Summary
우리는 메추라기 배아 모델 시스템에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현을 허용하는 방법으로 메신저 RNA (mRNA) 전기 를 보고합니다. 이 방법은 형광성 으로 세포를 표지하고 전기 개공 직후 시간 경과 현미경 검사법에 의해 생체 내 움직임을 기록하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
우리는 mRNA 전기 가기는 살아있는 메추라기 배아에 있는 세포에 DNA 전기 포공 보다는 더 빠르고 광범위하게 표지하기 위하여 형광성 단백질을 허용한다는 것을 보고합니다. 높은 형질감염 효율은 적어도 4개의 별개의 mRNAs가 ~87% 효율로 공동 형질감염되는 것을 허용합니다. 대부분의 전기 포어mAs는 처음 2시간 동안 전기 천공 후 저하되어 개발 배아에서 시간에 민감한 실험이 수행될 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 다양한 세포내 표적 형광 단백질을 인코딩하는 mRNAs로 전기화된 살아있는 배아를 동적으로 이미지화하는 방법을 설명합니다.
Introduction
전기 개출은 전기 펄스를 사용하여 플라즈마 막에 일시적인 기공을 생성하여 핵산이나 화학 물질과 같은 물질이 시토솔로 전달되도록하는 물리적 형질 감염 방법입니다. 전기 천공은 박테리아, 효모, 식물 및 포유류 세포1,2,3으로DNA를 전달하는 데 널리 사용됩니다. 그것은 일상적으로 세포의 개발 또는 라벨 이동 세포의 유전 제어를 연구하기 위해 개발 조류 배아 내에서 대상 세포와 조직에 유전 페이로드를 소개하는 데 사용4,5,6, 7. 그러나 DNA 전기 화 8과 관련하여몇 가지 실험적 한계가 존재합니다. 예를 들면, DNA 전기천공은 수시로 세포 당 발현 벡터의 높게 가변적인 수를 소개하고 그 후에 mRNAs 및 단백질은 그(것)들이 인코딩합니다. 이러한 가변성은 이미지 분석과 데이터 해석을 모두 복잡하게 하는 상당한 세포 세포 이질성으로 이어질 수있다9,10. 추가적으로, DNA 전기 천공에서 단백질은 단지 발현하기 시작 ~3 시간 후 전기 천공및 12 시간까지 세포 수와 형광 강도의 최대 효율에 도달하지 않습니다, 가능성이 때문에 핵으로 전달하고 완료하는 데 필요한 시간 생체 내 전사 및 번역모두 11.
대조적으로, mRNA 형질감염은 미세주입12,13,mRNA lipofectamine 형질감염에 의한 인간 줄기세포를 재프로그래밍하여 제노푸스 라에비스 난모세포를 포함한 다양한 모델 시스템에서 효과적으로 사용되고 있다14 , 성인 마우스15에서반응성 신경 줄기 세포를 전기화. 우리는 별개의 형광 성 단백질 (FPs)를 인코딩하는 시험관 내 합성 mRNAs를 사용하여 초기 조류 배아 발달 중에 세포를 효율적으로 라벨링하는 mRNA 전기 화기의 능력을 테스트했습니다. 우리의 연구를 위해, 우리는 pCS2+ 벡터, 제노푸스와 얼룩말 배아에서 단백질을 발현하기 위해 일반적으로 사용되는 다목적 발현 벡터를 사용했습니다. pCS2+에 있는 SP6 및 T7 RNA 중합효소 프로모터는 시험관 내 전사/번역 시스템에서 사용될 때 어떤 복제된 유전자든지에서 mRNA 그리고 단백질의 합성을 허용합니다.
여기에서, 우리는 mRNA 전기 천공이 메추라기 배아를 가두기에서 형광 성 단백질 (FPs)의 빠르고 효율적인 발현을 허용한다는 것을 보여줍니다. 우리는 이러한 연구에 사용되는 많은 발현 벡터를 설계하고 생성했습니다. 예를 들어, 우리는 LifeAct-eGFP 유전자16을 CMV 프로모터 및 SP6 프로모터로부터 발현하기 위해 pCS2+ 벡터17로 subcloned하였다. 삽입된 유전자는 SP6 프로모터의 하류및 SV40 폴리(A)꼬리(18)의 상류에 놓여 있다. mRNA 및 DNA와 함께 전기화된 배아에서, 시험관내 전사 mRNAs에서 부호매겨진 FPs는 전기 천공의 20 분 안에 처음 검출된 반면, DNA 발현 벡터에서 FPs는 3 시간 후에만 검출되었습니다. 막 단백질은 동시에 배아로 전기화될 수 있어 개별 세포에서 여러 단백질을 빠르고 효율적으로 발현할 수 있습니다. 마지막으로, 광표백(FRAP) 분석 후 생체 내 형광 회복을 사용하여, 우리는 대부분의 전기포케이트 mRNAs가 2시간 내에 붕괴되는 것을 보여준다. 따라서, 제한된 새로운 단백질 번역과 결합된 빠른 초기 단백질 생산은 mRNA 전기화를 발현의 시간적 조절이 필요할 때 귀중한 기술로 만든다.
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Protocol
모든 동물 절차는 로스 앤젤레스 어린이 병원과 남부 캘리포니아 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 된 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 생성 pCS2 기반 발현 벡터
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pCS2.Lifeact-eGFP를 복제하려면, 2 μg의 pCS2.CycB1-GFP(다른 인서트를 포함하는 구조)를 BamHI(10 U)와 BsrGI(10 U)와 적절한 소화 완충제(재료 표 참조)로 소화하여 벡터 백본을 총 반응에서 1배로 희석하여 준비합니다. 37°C에서 1시간 동안 50 μL의 부피를 확인합니다(복제 절차의 회로도에 대한 그림 1 참조).
- 탈인염은 새우 알칼리성 인산파타제(1 U)를 첨가하여 제한 효소 반응으로부터 벡터 백본의 자유 3'OH 말단을 첨가한다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 전체 혼합물을 1% 아가로즈 젤/1x 트리스 아세테이트 EDTA(TAE) 버퍼에서 ~50분 동안 90V로 실행한 다음, 1x TAE 버퍼에서 에티듐 브로마이드의 0.5 μg/mL 용액으로 젤을 15분 동안 부드럽게 흔들어 주세요. 또한, DNA 크기를 결정하는 데 도움이 무료 차선에 분자량 마커를로드해야합니다.
- DNA 안전 UV Transilluminator를 사용하여 DNA 를 사용하여 DNA 를 사용하여 DNA를 니콜라는 것을 피하고, 아가로즈 겔에서 벡터 백본 (4kb의 예상 밴드 크기)을 신속하게 잘라내고 제조업체의 지침을 사용하여 젤 정제 키트를 사용하여 젤 조각에서 DNA 조각을 분리합니다.
- 단계 1.1과 동시에, 37°C에서 1시간 동안 50 μL의 총 반응 량에서 1배로 희석된 적절한 소화 완충액에서 BglII(10 U) 및 BsrGI(10 U)로 2 μg의 pEGFP-N1-Lifeact를 소화하여 삽입을 준비한다. 1.1.2-1.3 단계에서 이전에 설명한 바와 같이 800 bp 대역을 분리하기 위해 전체 혼합물을 1% 아가로즈 겔로 실행한다.
