Summary
Här presenterar vi ett integrerat arbets flöde för att identifiera fenotypiska och molekyl ära egenskaper som karakteriserar cirkulerande tumör celler (CTCs). Vi kombinerar levande immunofärgning och robotliknande mikromanipulation av enstaka och klustrade ctcs med Single cell-baserade tekniker för nedströms analys och bedömning av metastaser-sådd förmåga.
Abstract
Blodburna metastaser står för de flesta cancerrelaterade dödsfall och involverar cirkulerande tumör celler (CTCs) som är framgångs rika i att etablera nya tumörer på avlägsna platser. CTCs finns i blodet av patienter som enstaka celler (Single CTCs) eller som multicellulära aggregat (CTC-kluster och CTC-vita blod kroppar kluster), med den senare uppvisar en högre metastatisk förmåga. Utöver uppräkning är fenotypisk och molekylär analys utomordentligt viktigt för att dissekera CTC-biologi och för att identifiera sårbarheter som kan åtgärdas. Här ger vi en detaljerad beskrivning av ett arbets flöde som omfattar CTC immunofärgning och micromanipulation, ex vivo kultur för att bedöma proliferativa och överlevnad kapacitet enskilda celler, och in vivo metastasis-formation analyser. Dessutom ger vi ett protokoll för att uppnå dissociation av CTC-kluster i enskilda celler och utredning av heterogenitet inom klustret. Med dessa metoder, till exempel, vi exakt kvantifiera överlevnad och proliferativ potential av enstaka CTCs och enskilda celler inom CTC-kluster, vilket leder oss till observation att celler i kluster visar bättre överlevnad och spridning i ex vivo -kulturer jämfört med enstaka ctcs. sammantaget erbjuder vårt arbets flöde en plattform för att dissekera egenskaperna hos ctcs på en enda cell nivå, som syftar till att identifiera metastaser-relevanta vägar och en bättre förståelse av CTC-biologi.
Introduction
Den kliniska manifestationen av metastaser i avlägsna organ representerar den sista etappen av cancer progression och står för mer än 90% av cancerrelaterade dödsfall1. Över gången från lokaliserad till metastaserad sjukdom är en process i flera steg, ofta medierad av cirkulerande tumör celler (ctcs)2,3,4. Dessa celler är utgjuta från den primära tumören i blod cirkulationen och transporteras till avlägsna organ, där de kan extravasate och fastställa metastaserande lesioner5,6. Även solida tumörer kan frigöra ett relativt stort antal CTCs, de flesta CTCs är avsedda att dö, på grund av hög skjuvning krafter i omlopp, anoikis-medierad celldöd, immun angrepp eller begränsad förmåga att anpassa sig till en utländsk mikromiljö7. Därför är det avgörande att etablera verktyg som möjliggör dissektion av molekyl ära egenskaper hos de CTCs som är utrustade med metastaser-seedning förmåga. Nyligen genomförda prekliniska och kliniska studier tyder på att förekomst och mängd av enstaka ctcs-och CTC-kluster är förknippat med ett sämre utfall hos patienter med olika typer av solida tumörer8,9,10 , 11 för att , 12 av de , 13 det , 14 (på) . CTC-kluster är grupper av två eller flera ctcs knutna till varandra under cirkulationen och är mer effektiva för att bilda metastaser jämfört med enstaka ctcs3,15,16. Celler i ett kluster upprätthålla stark cell-cell adhesion genom desmosomes och anhängare korsningar, som kan bidra till att övervinna anoikis17,18. Nyligen konstaterade vi att klustring av ctcs är kopplad till hypometylering av bindande platser för stemness-och proliferation-associerade transkriptionsfaktorer, vilket leder till en ökad förmåga att framgångs rikt initiera metastas19. CTC-kluster dissociation resulterar i ombyggnad av viktiga bindnings platser, och därmed dämpning av deras metastaserande potential19. Dessutom till kluster av cancer celler, kan CTCs också associera till vita blod kroppar (oftast neutrofiler) för att bibehålla höga spridnings nivåer i omlopp och öka deras metastaserande förmåga20. Emellertid, biologi CTCs förstås endast delvis och flera frågor förblir öppen, inklusive underliggande molekyl ära egenskaper och sårbarheter i enstaka och klustrade celler.
