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Biology

Aislamiento y cultivo de células endoteliales aórticas primarias de cerdos en miniatura

Published: August 14, 2019 doi: 10.3791/59673

Summary

Se describe un método enzimático eficaz para el aislamiento de las células endoteliales aórticas porcinas primarias (pAEC) de los cerdos en miniatura. Los pAEC primarios aislados se pueden utilizar para investigar la respuesta inmunitaria y de la coagulación en el xenotrasplante.

Abstract

El xenotrasplante es una forma prometedora de resolver la escasez de órganos humanos para los pacientes con insuficiencia orgánica terminal, y el cerdo se considera como una fuente de órganos adecuada. El rechazo inmune y la coagulación son dos obstáculos importantes para el éxito del xenotrasplante. La lesión y la disfunción de la célula endotelial vascular (EC) son importantes para el desarrollo de las respuestas de inflamación y coagulación en xenotrasplante. Por lo tanto, el aislamiento de las células endoteliales aórticas porcinas (PAECs) es necesario para investigar el rechazo inmune y las respuestas de coagulación. Aquí, hemos desarrollado un enfoque enzimático simple para el aislamiento, caracterización y expansión de pAECs altamente purificados de cerdos en miniatura. En primer lugar, el cerdo en miniatura fue anestesiado con ketamina, y se extirpado una longitud de aorta. En segundo lugar, la superficie endotelial de la aorta fue expuesta a 0.005% solución digestiva de colágeno IV durante 15 min. En tercer lugar, la superficie endotelial de la aorta fue raspada en una sola dirección con un rascador celular (<10 veces), y no se comprimió durante el proceso de Raspado. Finalmente, los pAEC aislados del Día 3, y después del paso 1 y el pasaje 2, fueron identificados por citometría de flujo con un anticuerpo anti-CD31. Los porcentajes de células cd31 positivas fueron del 97,4% al 1,2%, del 94,4 % al 1,1% y del 92,4% al 1,7% (media de SD), respectivamente. La concentración de Colagenasa IV, el tiempo digestivo, la dirección y la frecuencia e intensidad del raspado son fundamentales para disminuir la contaminación por fibroblastos y obtener alta pureza y un gran número de CE. En conclusión, nuestro método enzimático es un método altamente eficaz para aislar las EF de la aorta de cerdo en miniatura, y las células se pueden ampliar in vitro para investigar las respuestas inmunitarias y de coagulación en el xenotrasplante.

Introduction

La escasez de órganos disponibles para trasplantes es un problema pendiente en todo el mundo1. Según la Cruz Roja de China, sólo un pequeño número de pacientes con insuficiencia orgánica en etapa terminal recibieron un órgano adecuado en China en 2018.

El xenotrasplante es una forma prometedora de resolver el problema de la escasez de órganos. Los órganos de cerdo son considerados los órganos másadecuados para los seres humanos debido a las similitudes anatómicas y fisiológicas 2,3. El fracaso de un xenoinjerto de cerdo está en gran medida relacionado con el rechazo inmune de primates y las respuestas de coagulación. Las células endoteliales porcinas (ECs) son críticas ya que estas células son las primeras en interactuar con el sistema inmunitario de primates, que incluye anticuerpos, complementos, citoquinas y células inmunitarias (por ejemplo, células T, células B y macrófagos)4,5. Las CE porcinas desempeñan un papel vital en el órgano de cerdo y el islotes xenotrasplante6,7. Por lo tanto, las CE son células importantes para investigar las respuestas de rechazo y coagulación a un injerto de cerdo. Se requiere aislamiento de eCs porcinas de alta calidad para la investigación de xenotrasplantes.

En intentos de aislar los ECs de diferentes órganos (por ejemplo, corazón, riñón, hígado y aorta), se han notificado varios protocolos en un entorno de xenotrasplante8,9,10,11,12. Sin embargo, mantener una cultura ultrapura de CE aislados es un problema excepcional en los protocolos estándar. El aumento de la concentración de la solución digerida, el tiempo dedigestión inapropiado y la intensidad del raspado pueden contribuir al aumento de la contaminación por fibroblastos en los estudios actuales 8,10,13. Además, el método de pAECs aislados de cerdos en miniatura está menos estudiado. Aquí, describimos un método enzimático optimizado para aislar pAEC altamente purificados de cerdos en miniatura (Wuzhishan o Bama). Se han diseñado varios pasos en el protocolo para reducir la contaminación por fibroblastos y obtener eCs de alta pureza.

