Summary
Une méthode enzymatique efficace pour l'isolement des cellules endothéliales aortiques primaires porcines (pAECs) des porcs miniatures est décrite. Les pAECs primaires isolés peuvent être employés pour étudier la réponse immunisée et de coagulation dans la xénotransplantation.
Abstract
La xénotransplantation est un moyen prometteur de résoudre la pénurie d'organes humains chez les patients atteints d'insuffisance d'organes en phase finale, et le porc est considéré comme une source d'organes appropriée. Le rejet immunitaire et la coagulation sont deux obstacles majeurs au succès de la xénotransplantation. Les dommages et le dysfonctionnement vasculaires de cellules endothéliales (EC) sont importants pour le développement des réponses d'inflammation et de coagulation dans la xénotransplantation. Ainsi, l'isolement des cellules endothéliales aortiques porcines (pAECs) est nécessaire pour étudier les réponses de rejet et de coagulation immunisées. Ici, nous avons développé une approche enzymatique simple pour l'isolement, la caractérisation et l'expansion des pAEC sépulifiés à partir de porcs miniatures. Tout d'abord, le cochon miniature a été anesthésié avec de la kétamine, et une longueur d'aorte a été excisée. Deuxièmement, la surface endothéliale de l'aorte a été exposée à une solution digestive de collagène IV de 0,005 % pendant 15 min. Troisièmement, la surface endothéliale de l'aorte a été grattée dans une seule direction avec un grattoir cellulaire (10 fois) et n'a pas été comprimée au cours du processus de raclement. Enfin, les pAECs isolés du jour 3, et après passage 1 et passage 2, ont été identifiés par cytométrie de flux avec un anticorps anti-CD31. Les pourcentages de cellules CD31-positives étaient de 97,4 % - 1,2 %, 94,4 % - 1,1 %, et 92,4 % - 1,7 % (moyenne et DD), respectivement. La concentration de Collagène IV, le temps digestif, la direction, la fréquence et l'intensité du raclage sont essentiels pour diminuer la contamination par le fibroblaste et obtenir une haute pureté et un grand nombre d'ECs. En conclusion, notre méthode enzymatique est une méthode très effctive pour isoler les ECs de l'aorte miniature de porc, et les cellules peuvent être étendues in vitro pour étudier les réponses immunitaires et de coagulation dans la xénotransplantation.
Introduction
La pénurie d'organes disponibles pour la transplantation est un problème en suspens dans le monde entier1. Selon la Croix-Rouge chinoise, seul un petit nombre de patients atteints d'insuffisance d'organes en phase finale ont reçu un organe approprié en Chine en 2018.
La xénotransplantation est un moyen prometteur de résoudre le problème de la pénurie d'organes. Les organes porcins sont considérés comme les organes les plus appropriés pour l'homme en raison de similitudes anatomiques et physiologiques2,3. L'échec d'un xénogreffe de porc est en grande partie lié au rejet immunitaire de primate et aux réponses de coagulation. Les cellules endothéliales porcines (EC) sont critiques puisque ces cellules sont les premières à interagir avec le système immunitaire des primates, qui comprend des anticorps, des compléments, des cytokines et des cellules immunitaires (p. ex. lymphocytes T, cellules B et macrophages)4,5. Les CE porcins jouent un rôle vital dans l'organe porcin et la xénotransplantation des îlots6,7. Ainsi, les EC sont des cellules importantes pour étudier les réponses de rejet et de coagulation à une greffe de porc. L'isolement des EC soudeurs porcins de haute qualité est nécessaire pour la recherche sur la xénotransplantation.
