Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Snabb och effektiv uttryck av flera proteiner i aviär embryon med hjälp av mRNA elektroporation

Published: June 7, 2019 doi: 10.3791/59664
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

Summary

Vi rapporterar Messenger RNA (mRNA) elektroporation som en metod som möjliggör snabb och effektiv uttryck för flera proteiner i vaktel embryo modellsystem. Denna metod kan användas för att fluorescerande etikettceller och registrera deras in vivo rörelser av Time-lapse mikroskopi kort efter elektroporation.

Abstract

Vi rapporterar att mRNA elektroporation tillåter fluorescerande proteiner för att märka celler i levande vaktel embryon snabbare och bredare än DNA-elektroporation. Den höga transfektionseffektiviteten tillåter minst 4 distinkta mRNAs att co-transfected med ~ 87% effektivitet. De flesta av de elektroporerade mRNAs bryts ned under de första 2 h post-elektroporation, tillåter tidskänsliga experiment som skall utföras i det växande embryot. Slutligen beskriver vi hur man dynamiskt bild levande embryon electroporated med mRNAs som kodar olika subcellulära riktade fluorescerande proteiner.

Introduction

Electroporation är en fysisk transfection metod som använder en elektrisk puls för att skapa övergående porer i plasmamembranet, vilket gör att ämnen som nukleinsyror eller kemikalier att passera in i cytosolen. Elektroporation används ofta för att leverera DNA till bakterier, jäst, växter, och däggdjursceller1,2,3. Det används rutinmässigt för att införa genetiska nyttolaster i målceller och vävnader inom det framtagande aviär embryot för att studera genetisk kontroll av utveckling eller etikett som migrerar populationer av celler4,5,6, 7. Emellertid, flera experimentella begränsningar finns också med DNA-elektroporation8. Till exempel introducerar DNA-elektroporation ofta mycket varierande antal uttrycks vektorer per cell och därefter de mRNAs och proteiner de kodar. Denna variation kan leda till betydande cellcellers heterogenitet som kompliserar både bildanalys och data tolkning9,10. Dessutom, proteiner från DNA-elektroporation börjar bara att uttrycka ~ 3 h post-elektroporation och inte når den maximala effektiviteten i cell nummer och fluorescens intensitet tills 12 h, sannolikt på grund av den tid som krävs för att överföra till kärnan och komplett både transkription och översättning in vivo11.

Däremot har mRNA transfektion använts effektivt i en mängd olika modellsystem, inklusive Xenopus laevis oocyter av görs12,13, omprogrammering mänskliga stamceller av mRNA lipofectamine transfection14 , och electroporating motsträvt neurala stamceller hos vuxna möss15. Vi testade förmågan hos mRNA elektroporation att effektivt märka celler under tidig aviär embryonal utveckling med in vitro syntetiserade mrnas som kodar distinkta fluorescerande proteiner (FPS). För våra studier använde vi pCS2 + Vector, en mångsidig uttrycks vektor som ofta används för att uttrycka proteiner i embryon från Xenopus och zebrafiskar. De SP6-och T7 RNA-polymerasinitiativtagarna i pCS2 + tillåter syntesen av mRNA och protein från någon klonad gen när den används i en in vitro-transkription/översättningssystem.

Här visar vi att mRNA elektroporation möjliggör snabb och effektiv uttryck för fluorescerande proteiner (FPS) i gastrulating vaktel embryon. Vi utformade och genererade många av de uttryck vektorer som används i dessa studier. Till exempel subklonade vi LifeAct-eGFP Gene16 i pCS2 + Vector17 för att uttrycka från CMV promotorn och SP6 promotorn. Den insatta genen ligger nedströms av den SP6 promotorn och upstream av SV40 poly (A) Svanen18. I embryon Co-electroporated med mRNA och DNA, FPs kodade från in vitro transkriberas mRNAs upptäcktes först inom 20 min av Electroporation, medan FPs från DNA-uttryck vektorer upptäcktes först efter 3 h. flera mRNAs-kodning för Nuclear, Golgi och membranproteiner kan elektroporeras till ett embryo samtidigt, vilket resulterar i ett snabbt och effektivt uttryck av flera proteiner i enskilda celler. Slutligen, med hjälp av en in vivo fluorescens återhämtning efter photoblekning (FRAP) assay, visar vi att en majoritet av den elektroporerade mRNAs förfall inom 2 h. Således, snabb initial proteinproduktion kombinerat med begränsad ny protein översättning gör mRNA elektroporation en värdefull teknik när temporala kontroll av uttrycket är nödvändigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök utfördes i enlighet med godkända riktlinjer från Children ' s Hospital Los Angeles och University of Southern California institutionella djuromsorg och använda kommittéer.