Under de senaste åren har flera strategier fastställts som utnyttjar cell ytan uttrycks mönster samt fysikaliska egenskaper hos ctcs för isolering21,22,23,24, 25. antigen-beroende isolerings metoder förlitar sig främst på uttrycket av cellytan epitelial cell adhesionsmolekylen (epcam)26. Den mest använda och (i dags läget) den enda FDA-godkända plattform för CTC uppräkning, är CellSearch systemet, som bygger på en två-stegs förfarande för att isolera CTCs21. I det första steget avlägsnas plasma komponenterna genom centrifugering, medan CTCs fångas med magnetiska ferrovätskor kopplade till anti-EpCAM-antikroppar. I det andra steget är den CTC-berikade lösningen fläckig för nukleerade (DAPI-positiva) celler som uttrycker cytokeratin (CK)8,18,19, medan vita blod kroppar (WBCs) identifieras med hjälp av Pan-leukocytmarkör CD45. Slutligen är fångade celler placeras på en integrerad screening plattform och CTCs identifieras genom uttryck av EpCAM, CKs och DAPI samtidigt som negativa för CD45. Även om detta anses vara guldmynt standard för CTC uppräkning, är nedströms molekylär analys utmanande med denna teknik på grund av inneboende begränsningar i CTC-hämtning. Dessutom, med tanke på dess isolerings förfarande, kan cellsearch gynna berikning av ctcs med högre epcam nivåer jämfört med ctcs med lägre epcam uttryck, på grund av till exempel cancer heterogenitet27 eller nedreglering av epitelial markörer 28,29. För att övervinna dessa begränsningar har antigen-oberoende teknik för berikning av CTCs uppstått. Till exempel, CTC-iChip integrerar hydrodynamisk separation av nukleerade celler, inklusive CTCs och WBCs från kvarvarande blod komponenter, följt av en immunomagnetisk utarmning av anti kropp-märkta WBCs, möjliggör rening av otaggade och livskraftiga CTCs i lösning25. Dessutom, det faktum att de flesta ctcs är något större än röda blod kroppar (rbcS) eller WBCs ledde till utvecklingen av storleks-baserade CTC anriknings teknik23,30 (t. ex. parsortix systemet (Angle)) som använder sig av en microfluidic-baserad teknik, bestående av en förträngnings kanal över separations kassetten, ledande celler till ett terminalgap på antingen 10, 8, 6,5 eller 4,5 μm (olika storlekar finns tillgängliga beroende på den förväntade diametern av mål cancer celler). De flesta av blod kropparna passerar genom den smala klyftan, medan CTCs fastna på grund av deras storlek (men också på grund av deras lägre deformability) och är därför kvar i kassetten. Återgår flödes riktningen möjliggör frisläppandet av fångade CTCs, som är i ett livskraftigt tillstånd och lämpar sig för nedströms analys. Oberoende av det valda protokollet för CTC-isolering, ger dock typiska efteranriknings procedurer fortfarande CTCs som blandas med ett relativt litet antal RBCs och WBCs, vilket gör analysen av ren enkel eller bulk CTCs utmanande. För att lösa det här problemet har vi etablerat ett arbets flöde som tillåter CTC manipulation utan potentiell bias infördes av blod celler föroreningar. Tillsats av immunofärgning i förväg, med variabla anti kropps kombinationer, skiljer CTCs från blod kroppar och gör det även möjligt att identifiera CTC-undergrupper med distinkta uttrycks profiler för ytmarkörer. Detta mycket anpassningsbara förfarande kan sedan ytterligare kombineras med specifika nedströms applikationer.
Här beskriver vi ett arbets flöde som utgår från en CTC-berikad produkt (erhålls med valfri CTC-beriknings teknik) och kombinerar flera metoder för att få insikt i CTC-biologi vid encellig upplösning. I korthet möjliggör vårt arbets flöde identifiering av enstaka ctcs, CTC-kluster och CTC-WBC-kluster genom levande immunofärgning, följt av encellig mikromanipulation och nedströms analys med hjälp av ex vivo -odlings protokoll, encellig sekvensering och in vivo metastaser-analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som omfattade blodprover från patienter utfördes efter informerat samtycke från deltagarna. Förfaranden kördes enligt protokollen EKNZ BASEC 2016-00067 och EK 321/10, godkända av den etiska och institutionella gransknings nämnden (etik kommittén i nordvästra/centrala Schweiz [EKNZ]), och i enlighet med Helsingfors deklarationen.
Alla förfaranden för djur utfördes i enlighet med de institutionella och kantonala rikt linjerna (godkända mus protokoll #2781, kantonala veterinär kontoret i Basel-City).
1. Preparering av patient prov
- Innan du börjar, se till att arbeta med aseptiska lösningar och material för att upprätthålla sterilitet under hela proceduren.
- Dra upp 7,5 mL perifert blod från en bröst Cancer patient till en 10 mL EDTA blod insamlings rör.
- Inkubera de blodhaltiga rören under en kort tids period (upp till 1 h) vid rums temperatur (RT) på en gungskakapparat vid 40-svängning per minut (osc/min).
- Berika för enstaka ctcs och CTC-kluster med hjälp av en CTC-isolerings metod för val21,22,23,25. Släpp CTCs i en 1x DPBS lösning.
Beroende på den valda CTC-anriknings tekniken kan kvarvarande vita blod kroppar och röda blod kroppar förekomma. Justera frisläppnings trycket för att bevara CTC-klusterstrukturerna. - Fortsätt omedelbart till nästa steg i avsnitt 3.
2. förberedelse av mus prov
- Före start, Förbered en 1 mL insulin spruta med en 25 g nål, 5 mM EDTA filtrerad lösning, och 2 mL EDTA blod insamlings rör.
- Se till att arbeta med aseptiska lösningar och material för att upprätthålla sterilitet under hela proceduren.
- Förtvätta sprutan med 5 mM EDTA-lösning.
- Fyll på sprutan med 100 μL 5 mM EDTA och avlägsna bubblorna.
- Euthanize musen med 80% CO2 /20% O2 gas inandning och fortsätt omedelbart till nästa steg.
Anmärkning: ett alternativ till CO2 inhalations metod är isofluran anestesi (3 Vol% isofluran och syre (bärgas) vid flödet av 600 ml/min) följt av cervikal dislokering, eller överdosering injektion av Ketamin/xylazin lösning. Specifik eutanasi-metod kan variera beroende på godkänt mus protokoll. - Bekräfta djurets död genom avsaknad av andnings aktivitet, saknade horn hinnan reflex, och urinering utan yttre stimuli.
- Utför en hjärt punktering genom att försiktigt införa nålen på den förladdade EDTA-sprutan med 30 ° vinkel in i bröst korgen från bröst benet mot hjärtat.
Anmärkning: för oerfarna experimenterare, det rekommenderas att öppna bröst hålan först, innan du utför hjärt punktering, för att bättre visualisera hjärtat. - Hämta upp till 1 mL blod. Utan att släppa kolven, dra ut sprutan från djur bröstet, säkert ta bort nålen, öppna locket på 2 mL EDTA blod insamlings röret och Dispensera blodet direkt inuti. Stäng locket och vänd röret 10x.
- Inkubera de blodhaltiga rören under en kort tids period (upp till 1 h) vid RT på en gungande shaker vid 40 osc/min.
Varning: nålen måste kasseras i skarp-säker biologisk riskhantering.
Obs: flera punkteringar är möjliga att öka den totala blod volymen. Använd separata sprutor förladdade med EDTA för olika återtar för att undvika aspirering clotted blod närvarande i föregående nål. - Berika för enkel ctcs och CTC kluster med ctcs isolering metod val21,22,23,25. Släpp CTCs i en 1x DPBS lösning.
Obs: beroende på vald CTC-anriknings teknik kan kvarvarande vita blod kroppar och röda blod kroppar förekomma. Justera frisläppnings trycket för att bevara CTC-klusterstrukturerna. - Fortsätt omedelbart till nästa steg i avsnitt 3.
Anmärkning: för alla följande procedurer, se till att ofixerade och nyligen isolerade blod används.
3. CTCs levande immunofärgning
- Centrifugera CTC-berikad cell SUS pension vid 72 x g i 4 min.
Anmärkning: 72 x g motsvarar 800 RPM om rotorn har en diameter på 100 mm. omvandla g-kraftens nummer enligt rotorn. - Resuspendera försiktigt pelleten i 1% BSA-lösning i 1x DPBS och tillsätt 2 μg/mL anti-human EpCAM-AF488 anti kropp och 1 μg/mL anti-human CD45-BV605-antikropp eller 2 μg/mL anti-mus CD45-BV605 anti kropp i en total volym på 500 μL.
Anmärkning: för bröst Cancer patient-derived CTCs, anti-humana EGFR-FITC, och anti-human HER2-AF488 kan läggas dessutom till anti-EpCAM och anti-CD45. Detta gör det möjligt att bättre identifiera de CTCs som uttrycker lägre EpCAM nivåer. - Inkubera i 30 min vid RT och skydda från ljus.
- Tvätta CTCs SUS pension med 1 mL 1% BSA i 1x DPBS lösning och centrifugering vid 72 x g för 4 min. Upprepa denna tvätt två gånger.
- Omsuspendera färgade celler i 2 mL 1% BSA i 1x DPBS lösning och överföra den totala volymen i 1 brunn av en 6-brunnar ultra-låg fästplatta.
- Inkubera plattan för 10-15 min vid 4 ° c skyddad från ljus för att möjliggöra sedimentering av CTCs och kvarvarande blod kroppar.
4. micromanipulation av CTCs och Single-cell plockning
Obs: innan du börjar bör du vara medveten om att mikromanipulatorn kräver upp till 45 min för fullständig uppsättning. När det är konfigurerat kräver proceduren för CTC-identifiering och mikromanipulation upp till 2 minuter per cell (eller kluster).
- Se till att avsluta CTC-plockningsproceduren inom 2 h från slutet av färgningen.
- Starta upp micromanipulator program vara och slå på micromanipulator. Anslut micromanipulator till datorn och initiera robotarm samt Mikroskop scenen genom att trycka på Connect -knappen följt av int enhet.
- Stäng skydds skåpet efter varje manipulering av maskinen för att kunna manövrera den genom datorn.
- Rengör ytorna från damm och spill genom att spraya etanol och torka av skåpets invändiga ytor. En ren miljö kommer att säkerställa steriliteten i processen.
- Installera ett nytt glas kapillär på robotarm. För Single-cell plockning, Använd 20-30 μm kapillär medan 30-50 μm är att föredra för CTC kluster plockning.
- Ta bort alla bubblor som finns i slangen genom att mata ut eller aspirera på system oljan.
Varning: glas kapillär är skarp och bräcklig. Hantera med försiktighet. - Fyll steriliserings tanken 1 med 70% etanol, steriliserings tanken 2 med steril nuclease-fri H2O och bufferttanken med sterila 1x dpbs.
Varning: Stäng inte locken på tankarna, eftersom under nästa steg kapillär måste fritt komma åt tankarna. - Sterilisera kapillära två gånger med 70% etanol.
- Byt ut steriliserings tanken 1 med tank 2 och tvätta kapillär i H2O minst tre gånger med hjälp av steriliserings funktionen.
- Med hjälp av micromanipulator program vara, starta ett nytt experiment och Välj typ av plockning experiment mellan automatisk och manuell val lägen.
Obs: Välj typ av experiment baserat på punkten av manipulation. Manuellt läge gör det möjligt att manövrera en robotarm efter att kapillärarmen går in i cell SUS pensionen. Detta steg är nödvändigt för dissociation av CTC-kluster i enskilda celler. Det är möjligt att ändra typ av plockning under experimentet. - Ställ in däckets magasin som anger positionen för steriliserings tanken (vätska 1), bufferttank (vätska 2) och deponerings bricka (mål 1 eller 2). Mål 1 gör det möjligt att deponera i plattor, mål 2 gör det möjligt att deponera i PCR-rör eller PCR-plattor.
- Ställ in temperaturen på vätske tankarna och deponera brickan som valts till 4 ° c.
Obs: plocknings processen kan vara tids krävande. Kylning av vätske tankarna och deponerings brickan rekommenderas därför - Placera den extremt låga fästplattan som innehåller den släppta CTCs-lösningen under mikroskopet inuti mikromanipulatorskåpet. Ta bort locket från plattan och stäng skåpet. Förvara plattan vid RT för resten av uppsättningen och under Plock proceduren.
- Välj manuellt Mikroskop målet för plockning (10-20x) och exponerings tiden för alla nödvändiga kanaler (Brightfield, FITC, och TRITC-kanaler).
- Välj Visa väl Navigator från verktygsfältet för att visualisera och välja typ av pickup plattan (6-well tallrik).
Anmärkning: alla plåtar eller väl format kan installeras av tillverkaren endast. - Kalibrera upphämtnings positionen i mitten av brunnen som innehåller CTCs-lösningen, men utan några celler i mitten av synfältet. Kalibrering utförd vid kanterna av brunnarna kan resultera i felaktig kalibrering på grund av ojämn brunn yta.
- Använd sensorn för att försiktigt röra vid botten av plattan med kapillär (hastighet 0,01 mm/steg och 1% hastighet).
- Ställ in upphämtnings positionen 0,05 mm ovanför plattans botten.
Obs: se till att öppna och ta bort lock av plattor och tankar innan du fortsätter. Kapillär kan bryta på ett stängt eller oborttaget lock.
Varning: om kapillär bryts vid kontakt med lock, kan krossat glas finnas i omgivningen eller i lösningarna. - Välj cell typ och Plock parametrar. Plock parametern kan ställas in och läsas in vid varje start. För enkelcellig plockning väljer du det manuella läget.
- Inom plocknings förberedelse inställningarna:
- Ställ in luft gaps volymen mellan system oljan och provet på 1 μl
- Ställ in buffertvätskans volym att ta upp före varje plockning till 0,5 μl.
Obs: Buffertvätske volymen justeras till den totala maximala pickup-volymen. Små volymer påverkar inte Plock-eller deponerings effektiviteten. - Ställ in hastigheten för aspiration av buffertvätskan mellan 1-6%.
- Ställ in vänte tiden efter aspiration av bufferten till 1 s.
Anmärkning: möjligheten att ta upp bufferten från mål väl i stället för buffert flytande tank kan användas om det behövs - Ställ in att återanvända glas kapillärer och ingen sterilisering mellan plockar.
Anmärkning: sterilisering mellan plockningar kan utföras manuellt om det behövs. Utför flera tvättar i H2o mellan plockar eller två sterilisering i etanol följt av flera tvättar i h2o.
- Inom Plock inställningar:
- Ändra kamerans inställningar medan plockning och exponerings tid under Mikroskop till 7 500 μs.
- Välj fast Plock höjd.
Obs: verktygs sensorn eller autofokus kan väljas i stället. Dock kan små brister på plattan störa känsligheten hos sensorn eller autofokus som kan orsaka en påverkan av kapillär i plattan. - Ställ aspirationshastighet av kapillär in i käll plattan till 7-15%.
- Aktivera interaktiv plockning.
- Ställ in aspirationvolymen i μl till 0-0,05.
- Ställ in hastigheten för aspiration till 5%.
- Ställ in vänte tiden efter aspiration i s till 0-1.
- Ställ in antalet plockade partiklar per kapillär till 1.
- Ställ ingen multipel plockning på samma position och inga skrapnings funktioner. Aspirationsegenskaper måste ställas in efter typ av experiment (t. ex. kan automatiskt Plock läge kräva större ambitions volymer).
- Inom insättnings inställningarna:
Obs: deponerings inställningarna beror helt på den deponerande plattan/röret.- För Single-cell plockning, definiera hastigheten på kapillär in i mål plattan till 25%.
- Ställ in hastigheten för dispensering till 6%.
- Ställ in vänte tiden efter dispensering i s till 0.
- Ställ in mängden luft spalt dispenseras i målet väl till 100%.
- Ställ ingen sköljning efter insättning.
Anmärkning: sterilisering kan utföras efter insättning för att rengöra kapillär. - Ange maximal mängd partiklar deposition per brunn och antalet mål att fördela partiklar till 1.