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벡터와 삽입이 모두 분광광도계상에서 정제 및 정량화된 후, T4 DNA 리가제 버퍼에 벡터의 50 ng 및 삽입물의 38ng(삽입할 벡터의 1:3 몰 비)를 결합한 후 T4 DNA 리가제를 첨가하여 결찰 반응을 촉매한다. 또한, DNA 제어 없음, 벡터 전용 제어 및 삽입 전용 컨트롤을 설정합니다. 실온에서 모든 반응을 30 분 동안 배양하십시오.
- 결찰 혼합물의 1 μL을 유능한 대장균 DH10으로 변형시킵니다. 또한, 물만 음의 제어 및 pUC19 양성 제어의 20 pg를 변환합니다. 50 μg/mL 암피실린을 함유한 루리아 국물(LB) 한천 판에 박테리아를 펴고 37°C에서 밤새 배양합니다.
- 다음 날 아침, 각 접시에 식민지를 세는다.
참고: 이상적으로는 음의 대조판에 콜로니가 없어야 하며, 벡터+삽입 결찰에 콜로니가 없고 벡터 전용 플레이트에 콜로니가 적어야 합니다. - 벡터+삽입 결찰 혼합물로 변형된 한천 플레이트에서 적어도 8개의 세균 식민지를 선택하고 멸균 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 50 μg/mL Ampicillin을 함유한 액체 LB 국물 2mL로 접종합니다.
- 상업용 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 각 클론에서 DNA를 추출합니다.
- 37°C에서 1시간 동안 1회 희석된 적절한 소화 완충액에서 NotI(10 U) 및 BamHI(10 U)를 사용하여 각 클론으로부터 500 ng의 DNA를 사용하여 진단 제한 다이제스트를 실행하고 1x TAE 버퍼에서 1% 아가로즈 겔상에서 소화된 DNA를 실행한다. pCS2.Lifeact-eGFP 포지티브 클론의 예상 대역 크기는 3.9kb 및 978bp입니다.
- 양성 클론으로부터 의 DNA 의 1 pg-100 ng를 유능한 대장균 DH10으로 변환하고, 시험관 내 전사 반응(최소 10 μg)에 대한 충분한 양의 DNA를 얻기 위해 이전 단계에서 상세히 3-4miniprep 반응을 준비한다.
2. 체외 전사에 의한 mRNA의 준비
- pCS2.LifeAct-eGFP 의 10 μg를 17°C에서 하룻밤 동안 50 μL의 총 반응 량에서 1x로 희석된 적절한 소화 완충액에서 NotI(10 U)로 인서트의 3' 끝에 선형화한다.
참고: RNase 오염을 방지하고 mRNA 분해를 줄이려면 mRNA 샘플을 취급하는 동안 장갑을 착용하십시오. -
페놀의 혼합물을 사용하여 DNA를 정화 : 클로로 포름 : 이소아밀 알코올 (25 : 24 : 1, v / v).
- RNase 가 없는 물 150 μL을 첨가하여 소화 반응의 총 부피를 200 μL과 동일하게 만듭니다. 그런 다음 200 μL의 페놀을 추가하십시오 : 클로로 포름 : 이소아밀 알코올 및 20 s의 혼합물을 소용돌이.
- 최대 속도 (18,400 x g)의 마이크로 퍼지에서 2 분 동안 원심 분리기를 조심스럽게 선형화 된 DNA를 포함하는 상단 수성 상을 제거하십시오. 이 단계를 반복하여 추가 불순물을 제거하고 바닥과 상단 액체 상 사이에 형성 될 수있는 백색 침전물을 방해하지 않도록주의하십시오.
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1/10 부피 3M 나트륨 아세테이트 (RNase-free)와 100 % 에탄올의 2.5 부피를 추가하여 선형화 된 DNA를 침전시. 혼합물을 -20 °C에서 >30 분 동안 방치한 다음 최대 속도 (18,400 x g)로 원심 분리하여 DNA를 펠렛합니다.
- DNA 펠릿을 70% 에탄올로 씻은 다음 펠릿을 5분 동안 공기 건조시합니다.
- DNA 펠릿을 RNase 가 없는 물 5 μL에 녹입니다. 분광광도계로 DNA를 정량화합니다.
참고: 예상 된 DNA 농도는 ~0.5-1 μg/μL A260/A280 비율 사이 1.7-2.0.
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생체외 전사(IVT)에 대해 선형화된 pCS2.LifeAct-eGFP DNA의 1 μg를 사용한다. 상용 키트(재료 표 참조)에서 제조업체의 지침에 따라 캡 아날로그(최종 농도 0.8mM) 및 NTP(ATP, CTP 및 TTP의 최종 농도 1mM, GTP의 경우 0.2mMM), 10x 반응 버퍼 2 μL(최종 농도)을 포함합니다. 1x), SP6 RNA 폴리머라제 2 μL, 최대 20 μL의 RNase 없는 물.
- 전사체 크기에 따라 IVT 혼합물을 약 2시간 이상 배양한다.
참고 : 2 시간 배양은 3 kb 의 전사체에 적합하지만, 하룻밤 배양은 5 kb보다 큰 성적 증명서에 더 잘 작동합니다. - 전사 반응에서 자유 뉴클레오티드를 제거하려면, 30 μL의 LiCl RNA 침전액(7.5 M 염화리산 리튬, 50 mM EDTA)을 첨가하여 mRNA를 침전시한다. 혼합물을 간략하게 -20°C에서 30분 간 보관합니다. mRNA를 최대 속도(18,400 x g)에서 마이크로퍼지에서 15분 동안 돌리고 70% 에탄올(RNase 불포함)으로 헹구습니다.
- 전사체 크기에 따라 IVT 혼합물을 약 2시간 이상 배양한다.
- 합성된 mRNA를 RNase 가 없는 물 15 μL에 녹입니다. 합성 된 mRNA를 5 μL / 튜브 (총 3 튜브)에서 분배하고 장기 보관을위해 -80 °C에 놓습니다. 분광광도계로 mRNA를 정량화합니다.
참고: 예상 수율은 mRNA의 15-20 μg입니다 (~1 μg / μL). 1 μL (1 μg / μL)은 mRNA가 1 μg / μL에서 500 ng / μL로 희석되고 각 배아가 ~ 200 nL로 주입된다는 가정하에 ~ 10 배아를 실험하기에 충분합니다. 따라서 각 튜브는 ~ 5 실험에 충분한 mRNA를 포함해야 합니다. - RNase 오염 제거 용액 (예를 들어, RNase Away)으로 모든 젤 장비를 청소 한 후 1 % 아가로즈 젤에서 1 % 아가로즈 젤에 ~ 300 ng를 실행하고 mRNA가 하나의 밴드로 나타나는지 확인하십시오 (이차 구조가 형성되면 다중 밴드가 존재할 수 있음) 및 얼룩이 없는 지 확인하십시오. RNA 분해를 나타내는 젤 레인에서 ppears.
3. mRNA 전기 화공 혼합의 준비
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원하는 농도에서 mRNA를 해동하고 희석하십시오 (RNase-free 물에서 250-500 ng /μL은이 작품에서 테스트 된 모든 mRNAs에 적합합니다). mRNA 주입 부위를 시각화하고 전극을 올바르게 배치할 수 있도록 1/10 량의 착색 염료(재료 표, RNAE-free, 0.1% 최종 농도 참조)를 추가합니다.
참고: DNA와 RNA가 결합되어 공동 전기화를 수행하는 경우, mRNA 및 DNA 혼합물 이전에 페놀-클로로폼 추출 및 에탄올 침전을 사용하여 DNA가 RNases를 오염시키는 것이 없도록 하십시오.- 모의(RNA 첨가 없음) 전기 증액을 사용하여 음의 대조군을 준비해야 한다. 가능하다면, 사전 검증된 mRNA(이전 실험에서 FP를 성공적으로 생성하는 것으로 나타난 mRNA)를 사용하여 양성 대조군을 준비한다.
