Summary
介绍了一种从微型猪中分离原发猪主动脉内皮细胞(pAECs)的有效酶法。分离的初级pAEC可用于研究异种移植中的免疫和凝固反应。
Abstract
异种移植是解决终末期器官衰竭患者人体器官短缺的一种有希望的方法,猪被认为是合适的器官来源。免疫排斥和凝固是异种移植成功的两个主要障碍。血管内皮细胞(EC)损伤和功能障碍对异种移植中炎症和凝血反应的发展具有重要意义。因此,分离猪主动脉内皮细胞(pAECs)对于研究免疫排斥和凝固反应是必要的。在这里,我们开发了一种简单的酶法,用于从微型猪中分离、表征和扩展高度纯化的PAE。首先,微型猪被用氯胺酮麻醉,并切除了一条大头塔的长度。其次,主肠的内皮表面暴露于0.005%胶原酶IV消化溶液15分钟。 第三,主肠的内皮表面只刮一个方向与细胞刮刀(<10次),并没有压缩过程中刮。最后,通过流式细胞测定与抗CD31抗体测定第3天和通道1和通道2之后的分离的PAEC。CD31阳性细胞的百分比分别为97.4%~1.2%、94.4%~1.1%和92.4%~1.7%(均值=SD)。胶原酶IV的浓度、消化时间、方向、刮擦的频率和强度对于减少成纤维细胞污染、获得高纯度和大量EC至关重要。总之,我们的酶法是一种从微型猪主主塔中分离ECs的高效方法,细胞可以在体外扩展,以研究异种移植中的免疫和凝固反应。
Introduction
移植器官短缺是一个突出的世界性问题。根据中国红十字会的数据,2018年,中国只有少数期器官衰竭患者获得了合适的器官。
异体移植是解决器官短缺问题的一种有希望的途径。猪器官被认为是最适合人类的器官,因为解剖学和生理上的相似性2,3。猪异种移植的失败很大程度上与灵长类动物的免疫排斥和凝固反应有关。猪内皮细胞(ECs)至关重要,因为这些细胞是第一个与灵长类免疫系统相互作用的细胞,包括抗体、补体、细胞因子和免疫细胞(例如T细胞、B细胞和巨噬细胞)4、5。猪EC在猪器官和小岛异种移植中起着至关重要的作用。因此,ECs是研究猪移植物的排斥和凝固反应的重要细胞。异种移植研究需要分离高质量的猪E。
在试图从不同的器官(例如心脏、肾脏、肝脏和大头塔)中分离EC时,在异种移植设置8、9、10、11、12中报告了几种方案。然而,保持隔离的EC的超纯文化是标准协议中的一个突出问题。在目前的研究中,消化溶液浓度增加、消化时间和刮削强度不当,可能导致成纤维细胞污染增加。此外,对微型猪的分离方法的研究较少。在这里,我们描述了一种优化的酶法,从微型猪(武志山或巴马)中分离出高度纯化的PAE。该协议中的几个步骤已经设计用于减少成纤维细胞污染和获得高纯度的ECs。
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Protocol
动物的使用是深圳市第二人民医院伦理审查委员会根据动物福利原则批准的。
1. 动物、介质和缓冲液的准备
- 准备微型猪。
注:所有微型猪都是中国五指山或巴马猪(雄性)。猪的年龄和体重分别为100天~8天和5.7公斤=1.0公斤(均值=SD,n = 3)。 - 准备培养基:内皮细胞培养基(ECM)辅以10%(v/v)热灭活胎儿牛血清(FBS),1%(v/v)青霉素/链霉素(P/S)和1%(v/v)内皮细胞生长补充剂(ECGS)。
- 准备洗涤缓冲液:1x PBS溶液(pH 7.4),P/S为1%(v/v)。
- 在20 mL的PBS溶液中制备0.005%胶原酶IV消化溶液:1毫克胶原酶IV粉。在消化前37°C预热胶原酶消化溶液。
- 准备停止缓冲器:Dulbecco 的改良 Eagle 介质 (DMEM) 辅以 10% 热灭活 FBS 和 1% P/S。
2. 猪主动脉内皮细胞分离的手术和制备
- 在手术前用紫外线消毒手术室1小时,用医疗消毒剂84液体(可用氯含量为4.0%-5.0%,材料表)。
- 微型猪接受由15毫克/千克氯胺酮、15毫克/千克盐酸西拉津和0.05毫克/千克盐酸苯丙酸(体积:100μL/kg,材料表)形成的肌肉注射后(图1A),确认动物的麻醉状态与检查猪痛苦的刺激(如捏一只耳朵或摇动一个前肢)和生理指数(如血压,心脏和呼吸速率)。
注:如果猪有醒来的迹象,可以给猪另一半剂量注射。 - 用手术刀切腹部,露出劣质的vena卡瓦,然后注射肝素钠(5,000 U,材料表)到下级vena卡瓦与5mL注射器。
- 五分钟后,将导管插入腹部主头道以血液,切下胸部皮肤,用手术刀切开隔膜,随后将左心室切开。
注:通过在血液化后检查主动脉脉搏并切心脏,确保猪被安乐死。 - 用骨钳切除肋骨(材料表),并暴露心脏和肺部。找到主塔后心和肺,并夹住两端。用预冷洗涤缓冲液清洗主盘一次(图1B,C)。
- 用剪刀切出主塔,并保持主塔夹在每一端。用无菌钳子和剪刀切除主塔周围的多余组织。将主盘放入50 mL离心管中,用预冷洗涤缓冲液清洗主塔3x(每次洗涤30 mL),并将主盘转移到实验室(图1D)。
3. 猪主动脉内皮细胞的分离
- 在无菌条件下,从洗涤缓冲液中取出猪主菜,并将其放在 150 mm 培养皿上(图 2A)。
- 轻轻地切断主塔的两端,用无菌钳子和剪刀再次切除主塔周围的多余组织(图2B)。用20~50 mL的洗涤缓冲液清洗主塔的外侧和内侧(在室温下在培养盘上)。
注意:尝试只切割在手术期间放置夹子的区域,因为一些 EC 在此区域受损,并去除多余的组织和动脉侧枝。 - 通过主塔的手术缝合,然后用手术缝合线(5-0,90cm,材料表)绑主尾的一端。将手术缝合在主塔内侧(图2C,D)。
- 用钳子轻轻固定绑端附近的主塔,然后缓慢拉手术缝合线以反转主尾,直到主尾骨的内皮表面暴露(图2E-G)。
注意:确保固定靠近绑端的主塔,不要紧紧固定主塔,否则主塔不能通过拉手术缝合线来逆转主塔。 - 用洗涤缓冲液3x(每次洗涤10 mL)清洗主尾的内皮表面,然后丢弃此溶液。将主数放入15 mL离心管中,在管中用10 mL 0.005%胶原酶IV消化溶液覆盖主塔(图2H)。
注:在消化前在37°C下预加热0.005%胶原酶IV消化溶液。 - 在37°C孵育15分钟。将消化主母和消化溶液放入100毫米培养盘中,通过加入10~15 mL的预冷停止缓冲液,停止0.005%胶原酶IV的影响。
注:建议的消化时间在10至20分钟之间。确保主尾层表面被停止缓冲液覆盖。 - 使用细胞刮刀轻轻刮取主塔内表面的PAEC(图2I)。用洗涤缓冲液清洗刮过的主盘 3x(每次 5 mL)。将培养皿中的溶液放入 50 mL 离心管中。用洗涤缓冲液(每次5 mL)清洗培养皿底部2倍,并将溶液再次放入50 mL离心管中。
注:轻轻刮向一个方向,不要压缩。请勿触摸边缘和孔附近的组织。建议刮刮 5~8 倍。 - 在 4°C 下将管在 600 x g下离心 6 分钟。丢弃上清液,在 50 mL 离心管底部留下 10 mL 溶液。在 50 mL 离心管中加入 20 mL 的洗涤缓冲液,然后重新悬浮颗粒。在此步骤中避免气泡。
- 在 600 x g下在 4°C 下离心 6 分钟。慢慢丢弃上清液。用1mL培养基重新悬浮细胞颗粒,并混合良好。
注: 每厘米主塔获得的 EC 平均数为 1.9 x 105 = 1.4 x 104(均值 = SD,n = 3)。 - 使用单元格计数器对单元格进行计数。根据细胞编号,在不涂布任何材料的情况下,在容器中为细胞进行板和培养。如果细胞数小于或等于1.0 x 106,培养细胞在25厘米2烧瓶。如果细胞数大于1.0 x 106,则在几个25cm2烧瓶(每个烧瓶1.0 x106个细胞)中培养细胞。将烧瓶置于37°C的培养箱(无晃动)中,用5%的CO2,每2~3天更换一次。
注:某些细胞被细胞刮刀损坏。细胞活力测定发现活细胞的百分比为95.7%~1.7%(均值= SD,n = 3)。分离细胞的翻倍时间约为1⁄2天。
4. 纯内皮细胞的收获和表征
- 让细胞生长约4~5天。当细胞达到80%汇合(图3A),用0.25%胰蛋白酶消化细胞并通过细胞。然后,收集一些分离的细胞(第3天,通道1和通道2),并通过流动细胞测定(使用抗CD31抗体)进行识别。
- 标签分离的pAECs(细胞数:1 x 105)(第3天,通道1和通道2)与抗猪CD31-氟西洋酸(FITC)偶联抗体(每100μL细胞10μL抗体,在4°C下染色30分钟),用于流式细胞测定分析。
- 门总活细胞群具有向前散射图,未染色样本为负对照。然后用直方图呈现封闭细胞的CD31阳性细胞。
注:CD31阳性细胞的疗效分别为97.4%~1.2%(第3天)、94.4%~1.1%(P1)和92.4%~1.7%(P2)(均值=SD),分别为(图3B)。
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Representative Results
我们的方法旨在提供一种有效的方法,从主头塔中分离出高度纯化的E从微型猪。主数手术的过程如图1所示。第一步是从猪中切除了整个主塔。防止其他细胞或细菌污染是非常重要的。因此,不要伤害其他器官或组织,以防非靶向细胞或细菌污染主方,用预冷却洗涤缓冲液3x清洗主塔(图1B-D)。保持细胞活力的另一个关键步骤是尽量减少从获得手术标本到隔离程序之间的时间。
图2显示了净化pAEC的过程。我们的方法与其他方法不同,因为主塔的一端被绑起来,内皮表面暴露(图2C-G)。随后,整个主肠的内皮表面用预热的胶原酶消化液(5-10 mL)在15 mL离心管中消化(图2H)。与其他方法相比,内皮表面更完整,更优先,暴露于消化溶液,因为主数反转和浸入消化溶液(无气泡)。在消化停止与停止缓冲液后,主尾体的内皮表面必须轻轻地刮向一个方向与细胞刮刀(图2I)。刮擦的方向对于避免对 EC 的损害非常重要。请勿触摸消化主塔的孔和切边。
隔离后,在 0、1 和 2 天以及通过 1 (P1) 和通道 2 (P2) 之后检查 EC(图 3A)。分离的EC通过流动细胞测定仪使用抗CD31-FITC抗体进行识别。流式细胞测定分析表明,CD31阳性细胞的百分比分别为97.4%~1.2%(第3天)、94.4%~1.1%(P1)和92.4%~1.7%(P2)(均值=SD),分别为97.4%~1.2%(图3B)。因此,通过该协议可以成功地实现pAEC的隔离。
图1:从微型猪的外科手术和切除主塔。
(A) 一只微型猪的照片(巴马)。(B) 主塔在腹腔切除术和胸腔切除术后暴露。(C) 主塔夹在两端.(D) 主塔被放置在一个50 mL的管中,带有冷洗缓冲液。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:猪大数消化与pAEC分离。
(A) 主塔被放置在一个150毫米的培养皿中,带有冷洗缓冲液。(B) 去除结缔组织后猪大数的照片。(C) 用无菌手术缝合线绑住的玻璃棒穿过猪主塔。(D) 主塔的一端与无菌手术缝合线捆绑在主塔内侧。(E,F)主头塔通过拉动手术缝合线而反转。(G) 孔大肠的内皮表面暴露。(H) 消化主塔.(I) 用细胞刮刀刮去主肠的内皮表面。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:利用抗CD31单克隆抗体的流式细胞测定法,识别高纯化的PAEC。
(A) 第 0 天、第 1 天和第 2 天以及通道 1 和通道 2(200 倍放大率)上隔离的 PC 的代表性图像。(B) 使用抗CD31-FITC抗体对pAEC(第3天,第1段和第2节)的流式细胞学分析。统计数据显示在右下角。数据代表三个独立实验(均值 = SD)。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
内皮细胞通常用于血管功能障碍、糖尿病、组织再生、移植和癌症14、15、16、17、18的研究。为了了解和描述EC在这些疾病中的生物学和功能,已经报道了许多方法分离不同患病器官或组织的EC8,19,2021,22,23,24.最近,越来越多的报告表明,猪EC在异种移植的免疫排斥和凝固方面具有多种功能。然而,从微型猪中分离高纯化主动脉内皮细胞的报道较少。在这里,我们描述了一种稳定而简单的方法,用于从微型猪中分离主动脉内皮细胞。
胶原酶可以降解不同的组织,并优于胰蛋白酶或其他消化溶液26,27,28,29。我们使用0.005%胶原酶IV从小猪大头分离pAECs。重要的是,消化溶液的浓度应该针对不同的猪进行优化。胶原酶消化液分别用于不同猪的0.025%、0.05%和0.2%,按年龄和品种10、13、30。在这里,我们建议胶原酶IV的最佳浓度为0.005%,最佳消化时间是15分钟。时间不应为<10分钟或>20分钟,这与以前的研究8,30一致。胶原酶IV的浓度和消化时间对于获得高纯度和大量EC至关重要。降低胶原酶IV的浓度或缩短消化时间将导致更少的ECs。胶原酶IV浓度较高或消化时间更长会导致更多的成纤维细胞污染。
细胞损伤和成纤维细胞污染是pAEC隔离的两个问题。为了减少细胞损伤和成纤维细胞污染,我们采用了一种方法,用细胞刮刀轻轻刮擦EC。刮擦的方向、频率和强度对于防止细胞损伤和成纤维细胞污染至关重要。首先,我们只朝一个方向刮去主肠的内皮表面。其次,我们建议刮擦频率小于 10 倍(建议 5 到 8 倍),并且强度必须温和。最后,不应刮擦动脉侧枝孔和主动脉切边(可能导致成纤维细胞和更多损伤细胞)的区域。
胶原酶浓度越高,消化时间越长,刮擦的频率和强度增加,可能会增加成纤维细胞污染。成纤维细胞可能迅速超过CD31阳性细胞,从而降低分离的ECs31的纯度。与现有协议相比,虽然该协议经过精心设计以防止成纤维细胞污染,第3天的CD31阳性细胞达到97.4%~1.2%(均值= SD),但CD31阳性细胞的百分比在培养后缓慢下降.如果分离的EC用于在5个通道后进行实验,我们建议细胞应该用流动细胞测量细胞分拣机10分类。
通常,我们不仅分离内皮细胞,而且还获得其他器官的异种移植研究,如胰腺和肾脏。根据我们的经验,最好先分离胰腺和肺,然后进行肝肾的采购。即使在那之后,隔离心脏和主干也并非太晚,如果外科医生足够快,在不到半小时内完成所有的隔离。在这个过程中,保持手术区域无菌和寒冷是非常关键的。用抗生素将感冒的PBS倒入目标器官,以清除可能的污染,并保持组织在低温下。在动物麻醉后注射肝素,也有必要防止凝固。微血管血管中的血块会导致细胞死亡和多毛细血管器官的炎症,如胰腺、肺和肝脏。我们总是注射肝素到劣质的vena卡瓦和插入导管腹部主塔的血液。这将有效防止凝血相关的细胞死亡。
总之,我们提供了一种从微型猪中分离高纯化的PEC的有效方法。分离的pAECs有利于异种移植研究。尽管我们没有使用该协议从大型猪中分离 pAEC,但我们相信,通过修改一些关键步骤,我们将通过该协议从大型猪中获取高度纯化的 ECs。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了广东省自然科学基金的资助,资助/奖励编号:2016A030313028;广东省医学科学研究基金会,资助/奖励编号:B2018003;深圳市科技基金会,授予/奖励编号:JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY2016022292204849975, GJHZ2017031417171357556, JCYJ20160103000011 和 JCYJ2016016042822040404444;深圳市龙华区科技基金会,授奖/奖励编号:2017013;国家重点研发项目,授权/奖励编号:2017YFC1103704;深圳三明医药项目,授予/奖励编号:SZSM201412020;广东省高水平医院建设专项资金(2019年);深圳市高水平医学学科建设基金,助学金/奖励号:2016031638;深圳市卫生和计划生育委员会,授予/奖励编号:SZXJ2017021和SZXJ2018059。我们感谢深圳大学的张汉成和赵志成协助编写手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap ?T25? | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe?5mL? | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
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