de 200 m de chaque embryon a été quantifiée (au moins 150 cellules ont été comptées par région). Le tableau de bord moyen représente la moyenne, tandis que les barres supérieures et inférieures représentent l'écart standard par rapport à la moyenne. (E) Trois embryons coélectroporateds (ADN et ARNm) sont analysés pour la propagation du signal dans toutes les cellules électroporated dans une région donnée de 200 m. Chaque embryon a eu environ 100 cellules positives pour l'électroporation d'ARNm et 30 cellules positives pour l'électroporation d'ADN. Le tableau de bord moyen représente la moyenne, tandis que les barres supérieures et inférieures représentent l'écart standard par rapport à la moyenne. Il n'y a pas de différence significative entre la propagation de l'ARNm et l'électroporation de l'ADN, mais l'électroporation de l'ARNm est beaucoup plus efficace que celle de l'ADN. (A-C) Dimensions 425,10 x 425,10 x 55 m. Pixel habite 2,55 euros. Moyenne ligne 4. Bits par pixel 16. Métadonnées au microscope - microscope confocal inversé, objectif 20x (voir Tableau des matériaux) (A) Ex : 488 nm (0,05%), Piste d'émission S1 508-579 nm; (B) Ex 488 nm (5,0 %), Piste d'émission S1 508-579 nm; (C) Ex 488 nm (5,0 %), 561 nm (5,0 %), Piste d'émission S1 508-579 nm; S2 606-695 nm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : L'électroporation de l'ARNm montre l'expression par 22 min après l'électroporation et est beaucoup plus rapide que l'électroporation d'ADN. Images représentatives du cours du temps après l'ARNm (H2B-Citrine) et l'ADN (pCMV.H2B-mKate2) électroporation avec analyse de profil de parcelle à 22 min (A-A''), 45 min (B-B''), 1,5 h (C-C''), 3 h (D-D',et 6 h (E-E')à le début de l'imagerie (n ' 1). L'analyse de profil de parcelle est fournie pour chaque point de temps indiqué à travers la flèche dessinée dans l'image fusionnée. Chaque pic du profil de l'intrigue représente le noyau d'une cellule électroporated. Les cellules deviennent généralement plus brillantes au cours de l'intervalle de 6 h du film, ce qui indique que l'ARNm est encore traduit en nouvelle protéine fluorescente. Pour le point de 6 heures, des images d'une même région capturées à l'aide de conditions d'imagerie identiques(E-E') et de conditions d'imagerie plus faibles (F-F') sont montrées parce que les images des cellules électroporated de l'ADN étaient très saturées à l'aide de l'initiale conditions d'imagerie. Barre d'échelle de 20 m. Dimensions : 425,10 x 425,10 x 55 m. L'image est présentée sous forme de projection d'intensité maximale sur tous les points de temps illustrés. Pixel habite 2,55 euros. Moyenne ligne 4. Bits par pixel 16. Métadonnées au microscope - microscope confocal inversé, objectif 20x (voir Tableau des matériaux) Ex 488 nm (15%), 594 nm (5,0%) pour les premières années; Ex 488 nm (7,5%), 594 nm (0,5%) pour le dernier point de temps (figure 2F), Piste d'émission S1 499-562 nm; S2 605-661 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : La co-électroporation de quatre ARNm ciblant différentes structures sous-cellulaires est très efficace. L'ectoderm d'un embryon HH3 a été électroporated avec des ARNm qui codent mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Citrine, et membrane-Cherry. L'embryon a été fixé et imaged à 4 heures après l'électroporation. La plupart des cellules sont électroporated dans la région ciblée d'électrode avec chacun des quatre ARNM (87%). Chiffres représentatifs indiqués (3 embryons chacun, n '2 expériences). Barre à l'échelle de 50 m. (A) Fusionner les quatre ARNM (mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Citrine et membrane-Cherry). (B) Seul canal H2B-Citrine (Ex 488 nm (0,7%), Em 455-499 nm). (C) Seul canal mTurquoise2-Golgi (Ex 458 nm (22,0%), Em 455-499 nm). (D) Fusionner H2B-Citrine et mTurquoise2-Golgi