참고: 음성 대조는 데이터의 정규화를 위한 배경 형광 수준을 설치하기 위하여 모든 화상 진찰 실험을 위해 필수적입니다. 전기 개화 설정이 효과가 있는지 확인하도록 도와줌으로써 새로 전사된 mRNA로 작업할 때 긍정적인 제어가 특히 중요합니다.
- 모의(RNA 첨가 없음) 전기 증액을 사용하여 음의 대조군을 준비해야 한다. 가능하다면, 사전 검증된 mRNA(이전 실험에서 FP를 성공적으로 생성하는 것으로 나타난 mRNA)를 사용하여 양성 대조군을 준비한다.
- mRNA 전기 포화 용액을 얼음 슬러리에 저장하여 전기 화를 진행할 준비가 될 때까지 열화를 방지하십시오.
4. 살아있는 메추라기 배아로 전기 포레이트 mRNAs
- 갓 낳은 수정된 메추라기 알을 매일 모으고 1주일 이상 가습 냉장고에 13°C에 보관하십시오. 메추라기 알을 38°C에서 배양하여 원하는 배아 발달단계19,20,21까지배양한다.
참고: HH3 to HH5는 정적 및 동적 이미징 모두를 위한 본 연구에서 사용되었다. HH3 배아의 경우, 수확 전에 2시간 동안 실온에서 난자를 방치하면 배아가 냉각될 때 일반적으로 물리적 조작에 더 강하기 때문에 격리 과정이 훨씬 쉬워집니다. - EC 배양 시스템(22)에 따라배아를 분리및 준비한다. 음의 대조군(전기공화되지 않음)으로 작용하기 위해 적어도 하나를 포함하여 조건당 적어도 5개의 배아를 수집한다.
- 부드럽게 부수고 10cm 페트리 접시에 계란을 붓습니다. 전사 피펫으로 두꺼운 알부민의 대부분을 제거하고 배아가 종이 고리에 단단히 붙어 있는지 확인하기 위해 조직 닦아 노른자의 표면을 부드럽게 닦아 배아 주위에 남아있는 두꺼운 알부민을 제거합니다.
- 배아 위에 프리컷 필터 용지(재료 표참조)를 놓고 가위를 사용하여 배아 둘레를 부드럽게 자른다.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS로 배아의 근간을 하고, 부드러운 스트림을 사용하여 배아에 달라붙는 노른자를 비우게 합니다.
참고: 이 단계는 이 태아가 노른자에 더 달라붙는 경향이 있고 수시로 후속 세척 단계 도중 vitelline 막에서 분리하기 때문에 더 젊은 (&HH3) 태아로 일할 때 중요합니다. - 배아/종이 링을 비스듬히 위로 당기고 노른자를 빼내어 PBS로 채워진 페트리 접시에 넣고 추가 청소를 합니다. 노른자의 대부분이 제거되면, 한천 / 알부민의 반 고체 혼합물로 덮여 35mm 페트리 접시에 배아 복부 측면을 배치합니다.
- 유리 마이크로파이펫 풀러 기기를 사용하여 6~8개의 10cm 길이의 유리 미세 모세관(O.D. = 1.2 mm)을 준비합니다.
- 배아 복부 쪽을 PBS로 채워진 전기 화챔버에 올려 놓습니다. 유리 미세 모세관을 사용하여, 원하는 영역을 덮는 에피블라스트와 비텔린 막 사이의 공동에 mRNA 또는 DNA/mRNA 전기 화 혼합물의 200 nL의 볼러스를 주입한다.
참고: 펠루시다와 오파카에 대한 일부 영역의 전체 전방 영역은 이 원고에 표시된 대부분의 실험에서 전기화되었다. - 다음 펄스 서열을 사용하여 배아의 상하와 전기포산에 각각 양극 및 음극(백금 평평한 사각형 전극, 측면 길이 5mm)을 놓습니다: 5V의 5제곱 전기 펄스, 100 ms 간격으로 50 ms 지속 시간 생체 내 전기 포더레이터를 사용하여. 전극 사이의 거리가 ~5mm인지 확인합니다.
참고: 전기 개화 파라미터를 최적화하는 것은 깨지기 쉬운 배아 세포를 죽일 수있는 조건을 피하는 데 중요합니다. 전압, 펄스 길이, 펄스 간격 및 DNA 및 mRNA에 대한 펄스 수의 파라미터는 다양한 전기 천공 장치에 대해 고려되어야 합니다. - 38°C에서 전극배아를 원하는 발달 단계로 배양한다.
참고: 형광 해부 입체 스코프 (재료 표참조)는 형질 감염 된 배아와 형질 감염되지 않은 배아를 선별하는 데 도움이됩니다. - 배아를 정적으로 이미지화할 경우, PBS에서 4% 파라포름알데히드에 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 고정시다.
- 가위로 여과지 둘레를 부드럽게 자르고 날카로운 집게로 등지 표면의 반짝이는 멤브레인을 벗겨 내어 비텔린 막에서 배아를 제거합니다.
- PBS/트리톤(0.1%)에서 고정 배아세척 2x 를 5분 동안 유지하고 원하시면 소자 혼성화 또는 면역 염색을 계속합니다.
- 마지막으로, PBS/트리톤에서 배아를 0.5 μg/μL DAPI로 염색합니다(0.1%). 실온에서 30분 이상. PBS/트리톤 2x에서 배아를 5분 동안 세척하고 SCALE-U2 용액23에서 배아를 밤새 지웁습니다.
- 전기 개루의 효율을 분석하려면(그림 2참조), ImageJ의 이진 및 입자 분석 도구 및 DAPI 채널을 사용하여 이미지의 모든 셀에서 핵 윤곽선을 얻습니다.
- ImageJ에서 바이너리 도구를 사용하려면 대부분의 셀을 포함하는 DAPI 채널에서 단일 z 슬라이스를 사용하고 Process > Binary > 바이너리만들기를 클릭합니다. 근처 셀을 분리하려면 프로세스 > 바이너리 > 유역.을클릭합니다. 입자 분석 및 크기가 100-500(μm 2)로 설정된 것을 클릭하여 셀 윤곽선을 가져옵니다.
- 대부분의 셀이 DAPI 채널에 윤곽이 있는지 확인하고 ROI 관리자 팝업 창에 더 > 저장을 클릭하여 셀 윤곽선을 저장합니다.
- 이러한 윤곽선을 사용하여 mRNA 또는 DNA 채널의 단일 z 슬라이스에서 이전에 저장된 파일을 열어 mRNA 및 DNA 채널에 대한 형광 강도 값을 얻은 다음 ROI 관리자에서 측정을 클릭합니다.
- 마지막으로, 이러한 강도 값을 필터링하여 형질감염되지 않은 세포와 형질감염시 6,000개의 형광 강도를 가진 세포와 6,000개의 형광 강도를 가진 세포를 계수합니다.
5. 전기 포어mAs에 의해 인코딩 된 이미지 FPs
- 형광 해부 입체 에서 모든 전기 배아를 보고 동적 이미징 실험을 위한 가장 건강하고 최고의 전기 배아를 선택하십시오.