Dans les tentatives d'isoler les EC de différents organes (p. ex. cœur, rein, foie et aorte), plusieurs protocoles ont été signalés dans un cadre de xénotransplantation8,9,10,11,12. Cependant, le maintien d'une culture ultrapure d'ECs isolés est un problème exceptionnel dans les protocoles standard. La concentration accrue de la solution digérée, le temps de digestion inapproprié et l'intensité des éraflures peuvent contribuer à l'augmentation de la contamination par le fibroblaste dans les études actuelles8,10,13. En outre, la méthode des pAECs isolés de porcs miniatures est moins étudiée. Ici, nous décrivons une méthode enzymatique optimisée pour isoler les pAECs fortement purifiés des porcs miniatures (Wuzhishan ou Bama). Plusieurs étapes du protocole ont été conçues pour réduire la contamination par le fibroblaste et obtenir des EC de haute pureté.
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Protocol
L'utilisation d'animaux a été approuvée par le Comité d'examen de l'éthique du Shenzhen Second People's Hospital, conformément aux principes du bien-être animal.
1. Préparation des animaux, des milieuis et des tampons
- Préparer le cochon miniature.
REMARQUE : Tous les porcs miniatures étaient des porcs chinois de Wuzhishan ou de Bama (mâle). L'âge et le poids des porcs étaient de 100 jours, soit 8 jours et 5,7 kg et 1,0 kg (moyenne , SD, n - 3), respectivement. - Préparer le milieu de culture : milieu cellulaire endothélial (ECM) complété par 10 % (v/v) sérirum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS), 1 % (v/v) pénicilline/streptomycine (P/S) et 1 % (v/v) supplément de croissance des cellules endothéliales (ECGS).
- Préparer le tampon de lavage : 1x solution PBS (pH 7,4) avec 1 % (v/v) P/S.
- Préparer une solution digestive à 0,005% de collagène IV : 1 mg de poudre de collagène IV dans 20 ml de solution PBS. Préchauffer la solution digestive au collagène à 37 oC avant la digestion.
- Préparer le tampon d'arrêt : le milieu eagle modifié (DMEM) modifié de Dulbecco complété par 10 % de FBS inactivé par la chaleur et 1 % de P/S.
2. Chirurgie et préparation à l'isolement des cellules endothéliales aortiques porcines
- Désinfecter la salle d'opération avec de la lumière UV pendant 1 h et du désinfectant médical 84 liquide (la teneur en chlore disponible est de 4,0% - 5,0%, Tableau des matériaux)avant d'effectuer la chirurgie.
- Après que le porc miniature a reçu une injection intramusculaire formée par 15 mg/kg de kétamine, 15 mg/kg d'hydrochlorure de Xylazine et 0,05 mg/kg d'hydrochlorure de phénacétine ( Volumes : 100 l/kg, Tableau des matériaux) (Figure 1A), confirmer l'animal état de l'anesthésie avec contrôle du stimulus douloureux porcin (par exemple pincer une oreille ou secouer un membre antérieur) et l'index physiologique (par exemple, la pression artérielle, le rythme cardiaque et respiratoire).
REMARQUE : Une autre injection d'une demi-dose pourrait être administrée au porc si elle montre les signes de réveil. - Couper l'abdomen avec un scalpel, exposer le veau cava inférieur et par conséquent injecter de l'héparine sodium (5 000 U, Table of Materials) dans le veau cava inférieur avec une seringue de 5 ml.
- Cinq minutes plus tard, insérez un cathéter à l'aorte abdominale dans le sang, coupez la peau de la poitrine et incisez le diaphragme avec un scalpel et coupez ensuite le ventricule gauche.
REMARQUE : Assurez-vous que le porc est euthanasié en vérifiant le pouls aortique après le sang et la coupe du cœur. - Accise les côtes avec des forceps osseux (Table des Matériaux), et exposer le cœur et les poumons. Trouver l'aorte postérieure au cœur et les poumons et serrer les deux extrémités. Laver l'aorte une fois avec un tampon de lavage pré-réfrigéré (Figure 1B,C).
- Découper l'aorte avec des ciseaux et garder l'aorte serrée à chaque extrémité. Excisez l'excès de tissu autour de l'aorte avec des forceps stériles et des ciseaux. Mettre l'aorte dans un tube de centrifugeuse de 50 ml, laver l'aorte avec un tampon de lavage pré-refroidi 3x (30 ml par lavage), et transférer l'aorte au laboratoire (Figure 1D).
3. Isolement des cellules endothéliales aortiques porcines
- Dans des conditions aseptiques, retirer l'aorte de porc du tampon de lavage et le placer sur un plat Petri de 150 mm (figure 2A).
- Couper doucement les deux extrémités de l'aorte et exciser l'excès de tissu autour de l'aorte avec des forceps stériles et des ciseaux à nouveau (Figure 2B). Laver l'extérieur et l'intérieur de l'aorte (sur le plat de culture à température ambiante) avec 20 à 50 ml de tampon de lavage.
REMARQUE : Essayez seulement de couper la zone où les pinces ont été placées pendant la chirurgie puisque quelques ECs ont été endommagés dans ce secteur, et enlèvent les tissus excessifs et les branches latérales artérielles. - Passer une suture chirurgicale à travers l'aorte, puis attacher une extrémité de l'aorte en utilisant la suture chirurgicale (5-0, 90cm, Table des Matériaux). Gardez la suture chirurgicale à l'intérieur de l'aorte (Figure 2C,D).
- Fixer doucement l'aorte près de l'extrémité attachée avec des forceps, puis tirer la suture chirurgicale lentement pour inverser l'aorte jusqu'à ce que la surface endothéliale de l'aorte est exposée (Figure 2E-G).
REMARQUE: Assurez-vous de fixer l'aorte près de l'extrémité attachée et ne fixez pas l'aorte étroitement, ou bien l'aorte ne peut pas être inversée en tirant la suture chirurgicale. - Laver la surface endothéliale de l'aorte avec un tampon de lavage 3x (10 ml par lavage), puis jeter cette solution. Placer l'aorte dans un tube de centrifugeuse de 15 ml, et couvrir l'aorte de 10 ml de 0,005% collagène IV solution digestive dans le tube (Figure 2H).
REMARQUE : Réchauffez la solution digestive de 0,005% de collagène IV à 37 oC avant la digestion. - Incuber à 37 oC pendant 15 min. Placez l'aorte digérée et la solution digestive dans un plat de culture de 100 mm et arrêtez les effets de la collagène IV de 0,005 % en ajoutant 10 à 15 ml de tampon d'arrêt pré-réfrigéré.
REMARQUE : Le temps de digestion recommandé est compris entre 10 et 20 minutes. Assurez-vous que la surface endothéliale de l'aorte est recouverte par le tampon d'arrêt. - Gratter délicatement les pAEC s'éteignent de la surface intérieure de l'aorte à l'aide d'un grattoir cellulaire (Figure 2I). Laver l'aorte grattée 3x avec un tampon de lavage (5 ml par temps). Mettez la solution du plat de culture dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Laver le fond du plat de culture 2x avec un tampon de lavage (5 ml par temps), et mettre la solution dans un tube de centrifugeuse de 50 ml à nouveau.
REMARQUE : Grattez doucement dans une direction et ne comprimez pas. Ne touchez pas le tissu près des bords et des trous. Il est recommandé de gratter de 5 à 8x. - Centrifuger le tube à 600 x g pendant 6 min à 4 oC. Jeter le supernatant et laisser 10 ml de solution au fond d'un tube centrifugeur de 50 ml. Ajouter 20 ml de tampon de lavage au tube de centrifugeuse de 50 ml et suspendre à nouveau les granulés. Évitez les bulles pendant cette étape.
- Centrifugeuse à 600 x g pendant 6 min à 4 oC. Jetez lentement le supernatant. Resuspendre les granulés de cellules avec 1 ml de milieu de culture et bien mélanger.
REMARQUE : Le nombre moyen obtenu d'ECpar aorte de cm est de 1,9 x 105 x 1,4 x 104 (moyenne - SD, n - 3). - Comptez les cellules avec un compteur cellulaire. Plaque et culture des cellules dans un récipient sans revêtement de matériaux selon le numéro de cellule. Si le nombre de cellules est inférieur ou égal à 1,0 x 106, cellules de culture dans un flacon de 25 cm2. Si le nombre de cellules est supérieur à 1,0 x 106, cellules de culture dans plusieurs flacons de 25 cm2 (1,0 x 106 cellules par flacon). Placer le flacon dans un incubateur (sans secouer) à 37 oC avec 5 % de CO2 et remplacer le milieu tous les 2 à 3 jours.