1. generation pCS2-baserade uttryck vektorer

  1. För att klona pCS2. Lifeact-eGFP, Förbered Vector Backbone genom att smälta 2 μg pCS2. CycB1-GFP (en konstruktion som innehåller en annan insats) med BamHI (10 U) och BsrGI (10 U) i lämplig rötnings buffert (se tabell över material) späddes till 1x i en total reaktion 50 μL i 1 h vid 37 ° c (se figur 1 för det schematiska klonings förfarandet).
    1. Defosforylera den fria 3 ' OH ändarna av vektorn ryggraden från begränsningen enzym reaktionen genom att tillsätta räkor alkaliskt fosfatas (1 U). Inkubera i 30 min vid 37 ° c.
    2. Kör hela blandningen i en 1% aguppstod gel/1x Tris acetat EDTA (Tae) buffert vid 90 V för ~ 50 min och sedan färga gelen i en 0,5 μg/ml lösning av etidiumbromid bromid i 1x Tae buffert för 15 min med mild Rocking. Se också till att ladda molekylvikt markörer i en fri körfält för att bestämma DNA-storlekar.
    3. Med hjälp av en DNA-säker UV-transilluminator för att undvika Hack DNAS, klipp ut vektor stamnätet (förväntad band storlek på 4kb) från agaros gel snabbt och isolera DNA-fragmentet från gel biten med hjälp av en gel renings sats med tillverkarens instruktioner.
  2. Förbered skäret samtidigt med steg 1,1 genom att smälta 2 μg pEGFP-N1-Lifeact med BglII (10 U) och BsrGI (10 U) i lämplig rötnings buffert som späds till 1x i en total reaktions volym på 50 μL under 1 h vid 37 ° c. Kör hela blandningen i en 1% agaros gel för att isolera 800 BP-bandet som tidigare förklarats i steg 1.1.2-1.1.3.
  3. Efter både vektorn och insatsen renas och kvantifieras på spektrofotometer, kombinera 50 ng av vektorn och 38 ng av insatsen (1:3 molar förhållandet mellan vektor att infoga) i T4 DNA Ligase buffert innan du lägger T4 DNA Ligase att katalysera ligering reaktionen. Dessutom, ställa in en ingen DNA-kontroll, en vektor endast kontroll och en INSERT endast kontroll. Inkubera alla reaktioner vid rumstemperatur i 30 minuter.
    1. Omvandla 1 μL av ligeringsblandningen (erna) till den behöriga E. coli -DH10. Också, förvandla vatten endast negativ kontroll och 20 pg av pUC19 positiv kontroll. Fördela bakterier på Luria buljong (LB) agar plattor som innehåller 50 μg/mL ampicillin och inkubera över natten vid 37 ° c.
    2. På följande morgon, räkna kolonierna på varje tallrik.
      Anmärkning: Helst bör det inte finnas några kolonier på de negativa kontroll plattorna, > 100 kolonier på vektorn + skär ligationsplattor och färre kolonier på Vector-plattan.
    3. Plocka minst 8 bakteriekolonier från agarplattan omvandlad med Vector + INSERT ligering blandningen och Inokulera dem med hjälp av sterila tandpetare eller Pipettera tips i 2 ml flytande lb buljong som innehåller 50 μg/ml ampicillin.
    4. Extrahera DNA från varje kloner med hjälp av kommersiella plasmid miniprep Kits.
    5. Kör en diagnostisk begränsning Digest med 500 ng av DNA från varje klon med hjälp av (10 U) och BamHI (10 U) i lämplig rötnings buffert utspädd till 1x för 1 h vid 37 ° c och köra smält DNA på en 1% aguppstod gel i 1x TAE buffert. Förväntade bandstorlekar för pCS2. Lifeact-eGFP positiva kloner är 3,9 KB och 978 BP.
    6. Omvandla 1 PG-100 ng av DNA från den positiva klon till behöriga E. coli DH10, och förbereda 3-4 miniprep reaktioner som beskrivs i tidigare steg för att få en tillräcklig mängd DNA för in vitro-transkription reaktion (10 μg minimum).

2. beredning av mRNA genom in vitro-transkription

  1. Linearize 10 μg pCS2. LifeAct-eGFP på 3 ' slutet av insatsen med e (10 U) i en lämplig rötnings buffert utspädd till 1x i en total reaktions volym på 50 μL vid 37 ° c över natten.
    Anmärkning: För att förhindra att RNase kontamineras och reducera mRNA-nedbrytning, Använd handskar vid hantering av mRNA-prover.
  2. Rena DNA med hjälp av en blandning av fenol: kloroform: isoamylalkohol (25:24:1, v/v).
    1. Tillsätt 150 μL av RNase-fritt vatten för att göra den totala volymen av rötnings reaktionen lika med 200 μL. Tillsätt sedan 200 μL fenol: kloroform: isoamylalkohol och Vortexblanda blandningen i 20 s.
    2. Centrifugera i en mikrofuge vid max hastighet (18 400 x g) i 2 min. Ta försiktigt bort den övre vattenfasen som innehåller det lineariserade DNA. Upprepa detta steg för att ta bort ytterligare orenheter och var noga med att inte störa den vita fällningen som kan bildas mellan botten och övre vätske faser.
  3. Fällate linearized DNA genom att tillsätta 1/10 volym 3M natriumacetat (RNase-fri) och 2,5 volymer av 100% etanol. Lämna blandningen vid-20 ° c i > 30 min, sedan pelleten DNA genom centrifugering vid max hastighet (18 400 x g).
    1. Tvätta DNA-pelleten med 70% etanol, sedan lufttorka pelleten för > 5 min.
    2. Lös upp DNA-pelleten i 5 μL av RNase-fritt vatten. Kvantifiera DNA med spektrofotometer.
      Anmärkning: Den förväntade DNA-koncentrationen är ~ 0,5-1 μg/μL med ett A260/A280-förhållande mellan 1,7-2,0.
  4. Använd 1 μg av linearized pCS2. LifeAct-eGFP DNA för in vitro-transkription (IVT). Följ tillverkarens anvisningar i Commercial Kit (se tabell över material) för att inkludera 10 μL av Cap analog (slutlig koncentration 0,8 mM) och NTPs (slutlig koncentration 1 mM för ATP, CTP, och TTP; 0,2 mM för GTP), 2 μL av 10X reaktionsbuffert (slutlig koncentration 1x), 2 μL SP6-RNA-polymeras och RNase-fritt vatten upp till 20 μL.
    1. Inkubera IVT blandningen i ca 2 h eller längre, beroende på avskrift storlek.
      Anmärkning: 2 h inkubation fungerar bra för en 3 KB avskrift, men övernattning inkubering fungerar bättre för utskrifter som är större än 5 KB.
    2. För att avlägsna fria nukleotider från transkriptionsreaktionen, tillsätt 30 μL av LiCl RNA-utfällnings lösningen (7,5 M litiumklorid, 50 mM EDTA) för att fälla ut mRNA. Virvel blandningen kort och förvara vid-20 ° c i 30 min. snurra mRNA ner för 15 min i en mikrofugrör vid max hastighet (18 400 x g) och skölj med 70% etanol (RNase-fri).
  5. Lös upp den syntetiserade mRNA i 15 μL av RNase-fritt vatten. Fördela den syntetiserade mRNA vid 5 μL/tub (totalt 3 rör) och placera vid-80 ° c vid långtidsförvaring. Kvantifiera mRNA med en spektrofotometer.
    Anmärkning: Förväntad avkastning är 15-20 μg mRNA (~ 1 μg/μL). 1 μL (1 μg/μL) är tillräckligt för ett experiment med ~ 10 embryon, förutsatt att mRNA späds från 1 μg/μL till 500 ng/μL och att varje embryo injiceras med ~ 200 nL. Varje tub bör därför innehålla tillräckligt med mRNA för ~ 5 experiment.
  6. Kör ~ 300 ng av mRNA på en 1% agarosgel i 1x Tae buffert efter rengöring all gel utrustning med RNase dekontaminering lösning (t. ex., RNase bort) och se till att mRNA visas som ett band (flera band kan förekomma om sekundära strukturer form) och att inget smeta en tillfredsställelse i gel Lane, vilket indikerar RNA-nedbrytning.