- 실험 중에 이 배아가 사망하는 경우에 대비하여 선택된 배아를 이미징하는 동안 별도의 배큐베이터에서 다른 전기배아 및 비전기배아(음성 대조군)를 계속 배양한다.
- 동적 이미징의 경우, 앞에서 설명한 바와 같이 전체 마운트 ex ovo 조류 배아 배양을 사용하여24,25,26 을 반전된 공초점 현미경으로 사용한다.
참고 : 현미경은 이미징 중에 36 °C에서 온도를 유지하는 무대 인큐베이터 (재료 표참조)가 장착되어 있습니다. 36°C에서 배양된 배아가 더 높은 온도에서보다 더 오래 생존한다는 현미경 설정 동안, 아마도 레이저가 배아에 국소 가열을 일으킬 수 있기 때문에 관찰되었다. 독자는 자신의 현미경 설정을위한 최적의 무대 인큐베이션 온도를 결정해야합니다.- 배아 발생을 동적으로 이미지화하고 시각화하기 위해, PBS에서 집게를 사용하여 배아를 이동시켜 배아의 등쪽쪽에 형성될 수 있는 기포를 제거하기 위해 PBS를 사용하여 전기 배아를 간략하게 청소합니다. 솔루션.
- 깨끗한 배아를 알부민 한천(~150 μL)의 얇은 층을 포함하는 이미징 접시에 직접 놓아 배아(22)의등쪽 표면에 기포가 발생하지 않도록 한다.
- 장기 이미징의 생존을 보장하기 위해 이미징 접시의 안쪽 가장자리에 작은 촉촉한 압연 티슈 페이퍼를 추가하고 파라핀 필름을 사용하여 접시를 밀봉하여 이미징 및 배양 중에 증발을 최소화합니다.
- 이 접시를 공초점 현미경의 예열 단계로 빠르게 이동하고 주입 및 전기 배기 영역을 식별하는 밝은 필드 채널 (PMT 레이저 20%)을 사용하여 배아에서 착색 된 염료를 찾습니다.
- 이미징 소프트웨어를 원하는 목표(10 또는 20x), 이색 미러(GFP nm의 경우 488nm, RFP의 경우 561개), 방출 스펙트럼(GFP의 경우 499-562 nm, RFP의 경우 570-695nm)으로 설정하고 적절한 레이저(GFP의 경우 488nm, RFP의 경우 561nm)를 켭니다.
참고: 전기포상 mRNA는 20분 이내에 나타난 단백질로 번역되었다(도 3참조). 이 논문에서 대부분의 이미지에 사용되는 이미징 메타데이터는 20배 의 객관적인 반전된 공초점 현미경이었습니다(재료 표참조) 픽셀 거주 시간, ~ 1.5 μs; 4줄 스캔의 평균.- 이미징 소프트웨어에서 라이브를 클릭하고 각 현미경 레이저 전력에 따라 형광 강도에 적합한 설정으로 레이저 전력을 조정합니다. 1% 레이저 파워, 800 게인을 사용하여 배아를 이미징하여 시작하고 포화 픽셀이 보일 때까지 레이저 파워를 1% 씩 천천히 증가시다.
- 포화 픽셀이 더 이상 보이지 않는 때까지 레이저 파워를 약간 줄임으로써 이 작업을 수행하십시오.
참고: 배아의 화상 진찰 세션의 시작을 위해 선택된 레이저 힘은 초기 시간 점에 좋을 지도 모르지만 세포의 형광이 시간이 지남에 따라 훨씬 밝거나 어두워지는 경우에 나중에 시점에서 이상적이지 않을 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 전기 포어화 된 세포가 일반적으로 전기 천공 후 처음 6 시간 동안 더 밝아지기 때문에 초기에 약간 낮은 전력 설정에서 배아를 이미지화하십시오 (신호 증가의 정량화에 대한 그림 3A-E 참조). 이후 이미지의 포화 상태인 경우 원래 이미징 설정으로 이미지를 계속 하지만 이미징 설정이 약한 경우(핀홀이 작거나 레이저 전원이 약한 경우) 즉시 추가 이미지를 촬영합니다. - 다른 시간 점에 걸쳐 개별 세포 이동을 추적하기 위해 배아를 3-5 분마다 이미지화하십시오. 이 작업을 위해, 심상은 전체 전기 공극 영역의 z 스택 (~50 μm 두께) 및 그리고 z 스택의 바닥을 향해 몇 가지 여분의 공간을 더한 후 배아가 이미징 세션 내내 아가로즈 침대로 가라앉을 경우에 대비하여.
- 첫 번째 동영상의 처음 몇 시간 지점을 확인하여 셀이 얼마나 빠르게 움직이는지 관찰합니다. 셀이 빠른 속도로 이동하는 경우(즉, 이미지 영역의 영역을 몇 번 더 시간 지점 내에서 종료한다는 의미) 이미지 영역의 확대(1x à 0.8x)를 확장하거나 다른 영역을 이미징하는 것이 좋습니다.
참고: 지역 pellucida에 있는 배아 지구는 지역 opaca에 있는 그 것 보다는 훨씬 더 급속하게 움직입니다. 추가적으로, 더 젊은 태아 (HH3, HH5)는 수시로 오래된 태아에 비해 더 급속한 운동을 겪고 있는 세포를 포함합니다 (>HH7). - 배아의 전기포질 영역을 이미징한 후, 동일한 배아의 비전기 화 영역을 이미지화하여 자가형광 수준을 결정합니다(낮은 레이저 전력 및 10%가 배아를 이미지화하는 데 사용되는 경우 최소해야 함).
6. 분석 mRNA 무결성에 광 표백 후 형광 회복 (FRAP)
참고: 광표백 (FRAP) 분석 후 생체 내 형광 회복은 얼마나 오래 형질 감염된 mRNA가 FPs로 번역 될 수 있는지 를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 다음 프로토콜은 H2B의 반감기를 검출하기 위한 FRAP 실험을 간략하게 설명합니다. 전기 배아에서 시트린 mRNA.
- 20x 0.8 NA 대점과 완전히 열린 핀홀을 사용하여 반전된 공초점 현미경에서 FRAP 실험을 수행합니다.
- 입체 현미경에 H2B-Citrine의 전기 천공을 확인하고 반전 된 공초점 현미경 (단계 5.2.4 참조)에 예열 된 단계에 배아를 설정 한 후, 다양한 시간에 H2B-Citrine에서 세포 형광의 대부분을 광 표백 포인트 (45 분, 2 시간, 및 5 시간 후 전기 천공) 70 % 레이저 전력, 100 반복, 스캔 속도 4, 남아있는 형광의 5 %를 가진 405 nm 레이저를 사용하여.
참고: 이 프로세스는 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. - 광표백 후 36°C에서 배아를 계속 배양한다.
- 입체 현미경에 H2B-Citrine의 전기 천공을 확인하고 반전 된 공초점 현미경 (단계 5.2.4 참조)에 예열 된 단계에 배아를 설정 한 후, 다양한 시간에 H2B-Citrine에서 세포 형광의 대부분을 광 표백 포인트 (45 분, 2 시간, 및 5 시간 후 전기 천공) 70 % 레이저 전력, 100 반복, 스캔 속도 4, 남아있는 형광의 5 %를 가진 405 nm 레이저를 사용하여.
- 광표백 된 세포가 치료 후 완전히 사망하지 않았다는 것을 나타내는 광 표백 부위 내에서 세포를 적극적으로 분할하는 데주의를 기울여야합니다.
- 공초점 현미경을 사용하여 일정한 시간 간격(3 또는 5분)에서 최대 30분 동안 표백 후 이미지(전기 포어 영역의 z 스택)를 획득합니다.