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Protocol

El uso de animales fue aprobado por el Comité de Revisión de La Etica del Shenzhen Segundo Hospital del Pueblo, de acuerdo con los principios del bienestar animal.

1. Preparación de animales, medianos y tampones

  1. Prepara el cerdo en miniatura.
    NOTA: Todos los cerdos en miniatura eran cerdos chinos Wuzhishan o Bama (macho). La edad y el peso de los cerdos fueron de 100 días a 8 días y 5,7 kg a 1,0 kg (media de SD, n a 3), respectivamente.
  2. Preparar el medio de cultivo: medio celular endotelial (ECM) complementado con 10% (v/v) suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 1% (v/v) penicilina/estreptomicina (P/S) y 1% (v/v) suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS).
  3. Preparar el tampón de lavado: 1 solución PBS (pH 7.4) con 1% (v/v) P/S.
  4. Preparar una solución digestiva iv de la colagenasa 0.005%: 1 mg de polvo de colagenasa IV en 20 ml de solución de PBS. Precalentar la solución digestiva de la colagenasa a 37 oC antes de la digestión.
  5. Preparar el tampón de parada: El medio de eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de FBS inactivado por calor y 1% P/S.

2. Cirugía y preparación para el aislamiento de células endoteliales aórticas porcinas

  1. Desinfección del quirófano con luz UV durante 1 h y desinfectante médico 84 líquido (el contenido de cloro disponible es 4.0% - 5.0%, Tabla de Materiales)antes de realizar la cirugía.
  2. Después de que el cerdo en miniatura recibió una inyección intramuscular formada por 15 mg/kg de ketamina, 15 mg/kg de clorhidrato de xilazina y 0,05 mg/kg de clorhidrato de fenacetina ( Volúmenes: 100 oL/kg, Tabla de materiales) (Figura1A), confirman el estado de la anestesia con la comprobación del estímulo doloroso porcina (por ejemplo, pellizcar un oído o sacudir una extremidad anterior) y el índice fisiológico (por ejemplo, presión arterial, corazón y frecuencia respiratoria).
    NOTA: Se podría administrar otra media inyección de dosis al cerdo si muestra los signos de despertar.
  3. Cortar el abdomen con un bisturí, exponer la vena cava inferior y, en consecuencia, inyectar heparina sódica (5.000 U, Mesa de Materiales)en la vena cava inferior con jeringa de 5 ml.
  4. Cinco minutos más tarde, inserte un catéter en la aorta abdominal en la sangre, corte la piel del pecho e incise el diafragma con un bisturí y, posteriormente, corte el ventrículo izquierdo.
    NOTA: Asegúrese de que el cerdo esté eutanasiado comprobando el pulso aórtico después de ensangrentar y cortando el corazón.
  5. Exmarche las costillas con fórceps óseos (Tablade Materiales)y exponga el corazón y los pulmones. Encuentra la aorta posterior al corazón y los pulmones y sujeta los dos extremos. Lave la aorta una vez con tampón de lavado preenfriado (Figura1B,C).
  6. Corte la aorta con tijeras y mantenga la aorta sujeta en cada extremo. Exbote el exceso de tejido alrededor de la aorta con fórceps estériles y tijeras. Poner la aorta en un tubo centrífugo de 50 ml, lavar la aorta con tampón de lavado pre-enfriado 3x (30 ml por lavado) y transferir la aorta al laboratorio (Figura1D).

3. Aislamiento de células endoteliales aórticas porcinas

  1. En condiciones asépticas, retire la aorta de cerdo del tampón de lavado y colóquela en una placa Petri de 150 mm (Figura2A).
  2. Cortar suavemente los dos extremos de la aorta e extirpar el exceso de tejido alrededor de la aorta con fórceps estériles y tijeras de nuevo (Figura2B). Lavar el exterior y el interior de la aorta (sobre el plato de cultivo a temperatura ambiente) con 20 x 50 ml de tampón de lavado.
    NOTA: Trate de cortar sólo el área donde se colocaron las abrazaderas durante la cirugía, ya que algunas UNIDAD de transporte cardioverses se dañaron en esta zona, y eliminar el exceso de tejidos y ramas laterales arteriales.
  3. Pasar una sutura quirúrgica a través de la aorta y luego atar un extremo de la aorta usando la sutura quirúrgica (5-0, 90cm, Tabla de Materiales). Mantener la sutura quirúrgica en el interior de la aorta (Figura2C,D).
  4. Fije suavemente la aorta cerca del extremo atado con fórceps, y luego tire de la sutura quirúrgica lentamente para revertir la aorta hasta que la superficie endotelial de la aorta se exponga (Figura2E-G).
    NOTA: Asegúrese de fijar la aorta cerca del extremo atado y no fijar la aorta firmemente, o de lo contrario la aorta no se puede revertir tirando de la sutura quirúrgica.
  5. Lavar la superficie endotelial de la aorta con tampón de lavado 3x (10 mL por lavado) y luego deseche esta solución. Colocar la aorta en un tubo centrífugo de 15 ml y cubrir la aorta con 10 ml de 0,005% de solución digestiva de la colagenasa IV en el tubo (Figura2H).
    NOTA: Precalentar la solución digestiva iv de la colagenasa al 0,005% a 37 oC antes de la digestión.
  6. Incubar a 37 oC durante 15 minutos. Colocar la aorta digerida y la solución digestiva en un plato de cultivo de 100 mm y detener los efectos de la colatasa IV al añadir 10 a 15 ml de tampón de parada preenfriado.
    NOTA: El tiempo de digestión recomendado es de entre 10 y 20 minutos. Asegúrese de que la superficie endotelial de la aorta esté cubierta por el tampón de parada.
  7. Raspar suavemente los pAECs de la superficie interior de la aorta usando un rascador de celdas (Figura 2I). Lavar la aorta raspada 3x con tampón de lavado (5 ml por vez). Coloque la solución del plato de cultivo en un tubo centrífugo de 50 ml. Lave la parte inferior del plato de cultivo 2x con tampón de lavado (5 ml por vez) y vuelva a colocar la solución en un tubo centrífugo de 50 ml.
    NOTA: Rasque suavemente en una dirección y no comprima. No toque el tejido cerca de los bordes y agujeros. Se recomienda raspar 5 a 8x.
  8. Centrifugar el tubo a 600 x g durante 6 min a 4oC. Deseche el sobrenadante y deje 10 ml de solución en la parte inferior de un tubo centrífugo de 50 ml. Añadir 20 ml de tampón de lavado al tubo centrífugo de 50 ml y resuspender los pellets. Evite las burbujas durante este paso.
  9. Centrífuga a 600 x g durante 6 min a 4oC. Descarta lentamente el sobrenadante. Resuspender los pellets celulares con 1 ml de medio de cultivo y mezclar bien.
    NOTA: El número medio obtenido de ECs por cm aorta es de 1,9 x 105 x 1,4 x 104 (media de SD, n a 3).
  10. Cuente las celdas con un contador de celdas. Placa y cultivo de las células en un recipiente sin recubrimiento de ningún material de acuerdo con el número de celda. Si el número de celda es menor o igual que 1,0 x 106, las células de cultivo en un matraz de 25 cm2. Si el número de celda es mayor que 1,0 x 106, las células de cultivo en varios matraces de 25 cm2 (1,0 x 106 celdas por matraz). Colocar el matraz en una incubadora (sin agitar) a 37oC con 5% de CO2 y sustituir el medio cada 2 x 3 días.
    NOTA: Algunas células están dañadas por el rascador de células. Un ensayo de viabilidad celular encontró que el porcentaje de células vivas era 95,7% a 1,7% (media de SD, n a 3). El tiempo de duplicación de las células aisladas es de aproximadamente 1 a 2 días.