3. beredning av mRNA elektroporation mix

  1. Tina och späd mRNA med önskad koncentration (250-500 ng/μL i RNase-fritt vatten fungerar bra för alla mRNAs som testats i detta arbete). Tillsätt 1/10 volym av färgat färgämne (se tabell över material, RNAse-fri, 0,1% slutkoncentration) för att visualisera mRNA injektionsstället och korrekt Placera elektroderna.
    Anmärkning:     om DNA och RNA kombineras för att utföra en co-elektroporation, se till att DNA är fri från kontaminerande RNases genom att använda fenol-kloroform utvinning och etanol nederbörd före mRNA och DNA-blandning.
    1. Var noga med att förbereda en negativ kontroll med hjälp av en mock (No RNA Added) elektroporation lösning. Om möjligt, Förbered en positiv kontroll med förhandsval IDE rad mRNA (mRNA som har visat sig producera FP framgångsrikt i tidigare experiment).
      Anmärkning: Den negativa kontrollen är nödvändig för alla bild experiment för att skapa bakgrundfluorescensnivåer för normalisering av data. Den positiva kontrollen är särskilt viktig när man arbetar med nyligen transkriberade mRNA genom att hjälpa till att bekräfta att de elektroporation inställningarna fungerade.
  2. Förvara mRNA elektroporation lösning på en Ice flytgödsel att förhindra nedbrytning tills redo att fortsätta med elektroporation.

4. elektroporate mRNA till levande vaktel embryon

  1. Samla nyligen lagt befruktade vaktelägg dagligen och förvara vid 13 ° c i ett befuktat kylskåp för längre än 1 vecka. Inkubera vakteäggen vid 38 ° c tills de önskade embryonala utvecklingsstadierna19,20,21.
    Anmärkning: HH3 till HH5 användes i denna studie för både statisk och dynamisk avbildning. För HH3 embryon, lämnar äggen vid rumstemperatur för 2 h före skörd gör isolerings processen mycket lättare eftersom embryona är i allmänhet mer motståndskraftiga mot fysiska manipulationer när svalnat.
  2. Isolera och Förbered embryon enligt EG-kultursystemet22. Samla in minst 5 embryon per tillstånd, inklusive minst en för att fungera som en negativ kontroll (ej elektroporerad).
    1. Försiktigt bryta och häll ägget i en 10 cm petriskål. Ta bort majoriteten av tjockt albumin med en överföringspipett och ta bort det kvarvarande tjocka albumin runt embryot genom att försiktigt torka av äggulan med en vävnad torka för att säkerställa att embryot fastnar tätt i pappers ringen.
    2. Lägg precut filterpapper (se tabell över material) på embryot och använda sax för att smidigt skära runt omkretsen av embryot.
    3. Använd en Pasteur pipett för att ligga bakom embryot med PBS, med hjälp av milda strömmar att tömma någon äggula fastnar på embryot.
      Anmärkning: Detta steg är kritiskt när man arbetar med yngre (< HH3) embryon eftersom dessa embryon tenderar att sticka mer till äggulan och kommer ofta lossna från Eukaryoter membranet under efterföljande tvättsteg.
    4. Dra långsamt embryot/pappers ringen i en sned vinkel upp och bort äggulan i en petriskål fylld med PBS för ytterligare rengöring. När de flesta av äggulan har avlägsnats, placera embryot ventrala Sidan upp på en 35 mm petriskål täckt med en semi-solid blandning av agar/albumen.
  3. Förbered sex till 8 10 cm långa glas mikrokapillärer (O.D. = 1,2 mm) med hjälp av ett glas micropipett avdragare instrument.
  4. Placera embryot ventrala Sidan upp i elektroporation kammaren fylld med PBS. Med hjälp av ett glas microcapillary, injicera en bolus av 200 nl av mRNA eller DNA/mRNA elektroporation blanda i håligheten mellan epiblast och Eukaryoter membran som täcker den önskade regionen.
    Anmärkning: Hela det främre området för pellucida och något område för opaca var electroporated i de flesta av de experiment som visas i detta manuskript.
  5. Placera de positiva och negativa elektroderna (Platinum Flat Square elektrod; sidolängd på 5 mm) ovanpå respektive undersidan av embryot och electroporate med hjälp av följande pulssekvens: fem kvadratiska elektriska pulser av 5 V, 50 ms varaktighet med 100 MS intervall med en in vivo-elektroporator. Se till att avståndet mellan elektroderna är ~ 5 mm.
    Anmärkning: Att optimera elektroporeringsparametrarna är avgörande för att undvika förhållanden som kan döda de ömtåliga embryonala cellerna. Parametrar för spänning, pulslängd, puls intervall och antalet pulser för DNA och mRNA bör övervägas för olika elektroporeringsenheter.
  6. Inkubera de elektroporerade embryona vid 38 ° c till önskat utvecklingsstadium.
    Anmärkning: En fluorescerande dissekerande stereoskop (se tabell över material) hjälper till att avskärma transfekterade kontra icke-transfekterade embryon.
  7. Om embryona skall avbildas statiskt, fixera dem i 4% PARAFORMALDEHYD i PBS för 1 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° c.
    1. Ta bort embryon från Eukaryoter membranet genom att smidigt skära runt omkretsen av filtret papper med sax och skalar av det blanka membranet på dorsala ytan med vassa tång försiktigt.
    2. Tvätta de fasta embryona i PBS/Triton (0,1%) 2x i 5 min och fortsätt med in situ hybridisering eller immunofärgning om så önskas.
    3. Slutligen, fläcken embryot i 0,5 μg/μL DAPI i PBS/Triton (0,1%) i minst 30 minuter vid rumstemperatur. Tvätta embryon i PBS/Triton 2x i 5 min och rensa embryot i skala-U2 lösning23 över natten.
  8. För att analysera effektiviteten i elektroporation (se figur 2), Använd binära och Partikelanalys verktyg och DAPI kanal på imagej att få nukleära konturer från alla celler i bilden.
    1. För att använda det binära verktyget på ImageJ, Använd en enda z-slice i DAPI-kanalen som innehåller en majoritet av celler och klicka på Process ≫ binära ≫ gör binära. Om du vill separera närliggande celler klickar du på bearbeta ≫ binär ≫ vattendelare. Hämta cell konturer genom att klicka på analysera ≫ analysera partiklar, storlek inställt på 100-500 (μm2).
    2. Se till att en majoritet av cellerna beskrivs i DAPI-kanalen och spara cell konturerna genom att klicka på mer ≫ Spara i Roi Manager-popup-fönstret.
    3. Använd dessa konturer för att få fluorescensintensitet värden för mRNA och DNA-kanal genom att öppna den tidigare sparade filen på en enda z-slice i mRNA eller DNA-kanal och klicka sedan på mått på ROI Manager.
    4. Filtrera slutligen dessa intensitetsvärden, räkna celler med < 6000 fluorescensintensitet som icke-transfected och celler med > 6000 fluorescensintensitet som transfected.