montre que Golgi enveloppe un côté du noyau dans la plupart des cellules. (E) Seul canal LifeAct-eGFP (Ex 488 nm (0,7%), Em: 455-499 nm). (F) Seul canal Membrane-Cherry (Ex 594 nm (37,1%), Em et S2: 570-695 nm). (G) Fusionner LifeAct-eGFP et membrane-Cherry montre se chevaucher dans la plupart des cellules. Dimensions 425,10 x 425,10. Pixel habite 1,58 s. Moyenne ligne 4. Bits par pixel 16. Métadonnées au microscope - microscope confocal inversé, objectif 20x (voir Tableau des matériaux) Ex 405 nm (2,4 %), 458 nm (22,0 %), 488 nm (0,7 %), 594 nm (37,1 %), Piste d'émission S1 455-499 nm; S2 570-695 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : L'essai de blanchiment de photos montre une dégradation rapide de l'ARNm électroporated au cours des cinq premières heures après l'électroporation. Le photoblanchiment d'une région de 100 m2 contenant des cellules électroporated avec l'ARNm exprimant H2B-Citrine est effectué à 45 min, 2 h, et 5 h après l'électroporation. L'embryon a été photographié à intervalles réguliers après le photoblanchiment (3 ou 5 min). Les conditions de photoblanchiment sont les suivantes: 70% 405 nm laser, 100 itérations, environ 5 min de durée pour toute la région. Barre d'échelle 50 ' m. (A-A'') 45 min avant et après l'eau de Javel. B montre l'embryon immédiatement après le photoblanchiment et C montre l'embryon 30 min post-blanchiment. Barre d'échelle de 50 m. (B-B'') 2 h pré- et post-blanchiment. Le périmètre de la place est décalé parce que les cellules dans la région photoblanchie se déplaçaient légèrement pendant la période d'eau de Javel. (C-C'') 5 h pré- et post-blanchiment. (D-D')) Les mêmes images que A-A'' avec une luminosité accrue (valeur maximale ajustée à 11550 pour améliorer la luminosité après la collecte). (E-E'') Les mêmes images que B-B'' avec une luminosité accrue (valeur maximale ajustée à 11550 pour améliorer la luminosité après la collecte). Les pointes de flèche blanches pointent vers des cellules qui ont une récupération de fluorescence plus élevée que les cellules environnantes. La pointe de flèche cyan pointe vers une cellule photoblanchie qui a récemment subi une mitose. (F-F'') Les mêmes images que C-C'' avec une luminosité accrue (valeur maximale ajustée à 11550 pour améliorer la luminosité après la collecte). Dimensions 425,10 x 425,10 x 42 m. L'image est présentée sous forme de projection d'intensité maximale sur tous les points de temps représentés. Pixel habite 1,58 s. Moyenne ligne 4. Bits par pixel 16. Métadonnées au microscope - microscope confocal inversé, objectif 20x (voir Tableau des matériaux) Ex 488nm (1,5%), Piste d'émission S1 - 508-553 nm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Quantification de la récupération de fluorescence dans les cellules photoblanchies. (A) L'intensité de fluorescence de toutes les cellules dans les régions blanchies (35 cellules) a été suivie pour chaque cellule au cours de chaque période post-blanchiment. Il y a une forte baisse du taux d'intensité du signal récupéré de 45 min à 2 h, suivie d'une baisse plus faible de 2 h à 5 h. La barre d'erreur supérieure s'affiche pour chaque point, ce qui représente l'écart standard par rapport à la moyenne. La ligne indiquée est une ligne de régression linéaire. R2 pour 45 min, 2 h et 5 h est de 0,83, 0,58 et 0,84 respectivement. La moitié supérieure de la barre d'erreur s'affiche pour chaque point. (B) L'intensité de fluorescence de toutes les cellules dans les régions blanchies (35 cellules) a été suivie pour chaque cellule unique pendant chaque période post-blanchiment et graphique sans normalisation. Il y a une forte baisse du taux d'intensité du signal récupéré de 45 min à 2 h, suivie d'une baisse plus faible de 2 h à 5 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus importante de ce chiffre.

Film supplémentaire 1 : l'électroporation d'ARNm mène à l'expression plus tôt de protéine que l'électroporation d'ADN. L'ARNm H2B-Citrine et l'ADN H2B-mKate2 électroporated dans l'ectoderm de l'embryon HH5. La région représentée est à la frontière des tissus extra-embryonnaires et embryonnaires. Barre d'échelle de 50 m. (a) Chaîne H2B-Citrine et H2B-mKate2 (Ex 488 nm (15%), 594 nm (5,0%), Em: 499-562 nm; S2: 605-661 nm). (b) Seul canal mRNA H2B-Citrine montré (Ex 488 nm (15%), Em 499-562 nm). (c) Seul canal d'ADN H2B-mKate2 montré (Ex 594 nm (5,0%), Em - 605-661 nm). Dimensions 850,19 x 850,19 x 110 m. L'image est présentée sous forme de projection d'intensité maximale sur tous les points de temps représentés. Pixel habite 2,55 euros. Moyenne ligne 4. Bits par pixel 16. Métadonnées au microscope : microscope confocal inversé, objectif 20x (voir Tableau des matériaux) Ex 488 nm (15 %), 594 nm (5,0 %), Piste d'émission S1 499-562 nm; S2 605-661 nm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 2 : La co-électroporation des ARNm permet d'étudier dynamiquement les comportements cellulaires distincts. L'expansion radiale des cellules entre la bordure embryonnaire et extra-embryonnaire est électroporated avec l'ARNm (H2B-Citrine et mTurquoise2-Golgi) et représenté pendant la migration vers l'extérieur. Ce film a été photographié par microscopie confocale de 2 à 5 h après l'électroporation par imagerie toutes les 6 min. Barre d'échelle de 50 m.  (a) Les canaux H2B-Citrine et mTurquoise2-Golgi sont présentés (Ex 458 nm (28 %), 488 nm (5,0 %), Em 446-526 nm; S2: 508-553 nm). (b) Seul canal H2B-Citrine montré (Ex 488 nm (5,0%), Em et S2: 508-553 nm). (c) Seul canal mTurquoise2-Golgi montré (Ex 458 nm (28%), Em 446-526 nm). Dimensions 425,10 x 425,10 x 32,5 m. L'image est présentée sous forme de projection d'intensité maximale sur tous les points de temps représentés. Pixel dwell 0.79 s. Moyenne ligne 4. Bits par pixel 16. Métadonnées au microscope - microscope confocal inversé, objectif 20x (voir Tableau des matériaux) Ex 458 nm (28 %), 488 nm (5,0 %), Piste d'émission S1 446-526 nm; S2 508-553 nm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Dans ce protocole, nous avons fourni des instructions étape par étape sur la façon de micro-injecter et d'électroporate précisément l'ARNm dans les cellules des embryons de caille gazateurs. Nous avons démontré que l'électroporation de l'ARNm synthétisée in vitro permet une expression rapide et efficace des protéines fluorescentes (F) dans les embryons de caille gazateurs (figure2 et 3). La fluorescence de la protéine H2B-citrine traduite par des ARNm électroporated s'est avérée détectée par microscopie confocale dans un délai de 20 minutes et a augmenté en fluorescence DE la FP pendant des heures (Figure 3, Filmsupplémentaire 1). C'est étonnamment rapide et proche du temps présumé de maturation pour la citrine32,33. Les FP exprimés à partir de vecteurs d'ADN ont été détectés après 2-3 h (Figure 3, Supplément. Film 1), qui est similaire aux rapports précédents8,34,35. Divers FP ont des temps de maturation uniques, de sorte que la planification avancée assurera que le FP idéal est choisi en termes de distinction spectrale et de cinétique de maturation souhaitée pour l'expérience. De plus, les ARNm synthétisés cotranscètes plus efficacement que les vecteurs d'ADN11. L'efficacité plus élevée de la transfection fait en transfecté davantage de cellules dans la région d'intérêt avec des populations individuelles (figure 2) ou plusieurs d'ARNM (figure 4).

La stabilité de l'ARNm est fortement réglementée et peut être affectée par la polyadenylation, l'épissage, la traduction, la structure secondaire, et les régions non traduites pour n'en nommer que quelques-unes36,37. Les demi-vies de l'ARNm endogène et synthétisé dans les cellules peuvent varier de minutes àjours 36,38. Nous avons utilisé la récupération in vivo de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) pour blanchir les protéines H2B-citrine codées par ardendation existantes et avons observé la récupération la plus appréciable de fluorescence H2B-citrine pendant les 2 premières heures après l'électroporation (figure5 et 6). Les mARN différents auront sans aucun doute différentes demi-vies en fonction de leur longueur, séquences internes, modifications de 5' et 3'36,37, donc chacun doit être mis en fonction si désiré.

L'imagerie vitale exige généralement un compromis entre des conditions optimales pour une imagerie de haute qualité et une imagerie rapide et moins toxique39,40. Lors de l'imagerie, il est conseillé d'utiliser le moins de puissance laser possible pour minimiser le photoblanchiment et les photodommages aux cellules embryonnaires (voir les notes pour l'étape 5.3 du protocole)40. Modifier le réglage du microscope pour des collections rapides (p. ex., des vitesses d'analyse plus rapides, moins de moyenne) peut souvent aider sans perdre la résolution d'imagenécessaire 41. Enfin, il faut prendre soin de manipuler et de manipuler les embryons pendant la récolte, l'électroporation et l'imagerie (voir l'étape 4). Les embryons à un stade précoce sont délicats et peuvent être facilement endommagés.

Dans l'ensemble, le moment précis et la localisation précise de l'électroporation de l'ARNm permettent des expériences de perturbation qui capitalisent sur l'expression rapide, l'efficacité de la cotransfection et la décomposition rapide des transcriptions de l'ARNm. La surexpression ou la mauvaise expression d'un gène d'intérêt peut être accomplie par électroporation des ARNm synthétisés. Tittering la concentration pour chaque ARNm est crucial, car l'électroporating trop d'ARNm peut causer une toxicité cellulaire non spécifique, tandis que trop peu d'ARNm peut ne pas étiqueter les cellules désirées ou induire des changements phénotypiques de manière adéquate. Une pléthore de vecteurs générés pour la synthèse in vitro des ARNm qui codent les marqueurs de fusions FP pour la visualisation ou les produits génétiques modifiés pour les perturbations de divers processus biologiques existent déjà à partir de divers systèmes de modèles animaux. Beaucoup de ces constructions conçues pour la synthèse in vitro de l'ARNm peuvent être obtenues rapidement et à peu de frais à partir de dépôts plasmides à but non lucratif.

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Disclosures

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Nous remercions David Huss pour ses idées utiles sur ce travail. Ce travail a été soutenu en partie par la Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) et la bourse de recherche de premier cycle de l'USC Provost à M.T., le Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award to M.D., et l'Université de Southern California Undergraduate Research Associates Program award to R.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100

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References

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Biologie du développement numéro 148 électroporation de l'ARNm microscopie en accéléré caille volail embryon FRAP
Expression rapide et efficace des protéines multiples dans les embryons aviaires à l'aide de l'électroporation de l'ARNm
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Tran, M., Dave, M., Lansford, R.More

Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).

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