Summary
Primer domuz aort endotel hücrelerinin (pAECs) minyatür domuzlardan izolasyonu için etkili bir enzimatik yöntem tanımlanmıştır. İzole primer pAEC'ler ksenotransplantasyonda immün ve koagülasyon yanıtını araştırmak için kullanılabilir.
Abstract
Xenotransplantasyon son dönem organ yetmezliği olan hastalar için insan organı sıkıntısı gidermek için umut verici bir yoldur, ve domuz uygun bir organ kaynağı olarak kabul edilir. Bağışıklık reddi ve pıhtılaşma ksenotransplantasyonun başarısı için iki önemli engeldir. Vasküler endotel hücresi (EC) yaralanması ve disfonksiyonu ksenotransplantasyonda inflamasyon ve koagülasyon yanıtlarının gelişimi için önemlidir. Bu nedenle, domuz etitik endotel hücrelerinin izolasyon (pAECs) bağışıklık reddi ve pıhtılaşma yanıtları araştırmak için gereklidir. Burada, minyatür domuzlardan son derece saflaştırılmış pAEC'lerin izolasyonu, karakterizasyonu ve genişlemesi için basit bir enzimatik yaklaşım geliştirdik. İlk olarak, minyatür domuz ketamin ile anestezi ve aort uzunluğu çıkarıldı. İkinci olarak, aort endotel yüzeyi 15 dk. Üçüncü, aort endotel yüzeyi bir hücre kazıyıcı ile sadece bir yönde kazınmış oldu (<10 kez) için% 0.005 kollajenaz IV sindirim çözeltisi maruz kaldı ve süreci sırasında sıkıştırılmış değildi Kazıma. Son olarak, 3. CD31-pozitif hücrelerin yüzdeleri sırasıyla %97.4 ± %1.2, %94.4 ± %1.1 ve %92.4 ± %1.7 (ortalama ± SD) idi. Kollajenaz IV konsantrasyonu, sindirim süresi, yönü ve sıklığı ve kazıma sıklığı ve yoğunluğu fibroblast kontaminasyonu azaltmak ve yüksek saflıkta ve ECs çok sayıda elde etmek için önemlidir. Sonuç olarak enzimatik yöntemimiz, minyatür domuz aortundaki EC'leri izole etmek için son derece etkili bir yöntemdir ve ksenotransplantasyonda immün ve pıhtılaşma yanıtlarını araştırmak için hücreler in vitro olarak genişletilebilir.
Introduction
Transplantasyon için mevcut organ sıkıntısı dünya çapındaolağanüstü bir sorundur 1. Çin Kızıl Haç Derneği'ne göre, 2018 yılında Çin'de son dönem organ yetmezliği olan hastaların sadece az sayıda uygun bir organ aldı.
Xenotransplantasyon organ yetersizliği sorununu çözmek için umut verici bir yoldur. Domuz organları anatomik ve fizyolojik benzerlikler nedeniyle insanlar için en uygun organ olarak kabul edilir2,3. Bir domuz ksenograft yetmezliği büyük ölçüde primat bağışıklık reddi ve pıhtılaşma yanıtları ile ilgilidir. Bu hücreler antikor, kompleman, sitokinler ve bağışıklık hücreleri (örneğin, T hücreleri, B hücreleri ve makrofajlar)4,5içeren primat bağışıklık sistemi ile etkileşime ilk beri domuz eti endotel hücreleri (ECs) kritiktir . Domuz eti ecs domuz organ ve adacık xenotransplantasyon hayati bir rol oynamaktadır6,7. Bu nedenle, ECs bir domuz grefti reddi ve pıhtılaşma yanıtları araştırmak için önemli hücrelerdir. Knenotransplantasyon araştırmaları için yüksek kaliteli domuz eti izolasyonu gereklidir.
Farklı organlardan (örneğin, kalp, böbrek, karaciğer ve aort) EC'leri izole etme girişimlerinde, xenotransplant ayarında8,9,10,11,12gibi çeşitli protokoller bildirilmiştir. Ancak, yalıtılmış EC'lerin ultra saf kültürünü korumak standart protokollerde olağanüstü bir sorundur. Sindirilmiş çözeltinin artan konsantrasyonu, uygun olmayan sindirim süresi ve sıyrık yoğunluğu mevcut çalışmalarda artmış fibroblast kontaminasyonuna katkıda bulunabilir8,10,13. Ayrıca, minyatür domuzizole pAECs yöntemi daha az çalışılmıştır. Burada, minyatür domuzlardan (Wuzhishan veya Bama) yüksek oranda saflaştırılmış pAEC'leri izole etmek için optimize edilmiş bir enzimatik yöntemi tanımlıyoruz. Protokoldeki birkaç adım fibroblast kontaminasyonunu azaltmak ve yüksek saflıkta EC'ler elde etmek için tasarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanların kullanımı Shenzhen İkinci Halk Hastanesi Etik İnceleme Komitesi tarafından, hayvan refahı ilkelerine uygun olarak onaylandı.
1. Hayvanların, orta ve tamponların hazırlanması
- Minyatür domuzu hazırlayın.
NOT: Tüm minyatür domuzlar Çin Wuzhishan veya Bama domuz (erkek) idi. Domuzların yaşı ve ağırlığı sırasıyla 100 gün ± 8 gün ve 5.7 kg ± 1.0 kg (ortalama ± SD, n = 3) idi. - Kültür ortamını hazırlayın: endotel hücreli orta (ECM) %10 (v/v) ısıya inaktive fetal sığır serumu (FBS), %1 (v/v) penisilin/streptomisin (P/S) ve %1 (v/v) endotel hücre büyüme takviyesi (EKGS) ile desteklenmiştir.
- Yıkama tamponu hazırlayın: 1x PBS çözeltisi (pH 7.4) ile % 1 (v/v) P/S.
- %0.005 kollajenaz IV sindirim çözeltisi hazırlayın: PBS çözeltisinin 20 mL'sinde 1 mg kollajenaz IV tozu. Önceden 37 °C'de kollajenaz sindirim çözeltisi ısıtın.
- Durdurma tamponu hazırlayın: Dulbecco modifiye Eagle's orta (DMEM) ile desteklenmektedir 10% ısı-inaktive FBS ve 1% P / S.
2. Cerrahi ve domuz etitik endotel hücre izolasyonu için hazırlık
- Ameliyat tan önce ameliyathanenin 1 saat UV ışığı ve tıbbi dezenfektan 84 sıvı (mevcut klor içeriği %4,0 - %5,0, MalzemeTablosu) ile dezenfekte edilebgereklidir.
- Minyatür domuz15 mg/kg Ketamin, 15 mg/kg Ksilazin hidroklorür ve 0.05 mg/kg Fenasetin hidroklorür (Hacimler: 100μL/kg, MalzemeTablosu) (Şekil1A) domuz ağrılı uyarıcı kontrol ile anestezi durumu (örneğin, bir kulak pinching veya bir ön bacak sallayarak) ve fizyolojik indeks (örneğin kan basıncı, kalp ve solunum hızı).
NOT: Uyanma belirtileri ni gösteriyorsa domuza yarım doz daha enjeksiyon yapılabilir. - Bir neşter ile karın kesin, inferior vena kava maruz ve sonuç olarak 5 mL şırınga ile inferior vena kava içine heparin sodyum (5.000 U, MalzemeTablosu) enjekte.
- Beş dakika sonra, karın aort kan ateter takın, göğüs deri kesilmiş ve bir neşter ile diyafram eğim ve daha sonra sol ventrikül kapalı kesti.
NOT: O domuz kan ve kalp kestikten sonra aort nabız kontrol ederek ötenazi olduğundan emin olun. - Kemik forceps ile kaburga çıkarmak(Malzeme Tablosu), ve kalp ve akciğerler ortaya çıkarmak. Kalp ve akciğerler için aort posterior bulmak ve iki ucunu kelepçe. Aortu önceden soğutulmuş yıkama tamponuyla bir kez yıkayın (Şekil 1B,C).
- Makasla aortu kesin ve aortu her iki ucunda kenetletin. Steril forceps ve makas ile aort etrafında aşırı doku excise. Aortu 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun, aortu önceden soğutulmuş yıkama tamponu 3x (yıkama başına 30 mL) ile yıkayın ve aortu laboratuvara aktarın (Şekil1D).
3. Domuz etiaort endotel hücrelerinin izolasyonu
- Aseptik koşullar altında, domuz aortu yıkama tamponundan çıkarın ve 150 mm Petri kabına yerleştirin (Şekil2A).
- Aortun iki ucunu hafifçe kesip aort çevresindeki fazla dokuyu tekrar steril çalgılar ve makaslarla dışarı çıkarır (Şekil2B). 20−50 mL yıkama tamponu ile aortun dışını ve içini (oda sıcaklığında kültür çanağı üzerinde) yıkayın.
NOT: Bazı EC'ler bu bölgede hasar gördüğünden, sadece ameliyat sırasında kelepçelerin yerleştirildiği bölgeyi kesmeye çalışın ve fazla dokuları ve arteriyel yan dalları çıkarın. - Aort üzerinden bir cerrahi dikiş geçirin ve daha sonra cerrahi dikiş kullanarak aort bir ucunu kravat (5-0, 90cm, MalzemeTablosu). Cerrahi sütürü aort içinde tutun (Şekil 2C,D).
- Aort'u bağlı ucuna yakın aortu forceps ile yavaşça düzeltin ve aortun endotel yüzeyi açığa çıkana kadar aortu yavaşça tersine çevirmek için cerrahi sütürü yavaşça çekin (Şekil2E-G).
NOT: Bağlı ucuna yakın aort düzeltmek için emin olun ve sıkıca aort düzeltmek değil, aksi takdirde aort cerrahi dikiş çekerek ters olamaz. - Aort endotel yüzeyini yıkama tamponu 3x (yıkama başına 10 mL) ile yıkayın ve bu çözeltiyi atın. Aortu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve aortu tüpe %0,005 kollajenaz IV sindirim çözeltisi ile kaplayın (Şekil2H).
NOT: Önceden ısıtmak 0.005% kollajenaz IV sindirim çözeltisi 37 °C sindirim önce. - 15 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yat. Sindirilmiş aort ve sindirim solüsyonu 100 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin ve önceden soğutulmuş durdurma tamponuna 10−15 mL ekleyerek %0,005 kollajenaz IV'ün etkilerini durdurun.
NOT: Önerilen sindirim süresi 10 ile 20 dakika arasındadır. Aort endotel yüzeyinin durdurma tamponu ile kaplı olduğundan emin olun. - Bir hücre kazıyıcı kullanarak aort iç yüzeyinden pAEC'leri yavaşça kazıyın (Şekil2I). Kazınmış aort 3x yıkama tamponu (zaman başına 5 mL) ile yıkayın. Kültür çanasından gelen çözeltiyi 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun. Kültür kabının altını 2 kat yıkayın ve yıkama tamponu (her seferinde 5 mL) ve çözeltiyi tekrar 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun.
NOT: Tek bir yöne hafifçe kazıyın ve sıkıştırmayın. Kenarlara ve deliklere yakın dokuya dokunmayın. 5−8x kazıma önerilir. - Tüpü 600 x g'de 4 °C'de 6 dk santrifüj edin. Supernatant'ı atın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpünün altında 10 mL çözelti bırakın. 50 mL santrifüj tüpüne 20 mL yıkama tamponu ekleyin ve peletleri yeniden askıya alın. Bu adım sırasında kabarcıklar kaçının.
- Santrifüj 600 x g için 6 dk 4 °C'de. Yavaşça supernatant atın. 1 mL kültür ortamı ile hücre peletlerini yeniden askıya alın ve iyice karıştırın.
NOT: Elde edilen ortalama CM aort sayısı 1,9 x 105 ± 1,4 x 104 'dir (ortalama ± SD, n = 3). - Hücreleri hücre sayacıyla sayın. Plaka ve kültür hücre numarasına göre herhangi bir malzeme kaplama olmadan bir kap içinde hücreleri. Hücre sayısı 1,0 x 10 6'danaz veya eşitse, 25 cm2 şişedeki kültür hücreleri. Hücre sayısı 1.0 x 106'dan büyükse, birkaç 25 cm2 şişedeki kültür hücreleri (şişe başına 1.0 x 106 hücre). Şişeyi 37 °C'de %5 CO2 ile bir kuvöze (sallamadan) yerleştirin ve orta yı 2−3 günde bir değiştirin.
NOT: Bazı hücreler hücre kazıyıcı tarafından zarar görür. Hücre canlılığı telbettecanlı hücrelerinin yüzdesinin %95.7 ± %1.7 olduğunu saptamıştır (ortalama ± SD, n = 3). İzole hücrelerin iki katına çıkarma süresi yaklaşık 1−2 gündür.
4. Saf endotel hücrelerinin hasat ve karakterizasyonu
- Hücreleri yaklaşık 4−5 gün boyunca büyümesini bırakın. Hücreler %80 birleştiğinde (Şekil3A),%0.25 tripsin ile hücreleri sindirir ve hücreleri iletir. Daha sonra, bazı izole hücreleri toplamak (Gün 3, Passage 1 ve Passage 2) ve akış sitometri (bir anti-CD31 antikor ile) ile tanımlamak.
- Etiket izole pAECs (hücre numarası: 1 x 105) (Gün 3, Passage 1 ve Passage 2) anti-domuz cd31-floresan isothiocyanate (FITC) konjuge antikor (10 μL antikor 100 μL hücreleri başına, 30 dakika için 4 °C için boyanmış) akış sitometri analizi için.
- Bir ileri dağınık arsa ile kapı toplam canlı hücre popülasyonu, negatif bir kontrol olarak lekesiz örnek. Daha sonra kapılı hücrelerin CD31 pozitif hücrelerini histogramla birlikte sunun.
NOT: CD31-pozitif hücrelerin etkinliği sırasıyla %97.4 ± %1.2 (Gün 3), %94.4 ± %1.1 (P1) ve %92.4 ± %1.7 (P2) (± SD) dir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yöntemimiz, yüksek oranda arıtılmış EC'leri aortlardan minyatür domuzlardan ayırmak için etkili bir yol sağlamayı amaçlamaktadır. Aort cerrahisi süreci Şekil1'de gösterilmiştir. İlk adım, tüm aort domuz dan excised olmasıdır. Diğer hücre veya bakteriyel kontaminasyonu önlemek çok önemlidir. Bu nedenle, hedeflenmemiş hücre veya bakteri aort kontamine durumda diğer organ veya dokuları zarar vermez ve önceden soğutulmuş yıkama tampon 3x ile aort yıkayın (Şekil1B-D). Hücre canlılığını korumak için bir diğer kritik adım cerrahi numune elde etmek ve izolasyon prosedürü arasındaki süreyi en aza indirmektir.
PAEC'lerin saflaştırılmasında yer alan süreçler Şekil2'de gösterilmiştir. Aortun bir ucu bağlanıp endotel yüzeyi açığa çıktığından yöntemimiz diğerlerinden farklıdır (Şekil 2C-G). Daha sonra, tüm aort endotel yüzeyi önceden ısıtılmış kollajenaz sindirim çözeltisi (5-10 mL) ile 15 mL santrifüj tüp (Şekil 2H)sindirilir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, endotel yüzeyi daha tamamen, ve tercihen, sindirim çözeltisi aort ve sindirim çözeltisi içine daldırma ters nedeniyle sindirim çözeltisi maruz (kabarcıklar olmadan). Sindirim tampon durdurma ile durdurulduktan sonra, aort endotel yüzeyi yavaşça bir hücre kazıyıcı ile sadece bir yönde kazınmış olmalıdır (Şekil 2I). Kazıma yönü, AB'lerin zarar görmesini önlemek için önemlidir. Sindirilmiş aortun deliklerine ve kesik kenarlarına dokunmayın.
İzolasyondan sonra, EC'ler 0, 1 ve 2 günlerinde ve geçiş 1 (P1) ve geçiş 2 (P2) (Şekil 3A)sonrasında denetlenir. İzole EC'ler bir anti-CD31-FITC antikor kullanılarak akış sitometrisi ile tanımlanır. Akış sitometri sitometrisi analizi, CD31-pozitif hücrelerin yüzdelerinin sırasıyla %97,4 ± %1,2 (Day3), %94,4 ± %1,1 (P1) ve %92,4 ± %1,7 (P2) (ortalama ± SD) olduğunu göstermiştir (Şekil 3B). Böylece, pAECs izolasyon başarıyla bu protokol ile elde edilebilir.
Şekil 1: Minyatür bir domuzdan aort un cerrahi prosedürü ve eksizyonu.
(A) Minyatür bir domuzun fotoğrafı (Bama). (B) Aort laparotomi ve torakotomi sonrası maruz kalır. (C) Aort her iki ucunda kenetlenir. (D) Aort, soğuk yıkama tamponu ile 50 mL'lik bir tüpiçine yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Domuz aort sindirimi ve pAECs izolasyon.
(A) Aort soğuk yıkama tamponu ile 150 mm Petri kabına yerleştirilir. (B) Bağ dokuları çıkardıktan sonra domuz aort fotoğrafı. (C) Cam çubuk domuz aort geçmek için steril bir cerrahi dikiş ile bağlı. (D) Aortun bir ucu, aortun içinde tutulan steril cerrahi dikişle bağlanır. (E,F) Aort cerrahi dikiş çekerek ters. (G) Domuz aortunun endotel yüzeyi açığa çıkar. (H) Sindirilmiş aort. (I) Aortun endotel yüzeyini bir hücre kazıyıcı ile kazımak. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yüksek oranda saflaştırılmış pAEC'lerin akım sitometrisi ile anti-CD31 monoklonal antikor ile tanımlanması.
(A) 0, 1 ve 2. (B) Anti-CD31-FITC antikorlu pAEC'lerin (Gün 3, pasaj 1 ve 2) akış sitometri analizi. İstatistiksel veriler sağ alt tabakada sunulmaktadır. Veriler üç bağımsız deneyi (ortalama ± SD) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endotel hücreleri yaygın vasküler disfonksiyon araştırmalarında kullanılır, diyabet, doku rejenerasyonu, transplantasyon, ve kanserler14,15,16,17,18. Anlamak ve bu hastalıklarda ECs işlevini anlamak ve karakterize etmek için, farklı hastalıklı organ veya dokuların ECs izole etmek için çok sayıda yöntem bildirilmiştir8,19,20, 21.000 , 22.000 , 23.000 , 24. Son zamanlarda, raporların giderek artan sayıda domuz eCs immün ret ve kznotransplantasyon pıhtılaşma çeşitli fonksiyonlara sahip olduğunu göstermiştir6,25. Ancak, minyatür domuzlardan yüksek oranda saflaştırılmış aort endotel hücrelerinin izolasyonu daha az sıklıkta bildirilmiştir. Burada, minyatür domuzlardan aort endotel hücrelerinin izolasyonu için istikrarlı ve kolay bir yöntem açıklanmaktadır.
Kollajenaz farklı dokuları bozabilir ve tripsin veya diğer sindirim çözümleri26,27,28,29üstündür. PAEC'leri küçük bir domuz aortundan ayrıştırmak için %0.005 kollajenaz IV kullandık. Daha da önemlisi, sindirim çözeltisi konsantrasyonu farklı domuzlar için optimize edilmelidir. Kollajenaz sindirim solüsyonları 0.025%, 0.05% ve 0.2% farklı domuzlarda sırasıyla kullanılmıştır, yaş ve cinsgöre 10,13,30. Burada, kollajenaz IV optimal konsantrasyonu% 0.005 ve optimum sindirim süresi 15 dakika olması öneririz. Zaman olmamalıdır <10 dk veya >20 dk, hangi önceki çalışmalarla tutarlı8,30. Kollajenaz IV konsantrasyonu ve sindirim süresi yüksek saflıkta ve ECs çok sayıda elde etmek için önemlidir. Kollajenaz IV veya daha kısa sindirim süreleri düşük konsantrasyonlarda daha az ECs neden olacaktır. Kollajenaz IV veya daha uzun sindirim süreleri yüksek konsantrasyonlarda daha fibroblast kontaminasyona yol açacaktır.
Hücre hasarı ve fibroblast kontaminasyonu pAEC'lerin izolasyonunda iki sorunvardır. Hücre hasarını ve fibroblast kontaminasyonunu azaltmak için, EC'lerin bir hücre kazıyıcı ile hafifçe kazındığı bir yöntem benimsedik. Hücre hasarı ve fibroblast kontaminasyonunu önlemek için kazıma yönü, sıklığı ve yoğunluğu çok önemlidir. İlk olarak, aort endotel yüzeyini sadece tek bir yönde kazıdık. İkinci olarak, kazıma sıklığının 10 katından daha az olmasını öneririz (5-8 kez önerilir) ve yoğunluğu nazik olmalıdır. Son olarak, arteriyel yan dalların delikleri ve aort kesik kenarları çevreleyen alanlar (fibroblast hücreleri ve daha fazla hasar hücrelerine yol açabilir) kazınmış olmamalıdır.
Daha yüksek kollajenaz konsantrasyonu, daha uzun sindirim süresi, ve kazıma artan sıklığı ve yoğunluğu fibroblast kontaminasyonu artırabilir. Fibroblastlar hızla CD31-pozitif hücreleri büyümek, böylece izole ECs 31saflığını azaltarak olabilir. Mevcut protokollerle karşılaştırıldığında, protokol fibroblast kontaminasyonunu önlemek için özenle tasarlanmış olmasına ve Üçüncü Gün'deki CD31 pozitif hücreler %97.4 ± %1.2'ye (ortalama ± SD) ulaşsa da, KÜLTÜR den sonra CD31 pozitif hücrelerin inme yüzdesi yavaş yavaş azalmıştır. . İzole edilmiş EC'ler 5 pasajdan sonra deneyler yapmak için kullanılırsa, hücrelerin akış sitometri hücre ayırıcısı10ile sıralanmış olması önerilmiştir.
Genellikle, biz sadece endotel hücreleri izole değil, aynı zamanda ksenotransplantasyon araştırma için diğer organlar olsun, pankreas ve böbrek gibi. Deneyimlerimize göre, daha iyi pankreas ve akciğer ilk izole etmek ve daha sonra karaciğer ve böbrek temini gerçekleştirmek olacaktır. Bundan sonra bile kalp ve aort izole etmek için çok geç değil, cerrah yarım saatten daha kısa bir sürede tüm izolasyon bitirmek için yeterince hızlı ise. İşlem sırasında cerrahi alanın steril ve soğuk tutulması çok önemlidir. Olası kontaminasyonu temizlemek ve dokuları düşük sıcaklıkta tutmak için hedef organa antibiyotik içeren soğuk PBS döküldü. Ayrıca hayvan anestezi sonra heparin enjekte ederek pıhtılaşmayı önlemek için gereklidir. Mikro vasküler damar pıhtı hücre ölümü ve daha fazla kılcal damarlar ile organların iltihabı neden olur, pankreas gibi, akciğer ve karaciğer. Biz her zaman inferior vena kava heparin enjekte ve kan aort için abdominal ater bir kateter takın. Bu etkili pıhtılaşma ile ilgili hücre ölümünü önleyecektir.
Sonuç olarak, yüksek oranda saflaştırılmış pAEC'leri minyatür domuzlardan izole etmek için etkili bir yöntem salıyoruz. İzole pAEC'ler ksenotransplantasyon araştırmaları için yararlıdır. Protokolü kullanarak pAEC'leri büyük bir domuzdan izole etmemiş olsak da, bazı kritik adımları değiştirerek protokolle birlikte büyük bir domuzdan yüksek oranda saflaştırılmış EC'ler elde edeceğime inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Çalışma Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı hibe, Hibe / Ödül Numarası: 2016A030313028 tarafından desteklenmiştir; Guangdong Eyaleti Tıbbi Bilimsel Araştırma Vakfı, Hibe/Ödül Numarası: B2018003; Shenzhen Bilim ve Teknoloji Vakfı, Hibe/Ödül Numarası: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ2016042511ve JCYJ201604281420444444444444444444444444444444444444444444444444444444444442; Shenzhen Longhua Bölge Bilim ve Teknoloji Vakfı, Hibe/Ödül Numarası: 2017013; Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı, Hibe/Ödül Numarası: 2017YFC103704; Shenzhen Tıp Sanming Projesi, Hibe / Ödül Numarası: SZSM201412020; Guangdong Eyaleti Yüksek Düzeyli Hastanelerin İnşaatı Için Özel Fonlar (2019); Shenzhen Yüksek Düzeyde Tıbbi Disiplin İnşaatı Fonu, Hibe/Ödül Numarası: 2016031638; Shenzhen Sağlık ve Aile Planlaması Komisyonu Vakfı, Hibe/Ödül Numarası: SZXJ2017021 ve SZXJ2018059. Biz Hancheng Zhang ve Zhicheng Zou Shenzhen Üniversitesi'nden el yazması hazırlanmasında yardımcı olmak için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap ?T25? | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe?5mL? | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
References
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution? Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