5. bild FPs kodad med Electroporated mRNAs

  1. Välj den hälsosammaste och bästa elektroporated embryo för dynamisk avbildning experiment efter att ha tittat på alla elektroporated embryon under fluorescerande dissekera stereoskop.
    1. Fortsätt att Inkubera de andra elektroporerade embryona och det icke-elektroporerade embryot (den negativa kontrollen) i en separat inkubator medan du avbildar det valda embryot om detta embryo dör under experimentet.
  2. För dynamisk avbildning, Använd hela Mount ex ovo avian embryo kultur som tidigare beskrivits24,25,26 med en inverterad konfokal Mikroskop.
    Obs:     mikroskopet är utrustat med en på scenen inkubator (se tabell över material) som upprätthåller temperaturen vid 36 ° c under bildtagning. Det observerades under Mikroskop set-up att embryon inkuberas vid 36 ° c överleva längre än vid högre temperaturer, möjligen eftersom lasern kan orsaka lokal uppvärmning på embryot. Läsarna bör fastställa den optimala inkubations temperaturen på scenen för sin egen Mikroskop uppsättning.
    1. För att dynamiskt avbilda och visualisera embryogenes, rengör det elektroporerade embryot kort med PBS för att ta bort eventuella bubblor som kan bildas på ryggsidan av embryot under elektroporation processen genom att flytta embryot runt med hjälp av tång i en PBS ren Lösning.
    2. Placera det rena embryot direkt på en bildbehandling skålen som innehåller ett tunt skikt av albumen-agar (~ 150 μL) att se till att inte generera några bubblor på dorsala ytan av embryot22.
    3. För att säkerställa överlevnad för långsiktig avbildning, tillsätt en liten fuktig upprullad bit av silkespapper på insidan kanterna av Imaging skålen och försegla skålen med paraffin film för att minimera avdunstning under avbildning och inkubering.
    4. Flytta denna maträtt snabbt till förvärmda skede av ett konfokala Mikroskop och lokalisera den färgade färgen i embryot med hjälp av brightfield kanal (PMT laser 20%), som identifierar den injicerade och elektroporated regionen.
  3. Ställ bildprogram till önskat mål (10 eller 20x), Dichroic Mirror (488 Nm för GFP nm, 561 för RFP), emission Spectra (499-562 Nm för GFP, 570-695 Nm för RFP), och slå på en lämplig laser (488 Nm för GFP, 561 Nm för RFP).
    Anmärkning:     elektroporerad mRNA översattes till proteiner som sågs inom 20 minuter (se figur 3). Den avbildning metadata som används för de flesta av bilderna i detta dokument var: en inverterad konfokal Mikroskop med en 20x mål (se tabell över material); pixel Dwell tid, ~ 1,5 μs; medelvärde av 4-linjers genomsökningar.
    1. Klicka på Live på bildhanteringsprogrammet och justera lasereffekten till en inställning som är lämplig för fluorescensintensiteten beroende på varje Mikroskop lasereffekt. Börja med att avbilda embryot med 1% lasereffekt, 800 Gain, och öka lasereffekten långsamt med 1% steg tills mättade pixlar ses.
    2. Följ detta genom att minska lasereffekten något tills inga mättade pixlar syns längre.
      Anmärkning: Den lasereffekt som valts för början av en bildbehandlings session av ett embryo kan vara bra för tidigare tidpunkter men inte idealisk vid senare tidpunkter om cellernas fluorescens blir mycket ljusare eller svagare över tid. För att ta itu med detta, bild embryot till något lägre effektinställningar initialt eftersom de elektroporerade cellerna i allmänhet blir ljusare under de första 6 timmarna efter elektroporation (se figur 3a-E för kvantifiering av signal ökning). Om de senare bilderna är mättade fortsätter du till bilden med de ursprungliga bildinställningarna, men tar ytterligare en bild direkt efter med svagare bildinställningar (mindre hål eller svagare lasereffekt).
    3. Bild embryot varje 3-5 min för att spåra enskilda cell migration över olika tidpunkter. För detta arbete, bilderna var z-stackar (~ 50 μm tjock) av hela electroporated området, plus några extra utrymme mot botten av z-stacken i fall embryot sjunker in i aguppstod sängen hela imaging session.
    4. Observera hur snabbt cellerna rör sig genom att kontrollera de första tids punkterna i den första filmen. Om cellerna rör sig i en snabb takt (vilket innebär att de kommer att lämna området i den avbildade regionen inom ett par fler tidspunkter), Överväg att utvidga zoomning av det avbildade området (1x à 0.8 x) eller avbildning en annan region.
      Anmärkning: Embryonala regioner i området pellucida flytta mycket snabbare än de i området opaca. Dessutom innehåller yngre embryon (HH3, HH5) ofta celler som genomgår en snabbare förflyttning jämfört med äldre embryon (> HH7).
    5. Efter avbildning av den elektroporerade regionen av embryot, bild en un-elektroporated region av samma embryo för att bestämma autofluorescence nivåer (bör vara minimal om låg lasereffekt < 10% används för att bilden embryot).

6. fluorescens återhämtning efter Photoblekning (FRAP) till assay mRNA integritet

Anmärkning: En in vivo fluorescens återhämtning efter photoblekning (FRAP) analys kan användas för att avgöra hur länge transfekterade mRNA kan översättas till FPS. Följande protokoll beskriver ett FRAP-experiment för att upptäcka halveringstiden för H2B. Citrin mRNA i ett elektroporerat embryo.

  1. Utföra FRAP experiment på inverterade konfokala Mikroskop med en 20x 0,8 NA mål och en helt öppen Pinhole.
    1. Efter att ha bekräftat elektroporation av H2B-Citrin på stereomikroskopet och sätta embryot på förvärmd skede på inverterade konfokala Mikroskop (se steg 5.2.4), photobleach de flesta cellulära fluorescens från H2B-Citrin på en mängd tid Poäng (45 min, 2 h, och 5 h post-elektroporation) med hjälp av 405 nm Laser med 70% lasereffekt, 100 iterationer, skanningshastighet 4, som lämnar endast 5% av fluorescens kvar.
      Anmärkning: Den här processen bör ta ett par minuter.
    2. Fortsätt att Inkubera embryona på scenen vid 36 ° c efter foto blekning.
  2. Var noga med att uppmärksamma att aktivt dela celler inom photoblekt regionen, vilket tyder på att de fotoblekta cellerna inte har helt dött efter behandling.
  3. Förvärva post-Bleach bilder (z-stackar av den elektroporerade regionen) för upp till 30 min vid regelbundna tidsintervall (3 eller 5 min) med hjälp av konfokala Mikroskop.
    Anmärkning: Om tillgängligt, Använd en transgen H2B-XFP-linje som en positiv kontroll för att säkerställa cellöverlevnad i den fotoblekta regionen. Graden av fluorescens återhämtning för FP kodas av electroporated mRNA bör minska, men att för FP kodade via transgenens bör förbli konsekvent i hela filmen.
  4. För att säkerställa att avbildnings förhållandena inte på ett delligt sätt påverkar embryots överlevnad, samtidigt Inkubera elektroporerade embryon som inte är fotoblekta, som kan fungera som kontroll för avbildning.
  5. För att kvantifiera foto blekning resultat för mRNA Decay post-elektroporation, spåra cellfluorescens över tiden (3 eller 5 min) genom att mäta fluorescensintensitet av centrum (en 7,5 μm cirkel) av varje cell med ImageJ. Mät detta för alla celler inom den foto blekt region som inte genomgår Mitos och har varit helt fotoblekt.
    Anmärkning: Överväg att utelämna de mitotiska cellerna från kvantifieringen eftersom mitotiska kärnor har starkare fluorescens än Interphase kärnor på grund av kromatinkondensation.
  6. Rita fluorescensintensiteten över tiden efter blekmedel vid olika tidpunkter (45 min, 2 h och 5 h).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