REMARQUE : Certaines cellules sont endommagées par le grattoir cellulaire. Un analyse de viabilité cellulaire a révélé que le pourcentage de cellules vivantes était de 95,7 % et de 1,7 % (moyenne , DD, n et 3). Le temps de doublement des cellules isolées est d'environ 1/2 jours.
4. Récolte et caractérisation des cellules endothéliales pures
- Laissez les cellules se développer pendant environ 4 à 5 jours. Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence (Figure 3A), digèrent les cellules avec 0,25% de trypsine et de passage des cellules. Ensuite, collectez certaines des cellules isolées (Jour 3, Passage 1 et Passage 2) et identifiez par cytométrie de flux (avec un anticorps anti-CD31).
- Étiqueter les pAECs isolés (numéro cellulaire : 1 x 105) (Jour 3, Passage 1 et Passage 2) avec anticorps conjugués anti-porcc31-fluorescein isothiocyanate (FITC) (10 oL anticorps pour 100 cellules ll, tachés pendant 30 min à 4 oC) pour l'analyse de la cytométrie du débit.
- Population totale de cellules vivantes avec une parcelle dispersée vers l'avant, échantillon non taché comme un contrôle négatif. Ensuite, présentez les cellules positives CD31 des cellules fermées avec l'histogramme.
REMARQUE : L'efficacité des cellules cD31-positives est de 97,4 % - 1,2 % (Jour 3), 94,4 % - 1,1 % (P1) et 92,4 % - 1,7 % (P2) (moyenne et DP), respectivement (figure 3B).
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Representative Results
Notre méthode vise à fournir un moyen efficace d'isoler les CE très purifiés des aortes des porcs miniatures. Le processus de la chirurgie de l'aorte est montré dans la figure 1. La première étape est que toute l'aorte est excisée du cochon. Il est très important de prévenir d'autres contaminations cellulaires ou bactériennes. Ainsi, ne pas blesser d'autres organes ou tissus au cas où des cellules ou des bactéries non ciblées contaminent l'aorte, et lavez l'aorte avec un tampon de lavage pré-refroidi 3x (Figure 1B-D). Une autre étape critique pour maintenir la viabilité cellulaire est de minimiser la période entre l'obtention du spécimen chirurgical et la procédure d'isolement.
Les processus impliqués dans la purification des pAECsont sont présentés à la figure 2. Notre méthode est différente des autres puisqu'une extrémité de l'aorte est attachée et que la surface endothéliale est exposée (figure 2C-G). Par la suite, la surface endothéliale de l'aorte entière est digérée avec la solution digestive pré-chauffée de collagène (5-10 ml) dans un tube de centrifugeuse de 15 ml (figure 2H). Par rapport à d'autres méthodes, la surface endothéliale est plus complètement, et de préférence, exposés à la solution digestive en raison de l'inversion de l'aorte et la submersion dans la solution digestive (sans bulles). Une fois la digestion arrêtée avec le tampon d'arrêt, la surface endothéliale de l'aorte doit être doucement grattée dans une seule direction avec un grattoir cellulaire (figure 2I). La direction du grattage est importante pour éviter d'endommager les CE. Ne touchez pas les trous et coupez les bords de l'aorte digérée.
Après l'isolement, les CE sont inspectés les jours 0, 1 et 2, et après le passage 1 (P1) et le passage 2 (P2) (figure 3A). Les CE isolés sont identifiés par cytométrie de flux à l'aide d'un anticorps anti-CD31-FITC. L'analyse de la cytométrie des flux a révélé que les pourcentages de cellules cD31-positives sont de 97,4 % - 1,2 % (Jour3), 94,4 % - 1,1 % (P1) et 92,4 % - 1,7 % (P2) (moyenne et DP), respectivement (figure 3B). Ainsi, l'isolement des pAECs peut être réalisé avec succès avec ce protocole.