- Kalibrera insättnings höjden på position a1 för mål 1 för plåtar eller på position a1 i mål 2 för rör. Placera ett öppet rör eller plåt utan lock för kalibreringen och Använd sensorn för att försiktigt röra vid deponerings brunnen (hastighet 0,01 mm/steg och 1% hastighet). Ställ in insättnings höjden 1 mm över botten av plattan.
- Inom inställningarna:
- Ställ in scenens hastighet under plockning till 5-10%.
Obs: snabba rörelser av plattan kan resultera i förflyttning av celler i SUS pension och svårigheter i flera cell plockning på grund av mispositioning. - Ställ in steriliserings egenskaper med sköljvolym till 1 μl, 3 sköljslingor och 2 s vänte tid per steriliserings runda.
- Tillämpa ändringarna innan du stänger.
- Ställ in scenens hastighet under plockning till 5-10%.
- Navigera glaset kapillär med hjälp av joysticken i brunnen och placera den ovanpå den enda cell av intresse. Välj att plocka upp positioner på ett säkert avstånd från brunnen gränsen (1 mm) som kapillär kan bryta på kanten av brunnen.
- Manuellt lägga till partiklar med hjälp av knappen på joysticken eller manuellt välja från menyn.
- Välj plocka aktiverade partiklar för att starta plockningen.
- Kapillär kommer att stoppa 0,05 mm över botten av plattan och ovanpå den valda pickup position på grund av den interaktiva plockning (manuellt läge). Vrid försiktigt vredet på joysticken medurs för att manuellt aspirera på partikeln och den omgivande DPBS-lösningen. Den maximala volymen är inte fast när det manuella läget är på. Den maximala volym som tillåts i sprutan kommer dock att vara 25 μL.
- Dispensera överflödig DPBS lösning eller oönskade partiklar genom att försiktigt vrida ratten på joysticken moturs. För mycket dispensering kommer att frigöra luft gapet i sprutan bildar bubblor i din lösning och kompromissa synlighet.
- Tryck på Next för att fortsätta med insättningen.
- Observera kapillär in den deponerande PCR-röret eller PCR-plattan, frigöra volymen och gå tillbaka till start positionen med en tom kapillär.
Anmärkning: om det finns volym kvar i kapillär, Fortsätt med sterilisering. Sedan, åter kontrol lera inställningarna, olje nivån, och oljans höjd innan du utför en ny plockning. - Fortsätt från punkt 26 i avsnitt 4 för att starta en ny encellig plockning. Under plockning kan det vara nödvändigt att ersätta kapillär. Efter installationen måste en ny kalibrering av upphämtnings positionen utföras. I slutet av kalibreringen väljer du funktionen tillämpa kalibrerade ändringar i Z-höjd för att sätta in höjden för att korrigera insättnings höjden till den nya kapillärkalibreringen och för att hoppa över insättnings Höjds kalibreringen (avsnitt 4,16).
Anmärkning: stegen som beskrivs i avsnitt 1-4 gäller för de flesta av CTCs beriknings-och isolerings metoder. Här rapporterar vi valfria steg för specifika CTCs-analys.
5. Single-cell plockning och seedning för överlevnad och spridning analys
- Se till att arbeta med aseptiska lösningar och material för att upprätthålla sterilitet under hela proceduren.
- Förbered en 384-platta för att innehålla de plockade enstaka CTCs för odling med 20 μL CTC-odlings medium31. Se till att CTC är seedade i små volymer av mediet efter manipulation (t. ex. 10-20 μL för en 384 brunn platta).
- Snurra ner lösningen till botten av plattan. Placera 384 väl plattan i mål 1 och Behåll vid 4 ° c.
- Utför alla steg med mikromanipulatorn som beskrivs i avsnitt 4 för att ställa in mikromanipulatorn och starta en ny plockning.
Anmärkning: flera val av enstaka celler kommer att orsaka bildandet av en Plock lista. Partiklarna kommer att plockas och deponeras en efter en i på varandra följande brunnar (se avsnitt 4.22.6). Men det interaktiva läget (manuellt läge) kommer att stoppa kapillär precis innan aspiration, därför gör det möjligt för försöks ledaren att kontrol lera detta kritiska steg och för att säkerställa lyckad plockning. Snabba rörelser av plattan kan resultera i förflyttning av cellerna i SUS pension och svårigheter i flera cell plockning. - Efter insättningen upprepar du steg 4 för att starta en ny plockning.
- Vid slutet av plockningen Centrifugera plattan vid 72 x g i 4 min för att säkerställa att de plockade cellerna placeras längst ner i brunnen.
6. CTC kluster brytning och encellig plockning för sekvensering
- Se till att arbeta med aseptiska lösningar och material för att bibehålla steriliteten under hela proceduren.
- Förbered enkla PCR-rör eller en PCR-platta som kommer att innehålla de enskilda cellerna i det trasiga klustret med den totala 2,5 μL-celllysing-lösning som består av 1 U/μL RNA-hämmare.
- Snurra snabbt ner lösningen till botten av röret. Placera deponerings behållarna i mål 2 och Behåll vid 4 ° c.
- Utför alla steg som beskrivs i avsnitt 4 med micromanipulatorn för att ställa in mikromanipulatorn.
- Starta en ny plockning. Kapillär kommer att stoppa 0,05 mm över botten av plattan och ovanpå den valda CTC-kluster på grund av den interaktiva plockning (manuellt läge).