mRNA elektroporation är effektivare än DNA-elektroporation

Vi använde pCS2 +. H2B-Citrin att förbereda in vitro transkriberas mRNA. Eftersom DNA-elektroporation vanligen utförs på 1-2 μg/μl, använde vi en ekvimolära koncentration av mRNA (beräknas vara runt 0,25-0,5 μg/μl för H2B-Citrin) för mRNA elektroporation. Vi testade först elektroporation effektiviteten av pCS2 +. H2B-Citrin DNA jämfört med H2B-Citrin mRNA (in vitro transkriberas från SP6 promotorn av pCS2 +. H2B-Citrin) genom elektroporating DNA eller mRNA separat i HH5 vaktel embryon sedan undersöka elektroporation effektivitet vid 12 h post-elektroporation. Även DNA-elektroporation leder till ljusare fluorescens i vissa elektroporerade celler, var effektiviteten i DNA-elektroporation synligt lägre jämfört med den allmänt uttryckta mRNA kodade FPs (figur 2A och B).

För att redogöra för inneboende variation av embryo-till-embryo i protokollet för elektroporering, var en ekvimolära kombination av mRNA-kodning H2B-Citrin och DNA-uttryck H2B-mKate2 elektroporerad till ektoderm av HH5 embryon och observerade 12 h efter elektroporation. Vid jämförelse av DNA och mRNA Co-Electroporation i samma embryo var DNA-uttryckande FP också signifikant och genomgående mindre effektiv än mRNA (figur 2C). Genom att kvantifiera alla embryon elektroporated med endast mRNA, DNA, eller en kombination av de två, fann vi att mRNA transfekter ~ 75% av cellerna i en viss region, medan DNA endast transfekter ~ 25% av cellerna i en viss region (figur 2D). Spridningen i uttrycket av fluorescerande proteiner kodade av mRNA eller DNA var inte signifikant annorlunda i alla Co-elektroporerade embryon (figur 2e).

Protein uttryck är snabbare i mRNA elektroporation än DNA-elektroporation

Den transfekterade mRNA bör leda till snabbare proteinproduktion eftersom det omedelbart kan erkännas av cytosoliska översättnings maskiner som visas i figur 3. DNA måste transplaceras till kärnan, transkriberas, och mRNA transporteras tillbaka till Cytosol där det erkänns av cytosoliska översättnings maskiner, förväntas ta längre tid. För att direkt jämföra mRNA kontra DNA-uttryckspriser av proteinproduktion, genomförde vi en serie tid kurs experiment där vi Co-elektroporated en ekvimolära kombination av DNA (pcmv. H2B-mKate2) och mRNA (H2B-Citrin) i ektoderm av HH5 embryon. Vi upptäckte mRNA-kodade FP uttryck runt 22 min post-elektroporation, som fortsätter att öka i relativ fluorescens intensitet för ~ 6 h (figur 3a-E, kompletterande. Movie S1b). Däremot är DNA-kodade FP uttryck först ses på ~ 1,5 h post-elektroporation (figur 3A'-E ', kompletterande. Movie S1c) och fortsätter att öka i ljusstyrka tills 6 h när filmen stoppades. Eftersom DNA-elektroporerade celler var mättade av 6 h-märket, reimaged vi detta villkor med svagare bildförhållanden (figur 3F-F ' '). Över all tid pekar av denna tid förfaller (22 minuter till 6 h), transfects mRNA flera tider mer celler än DNA (kompletterande. Film S1A, den totala effektiviteten i elektroporation genom brightfield och DAPI visas inte eftersom dessa bilder tas från en tid-lapse av en vild typ vaktel embryo). Baserat på detta, vi drar slutsatsen att mRNA elektroporation leder till tidigare uttryckt protein.

Samtidig elektroporation av flera mRNAs är mycket effektiv

Därefter försökte vi ytterligare testa effektiviteten hos mRNA elektroporation genom att electroporating flera mrnas till en region av intresse. Samtidig elektroporation av flera DNAs hade tidigare visat sig vara relativt ineffektiv, visar med antalet multi-märkt är 25%, 14%, och 10% för 2, 3 och 4 DNA-konstruktioner electroporated, beräknas som en andel av det totala antalet celler11 . Vi först electroporated två mRNA som kodar spektralt distinkta FPs (Turquoise2-Golgi/H2B-Citrin) i HH5 embryon och fick hög transfektion effektivitet i alla elektroporated regioner. Vi använde denna dubbel-Electroporation att fånga filmer av radiell expansion mellan området pellucida och opaca i en HH4 gastrulating embryo, avbildas 2 h post-Electroporation (kompletterande film S2a, b, och c). H2B-Citrin är lokaliserad inom cellkärnan och tillåter cellproliferation att spåras27. Den Turquoise2-Golgi FP verkar Visa subcellulära polaritet inom de embryonala cellerna, men verkar inte korrelera med hastighet eller riktning att flytta ektoderm celler in vivo28. Den här filmen (kompletterande film S2) visar att celler som electroporated med flera mrnas kan fortsätta normal cellulär aktivitet utan några uppenbara defekter.

Dessutom Co-elektroporation av 4 mRNAs-Turquoise2-Golgi (för att visualisera Golgi apparater), LifeAct-eGFP (för att visualisera F-Actin), H2B-Citrin (att visualisera kärnan), och membran-Cherry FP (för att visualisera membran)-resulterade i 87% transfektion effektiviteten hos alla 4 mRNAs i alla elektroporerade regioner (figur 4). LifeAct-EGFP och H2B-Citrin separerades av den linjära unmixing bearbetningsverktyg i kommersiell programvara.