Figure 1 : L'intervention chirurgicale et l'excision de l'aorte d'un porc miniature.
(A) Photographie d'un cochon miniature (Bama). (B) L'aorte est exposée après la laparotomie et la thoracotomie. (C) L'aorte est serrée à chaque extrémité. (D) L'aorte est placée dans un tube de 50 ml avec tampon de lavage à froid. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Digestion porcine de l'aorte et isolement des pAECs.
(A) L'aorte est placée dans un plat Petri de 150 mm avec tampon de lavage à froid. (B) Photographie de l'aorte porcine après avoir enlevé les tissus conjonctifs. (C) La barre de verre attachée à une suture chirurgicale stérile pour passer à travers l'aorte porcine. (D) Une extrémité de l'aorte est attachée à une suture chirurgicale stérile, qui est maintenue à l'intérieur de l'aorte. (E,F) L'aorte est inversée en tirant la suture chirurgicale. (G) La surface endothéliale de l'aorte porcine est exposée. (H) L'aorte digérée. (I) Scraping la surface endothéliale de l'aorte avec un grattoir cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Identification des pAEC hautement purifiés par cytométrie d'écoulement avec un anticorps monoclonal anti-CD31.
(A) Images représentatives des pAEC s'agitent les jours 0, 1 et 2, et après le passage 1 et le passage 2 (200x grossissement). (B) Analyse cytométrie de flux des pAECs (Jour 3, passage 1 et 2) avec anticorps anti-CD31-FITC. Les données statistiques sont présentées en bas à droite. Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes (moyenne et DD). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les cellules endothéliales sont couramment utilisées dans la recherche sur le dysfonctionnement vasculaire, le diabète, la régénération des tissus, la transplantation et les cancers14,15,16,17,18. Pour comprendre et caractériser la biologie et la fonction des E dans ces maladies, de nombreuses méthodes d'isolement des CE de différents organes ou tissus malades ont été signalées8,19,20, 21 Ans, états-unis , 22 Ans , 23 Ans, états-unis , 24. Récemment, un nombre croissant de rapports ont démontré que les CE porcins ont diverses fonctions dans le rejet immunitaire et la coagulation de la xénotransplantation6,25. Cependant, l'isolement des cellules endothéliales aortiques fortement purifiées des porcs miniatures a été rapporté moins fréquemment. Ici, nous décrivons une méthode stable et facile pour l'isolement des cellules endothéliales aortiques des porcs miniatures.
La collagène peut dégrader différents tissus, et est supérieure à la trypsine ou d'autres solutions digestives26,27,28,29. Nous avons utilisé 0,005% de collagène IV pour dissocier les pAECs d'une petite aorte de porc. Il est important de noter que la concentration de la solution digestive doit être optimisée pour différents porcs. Collagenase solutions digestives à 0,025%, 0,05% et 0,2% ont été utilisés respectivement dans différents porcs, selon l'âge et la race10,13,30. Ici, nous recommandons la concentration optimale de collagène IV à 0,005%, et le temps digestif optimal d'être de 15 min. Le temps ne devrait pas être 'lt;10 min ou 'gt;20 min, ce qui est compatible avec les études précédentes8,30. La concentration de collagène IV et le temps digestif sont essentiels pour obtenir une grande pureté et un grand nombre d'ECs. Des concentrations plus faibles de collagène IV ou des temps digestifs plus courts se traduiront par moins d'ECs. Des concentrations plus élevées de collagène IV ou de temps digestif plus long s'admindront dans la contamination par le fibroblaste.