- Vrid försiktigt vredet på joysticken medurs för att manuellt aspirera på klustret och den omgivande DPBS-lösningen. Dispensera den aspirade volymen inklusive CTC-kluster genom att försiktigt vrida joystickens vred moturs.
- Upprepa aspirationen/bortskaffandet av CTC-klustret som beskrivs i steg 6 tills de enskilda cellerna som bildar klustret bryts sönder.
Obs: för mycket dispensering kommer att frigöra luft gapet i sprutan bildar bubblor i din lösning och kompromissa synlighet. - Följ med ögat positionen för de enskilda cellerna. Manuellt lägga till partiklarna med hjälp av knappen på joysticken eller manuellt välja från menyn.
Anmärkning: flera val av enstaka celler kommer att orsaka bildandet av en Plock lista. Partiklarna kommer att plockas och deponeras en efter en i konsekutiva PCR-rör/brunnar (se avsnitt 4.22.6). Men det interaktiva läget (manuellt läge) kommer att stoppa kapillär precis innan aspiration, därför gör det möjligt för försöks ledaren att kontrol lera detta kritiska steg och för att säkerställa lyckad plockning. - Välj plocka aktiverade partiklar för att starta plockningen.
Obs: mängden cell lyseringslösning lösning kommer att tillåta en enda cell för att helt lyse. Långvarig exponering av det lyserade innehållet i lyseringslösning-medlet kan dock försämra DNA eller mRNA. Fortsätt därför direkt till nästa steg. - Stäng omedelbart röret som innehåller den plockade singelcellen och överför på torris för snäppfrysning.
- Snurra snabbt röret och kontrol lera frånvaron av droppar på sidorna av röret för att säkerställa en ordentlig lysera av den deponerade cellen.
- Upprepa från steg 5 för att starta en ny plockning.
Anmärkning: Mikroskop stadiet kommer att flytta från en tillagd partikel till en annan med den hastighet som beskrivs i avsnitt 4.23.1. CTCs SUS pension i ultra-low fästplattan kan flytta, orsakar felaktig plockning på grund av mispositioning.
7. CTCs isolering för mus insprutning
- Se till att arbeta med aseptiska lösningar och material för att upprätthålla sterilitet under hela proceduren.
- Förbered ett PCR-rör med 5 μL sterilt 1x DPBS.
- Snurra snabbt ner lösningen till botten av röret. Placera deponerings behållarna i mål 2 och Behåll vid 4 ° c.
- Inom insättnings inställningarna tillämpas en förändring i steg 4.22.6: Ställ in den maximala mängden partiklar insättning per brunn till 1 000 och antalet mål att fördela partiklar till 1. Detta steg säkerställer att de plockade cellerna kommer att deponeras i samma slang för 1 000 gånger.
- Använd endast det interaktiva läget (manuellt läge) för att exakt styra Plock steget och hålla den plockade lösningen fri från kontaminerande celler.
Obs: om mer än 1 000 celler behövs, öka antalet mål för att fördela partiklar för att undvika förlust av provet efter 1 000 celler. - Fortsätt stegen i avsnitt 4,26 för att starta en ny plockning. Upprepa steg 6 för att utföra flera pickings. Anteckna antalet celler som samlats in vid varje plockning för att hålla reda på antalet celler som är tillgängliga för mus injektionen.
- Centrifugera röret vid slutet av plockningen vid 72 x g i 4 min (se avsnitt 3,1.) och aspirera supernatant.
- Omsuspendera insamlade CTCs i bufferten för val, lämplig för mus insprutning. För bröst fett pad injektion, omsuspendera insamlade CTCs i en 1 till 1 förhållande av 1x DPBS och rekonstituerad källare membran extraherade, och hålla vid 4 ° c tills injektionen. För intravenös injektion, omsuspendera insamlade CTCs endast i DPBS.
Obs: lösningens volym beror helt på hur många CTCs som kommer att injiceras. Det rekommenderas att injicera i bröst fett pad eller intravenöst högst 100 μL per mus. Vid beräkning av volymen, alltid överväga den döda volymen för manipulation och sprutlastning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det presenterade arbets flödet gör det möjligt att förbereda enskilda CTP: er, antingen från enstaka CTCs eller separerade från CTC-kluster. CTCs från patienter eller tumör bär ande möss är berikade från helblod med tillgängliga CTC-beriknings metoder och sedan färgas med anti kroppar mot cancerassocierade markörer (t. ex. EpCAM, grön) och WBC-specifika markörer (t. ex. CD45, röd) (figur 1a ). Den färgade CTC-produkten överförs sedan till mikromanipuleringsstationen där enskilda celler plockas, deponeras i PCR-rör eller multispot-plattor och bereds för analys nedströms, inklusive encellig sekvensering, in vitro -odling eller in vivo -analyser (figur 1b).
Tillförlitligheten av denna metod är baserad på en ordentlig mål-cell distinktion under manuell cell plockning. Levande immunofärgning med anti-EpCAM anti kroppar visualiserar cancer celler i SUS pensionen och möjliggör en noggrann åtskillnad från CD45-positiva händelser (troligen, WBCs) (figur 2A). När den är korrekt kalibrerad och underhålls ger CellCelector välkontrollerad cell manipulation. Exakt CTC-isolering kännetecknas av aspiration av endast det önskade målet utan omgivande kontaminerande celler (RBCs eller WBCs), som visas på bilderna tagna före och efter CTC-klustrets aspiration (figur 2b, C).
Som tidigare beskrivits visar CTC-kluster en mer metastaserad fenotyp jämfört med matchade enstaka CTCs19. Men om närvaron av angränsande celler är tillräcklig för att öka spridningen av celler i kluster är okänd. För att ta itu med denna fråga 1009 en CTC-och 1008 CTC-kluster som varierade mellan 2-17 celler (med 89,5% av dem är 2-5 cell kluster) som härrör från CTC-härledd BR16 cell rad20 var mikromanipulerade i enskilda brunnar av 384-well extra låga fästplåtar. Antalet levande celler i varje brunn räknades manuellt under Mikroskop och registreras varje vecka. Alla analyser utfördes efter normalisering av cell nummer (d.v.s. trecellsklustret analyserades som tre enskilda celler). Misslyckade kolonier präglades av bristen på levande celler i brunnen i slutet av experimentet. Som misstänkt uppvisade CTC-kluster ökad överlevnad jämfört med enstaka CTC och gav upphov till cellkolonier inom 56 dagar efter in vitro -odling (figur 3a, 3b). I synnerhet visade CTC-kluster också högre spridnings frekvens och nådde därmed högre slutliga cell nummer (figur 3c), vilket tyder på att direkt kontakt med andra tumör celler påverkar både deras livs kraft och spridnings frekvens.
Slutligen tillhandahåller vi encellig RNA-sekvenseringdata för CTCs som är direkt isolerade från bröst cancer patienter. I synnerhet visar vi en t-distribuerad Stochastic Neighbor inbäddning (tSNE) av enstaka celler som härrör från antingen enstaka CTCs, CTC-kluster eller CTC-WBC-kluster (figur 4). Detta tillvägagångs sätt gör det möjligt att identifiera celler med liknande gen uttrycks profil, liksom skillnaden mellan cell populationer som skiljer sig åt beroende på uttrycket av särskilda gener.
Figur 1 . Schematisk representation av det experimentella arbets flödet. (A) ctcs erhålls från blod av cancer patienter eller mus cancer modeller, berikad med tillgängliga metoder och märkta med anti kroppar för att diskriminera tumör celler (grön) från vita blod kroppar (röd). (B) exakt mikromanipulering av ctcs underlättar flera förfaranden och tillämpningar, t. ex. encellig SEKVENSERING, CTC-kultur eller in vivo -transplantations experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Representativa bilder av CTCs före och efter micromanipulation. (A) representativa bilder av ctcs härledda från en CTC-derived xenograft (NSG-cdx-BR16) och färgas med anti kroppar mot epcam (grön) och anti-CD45 (röd) för att möjliggöra visualisering av ctcs och vita blod kroppar, respektive. Förstoring 40x visas. (B, C) Micromanipulation möjliggör exakt separation av CTCs från oönskade celler som visas i bilderna före (vänster) och efter (höger) cell-aspiration förfarande. Förstoring 10x. Det större synfält (B) och smalare synfält (C) visas respektive. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Överlevnads-och spridnings analys av enstaka CTCs-och CTC-kluster. Enskilda celler från enstaka CTCs eller CTC-kluster från odlade CTC-härledda BR16 celler var micromanipulated i 384-well plattor. (A) Kaplan-Meier-kurva som visar överlevnads sannolikheten för seedade enstaka celler kontra cell kluster. P< 0,0001 med Pairwise log-Rank Test. (B) stapeldiagram som representerar andelen kolonier som bestod av levande celler i slutet av försöket (dag 56). P< 0,0001 av Chi-square test. (C) heatmaps visualisera normaliserade cell nummer fördelning under loppet av experimentet (dag 0, 8, 32, 56). Varje block representerar en start cell och heatmap visar antalet celler per brunn vid en given tidpunkt. d = dag. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Encellig RNA-sekvensering. Visualisering av CTC RNA-uttrycksdata med t-distribuerad stokastisk granne inbäddning (tSNE). Varje punkt representerar en enda cell som härleds från en enda CTC, ett CTC-kluster eller ett CTC-WBC-kluster. Färgerna på prickarna motsvarar givar-ID: t. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den molekyl ära karakteriseringen av CTCs har löftet att förbättra vår förståelse av metastatisk process och vägleda utvecklingen av nya anti-metastasis terapier. Här ger vi en detaljerad beskrivning av de protokoll som möjliggör CTC-mikromanipulation och nedströms analys, inklusive både enkelcellsbaserade funktionella analyser, gen uttrycks analys och in vivo -transplantation för metastatisk potential bedömning20.