FRAP-analysen visar den snabba nedbrytningen av elektroporated mRNA under de två första timmarna efter elektroporation.

Det är välkänt att nakna mRNAs snabbt bryts ned av cellulära RNAases29. Vi postulerade att mRNA elektroporation kan vara användbart för förlust eller Gain-of-funktion experiment genom att möjliggöra snabb och effektiv uttryck av proteiner i ett växande embryo. Därför skulle det vara bra att kvantifiera graden av mRNA förfall efter mRNA elektroporation, eftersom mRNA bryts ned snabbare än DNA i celler. I tidigare rapporter om mRNA elektroporation i vuxna mus neurala stamceller, cirka 80% mRNA identifierades 2 h post-elektroporation av QRT-PCR, men lite till ingen mRNA upptäcktes av 24 h post-elektroporation15. Vi försökte att ytterligare kvantifiera mRNA-uttryck efter elektroporation genom att designa en in vivo FRAP-analys för att detektera mRNA-nivåer i elektroporerade celler.

Photoblekning är den oåterkalleliga förstörelsen av fluorophore som kan inträffa när fluorophore (fluorescerande proteiner i vårt fall) är i en upphetsad tillstånd, vilket eliminerar fluorescens under observation30,31. Alla avgivna ljus från fluorescerande proteiner (FPS) som kan upptäckas i foto blekt celler över baslinjenivåer bör därför representera nyligen översatt fps kodade av intakt, transfekterade mrnas. Därför försökte vi photobleach de elektroporerade cellerna för att eliminera alla befintliga FP-derived fluorescens vid olika tidpunkter och spåra efterföljande fluorescens återhämtning.

Med hjälp av optimerade inställningar för foto blekning enligt beskrivningen i avsnittet protokoll fann vi att photoblekning initialt reducerar fluorescensintensiteten i alla fotoblekta celler med ~ 95% när den analyseras omedelbart efter foto bleknings händelsen. Detta gjordes på 45 min, 2 h, och 5 h efter elektroporation (figur 5a-C). Fluorescensåterhämtningen i varje cell inom den fotoblekta regionen spårades under en 30 min tidsperiod efter foto blekning vid varje tidpunkt genom att avbilda samma region med jämna mellanrum (3 eller 5 min). Våra data tyder på att det finns en signifikant minskning av transfekterade mRNA nivåer mellan 45 min och 5 h post-elektroporation. Detta framgår av den stora minskningen i FRAP mätt vid 5 h jämfört med 45 min post-elektroporation. För att belysa fluorescensåterhämtningen i de blekta cellerna, särskilt i 5 h-punkten, förbättrade vi ljusstyrkan i figur 5a-C med hjälp av verktyget ljusstyrka/kontrast i imagej och visar dessa modifierade bilder i figur 5D-F. Intressant, det finns en stor heterogenitet i fluorescens återhämtning från cell-till-cell inom photoblekta området vid 2 h eftersom vissa celler återhämta fluorescens snabbare än andra celler (figur 5E ' ', se pilspetsar). Emellertid, alla celler inom 5 h foto blekt område återhämta fluorescens långsammare (figur 5F ' ') än de foto blekt celler vid 2 h. Vi identifierar också aktivt dela celler i vår photoblekt region, vilket tyder på att cellerna inte har dött till följd av foto blekning processen (figur 5E ' ').

Vi kvantifierar dessa resultat i figur 6a genom att visa den normaliserade signalintensiteten för varje cell i de fotoblekta områdena under en 30 min-period efter foto bleknings händelsen. För varje cell normaliserades fluorescensvärdena mot signalintensiteten i cellen omedelbart efter foto blekning. Denna normalisering gjordes för alla celler över alla tidspunkter avbildade (45 min, 2 h, 5 h). De normaliserade värdena för fluorescensåterhämtning av cellerna inom samma foto blekt region slogs sedan samman och graferade över tiden efter foto blekning händelse; Därför representerar varje punkt i diagrammet ~ 35 celler. De onormaliserade uppgifterna visas också i figur 6B, där varje linje representerar en cell med återhämtar fluorescenssignalintensitet omedelbart efter foto blekning. Denna data övergripande tyder på att med 5 h, alla celler har uttömt de flesta av deras mRNA, med en stor del av denna droppe som inträffar mellan 45 min och 2 h post-Electroporation.