4. Cosecha y caracterización de células endoteliales puras

  1. Deje que las células crezcan durante unos 4 a 5 días. Cuando las células alcancen el 80% de confluencia (Figura3A),digiere las células con 0.25% de trippsina y pasaje las células. Luego, recoja algunas de las células aisladas (Día 3, Pasaje 1 y Pasaje 2) e identifique por citometría de flujo (con un anticuerpo anti-CD31).
  2. Etiquetar pAEC aislados (número de celda: 1 x 105) (Día 3, Pasaje 1 y Pasaje 2) con anticuerpo conjugado anti-porcino CD31-fluoresceina isotiocianato (FITC) (10 l anticuerpo para por células de 100 l, manchado durante 30 min a 4 oC) para el análisis de citometría de flujo.
  3. Población de células vivas total escalonada con una gráfica dispersa hacia adelante, muestra sin mancha como un control negativo. A continuación, presente las celdas positivas CD31 de las celdas cerradas con histograma.
    NOTA: La eficacia de las células con cm. con femhayación es del 97,4 % a 1,2 % (día 3), del 94,4 % al 1,1 % (P1) y del 92,4 % al 1,7 % (P2) (media de SD), respectivamente (figura 3B), respectivamente (figura3B).

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Representative Results

Nuestro método tiene como objetivo proporcionar una manera eficaz de aislar los CO altamente purificados de las aortas de los cerdos en miniatura. El proceso de cirugía de aorta se muestra en la Figura1. El primer paso es que toda la aorta se extirpan del cerdo. La prevención de la contaminación bacteriana o celular es muy importante. Por lo tanto, no lesione otros órganos o tejidos en caso de que las células o bacterias no dirigidas contaminen la aorta, y lave la aorta con tampón de lavado pre-enfriado 3x (Figura1B-D). Otro paso crítico para mantener la viabilidad celular es minimizar el período de tiempo entre la obtención de la muestra quirúrgica y el procedimiento de aislamiento.

Los procesos involucrados en la purificación de los PAEC se muestran en la Figura2. Nuestro método es diferente de los demás ya que un extremo de la aorta está atado y la superficie endotelial está expuesta (Figura 2C-G). Posteriormente, la superficie endotelial de toda la aorta se digiere con solución digestiva de colagenasa precalentada (5-10 ml) en un tubo centrífugo de 15 ml (Figura 2H). En comparación con otros métodos, la superficie endotelial está más completamente, y preferentemente, expuesta a la solución digestiva debido a la inversión de la aorta y la inmersión en la solución digestiva (sin burbujas). Después de detener la digestión con tampón de parada, la superficie endotelial de la aorta debe rasparse suavemente en una sola dirección con un rascador celular (Figura 2I). La dirección del raspado es importante para evitar daños a las CE. No toque los orificios ni corte los bordes de la aorta digerida.

Después del aislamiento, los CE se inspeccionan en los días 0, 1 y 2, y después del pasaje 1 (P1) y del pasaje 2 (P2) (Figura 3A). Las CE aisladas se identifican mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-CD31-FITC. El análisis de citometría de flujo ha indicado que los porcentajes de células CD31 positivas son 97,4% a 1,2% (Día3), 94,4% a 1,1% (P1) y 92,4% a 1,7% (P2) (media de SD), respectivamente (Figura 3B). Por lo tanto, el aislamiento de los PAECs se puede lograr con éxito con este protocolo.

Figure 1
Figura 1: El procedimiento quirúrgico y la escisión de la aorta de un cerdo en miniatura.
(A) Fotografía de un cerdo en miniatura (Bama). (B) La aorta se expone después de la parotomía y toracotomía. (C) La aorta se sujeta en cada extremo. (D) La aorta se coloca en un tubo de 50 ml con tampón de lavado en frío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Porcino aorta digestión y pAECs aislamiento.
(A) La aorta se coloca en un plato Petri de 150 mm con tampón de lavado en frío. (B) Fotografía de la aorta porcina después de extraer los tejidos conectivos. (C) La barra de vidrio atada con una sutura quirúrgica estéril para pasar a través de la aorta porcina. (D) Un extremo de la aorta está atado con una sutura quirúrgica estéril, que se mantiene en el interior de la aorta. (E,F) La aorta se invierte tirando de la sutura quirúrgica. (G) La superficie endotelial de la aorta porcina está expuesta. (H) La aorta digerida. (I) Raspar la superficie endotelial de la aorta con un rascador celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Identificación de pAEC altamente purificados por citometría de flujo con un anticuerpo monoclonal anti-CD31.
(A) Imágenes representativas de los pAECaislados en los días 0, 1 y 2, y después del pasaje 1 y el pasaje 2 (aumento de 200x). (B) Análisis de citometría de flujo de pAEC (Día 3, pasaje 1 y 2) con anticuerpo anti-CD31-FITC. Los datos estadísticos se presentan en la parte inferior derecha. Los datos son representativos de tres experimentos independientes (media de SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las células endoteliales se utilizan comúnmente en la investigación de la disfunción vascular, diabetes, regeneración de tejidos, trasplante, y cánceres14,15,16,17,18. Para comprender y caracterizar la biología y la función de las CE en estas enfermedades, se han notificado numerosos métodos para aislar las CE de diferentes órganos o tejidos enfermos8,19,20, 21 , 22 , 23 , 24. Recientemente, un número cada vez mayor de informes han demostrado que las CE porcinas tienen diversas funciones en el rechazo inmune y la coagulación del xenotrasplante6,25. Sin embargo, el aislamiento de células endoteliales aórticas altamente purificadas de cerdos en miniatura se ha notificado con menos frecuencia. Aquí, describimos un método estable y fácil para el aislamiento de células endoteliales aórticas de cerdos en miniatura.