Bland de mest kritiska stegen i vårt protokoll, mikromanipulation av CTC-berikade produkter syftar till att få en enda cell upplösning från relativt heterogena cell SUS pensioner, dvs gör det möjligt att nå de högsta renhets grader och förbättra kvaliteten på efterföljande funktionella eller molekyl ära analyser. Till exempel har encellig plockning av CTC gjort det möjligt för oss och andra att undersöka CTC-heterogenitet (t. ex. skillnader mellan enskilda CTC-grupper, CTC-kluster och CTC-WBC-kluster), både ur molekylär synvinkel och utifrån perspektivet att kunna bedöma förmåga att initiera metastaser. Även om vi i allmänhet gynna cell Plock protokoll som gör det möjligt för försöks ledaren att manuellt isolera CTCs (dvs. möjliggör en högre grad av flexibilitet beroende på egenskaperna hos enskilda mål), är automatiserade lösningar nu tillgängliga för att under lätta cell plockning och påskynda CTC-isoleringsprocessen i välkontrollerade experiment.
När man överväger encellig mikromanipulation i samband med CTC-analys är tiden en mycket kritisk begränsande faktor. Eftersom vårt protokoll är tänkt att föras på levande celler, är det absolut nödvändigt att gå så snabbt som möjligt för att minimera förändringar på grund av ex vivo miljö, såsom uppreglering eller nedreglering av gener som är kontext beroende. Jämfört med de befintliga teknikerna för CTC-analys erbjuder encellig mikromanipulation av levande ctcs större flexibilitet för nedströmsanalysen av val, allt från encellig sekvensering till direkta funktionella analyser.
I detta manuskript ger vi också nya data som belyser viktiga skillnader mellan enstaka och klustrade CTCs genom micromanipulating och seedar mer än tusen enstaka CTCs eller CTC-kluster (med en klart definierad storlek) från en CTC-härledd cellinjen i enskilda brunnar av en mikrotiterplatta. För det första, vi noterar att CTC-kluster (dvs närvaron av angränsande celler) är tillräckliga för att uppnå bättre överlevnad av seedade celler, stödja våra in vivo data tyder på lägre apoptotiska frekvenser av CTC-kluster vid seedning på en avlägsen plats 19. vidare, även vid normalisering för antalet seedade celler, cancer celler odlas som kluster uppvisar mycket högre spridnings tal, ytterligare förstärka konceptet att klustrade CTCs är mycket effektiva metastaser bidrags givare.
Tillsammans presenterar vi specifika protokoll för CTC-analys i syfte att främja enskilda cellrelaterade undersökningar inom CTC-området. I framtiden räknar vi med att dessa protokoll kan vara användbara för CTC-relaterade utredningar, som syftar till en bättre förståelse av den biologi som kännetecknar blodburna metastaser i olika cancer typer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
N.A. och B.M.S. är listade som uppfinnare i patent ansökningar som relaterar till cirkulerande tumör celler och behandling av cancer. N.A. är en betald konsult för läkemedels-och försäkrings bolag med ett intresse för flytande biopsi.
Acknowledgments
Vi tackar alla patienter som donerade blod till vår studie, liksom alla involverade kliniker och studie sköterskor. Vi tackar Jens Eberhardt, Uwe Birke och Dr. Katharina Uhlig från ALS Automated Lab Solutions GmbH för kontinuerligt stöd. Vi tackar alla medlemmar i Aceto-labbet för feedback och diskussioner. Forskningen i Aceto-labbet stöds av europeiska forsknings rådet, Europeiska unionen, schweiziska National Science Foundation, schweiziska cancer förbundet, Basel cancer League, de två kantonerna i Basel genom ETH Zürich och universitetet i Basel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
| 1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
| 6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
| Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
| Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
| Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
| BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
| Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
| CellD software | ALS | version 3.0 | |
| Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
| Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
| PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
| SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |
References
- Talmadge, J. E., Fidler, I. J. AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective. Cancer Research. 70 (14), 5649-5669 (2010).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Trends in Cancer. 1 (1), 44-52 (2015).
- Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review). International Journal of Oncology. 49 (6), 2206-2216 (2016).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Review Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Pantel, K., Speicher, M. R. The biology of circulating tumor cells. Oncogene. 35 (10), 1216-1224 (2016).
- Hou, J. M., et al. Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (5), 525-532 (2012).
- Long, E., et al. High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness. Cancer Medicine. 5 (6), 1022-1030 (2016).
- Wang, C., et al. Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (1), 83-94 (2017).
- Mu, Z., et al. Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 154 (3), 563-571 (2015).
- Zhang, D., et al. Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy. Cancer Cell International. 17, 6 (2017).
- Zheng, X., et al. Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer. Translational Oncology. 10 (3), 431-441 (2017).
- Chang, M. C., et al. Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clinical Chemistry. 62 (3), 505-513 (2016).
- Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
- Cheung, K. J., et al. Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (7), E854-E863 (2016).
- Giuliano, M., et al. Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize. Cancer Research. 78 (4), 845-852 (2018).
- Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11, 33 (2016).
- Gkountela, S., et al. Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding. Cell. 176 (1-2), 98-112 (2019).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. , (2019).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment? Cancer Treatment Reviews. 41 (2), 144-150 (2015).
- Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nature Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10 (9), e0138032 (2015).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Science Translational Medicine. 5 (179), 179ra147 (2013).
- Went, P. T., et al. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas. Human Pathology. 35 (1), 122-128 (2004).
- Soysal, S. D., et al. EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer. British Journal of Cancer. 108 (7), 1480-1487 (2013).
- Yu, M., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
- Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
- Zheng, S., et al. Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells. Journal of Chromatography A. 1162 (2), 154-161 (2007).
- Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