Figure 1
Figur 1: Schematisk kloning förfarande för att göra pCS2 + LifeAct-eGFP konstruera. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: mRNA-elektroporation är effektivare än DNA-elektroporation. (a-a ' ') DNA uttrycker pCS2. H2B-Citrin var electroporated in i ektoderm av HH5 embryon. Fluorescensen observerades 12 h efter elektroporation. Scale bar = 50 μm. (b-b ' ') mRNA uttrycker H2B-Citrin var electroporated in i ektoderm av HH5 embryon. Fluorescensen observerades 12 timmar efter elektroporation. Scale bar = 50 μm. (c-c ' ') equimolar kombination av DNA (pcmv. H2B-mKate2) och MRNA (H2B-Citrin) var electroporated till HH5 embryon och observerade 12 h post-elektroporation. Tre embryon testades per tillstånd (n = 2 experiment). Skalstapel = 50 μm. (D) tre embryon från A, B och C (9 totalt embryon) kvantifierades för elektroporering effektivitet med hjälp av Partikelanalys verktyg på imagej. En region på 200 μm från varje embryo kvantifierades (minst 150 celler räknades per region). Mellersta streck representerar snål, fördriva tiden topp och botten listerna representera standaren avvikelsen från snål. (E) tre Co-ELECTROPORATED (DNA och mRNA) embryon analyseras för spridning av signalen över alla elektroporerade celler i en given 200 μm region. Varje embryo hade runt 100 celler positiva för mRNA elektroporation och 30 celler positiva för DNA-elektroporation. Mellersta streck representerar snål, fördriva tiden topp och botten listerna representera standaren avvikelsen från snål. Det finns ingen signifikant skillnad mellan spridningen av mRNA vs. DNA-elektroporation, men mRNA elektroporation är mycket effektivare än DNA. (a-C) Mått = 425,10 x 425,10 x 55 μm. pixel Dwell 2,55 μs. medellinje 4. Bitar per pixel = 16. Mikroskop metadata = inverterat konfokalmikroskop, 20x mål (se tabell över material) (a) Ex: 488 nm (0,05%), emissions spår S1 = 508-579 nm; B) ex = 488 nm (5,0%), utsläpps spår S1 = 508-579 nm. C) ex = 488 nm (5,0%), 561 nm (5,0%), utsläpps spår S1 = 508-579 nm. S2 = 606-695 nm vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: mRNA elektroporation visar uttryck med 22 min post-elektroporation och är mycket snabbare än DNA-elektroporation. Representativa bilder av tidsförlopp efter mRNA (H2B-Citrin) och DNA (pCMV. H2B-mKate2) elektroporation med observations profilanalys vid 22 min (a-a ' '), 45 min (B-b ' '), 1,5 h (c-c ' '), 3 h (D-d), och 6 h (e-e ' ') vid start av avbildning (n = 1). Profilanalys för diagram tillhandahålls för varje tidspunkt som visas över den ritade pilen i den sammanslagna bilden. Varje topp i observations profilen representerar kärnan i en elektroporerad cell. Cellerna blir i allmänhet ljusare över 6 h intervallet av filmen, vilket indikerar att mRNA fortfarande är översatt till nya fluorescerande protein. För 6-timmarspunkten visas bilder av samma region som tagits med identiska bildförhållanden (e-e ' ') och svagare bildförhållanden (f-f '), eftersom bilderna av DNA-elektroporerade celler var mycket mättade med hjälp av den initiala bildförhållanden. Skalstapel = 20 μm. mått: 425,10 x 425,10 x 55 μm. bilden visas som en maximal intensitetsprojektion över alla tidspunkter som avbildas. Pixel Dwell 2,55 μs. genomsnittlig linje 4. Bitar per pixel = 16. Mikroskop metadata = inverterat konfokala Mikroskop, 20x mål (se tabell över material) Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5,0%) för initial; Ex = 488 nm (7,5%), 594 nm (0,5%) för sista gången (figur 2F), emissions spår S1 = 499-562 nm; S2 = 605-661 nm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: samtidig elektroporation av fyra mRNAs som riktar sig mot olika sub-cellulära strukturer är mycket effektiv. Den ektoderm av ett HH3 embryo var electroporated med mRNAs att koda mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Citrin, och membran-körsbär. Embryot var fast och avbildas vid 4 timmar efter elektroporation. De flesta celler är elektroporerade inom elektroden riktade regionen med alla fyra mRNAs (87%). Representativa siffror visas (3 embryon vardera, n = 2 experiment). Scale bar = 50 μm. (a) sammanfoga alla fyra mrnas (MTurquoise2-Golgi, lifeact-EGFP, H2B-Citrin, och membran-körsbär). B) endast H2B-Citrin-kanalen (Ex = 488 nm (0,7%), Em = 455-499 nm). C) endast MTurquoise2-Golgi-kanalen (Ex = 458 nm (22,0%), Em = 455-499 nm). (D) merge H2B-Citrin och MTurquoise2-Golgi visar att Golgi kuvert ena sidan av kärnan i de flesta celler. (E) endast lifeact-egfp-kanalen (Ex = 488 nm (0,7%), Em: 455-499 nm). Fendast membran-Cherry Channel (Ex = 594 nm (37,1%), EM = S2:570-695 nm). (G) sammanfoga Lifeact-egfp och membran-körsbär visar överlappar varandra i de flesta celler. Mått = 425,10 x 425,10. Pixel Dwell 1,58 μs. genomsnittlig linje 4. Bitar per pixel = 16. Mikroskop metadata = inverterat konfokala Mikroskop, 20x mål (se tabell över material) Ex = 405 nm (2,4%), 458 nm (22,0%), 488 nm (0,7%), 594 nm (37,1%), emissions spår S1 = 455-499 nm; S2 = 570-695 nm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: foto blekning analys visar snabb nedbrytning av electroporated mRNA under de första fem timmarna efter elektroporation. Photoblekning av en 100 μm ² region som innehåller celler electroporated med mRNA uttrycker H2B-Citrin utförs på 45 min, 2 h, och 5 h post-elektroporation. Embryot var avbildad vid regelbundna tidsintervall efter foto blekning (3 eller 5 min). Foto blekning villkor är följande: 70% 405 nm Laser, 100 iterationer, ca 5 min varaktighet för hela regionen. Scale bar 50 = μm. (A-a ' ') 45 min före och efter blekmedel. B visar embryot omedelbart efter foto blekning och C visar embryo 30 min efter blekmedel. Scale bar = 50 μm. (b-b ' ') 2 h före och efter blekmedel. Omkretsen av torget skiftas eftersom cellerna i den foto blekt regionen flyttas något under blekmedel perioden. (C-c ' ') 5 h före och efter blekmedel. (d-d ' ') Samma bilder som A-A ' ' med förbättrad ljusstyrka (maximalt värde justerat till 11550 för att förbättra ljusstyrkan efter insamling). (e-e ' ') Samma bilder som B-B ' ' med förbättrad ljusstyrka (maximalt värde justerat till 11550 för att förbättra ljusstyrkan efter insamling). De vita pilspetsar pekar på celler som har högre fluorescens återhämtning än omgivande celler. Den cyanfärgade pilspetsen pekar på en fotoblekt cell som nyligen har genomgått Mitos. (f-f ' ') Samma bilder som C-C ' ' med förbättrad ljusstyrka (maximalt värde justerat till 11550 för att förbättra ljusstyrkan efter insamling). Mått = 425,10 x 425,10 x 42 μm. bilden visas som en maximal intensitetsprojektion över alla tidspunkter avbildade. Pixel Dwell 1,58 μs. genomsnittlig linje 4. Bitar per pixel = 16. Mikroskop metadata = inverterat konfokala Mikroskop, 20x mål (se tabell över material) ex = 488nm (1,5%), emissions spår S1 = 508-553 nm vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: kvantifiering av fluorescensåterhämtningen i foto blekt celler. (A) fluorescensintensiteten för alla celler i de blekta regionerna (~ 35 celler) spårades för varje enskild cell under varje tidsperiod efter blekmedel. Det finns en stor droppe i hastighet av återvunna signalintensitet från 45 min till 2 h, följt av en mindre droppe från 2 h till 5 h. Det översta fel fältet visas för varje punkt, som representerar standardavvikelse från medelvärdet. Den rad som visas är en linjär regressionslinje. R ² för 45 min, 2 h, och 5 h är 0,83, 0,58 och 0,84 respektive. Den övre halvan av fel fältet visas för varje punkt. (B) fluorescensintensiteten för alla celler i de blekta regionerna (~ 35 celler) spårades för varje enskild cell under varje tidsperiod efter blekmedel och graferad utan normalisering. Det finns en stor droppe i hastighet av återvunna signalintensitet från 45 min till 2 h, följt av en mindre droppe från 2 h till 5 h. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande film 1: mRNA elektroporation leder till tidigare proteinuttryck än DNA-elektroporation. H2B-Citrin mRNA och H2B-mKate2 DNA electroporated till ektoderm av HH5 embryo. Regionen avbildas är vid gränsen till extra embryonala och embryonala vävnad. Skalstapel = 50 μm.a) både H2B-Citrin och H2B-mKate2 kanal (Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5,0%), Em: 499-562 nm; S2:605-661 nm). b) endast MRNA H2B-Citrin-kanal visad (Ex = 488 nm (15%), Em = 499-562 nm). c) endast H2B-mKate2 DNA-kanal som visas (Ex = 594 nm (5,0%), Em = 605-661 nm). Mått = 850,19 x 850,19 x 110 μm. bilden visas som en maximal intensitetsprojektion över alla tidspunkter avbildade. Pixel Dwell 2,55 μs. genomsnittlig linje 4. Bitar per pixel = 16. Mikroskop metadata: inverterat konfokala Mikroskop, 20x mål (se tabell över material) Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5,0%), emissions spår S1 = 499-562 nm; S2 = 605-661 nm. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande film 2: samtidig elektroporation av mRNAs tillåter distinkta cell beteenden att studeras dynamiskt. Radiell expansion av celler mellan embryonala och extra embryonala gränsen är elektroporated med mRNA (H2B-Citrin och mTurquoise2-Golgi) och avbildas vid utåtriktad migration. Denna film var avbildad av konfokal mikroskopi från 2 till 5 h post-Electroporation av Imaging var 6 min. Scale bar = 50 μm.  a) både H2B-Citrin och mTurquoise2-Golgi kanalersomvisas (Ex = 458 nm (28%), 488 nm (5,0%), Em = 446-526 nm; S2:508-553 nm). (b) endast H2B-Citrin kanal visas (Ex = 488 nm (5,0%), EM = S2:508-553 nm). (c) endast MTurquoise2-Golgi kanal visas (Ex = 458 nm (28%), Em = 446-526 nm). Mått = 425,10 x 425,10 x 32,5 μm. bilden visas som en maximal intensitetsprojektion över alla tidspunkter avbildade. Pixel Dwell 0,79 μs. genomsnittlig linje 4. Bitar per pixel = 16. Mikroskop metadata = inverterat konfokala Mikroskop, 20x mål (se tabell över material) Ex = 458 nm (28%), 488 nm (5,0%), emissions spår S1 = 446-526 nm; S2 = 508-553 nm. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll, vi gav steg för steg instruktioner om hur man exakt microinjicera och elektroporate mRNA i cellerna i gastrulating vaktel embryon. Vi visade att in vitro syntetiserade mRNA elektroporation möjliggör snabb och effektiv uttryck för fluorescerande proteiner (FPs) i gastrulating vaktel embryon (figur 2 och 3). Fluorescens från H2B-Citrin protein översatt från electroporated mRNAs kunde upptäckas av konfokalmikroskopi inom ~ 20 min och ökade i FP-fluorescens i timmar (figur 3, kompletterande film 1). Detta är förvånansvärt snabbt och nära den förmodade mogningen tid för Citrin32,33. FPs uttrycks från DNA-vektorer upptäcktes efter 2-3 h (figur 3, kompletterande. Film 1), som liknar tidigare rapporter8,34,35. Olika FPs har unika mognads tider, så avancerad planering kommer att säkerställa att den ideala FP väljs i termer av den spektrala distinktionen och mognads kinetik önskas för experimentet. Dessutom är den syntetiserade mRNAs effektivare Co-transfect embryonala celler än DNA vektorer11. Den högre transfektionseffektiviteten resulterar i att fler celler transfekterade i regionen av intresse med enstaka (figur 2) eller flera populationer av mrnas (figur 4).