La colagenasa puede degradar diferentes tejidos, y es superior a la trippsina u otras soluciones digestivas26,27,28,29. Usamos 0.005% colagenasa IV para disociar pAECs de una pequeña aorta de cerdo. Es importante destacar que la concentración de la solución digestiva debe optimizarse a diferentes cerdos. Soluciones digestivas de la colagenasa al 0,025%, 0,05% y 0,2% se han utilizado respectivamente en diferentes cerdos, según edad y raza10,13,30. Aquí, recomendamos la concentración óptima de colagenasa IV para ser 0.005%, y el tiempo digestivo óptimo para ser 15 min. El tiempo no debe ser <10 min o >20 min, que es coherente con estudios anteriores8,30. La concentración de colagenasa IV y el tiempo digestivo son críticos para obtener alta pureza y un gran número de CE. Las concentraciones más bajas de colagenasa IV o tiempos digestivos más cortos darán lugar a menos ECs. Las concentraciones más altas de colagenasa IV o tiempos digestivos más largos conducirán a una mayor contaminación por fibroblastos.

El daño celular y la contaminación por fibroblastos son dos problemas en el aislamiento de los PAEC. Con el fin de reducir el daño celular y la contaminación por fibroblastos, adoptamos un método en el que las CE fueron raspadas suavemente con un rascador celular. La dirección, la frecuencia y la intensidad del raspado son fundamentales para prevenir el daño celular y la contaminación por fibroblastos. Primero, raspamos la superficie endotelial de la aorta en una sola dirección. En segundo lugar, recomendamos que la frecuencia de raspado sea inferior a 10 veces (5 a 8 veces se recomienda), y la intensidad debe ser suave. Por último, las áreas que rodean los agujeros de las ramas laterales arteriales y los bordes cortados de la aorta (que podrían conducir a células fibroblastas y más células de daño) no deben rasparse.

Una mayor concentración de colagenasa, mayor tiempo de digestión y mayor frecuencia e intensidad de raspado pueden aumentar la contaminación por fibroblastos. Los fibroblastos pueden superar rápidamente a las células con positivo CD31, reduciendo así la pureza de las CE aisladas31. En comparación con los protocolos existentes, aunque el protocolo ha sido cuidadosamente diseñado para prevenir la contaminación por fibroblastos, y las células con cmitación CD31 en el día 3 alcanzaron el 97,4% a 1,2% (media de SD), el porcentaje de células positivas CD31 disminuyó lentamente después del cultivo . Si los ECaislados se utilizan para llevar a cabo experimentos después de 5 pasajes, sugerimos que las celdas se ordenen con un clasificador de células de citometría de flujo10.