Les dommages cellulaires et la contamination par le fibroblaste sont deux problèmes dans l'isolement des pAECs. Afin de réduire les dommages cellulaires et la contamination par le fibroblaste, nous avons adopté une méthode dans laquelle les CE ont été grattés doucement avec un grattoir cellulaire. La direction, la fréquence et l'intensité du grattage sont essentielles pour prévenir les dommages cellulaires et la contamination par le fibroblaste. Tout d'abord, nous avons gratté la surface endothéliale de l'aorte dans une seule direction. Deuxièmement, nous recommandons que la fréquence de grattage soit moins de 10 fois (5 à 8 fois est recommandée), et l'intensité doit être douce. Enfin, les zones entourant les trous des branches latérales artérielles et les bords coupés de l'aorte (qui pourraient conduire à des cellules de fibroblaste et plus de cellules de dommages) ne devraient pas être grattés.
Une concentration plus élevée de collagène, un temps de digestion plus long, et une fréquence et une intensité accrues de raclage peuvent augmenter la contamination par le fibroblaste. Les fibroblastes peuvent rapidement dépasser les cellules CD31-positives, réduisant ainsi la pureté des ECs31isolés. En comparaison avec les protocoles existants, bien que le protocole ait été soigneusement conçu pour prévenir la contamination par le fibroblaste, et que les cellules cD31-positives le jour 3 aient atteint 97,4 % - 1,2 % (moyenne et DD), le pourcentage de cellules positives CD31 a lentement diminué après la culture. . Si les EC isolés sont utilisés pour effectuer des expériences après 5 passages, nous suggérons que les cellules doivent être triées avec un trieur de cellules de cytométrie de flux10.
Habituellement, nous isolons non seulement les cellules endothéliales, mais obtenons également d'autres organes pour la recherche de xénotransplantation, telle que le pancréas et le rein. Selon notre expérience, il serait préférable d'isoler le pancréas et les poumons d'abord, puis effectuer l'acquisition du foie et des reins. Même après cela, il n'est pas trop tard pour isoler le cœur et l'aorte, si le chirurgien est assez rapide pour terminer tout l'isolement en moins d'une demi-heure. Pendant le processus, il est très critique de garder la zone chirurgicale stérile et froide. Le PBS froid avec des antibiotiques a été versé à l'organe cible pour nettoyer la contamination possible et pour maintenir les tissus à basse température. Il est également nécessaire de prévenir la coagulation en injectant de l'héparine après anesthésie de l'animal. Le caillot dans le vaisseau micro vasculaire induirait la mort cellulaire et l'inflammation des organes avec plus de capillaires, tels que le pancréas, le poumon et le foie. Nous injectons toujours l'héparine à la veine inférieure cava et insérez un cathéter à l'aorte abdominale au sang. Ceci empêchera effectivement la mort cellulaire liée à la coagulation.
En conclusion, nous fournissons une méthode efficace pour isoler les pAECs hautement purifiés des porcs miniatures. Les pAEC isolés sont bénéfiques pour la recherche sur la xénotransplantation. Bien que nous n'ayons pas isolé les pAECd d'un gros porc en utilisant le protocole, nous croyons que nous obtiendrons des CE très purifiés d'un gros porc avec le protocole en modifiant certaines étapes critiques.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les travaux ont été soutenus par des subventions de la Natural Science Foundation of Guangdong Province, Numéro de subvention/prix: 2016A030313028; Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province, Grant/Award Number: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Numéro de subvention/prix: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160222204849975, GJHZ2017031417135556, JCYJ201604251030000011 et JCYJ2016042420420 Shenzhen Longhua District Foundation of Science and Technology, Numéro de subvention/prix: 2017013; National Key R-D Program of China, Grant/Award Number: 2017YFC1103704; Sanming Project of Medicine à Shenzhen, Numéro de subvention/prix: SZSM201412020; Fonds spéciaux pour la construction d'hôpitaux de haut niveau dans la province du Guangdong (2019); Fonds pour la construction de discipline médicale de haut niveau de Shenzhen, numéro de subvention/prix : 2016031638 ; Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission, Numéro de subvention/prix: SZXJ2017021 et SZXJ2018059. Nous remercions Hancheng Zhang et Zhicheng Zou de l'Université de Shenzhen d'avoir aidé à la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap ?T25? | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe?5mL? | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
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