Stabiliteten hos mRNA är starkt reglerad och kan påverkas av polyadenylering, skarvning, översättning, sekundär struktur och oöversatta regioner för att nämna några36,37. Halveringstiden för både endogena och syntetiserade mRNA i celler kan variera från minuter till dagar36,38. Vi använde in vivo fluorescens återhämtning efter foto blekning (FRAP) att bleka befintliga mRNA-kodade H2B-Citrin proteiner och observerade den mest märkbara H2B-Citrin fluorescens återhämtning under de första 2 timmar efter elektroporation (figur 5 och 6). olika mrnas kommer utan tvekan att ha olika halveringstid baserat på deras längd, interna sekvenser, 5 ' och 3 ' modifieringar36,37, så var och en måste analyseras om så önskas.

Vital Imaging kräver vanligtvis en avvägningarna mellan optimala förhållanden för högkvalitativ avbildning och snabb, mindre giftig avbildning39,40. Vid avbildning är det tillrådligt att använda så låg lasereffekt som möjligt för att minimera foto blekning och foto skada på embryonala celler (se anmärkning för steg 5,3 i protokollet)40. Att förändra Mikroskop inställningen för snabba samlingar (t. ex. snabbare skannings hastigheter, mindre medel) kan ofta hjälpa utan att förlora nödvändig bildupplösning41. Slutligen, försiktighet bör iakttas vid hantering och manipulera embryon under skörd, elektroporation, och avbildning (se steg 4). Embryona i tidigt skede är ömtåliga och kan lätt skadas.

Sammantaget, exakt timing och korrekt lokalisering av mRNA elektroporation tillåta störning experiment som kapitalisera på det snabba uttrycket, Co-transfektion effektivitet, och snabbt förfall av mRNA utskrifter. Över-uttryck eller misexpression av en gen av intresserar kan vara fulländad till och med elektroporation av syntetiseras mrnas. Tittering koncentrationen för varje mRNA är avgörande, som elektroporating för mycket mRNA kan orsaka icke-specifika cellulära toxicitet, medan för lite mRNA inte kan märka önskade celler eller inducera fenotypiska förändringar adekvat. En uppsjö av vektorer som genereras för in vitro-syntes av mrnas som kodar FP fusions markörer för visualisering eller förändrade genprodukter för störningar av olika biologiska processer finns redan från olika djurmodell system. Många av dessa konstruktioner avsedda för in vitro-mRNA syntes kan snabbt och billigt erhållas från icke-vinstdrivande plasmid förråd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

Vi tackar David Huss för hjälpsamma insikter i detta arbete. Detta arbete stöddes delvis av Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) och USC Provost ' s undergrad Research Fellowship to MT, den Saban Research Institute intramural utbildning pre-doc Award till MD, och University of Southern California Grundutbildning Research Associates program Award till R.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Garland Science. (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Tags

Utvecklingsbiologi utgåva 148 mRNA Electroporation Time-lapse mikroskopi vaktel aviär embryo FRAP
Snabb och effektiv uttryck av flera proteiner i aviär embryon med hjälp av mRNA elektroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tran, M., Dave, M., Lansford, R.… More

Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter