Summary
Der er beskrevet en effektiv enzymatisk metode til isolering af primære svin aorta endotheliale celler (pAECs) fra miniature grise. De isolerede primære pAECs kan anvendes til at undersøge immun-og koagulations reaktionen i xenotransplantation.
Abstract
Xenotransplantation er en lovende måde at løse manglen på menneskelige organer til patienter med slutstadiet organsvigt, og grisen betragtes som en egnet organ kilde. Immun afvisning og Koagulering er to store forhindringer for xenotransplantations succes. Vaskulær endotelcelle (EC) skade og dysfunktion er vigtige for udviklingen af inflammation og koagulations respons i xenotransplantation. Således isolering af svin aorta endotelceller (pAECs) er nødvendig for at undersøge immun afvisning og koagulations reaktioner. Her har vi udviklet en simpel enzymatisk tilgang til isolation, karakterisering og udvidelse af højt oprensede pAECs fra miniature grise. For det første blev miniature grisen bedøvet med ketamin, og en længde på aorta blev fjernet. For det andet blev den endotelale overflade af aorta udsat for 0,005% kollagenase IV fordøjelsesvæske opløsning i 15 min. for det tredje blev den endotelale overflade af aorta skrabet i kun én retning med en celle skraber (< 10 gange), og blev ikke komprimeret under processen med Skrabning. Endelig blev de isolerede pAECs af dag 3, og efter passage 1 og passage 2, identificeret ved flow cytometri med et anti-CD31-antistof. Procentdelen af CD31-positive celler var henholdsvis 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1% og 92,4% ± 1,7% (gennemsnit ± SD). Koncentrationen af collagenase IV, fordøjelses tiden, retningen, og hyppigheden og intensiteten af skrabning er afgørende for faldende fibroblast forurening og opnåelse af høj renhed og et stort antal ECs. Afslutningsvis er vores enzymatiske metode en meget virkningsfuld metode til isolering af ECs fra miniature svinet aorta, og cellerne kan ekspanderes in vitro for at undersøge immun-og koagulations responset i xenotransplantation.
Introduction
Manglen på tilgængelige organer til transplantation er et udestående problem på verdensplan1. Ifølge Røde Kors Society i Kina, kun et lille antal patienter med slutstadiet organsvigt modtaget et passende organ i Kina i 2018.
Xenotransplantation er en lovende måde at løse problemet med organmangel på. Svine organer anses for at være de mest egnede organer for mennesker på grund af anatomiske og fysiologiske ligheder2,3. Svigt af et svine xenograft er i vid udstrækning relateret til primat immun afstødning og koagulations respons. Porcin endotelceller (ECs) er kritiske, da disse celler er de første til at interagere med primat immunsystemet, som omfatter antistof, komplement, cytokiner og immunceller (f. eks. T-celler, B-celler og makrofager)4,5. Porcin ECs spiller en afgørende rolle i svine orgel og ø-xenotransplantation6,7. Således, ECs er vigtige celler til at undersøge afvisning og koagulations reaktioner på en gris transplantat. Der kræves isolering af svin af høj kvalitet til xenotransplantations forskning.
I forsøg på at isolere ECs fra forskellige organer (f. eks. hjerte, nyrer, lever og aorta) er der rapporteret om flere protokoller i en xenotransplantations indstilling8,9,10,11,12. Men at holde en ultrabure kultur af isolerede ECs er et udestående problem i standardprotokoller. Den øgede koncentration af den Ford øjede opløsning, uhensigtsmæssig fordøjelsestid og skrabe intensitet kan bidrage til den øgede fibroblast kontaminering i de nuværende undersøgelser8,10,13. Desuden er metoden med isolerede pAECs fra miniature grise mindre undersøgt. Her beskriver vi en optimeret enzymatisk metode til isolering af højt oprensede pAECs fra miniature grise (Wuzhishan eller BAMA). Flere trin i protokollen er designet til at reducere fibroblast kontaminering og opnå høj renhed ECs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brugen af dyr blev godkendt af det etiske undersøgelsesudvalg i Shenzhen Second folks Hospital, i overensstemmelse med principperne om dyrevelfærd.
1. tilberedning af dyr, medium og buffere
- Forbered miniature gris.
Bemærk: alle miniature grise var kinesiske Wuzhishan-eller BAMA-grise (mænd). Alder og vægt af svin var 100 dage ± 8 dage og 5,7 kg ± 1,0 kg (gennemsnit ± SD, n = 3), hhv. - Forbered kulturmediet: endotel celle medium (ECM) suppleret med 10% (v/v) varme-inaktiveret føtal bovint serum (FBS), 1% (v/v) penicillin/streptomycin (P/S) og 1% (v/v) endotel cellevækst supplement (ecgs).
- Forbered vaskebufferen: 1x PBS opløsning (pH 7,4) med 1% (v/v) P/S.
- Forbered en 0,005% kollagenase IV fordøjelsesvæske opløsning: 1 mg kollagenase IV pulver i 20 ml PBS opløsning. Forvarm kollagenase fordøjelses opløsningen ved 37 °c før fordøjelsen.
- Forbered stop bufferen: Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 10% varme inaktiverede FB'ER og 1% P/S.
2. kirurgi og forberedelse til Porcin aorta endotelcelle isolation
- Desinficering af operationsstuen med UV-lys i 1 h og medicinsk desinfektionsmiddel 84 væske (tilgængeligt klorindhold er 4,0%-5,0%, tabel over materialer) før udførelse af kirurgi.
- Efter at miniature grisen fik en intramuskulær injektion dannet af 15 mg/kg ketamin, 15 mg/kg xylazinhydrochlorid og 0,05 mg/kg Phenacetin hydrochlorid (volumener: 100μL/kg, tabel over materialer) (figur 1a), Bekræft dyrets anæstesi status med kontrol af svin smertefulde stimulus (f. eks. klemme det ene øre eller ryste en forbimb) og fysiologiske indeks (f. eks. blodtryk, hjerte og respiratorisk hastighed).
Bemærk: en anden halv dosis injektion kunne gives til grisen, hvis den viser tegn på at vågne op. - Skær maven med en skalpel, udsætte den ringere Vena cava og dermed injicere heparin natrium (5.000 U, tabel over materialer) ind i ringere Vena cava med 5 ml sprøjte.
- Fem minutter senere, indsætte et kateter til abdominal aorta til blod, klippe huden af brystet og incise membranen med en skalpel og efterfølgende skære venstre ventrikel off.
Bemærk: Sørg for, at gris er aflives ved at kontrollere aorta puls efter blooding og skære hjertet. - Punkt på ribbenene med knogle tang (tabel over materialer), og udsætte hjertet og lungerne. Find aorta posterior til hjertet og lungerne og klemme de to ender. Aorta vaskes én gang med en forkølet vaskebuffer (figur 1B, C).
- Skær aorta med en saks og hold aorta fastspændt i hver ende. Punktafgiftspligtige overskydende væv omkring aorta med sterile pincet og saks. Sæt aorta i et 50 mL centrifugeglas, vask aorta med forkølet vaskebuffer 3x (30 mL pr. vask), og Overfør aorta til laboratoriet (figur 1d).
3. isolering af svin aorta endotheliale celler
- Under aseptiske forhold skal du fjerne grisen aorta fra vaskebufferen og anbringe den på en 150 mm Petri skål (figur 2a).
- Skær forsigtigt de to ender af aorta og punktafgiftspligtige overskydende væv omkring aorta med sterile pincet og saks igen (figur 2b). Vask yder-og indersiden af aorta (over dyrknings skålen ved stuetemperatur) med 20 − 50 mL vaskebuffer.
Bemærk: Prøv kun at skære det område, hvor klemmerne blev placeret under operationen, da nogle ECs blev beskadiget i dette område, og fjerne overskydende væv og arteriel sidegrene. - Passere en kirurgisk sutur gennem aorta og derefter binde den ene ende af aorta ved hjælp af kirurgisk sutur (5-0, 90cm, tabel over materialer). Hold den kirurgiske sutur inde i aorta (figur 2c,D).
- Fastgør forsigtigt aorta nær den bundne ende med pincet, og træk derefter den kirurgiske sutur langsomt for at vende aorta, indtil den endotelale overflade af aorta er eksponeret (figur 2E-G).
Bemærk: Sørg for at fastgøre aorta nær den bundne ende, og fastgør ikke aorta stramt, ellers kan aorta ikke vendes ved at trække i kirurgisk sutur. - Vask den endotelale overflade af aorta med vaskebuffer 3x (10 mL pr. vask), og kassér derefter opløsningen. Aorta placeres i et 15 mL centrifugeglas, og aorta dækkes med 10 mL 0,005% kollagenase IV fordøjelsesvæske i røret (figur 2H).
Bemærk: Forvarm 0,005% kollagenase IV fordøjelsesvæske opløsning ved 37 °c før fordøjelsen. - Inkuber ved 37 °c i 15 min. Placer den Ford øjede aorta og fordøjelses opløsningen i en 100 mm kulturfad og stop virkningerne af 0,005% kollagenase IV ved at tilføje 10 − 15 ml forkølet stop buffer.
Bemærk: den anbefalede fordøjelsestid er mellem 10 og 20 minutter. Sørg for, at den endotelale overflade af aorta er dækket af stop bufferen. - Skrabe pAECs forsigtigt af den indvendige overflade af aorta ved hjælp af en celle skraber (figur 2I). Vask skrabet aorta 3x med vaskebuffer (5 mL pr. gang). Sæt opløsningen fra kultur skålen i et 50 mL centrifugeglas. Vask bunden af kultur skålen 2x med en vaskebuffer (5 mL pr. gang), og sæt opløsningen i et 50 mL centrifugeglas igen.
Bemærk: skrabe i en retning forsigtigt og ikke komprimere. Rør ikke ved vævet nær kanterne og hullerne. Skrabning 5 − 8x anbefales. - Centrifugeglasset centrifugeres ved 600 x g i 6 minutter ved 4 °c. Supernatanten kasseres, og der efterlades 10 mL opløsning i bunden af et 50 mL centrifugeglas. 20 mL vaskebuffer tilsættes til 50 mL centrifugeglasset, og pellets opslæmmes. Undgå bobler under dette trin.
- Centrifugeres ved 600 x g i 6 minutter ved 4 °c. Kassér forsigtigt supernatanten. Resuspension celle pellets med 1 mL kulturmedium og bland godt.
Bemærk: det opnåede gennemsnitlige antal ECs pr. cm aorta er 1,9 x 105 ± 1,4 x 104 (gennemsnit ± SD, n = 3). - Tæl cellerne med en celle tæller. Plade og kultur cellerne i et fartøj uden belægning materialer i henhold til celle nummeret. Hvis celle nummeret er mindre end eller lig med 1,0 x 106, kultur celler i en 25 cm2 kolbe. Hvis celle nummeret er større end 1,0 x 106, kultur celler i flere 25 cm2 kolber (1,0 x 106 celler pr. kolbe). Kolben anbringes i en inkubator (uden omrystning) ved 37 °C med 5% CO2 og Udskift mediet hver 2 − 3 dage.
Bemærk: nogle celler beskadiges af celle skraberen. En analyse af cellernes levedygtighed viste, at procentdelen af levende celler var 95,7% ± 1,7% (gennemsnit ± SD, n = 3). Fordoblings tiden for de isolerede celler er ca. 1 − 2 dage.
4. høst og karakterisering af rene endotelceller
- Lad cellerne vokse i ca. 4 − 5 dage. Når cellerne når 80% sammenløbet (figur 3a), fordøje cellerne med 0,25% trypsin og passage cellerne. Derefter indsamle nogle af de isolerede celler (dag 3, passage 1 og passage 2) og identificere ved flow flowcytometri (med et anti-CD31-antistof).
- Label isolerede pAECs (celle nummer: 1 x 105) (dag 3, passage 1 og passage 2) med anti-PORCIN CD31-fluorescein isothiocyanat (FITC) konjugeret antistof (10 μl antistof for per 100 μl celler, farvet i 30 min ved 4 °c) for flow cytometri analyse.
- Gate samlede levende celle befolkning med en fremad spredt plot, uforfarvet prøve som en negativ kontrol. Derefter præsenterer de CD31 positive celler i de gated celler med histogram.
Bemærk: effekten af CD31-positive celler er 97,4% ± 1,2% (dag 3), 94,4% ± 1,1% (P1) og 92,4% ± 1,7% (P2) (gennemsnit ± SD) henholdsvis (figur 3b).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores metode har til formål at give en effektiv måde at isolere højt renset ECs fra Aortas fra miniature grise. Processen med aorta kirurgi er vist i figur 1. Det første skridt er, at hele aorta er fjernet fra grisen. Forebyggelse af anden celle eller bakteriel kontaminering er meget vigtigt. Derfor må du ikke skade andre organer eller væv i tilfælde af umålrettede celler eller bakterier forurene aorta, og vaske aorta med forkølet vaskebuffer 3x (figur 1B-D). Et andet kritisk skridt til at opretholde cellernes levedygtighed er at minimere tidsrummet mellem opnåelse af den kirurgiske prøve og isolations proceduren.
De processer, der er involveret i rensning af pAECs, er vist i figur 2. Vores metode er forskellig fra andre, da den ene ende af aorta er bundet og den endotelale overflade er eksponeret (figur 2c-G). Efterfølgende er den endotelale overflade af hele aorta fordøjet med præ-opvarmet kollagenase fordøjelsesvæske (5-10 mL) i et 15 mL centrifugeglas (figur 2H). Sammenlignet med andre metoder, den endotelale overflade er mere fuldstændigt, og fortrinsvis, udsat for fordøjelsessystemet løsning på grund af inversion af aorta og nedsænkning i fordøjelsessystemet opløsning (uden bobler). Efter fordøjelsen stoppes med stop buffer, skal den endotelale overflade af aorta forsigtigt skrabet i én retning med en celle skraber (figur 2i). Retningen af skrabning er vigtigt for at undgå skader på ECs. Rør ikke ved hullerne og skær kanterne af den fordøjet aorta.
Efter isolering inspiceres ECs på dag 0, 1 og 2 og efter passage 1 (P1) og passage 2 (P2) (figur 3a). De isolerede ECs identificeres ved flow cytometri ved hjælp af et anti-CD31-FITC-antistof. Flowcytometri analyse har vist, at procentdelen af CD31-positive celler er 97,4% ± 1,2% (Day3), 94,4% ± 1,1% (P1) og 92,4% ± 1,7% (P2) (gennemsnit ± SD) henholdsvis (figur 3b). Således kan isolering af pAECs med held opnås med denne protokol.
Figur 1: den kirurgiske procedure og excision af aorta fra en miniature gris.
A) fotografi af en miniature gris (BAMA). B) aorta er eksponeret efter laparotomi og thoracotomi. C) aorta klemmes i hver ende. D) aorta anbringes i et 50 ml rør med kold vaskebuffer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Porcin aorta fordøjelse og pAECs isolation.
A) aorta anbringes i en 150 mm Petri skål med kold vaskebuffer. B) fotografi af Porcin aorta efter fjernelse af bindevæv. C) glas stangen, der er bundet med en steril kirurgisk sutur, der passerer gennem svinet aorta. D) den ene ende af aorta er bundet med en steril kirurgisk sutur, som holdes på indersiden af aorta. (E, F) Aorta vendes ved at trække i den kirurgiske sutur. G) den endotelale overflade af Porcin aorta eksponeres. H) den fordøjet aorta. I)skraber den endotheliale overflade af aorta med en celle skraber. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: identifikation af højt oprensede pAECs ved flow cytometri med et anti-CD31 monoklonalt antistof.
(A) repræsentative billeder af isolerede Paecs på dag 0, 1 og 2, og efter passage 1 og passage 2 (200x forstørrelse). B) flow cytometri-analyse af Paecs (dag 3, passage 1 og 2) med anti-CD31-FITC-antistof. Statistiske data præsenteres nederst til højre. Data er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter (gennemsnit ± SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endotelceller er almindeligt anvendt i forskning af vaskulær dysfunktion, diabetes, vævsregenerering, transplantation, og kræftformer14,15,16,17,18. At forstå og karakterisere biologi og funktion af ECS i disse sygdomme, talrige metoder til at isolere ECS af forskellige syge organer eller væv er blevet rapporteret8,19,20, 21 , 22 , 23 , 24. for nylig har et stigende antal rapporter vist, at svine-ECs har forskellige funktioner i immun afvisning og Koagulering af xenotransplantation6,25. Imidlertid er isoleringen af højt rensede aorta endotelceller fra miniature grise blevet rapporteret sjældnere. Her beskriver vi en stabil og nem metode til isolering af aorta endotheliale celler fra miniature grise.
Collagenase kan nedbryde forskellige væv, og er bedre end trypsin eller andre fordøjelses løsninger26,27,28,29. Vi brugte 0,005% kollagenase IV til at dissociere paecs fra en lille gris aorta. Det er vigtigt, at koncentrationen af fordøjelses opløsningen optimeres til forskellige grise. Collagenase fordøjelsessystemet opløsninger på 0,025%, 0,05% og 0,2% har været anvendt henholdsvis i forskellige grise, efter alder og race10,13,30. Her anbefaler vi den optimale koncentration af kollagenase IV at være 0,005%, og den optimale fordøjelsestid til at være 15 min. Tiden bør ikke være < 10 min eller > 20 min, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser8,30. Koncentrationen af kollagenase IV og fordøjelses tiden er afgørende for at opnå høj renhed og et stort antal ECs. Lavere koncentrationer af kollagenase IV eller kortere fordøjelses tider vil resultere i færre ECs. Højere koncentrationer af kollagenase IV eller længere fordøjelses tiden vil føre til mere fibroblast kontaminering.
Celleskader og fibroblast forurening er to problemer i isoleringen af pAECs. For at reducere celleskader og fibroblast forurening, vi har vedtaget en metode, hvor ECs blev skrabet forsigtigt med en celle skraber. Retningen, hyppigheden og intensiteten af skrabning er afgørende for at forhindre celleskader og fibroblast kontaminering. Først skrabede vi den endotelale overflade af aorta i en retning alene. For det andet anbefaler vi, at skrabning frekvensen være mindre end 10 gange (5 til 8 gange anbefales), og intensiteten skal være blid. Endelig bør områderne omkring hullerne i arterielle sidegrene og de afskårne kanter af aorta (som kan føre til fibroblast celler og flere skade celler) ikke skrabet.
En højere kollagenase koncentration, længere fordøjelsestid, og øget hyppighed og intensitet af skrabning kan øge fibroblast forurening. Fibroblaster kan hurtigt vokse CD31-positive celler, hvilket reducerer renheden af den isolerede ECs31. Sammenlignet med eksisterende protokoller, selv om protokollen er blevet omhyggeligt designet til at forhindre fibroblast kontaminering, og de CD31-positive celler på dag 3 nåede 97,4% ± 1,2% (gennemsnit ± SD), procentdelen af CD31 positive celler langsomt faldt efter kultur . Hvis den isolerede ECs bruges til at udføre eksperimenter efter 5 passager, foreslår vi, at cellerne skal sorteres med en flow flowcytometri celle sortering10.
Normalt isolerer vi ikke kun endotelcellerne, men får også andre organer til xenotransplantations forskning, såsom bugspytkirtlen og nyrerne. Ifølge vores erfaring, det ville bedre at isolere bugspytkirtlen og lunge først, og derefter udføre indkøb af lever og nyrer. Selv efter at det ikke er for sent at isolere hjertet og aorta, hvis kirurgen er hurtig nok til at afslutte hele isolationen på mindre end en halv time. Under processen er det meget vigtigt at holde operationsområdet sterilt og koldt. Den kolde PBS med antibiotika blev hældt til målorganet for at rense den mulige forurening og holde væv i lav temperatur. Det er også nødvendigt at forhindre koagulation ved at injicere heparin efter anæstesi af dyr. Blodprop i mikro vaskulære fartøj ville inducere celledød og betændelse i organer med flere kapillærer, såsom bugspytkirtlen, lungerne og leveren. Vi injicerer altid heparin til den ringere Vena cava og indsætter et kateter til abdominal aorta til blod. Dette vil effektivt forhindre koagulations relaterede celledød.
Afslutningsvis, vi giver en effektiv metode til at isolere højt oprenset pAECs fra miniature grise. De isolerede pAECs er til gavn for xenotransplantation forskning. Selv om vi ikke har isoleret pAECs fra en stor gris ved hjælp af protokollen, vi tror, vi vil få meget renset ECs fra en stor gris med protokollen ved at ændre nogle kritiske trin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af tilskud fra Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Grant/bonusnummer: 2016A030313028; Medicinsk videnskabelig forskning Foundation af Guangdong-provinsen, Grant/bonusnummer: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Grant/bonusnummer: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 og JCYJ20160428142040945; Shenzhen Longhua District Foundation for videnskab og teknologi, Grant/bonusnummer: 2017013; National Key R & D program i Kina, Grant/bonusnummer: 2017YFC1103704; Sanming projekt af medicin i Shenzhen, Grant/bonusnummer: SZSM201412020; Særlige midler til opførelse af hospitaler på højt niveau i Guangdong-provinsen (2019); Fond for højt niveau medicinsk disciplin opførelse af Shenzhen, Grant/bonusnummer: 2016031638; Shenzhen Foundation for sundhed og familieplanlægning provision, Grant/tildeling nummer: SZXJ2017021 og SZXJ2018059. Vi takker Hancheng Zhang og Zhicheng Zou fra Shenzhen University for at hjælpe med forberedelsen af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap ?T25? | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe?5mL? | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
References
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution? Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