참고: 가능한 경우, 광표백 영역에서 세포 생존을 보장하기 위한 양성 대조군으로서 형질전환 H2B-XFP 라인을 사용한다. 전기 포이터mRNA에 의해 인코딩된 FP에 대한 형광 회복속도는 감소해야 하지만, 이식유전자를 통해 인코딩된 FP의 경우 전체 영화 전체에 걸쳐 일관되게 유지되어야 한다. - 화상 진찰 조건이 배아 생존에 해로울 수 없다는 것을 확인하기 위하여는, 동시에 화상 진찰을 위한 통제로 봉사할 수 있는 광표백되지 않는 배극화한 태아를 배양합니다.
- mRNA 붕괴 후 전기 천공에 대한 광표백 결과를 양량화하려면 ImageJ를 사용하여 각 세포의 중심(7.5 μm 원)의 형광 강도를 측정하여 시간(3 또는 5분)에 걸쳐 세포 형광을 추적합니다. 유사분열을 겪고 있지 않고 완전히 광표백된 광표백 부위 내의 모든 세포에 대해 이 것을 측정합니다.
참고: 미소 핵은 염색질 응축으로 인한 상간 핵보다 더 강한 형광을 가지고 있기 때문에 정량화에서 미토틱 세포를 생략하는 것을 고려하십시오. - 다양한 시간 포인트(45분, 2시간 및 5시간)에서 표백 후 시간에 걸쳐 형광 강도를 플로팅합니다.
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Representative Results
mRNA 전기 화는 DNA 전기 화보다 더 효율적입니다.
우리는 pCS2 +를 사용했습니다. H2B-시트린은 시험관내 전사 mRNA를 준비한다. DNA 전기화는 일반적으로 1-2 μg/μL에서 수행되기 때문에 mRNA 전기화에 대해 mRNA(H2B-Citrine의 경우 약 0.25-0.5 μg/μL로 계산)의 등쪽 농도를 사용했습니다. 우리는 먼저 pCS2+의 전기 개광 효율을 테스트했습니다. H2B-시트린 DNA는 H2B-시트린 mRNA(pCS2+의 SP6 프로모터로부터 전사된 체외에서)와 비교되었다. H2B-Citrine)을 HH5 메추라기 배아에 별도로 전기대기또는 mRNA를 전기화한 후 12시간 후 전기천공에서 전기화 효율을 검사하였다. DNA 전기천공은 일부 전기포지체에서 더 밝은 형광을 유도하지만, 널리 발현된 mRNA 인코딩된 FPs에 비해 DNA 전기천공의 효율은 눈에 띄게 낮았다(도2A 및B).
전기 천공 프로토콜에서 내재된 배아 대 배아 가변성을 설명하기 위해 H2B-Citrine을 코딩하는 mRNA와 H2B-mKate2를 발현하는 DNA의 등측 결합을 HH5 배아의 이관체 내로 전기포에 넣고 12시간 관찰했습니다. 전기 후. 동일한 배아에서 DNA 및 mRNA 동시 전기를 비교할 때, FP를 발현하는 DNA는또한 mRNA의 그것보다 유의하고 일관되게 덜 효율적이었다(도 2C). mRNA, DNA 또는 이 두 가지의 조합으로 전기화된 모든 배아를 정량화함으로써, 우리는 mRNA트랜스펙트가 주어진 영역에서 세포의 ~75%를 트랜스펙트하는 반면,DNA는 주어진 부위에서 세포의 ~25%를 트랜스펙트한다는 것을 발견하였다(도 2D). mRNA 또는 DNA에 의해 코딩된 형광 단백질의 발현에서의 확산은 모든 공전기 배아에서 유의로 다르지 않았다(도2E).
단백질 발현은 DNA 전기 화보다 mRNA 전기 화에서 더 빠름
형질감염된 mRNA는 그림3에서 볼 수 있듯이 세포질 번역 기계에 의해 즉시 인식될 수 있기 때문에 더 빠른 단백질 생산으로 이끌어 내야 한다. DNA는 핵으로 옮겨져야 하며, 전사되고, mRNA는 시토솔로 다시 이송되어야 하며, 여기서 세포질 번역 기계에 의해 인식되며, 더 많은 시간이 걸릴 것으로 예상된다. 단백질 생산의 mRNA 와 DNA 발현 비율을 직접 비교하기 위해, 우리는 DNA (pCMV.H2B-mKate2)와 mRNA (H2B-Citrine)의 등가 조합을 HH5 배아의 외피로 결합하는 일련의 시간 과정 실험을 수행했습니다. 우리는 ~6 시간 (그림 3A-E, 보충)에 대한 상대 형광 강도에서 계속 증가하는 약 22 분 후 전기 화후 mRNA 인코딩 FP 발현을 검출했다. 영화 S1b). 대조적으로, DNA 인코딩된 FP 발현은 ~1.5h 의 포스트 전기천공(도3A'-E', 보충)에서 처음 볼 수 있다. 무비 S1c)는동영상이 정지되었을 때 6시간까지 밝기가 계속 증가하고 있다. DNA 전기포상 세포가 6h 마크에 의해 포화되었기 때문에, 우리는 약한 화상 진찰 조건으로 이 조건을 다시 이미지화했습니다 (그림3F-F'). 이 시간 경과의 모든 시간 지점에 걸쳐 (22 분 내지 6 시간), mRNA는 DNA보다 몇 배 더 많은 세포를 트랜스펙트(보충. 영화 S1a는,이러한 이미지는 야생형 메추라기 배아의 시간 경과로부터 촬영되기 때문에 브라이트필드 및 DAPI를 통한 전기천공의 총 효율은 나타나지 않는다. 이를 바탕으로, 우리는 mRNA 전기천공이 이전에 발현된 단백질로 이어진다는 결론을 내린다.
다중 mRNA의 공동 전기 화는 매우 효율적입니다.
다음으로, 우리는 다중 mRNA를 관심 있는 지역으로 전기화하여 mRNA 전기천공의 효율을 더 시험하고자 했습니다. 다중 DDNA의 공전기 화광화는 이전에 상대적으로 비효율적인 것으로 나타났으며, 다중 표지수가 25%, 14%, 10%인 2, 3 및 4 DNA 구성물의 총 세포 수의 비율로 계산된 것으로 나타났습니다11 . 우리는 먼저 관발적으로 구별되는 FPs (터키석2-골기/H2B-Citrine)를 HH5 배아로 인코딩하고 모든 전기 화 영역에서 높은 형질 감염 효율을 얻은 두 개의 mRNAs를 전기화했습니다. 우리는 HH4 gastrulating 태아에 있는 지역 pellucida와 opaca 사이 방사형 확장의 영화를 붙잡기 위하여 이 이중 전기 천공을 이용했습니다, 이미지 2 시간 후 전기 천공 (보충영화 S2a, b, 및c). H2B-Citrine은 세포 핵 내에서 국소화되고 세포 증식이27로추적될 수 있도록 합니다. 청록색2-골지 FP는 배아 세포 내에서 세포내 극성을 보이는 것으로 보이지만 생체 내 외피 세포 이동속도 또는 방향과 상관관계가 나타나지 않는다28. 이 동영상 (보충영화 S2)는여러 mRNAs로 전기화 된 세포가 명백한 결함없이 정상적인 세포 활성을 계속할 수 있음을 보여줍니다.
또한, 4 mRNAs의 공동 전기 화 - 터콰이즈2-골지 (골지 장치를 시각화하기 위해), LifeAct-eGFP (F-액틴을 시각화하기 위해), H2B-Citrine (핵을 시각화하기 위해), 멤브레인 체리 FP (멤브레인 시각화) - 87 % 형전 모든 전기 화 영역에서 모든 4 mRNAs의 효율(그림4). LifeAct-EGFP 및 H2B-Citrine은 상용 소프트웨어에서 선형 혼합 처리 도구에 의해 분리되었다.
FRAP 분석은 전기화 후 처음 2시간 동안 의 전기포이징 mRNA의 급속한 분해를 나타낸다.
알몸 mRNA가 세포 RNAases29에의해 신속하게 저하된다는 것은 잘 알려져 있습니다. 우리는 mRNA 전기 가루가 발달하는 태아에 있는 단백질의 빠르고 능률적인 표현을 허용해서 손실 또는 기능 의 이득 실험에 유용할 지도 모른다는 것을 가정했습니다. 따라서 mRNA가 세포에서 DNA보다 빠르게 저하되기 때문에 mRNA 전기 포어화 후 mRNA 부패속도를 정량화하는 것이 도움이 될 것이다. 성인 마우스 신경 줄기 세포에서 mRNA 전기화의 이전 보고에서, 약 80% mRNA는 qRT-PCR에 의해 2시간 후 전기천자를 확인하였지만, 아직 거의 또는 전혀 mRNA가 24시간 후 전기천공15에 의해 검출되었다. 우리는 전기 포이션 된 세포에서 mRNA 수준을 검출하기 위해 생체 내 FRAP 분석을 설계하여 mRNA 발현 후 전기 를 추가로 정량화하고자했습니다.
광표백은 형광포(우리의 경우 형광 단백질)가 관찰 시 형광을 제거하는 흥분 상태에 있을 때 발생할 수 있는 형광포의 돌이킬 수 없는 파괴이다(30,31. 기준선 수준 이상의 광표백 세포에서 검출될 수 있는 형광 단백질(FPs)에서 방출된 모든 발광은, 따라서, 손상되지 않은 형질감염된 mRNAs에 의해 인코딩된 새로 번역된 FPs를 나타내야 한다. 따라서, 우리는 다양한 시점에서 기존의 모든 FP 유래 형광을 제거하고 후속 형광 회복을 추적하기 위해 전기 포케이션 세포를 광표백하고자했습니다.
프로토콜 섹션에 설명된 대로 최적화된 광표백 설정을 사용하여, 우리는 광표백이 처음에 광표백 사건 직후 분석할 때 모든 광표백 된 세포의 형광 강도를 ~ 95 % 감소시킨다는 것을 발견했습니다. 이것은 45 분, 2 시간 및 5 시간 후 전기 천공에서 수행되었다 (그림5A-C). 광표백 부위 내의 각 세포에서형광 회복은 일정한 시간 간격으로 동일한 영역을 이미징함으로써 각 시점에서 광표백 후 30분 동안 추적하였다(3 또는 5분). 우리의 데이터는 45 분과 5 시간 포스트 전기 천공 사이 형질 감염된 mRNA 수준에 있는 중요한 감소가 있다는 것을 건의합니다. 이는 45분 후 전기천공에 비해 5시간에서 측정된 FRAP의 큰 감소에 의해 나타난다. 특히 5시간 시점에서 표백된 셀의 형광 회복을 강조하기 위해 ImageJ의 밝기/대비 도구를 사용하여 그림 5A-C의 밝기를 향상시키고 그림 5D-F에서이러한 수정된 이미지를 보여 줍니다. 흥미롭게도, 일부 세포가 다른 세포보다 형광을 더 빨리 회복하기 때문에 2시간 에서 광표백 영역 내의 세포 간 세포로부터의 형광 회복에 큰 이질성이 있다(도5E', 화살촉참조). 그러나, 5h 광표백 영역 내의 모든 세포는 2 시간에서 광표백 된 세포보다 형광 속도가 느립니다 (도5F''). 우리는 또한 광표백 된 부위 내에서 세포를 적극적으로 분할하는 것을 감지하여 광 표백 과정의 결과로 세포가 사망하지 않았다는 것을 시사합니다 (그림5E').
우리는 광표백 사건 후 30 분 기간 동안 광 표백 영역 내에서 각 세포의 정규화 된 신호 강도를 표시하여 도 6A에서 이러한 결과를 정량화. 각 세포에 대해, 형광 값은 광표백 직후 해당 세포의 신호 강도에 대해 정규화되었다. 이러한 정규화는 이미지화된 모든 시간 포인트(45분, 2시간, 5시간)에 걸쳐 모든 셀에 대해 수행되었다. 동일한 사진 표백 부위 내의 세포의 형광 회수의 정규화된 값을 함께 풀링하고 광표백 사건 후 시간이 지남에 따라 그래프화하였다; 따라서 그래프의 각 점은 ~35 셀을 나타냅니다. 비정규화된 데이터는 또한 도 6B에 표시되며, 각 라인은 광표백 직후형광 신호 강도를 회복하는 세포를 나타낸다. 이 데이터는 전반적으로 5 h에 의해, 모든 세포가 그들의 mRNA의 대부분을 고갈했다는 것을 건의합니다, 이 투하의 큰 부분은 45 분과 2 시간 포스트 전기 천공 사이에서 생기는.
그림 1: pCS2+LifeAct-eGFP 구단을 만들기 위한 복제 절차의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: mRNA 전기화는 DNA 전기화보다 더 효율적이다. (A-A') pCS2.H2B-Citrine을 발현하는 DNA는 HH5 배아의 외엽내로 전기로 이식되었다. 형광은 12시간 후 전기포공에서 관찰되었다. 스케일 바 = 50μm.(B-B'') H2B-Citrine을 발현하는 mRNA를 HH5 배아의 이관체 내로 전기로 박살하였다. 형광은 전기 후 12시간 동안 관찰되었다. 스케일 바 = 50 μm.(C-C')DNA(pCMV.H2B-mKate2) 및 mRNA(H2B-Citrine)의 등음부 조합을 HH5 배아내로 전기포지체화하고 12시간 후 전기포공을 관찰하였다. 3개의 배아를 조건당 시험하였다(n=2 실험). 스케일 바 = 50μm. (D) 이미지J에서 입자 분석 도구를 사용하여 A, B 및 C(총 9개의 배아)로부터3개의 배아를 정량화하였다. 각 배아로부터 200 μm 영역을 정량화하였다(적어도 150개의 세포는 영역당 계수되었다). 가운데 대시는 평균을 나타내고 위쪽 과 아래쪽 막대는 평균과 표준 편차를 나타냅니다. (e) 3개의 공동 전기포상(DNA 및 mRNA) 배아는 주어진 200 μm 영역에서 모든 전기포상 세포에 걸쳐 신호의 확산을 위해 분석된다. 각 배아는 mRNA 전기천공에 대해 약 100개의 세포를 양성, DNA 전기천공에 대해 양성 세포를 30개 했다. 가운데 대시는 평균을 나타내고 위쪽 과 아래쪽 막대는 평균과 표준 편차를 나타냅니다. mRNA 대 DNA 전기 천공의 확산 사이에는 유의한 차이가 없지만 mRNA 전기 천공은 DNA보다 훨씬 효율적입니다. (A-C) 치수 = 425.10 x 425.10 x 55 μm. 픽셀 거주자 2.55 μs. 평균 라인 4. 픽셀당 비트 = 16. 현미경 메타데이터 = 역 공초점 현미경, 20x 목표 (재료 표참조) (A) Ex: 488 nm (0.05%), 방출 트랙 S1 = 508-579 nm; (B) Ex = 488 nm (5.0%), 배출 트랙 S1 = 508-579 nm; (C) Ex = 488 nm (5.0%), 561 nm (5.0%), 방출 트랙 S1 = 508-579 nm; S2 = 606-695 nm이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: mRNA 전기포공은 22분 후 전기화로 발현을 나타내고 DNA 전기포공보다 훨씬 빠르다. mRNA (H2B-Citrine) 및 DNA (pCMV.H2B-mKate2) 22 분(A-A'),45 분(B-B'),1.5 시간(C-C'),3 시간(D-D'),6 시간(E-E')에서플롯 프로파일 분석 후 시간 과정의 대표적인 이미지 이미징의 시작(n = 1). 플롯 프로파일 분석은 병합된 이미지에서 그려진 화살표를 가로질러 표시되는 매시점마다 제공됩니다. 플롯 프로파일의 각 피크는 전기 포어셀의 핵을 나타냅니다. 세포는 일반적으로 mRNA가 아직도 새로운 형광성 단백질로 번역되고 있다는 것을 나타내는 영화의 6 시간 간격을 통해 밝게 됩니다. 6시간 의 시간 포인트를 위해, 동일한 이미징조건(E-E')을사용하여 포획된 동일한 영역의 이미지와 약한 이미징 조건(F-F'')은 초기 를 사용하여 DNA 전기 포동 세포의 이미지가 고도로 포화되었기 때문에 표시됩니다. 이미징 조건. 축척 막대 = 20 μm. 치수: 425.10 x 425.10 x 55 μm. 이미지는 이미지된 모든 시간 포인트에 걸쳐 최대 강도 투영으로 표시됩니다. 픽셀 은 2.55 μs. 평균 라인 4. 픽셀당 비트 = 16. 현미경 메타데이터 = 역 공초점 현미경, 20배 객관적(재료 표참조) Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5.0%) 이니셜용; 예 = 488 nm (7.5%), 594 nm (0.5%) 마지막 시간 지점 (그림2F),방출 트랙 S1 = 499-562 nm; S2 = 605-661 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 상이한 하위 세포 구조를 대상으로 하는 4개의 mRNAs의 공전기화는 매우 효율적입니다. HH3 배아의 외피체는 mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Citrine 및 막 체리를 인코딩하는 mRNA로 전기화되었다. 배아를 4시간 후 전기포공에서 고정 및 화상했다. 대부분의 세포는 4개의 mRNAs (87%)를 가진 전극 표적으로 한 지역 내의 전기로 배분됩니다. 대표적인 수치(각각 3개의 배아, n=2개의 실험). 스케일 바 = 50μm. (A) 4개의 mRNAs(mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Citrine 및 멤브레인 체리)를 모두 병합합니다. (B) 만 H2B-Citrine 채널 (예 = 488 nm (0.7%), Em = 455-499 nm). (C) 만 mTurquoise2-골지 채널 (예 = 458 nm (22.0 %), Em = 455-499 nm). (D) 병합 H2B-Citrine 및 mTurquoise2-Golgi는 골지가 대부분의 세포에서 핵의 한쪽을 감싸는 것을 보여준다. (E) 만 LifeAct-eGFP 채널 (예 = 488 nm (0.7%), Em : 455-499 nm). (F) 만 멤브레인 체리 채널 (예 = 594 nm (37.1 %), Em = S2 : 570-695 nm). (G) 병합 LifeAct-eGFP 및 멤브레인 체리는 대부분의 세포에서 중첩을 나타낸다. 치수 = 425.10 x 425.10. 픽셀 은 1.58 μs. 평균 라인 4. 픽셀당 비트 = 16. 현미경 메타데이터 = 역 공초점 현미경, 20x 목표 (재료 표참조) Ex = 405 nm (2.4%), 458 nm (22.0%), 488 nm (0.7%), 594 nm (37.1%), 방출 트랙 S1 = 455-499 nm; S2 = 570-695 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 광표백 분석은 전기천공 후 처음 5시간 동안 의 전기기mRNA의 급속한 분해를 나타낸다. H2B-Citrine을 발현하는 mRNA로 전기화된 세포를 함유하는 100 μm² 영역의 광표백은 45분, 2시간, 및 5시간 후 전기천공에서 수행된다. 배아는 광표백 후 정규 시간 간격으로(3 또는 5분) 영상하였다. 광표백 조건은 다음과 같습니다: 70% 405 nm 레이저, 100 반복, 전체 영역에 대한 약 5 분 소요시간. 스케일 바 50 = μm.(A-A')45 분 사전 및 후 표백제. B는 광표백 직후 배아를 나타내고 C는 배아를 30분 후 표백을 나타낸다. 스케일 바 = 50 μm.(B-B')2 시간 전 및 후 표백제. 표백 된 영역 내의 세포가 표백 기간 동안 약간 이동하기 때문에 사각형의 둘레가 이동됩니다. (C-C')5 시간 전후 표백제. (D-D') 향상된 밝기를 갖춘 A-A'와 동일한 이미지(최대값 11550으로 조정하여 밝기 포스트 콜렉션 을 향상시킵니다). (E-E') 향상된 밝기를 가진 B-B'와 동일한 이미지(최대값11550으로 조정하여 밝기 포스트 콜렉션). 백색 화살촉은 주변 세포보다 형광 회복이 높은 세포를 가리킵니다. 시안 화살촉은 최근에 유사분열을 겪은 광표백 세포를 가리킵니다. (F-F') 향상된 밝기를 갖춘 C-C'와 동일한 이미지(최대값 11550으로 조정되어 수집 후 밝기 향상). 치수 = 425.10 x 425.10 x 42 μm. 이미지는 이미지된 모든 시간 포인트에 걸쳐 최대 강도 투영으로 표시됩니다. 픽셀 은 1.58 μs. 평균 라인 4. 픽셀당 비트 = 16. 현미경 메타데이터 = 반전 된 공초점 현미경, 20 x 목표 (재료 표참조) Ex = 488nm (1.5 %), 방출 트랙 S1 = 508-553 nm이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 광표백 된 세포에서형광 회복의 정량화. (a) 표백 부위 내의 모든 세포의 형광 강도(~35세포)를 표백 후 각 기간 동안 각 단일 세포에 대해 추적하였다. 45분에서 2시간으로 회복된 신호 강도의 비율이 크게 떨어지고 2시간에서 5시간으로 더 작은 강하가 뒤따릅니다. 상단 오류 막대는 평균에서 표준 편차를 나타내는 각 점에 대해 표시됩니다. 표시된 선은 선형 회귀 선입니다. R² 45분, 2시간 및 5시간 동안은 각각 0.83, 0.58 및 0.84입니다. 각 점에 대해 오류 막대의 위쪽 절반이 표시됩니다. (b) 표백 부위 내의 모든 세포의 형광 강도(~35세포)를 표백 후 각 기간 동안 각 단일 세포에 대해 추적하고 정상화 없이 그래프화하였다. 복구 된 신호 강도의 비율이 45 분에서 2 시간으로 크게 떨어지고 2 시간에서 5 h로 더 작은 드롭이 있습니다.