Por lo general, no sólo aislamos las células endoteliales, sino que también obtenemos otros órganos para la investigación de xenotrasplantes, como el páncreas y el riñón. Según nuestra experiencia, sería mejor aislar el páncreas y el pulmón primero, y luego realizar la adquisición de hígado y riñón. Incluso después de eso no es demasiado tarde para aislar el corazón y la aorta, si el cirujano es lo suficientemente rápido como para terminar todo el aislamiento en menos de media hora. Durante el proceso, es muy crítico mantener el área quirúrgica estéril y fría. El resfriado frío con antibióticos se vertió al órgano objetivo para limpiar la posible contaminación y mantener los tejidos a baja temperatura. También es necesario prevenir la coagulación mediante la inyección de heparina después de la anestesia de animal. El coágulo en el micro vascular induciría la muerte celular y la inflamación de órganos con más capilares, como el páncreas, el pulmón y el hígado. Siempre inyectamos heparina en la vena cava inferior e insertamos un catéter en la aorta abdominal en sangre. Esto evitará eficazmente la muerte celular relacionada con la coagulación.

En conclusión, proporcionamos un método eficaz para aislar pAEC altamente purificados de cerdos en miniatura. Los pAEC aislados son beneficiosos para la investigación de xenotrasplantes. Aunque no hemos aislado los pAECs de un cerdo grande utilizando el protocolo, creemos que obtendremos CP altamente purificados de un cerdo grande con el protocolo modificando algunos pasos críticos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong, Número de Subvención/Premio: 2016A030313028; Fundación de Investigación Científica Médica de la Provincia de Guangdong, Número de Subvención/Premio: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Número de subvención/premio: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY2016029204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 y JCYJ201604281420409945; Shenzhen Longhua District Foundation of Science and Technology, Número de Subvención/Premio: 2017013; Programa Nacional Clave de I+D de China, Número de Subvención/Premio: 2017YFC1103704; Sanming Project of Medicine en Shenzhen, Número de subvención/premio: SZSM201412020; Fondos Especiales para la Construcción de Hospitales de Alto Nivel en la Provincia de Guangdong (2019); Fondo para la construcción de disciplina médica de alto nivel de Shenzhen, número de subvención/premio: 2016031638; Comisión de La Fundación de Salud y Planificación Familiar de Shenzhen, Número de Subvención/Premio: SZXJ2017021 y SZXJ2018059. Agradecemos a Hancheng Zhang y Zhicheng Zou de la Universidad de Shenzhen por ayudar en la preparación del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACSAria II BD Bioscience
Boneforceps Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China HL-YGQ  
BOON Disposable Syringe (10ml) Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China
CD31-FITC antibody Bio-Rad MCA1746F
Cell scraper Corning  3010#
Collagenase IV Sigma-Aldrich C5138#-1G
Compound ketamine injection  Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Life Technologies D1306#
DMEM Life Technologies 11965118#
ECM Sciencell 1001#
ECGS Sciencell 1052#
Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL)  AXYGEN MCT-150-C#
Falcon 100mm Cell Culture Dish Corning 353003#
Fetal Bovine Serum GIBCO 10270-106#
Flowjo v10.0
Forceps  ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China
Heparin sodium Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China
Iodine tincture Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China
Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China
Mshot microscope  Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. M152
Petri Dishes (150 x 15 mm) Biologixgroup 66-1515#
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070063#
Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap ?T25? Corning  3289#
Scissors ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China
Serological Transfer Pipettes (10ml) JET Biofil GSP010010# 
Sterile Pasteur Pipette GeneBrick GY0025#
Sterile Syringe Filter (0.22µm) Millipore SLGV033RS#
Surgical scalpel ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China 22#
Surgical suture Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd 5-0#
Syringe?5mL? Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO 25200056#
75% Medical alcohol Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China
20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) Sangon Biotech B540627#
Medical disinfectant 84 liquid Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd 450ml/bottle

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
  2. Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution? Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
  3. Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
  4. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
  5. McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
  6. Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
  7. Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
  8. Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
  9. Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
  10. Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
  11. Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
  12. Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
  13. Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
  14. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
  15. Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
  16. Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
  17. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  18. Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
  19. Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
  20. Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
  21. Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
  22. Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
  23. Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
  24. Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
  25. Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
  26. Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
  27. Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
  28. Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
  29. French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).
  30. Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
  31. Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).

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Aislamiento y cultivo de células endoteliales aórticas primarias de cerdos en miniatura
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Zhao, Y., Zhao, C., Cooper, D. K. C., Lu, Y., Luo, K., Wang, H., Chen, P., Zeng, C., Luan, S., Mou, L., Gao, H. Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs. J. Vis. Exp. (150), e59673, doi:10.3791/59673 (2019).

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