보충 부비젼 1: mRNA 전기체는 DNA 전기포공보다 조기 단백질 발현을 유도한다. H2B-시트린 mRNA 및 H2B-mKate2 DNA는 HH5 배아의 이관체내로 전기화되었다. 상화 된 영역은 엑스트라 배아 및 배아 조직의 경계에 있습니다. 스케일 바 = 50μm. (a) 모두 H2B-Citrine 및 H2B-mKate2 채널 표시 (예 = 488 nm (15%), 594 nm (5.0%), Em: 499-562 nm; S2: 605-661 nm). (b) 만 mRNA H2B-Citrine 채널 표시 (예 = 488 nm (15%), Em = 499-562 nm). (c) 오직 H2B-mKate2 DNA 채널만 도시된(Ex = 594 nm (5.0%), Em = 605-661 nm). 치수 = 850.19 x 850.19 x 110 μm. 이미지는 이미지된 모든 시간 포인트에 걸쳐 최대 강도 투영으로 표시됩니다. 픽셀 은 2.55 μs. 평균 라인 4. 픽셀당 비트 = 16. 현미경 메타 데이터: 반전 된 공초점 현미경, 20 x 목표 (재료의 표참조) Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5.0%), 방출 트랙 S1 = 499-562 nm; S2 = 605-661 nm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 2: mRNAs의 공전기는 동적으로 공부하는 명백한 세포 행동을 허용합니다. 배아 와 엑스트라 배아 경계 사이의 세포의 방사형 확장은 mRNA (H2B-Citrine 및 mTurquoise2-Golgi)로 전기화되고 외부 이동 중에 이미지화됩니다. 이 영화는 6 분마다 이미징하여 2 내지 5 h 후 전기 천공에서 공초점 현미경으로 이미지화되었습니다. (a) H2B-Citrine 및 mTurquoise2-Golgi 채널 모두 도시된 (예 = 458 nm (28%), 488 nm (5.0%), Em = 446-526 nm; S2: 508-553 nm). (b) 표시된 H2B-Citrine 채널만 표시됨(예 = 488 nm (5.0%), Em = S2: 508-553 nm). (c) 만 mTurquoise2-골지 채널 표시 (예 = 458 nm (28%), Em = 446-526 nm). 치수 = 425.10 x 425.10 x 32.5 μm. 이미지는 이미지된 모든 시간 포인트에 걸쳐 최대 강도 투영으로 표시됩니다. 픽셀 은 0.79 μs. 평균 라인 4. 픽셀당 비트 = 16. 현미경 메타데이터 = 역 공초점 현미경, 20x 목표 (재료 표참조) Ex = 458 nm (28%), 488 nm (5.0%), 방출 트랙 S1 = 446-526 nm; S2 = 508-553 nm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에서는 메추라기 배아를 가스투압하는 세포로 mRNA를 정밀하게 미세 주입하고 전기 포어하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공했습니다. 우리는 시험관 내 합성 mRNA 전기화가 메추라기 배아에서 형광 단백질 (FPs)의 빠르고 효율적인 발현을 허용한다는 것을 입증했습니다 (그림2 및 3). 전기 포공 mRNAs에서 번역된 H2B-시트린 단백질로부터의 형광은 ~ 20분 이내에 공초점 현미경검사법에 의해 검출될 수있고 시간 동안 FP 형광에서 증가하였다(그림 3,보충 영화1). 이것은 놀랍게도 빠르며 시트린32,33에대한 추정 된 성숙 시간에 가깝습니다. DNA 벡터로부터 발현된 FPs는 2-3시간 후에 검출되었다(도 3,보충. 영화1) 이는 이전보고서 8,34,35와유사하다. 다양한 FP는 고유한 성숙 시간을 가지므로 고급 계획은 실험에 필요한 스펙트럼 구별 및 성숙 역학의 관점에서 이상적인 FP가 선택되도록 보장합니다. 부가적으로, 합성된 mRNAs는 DNA 벡터11보다더 효율적으로 배아 세포를 공동 트랜스펙트한다. 형질감염 효율이 높을수록 단일(그림2)또는 mRNAs의 다중 집단으로 관심 영역에서 더 많은 세포가 형질감염되는 결과를 낳는다(그림 4).
mRNA의 안정성은 매우 규제되고 폴리아데닐레이션, 접합, 번역, 보조 구조 및 번역되지 않은영역의 영향을 받을 수 있으며, 몇 가지 36,37을지칭한다. 세포 내 내 내인성 및 합성 mRNA의 반감기는 36일 36,38까지분에서 다를 수 있습니다. 우리는 기존 mRNA-인코딩된 H2B-시트린 단백질을 표백하기 위해 광표백(FRAP) 후 생체내 형광 회수를 사용했으며, 전기 후 최초 2시간 동안 가장 눈에 좋은 H2B-시트린 형광 회수를 관찰하였다(그림5 및 6). 다른 mRNAs는 의심 할 여지없이 자신의 길이, 내부 시퀀스, 5'와 3 '수정36,37에따라 다른 반감기를해야합니다, 그래서 각각 원하는 경우 분석해야합니다.
중요한 화상 진찰은 전형적으로 고품질 화상 진찰을 위한 최적 조건 사이 절충을 요구하고 빠르고, 보다 적게 유독한 화상 진찰39,40. 이미징 시, 배아 세포에 대한 광표백 및 광손상을 최소화하기 위해 가능한 한 낮은 레이저 전력을 사용하는 것이 바람직하다(프로토콜의 5.3단계에 대한 참고 사항 참조)40. 빠른 컬렉션(예: 빠른 스캔 속도, 평균 이하)을 위해 현미경 설정을 변경하면 필요한 이미지 해상도41을잃지 않으면서 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로, 수확, 전기 천공 및 이미징 중에 배아를 처리하고 조작할 때 주의를 기울여야 합니다(4단계 참조). 초기 단계 배아는 섬세하고 쉽게 손상될 수 있습니다.
전반적으로, mRNA 전기 천공의 정확한 타이밍 과 정확한 국소화는 mRNA 전사체의 신속한 발현, 공동 형질전환 효율 및 빠른 붕괴를 활용하는 교란 실험을 허용한다. 관심 있는 유전자의 과발현 또는 오발은 합성된 mRNA의 전기 포공화를 통해 달성될 수 있다. 각 mRNA에 대한 농도를 tittering하는 것은 중요합니다, 너무 많은 mRNA는 비 특이적 세포 독성을 일으킬 수 있기 때문에, 너무 작은 mRNA는 원하는 세포를 표시하거나 적절하게 현상형 변화를 유도하지 않을 수 있습니다. 다양한 생물학적 과정의 교란을 위해 FP 융합 마커를 인코딩하는 mRNAs의 체외 합성을 위해 생성된 과다한 벡터는 다양한 동물 모델 시스템에서 이미 존재한다. 체외 mRNA 합성을 위해 설계된 이들 구성품의 대부분은 비영리 플라스미드 저장소로부터 신속하고 저렴하게 얻을 수 있다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는이 작품에 도움이 통찰력을 데이비드 Huss 감사합니다. 이 작품은 로즈 힐스 재단 여름 연구 펠로우십 (2016-2018)과 USC Provost의 언더 그라드 연구 펠로우십M.T., 사반 연구소 교내 교육 박사 전 박사 상, 그리고 대학에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 남부 캘리포니아 학부 연구 어소시에이트 프로그램 수상
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
| SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
| SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
| Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
| pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
| pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
| pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
| pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
| pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
| Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
| CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
| Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
| Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
| XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
| 1.37 M NaCl | |||
| 27 mM KCl | |||
| 80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
| PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use. | ||
| 1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
| 0.1% Triton X-100 |
References
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