Summary
Aquí, presentamos un flujo de trabajo integrado para identificar rasgos fenotíricos y moleculares que caracterizan las células tumorales circulantes (CTCs). Combinamos la inmunostalización en vivo y la micromanipulación robótica de los CTCs individuales y agrupados con técnicas basadas en una célula para el análisis y la evaluación de la capacidad de la metastasis-siembra.
Abstract
La metástasis transmitida por la sangre representa la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer e involucra células tumorales circulantes (CTCs) que tienen éxito en el establecimiento de nuevos tumores en sitios distantes. Los CTCs se encuentran en el torrente sanguíneo de los pacientes como células individuales (CTCs individuales) o como agregados multicelulares (clusters CTC y cúmulos de glóbulos blancos), con este último mostrando una mayor capacidad metastásica. Más allá de la enumeración, el análisis fenotírico y molecular es extraordinariamente importante para diseccionar la biología CTC y para identificar vulnerabilidades accionables. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de un flujo de trabajo que incluye inmunostinalización CTC y micromanipulación, cultura ex vivo para evaluar las capacidades proliferativas y de supervivencia de las células individuales, y los ensayos de formación de metástasis in vivo . Adicionalmente, proporcionamos un protocolo para lograr la disociación de los clústeres CTC en células individuales y la investigación de la heterogeneidad intra-cluster. Con estos enfoques, por ejemplo, cuantificamos con precisión la supervivencia y el potencial proliferativo de los CTCs únicos y las células individuales dentro de los clústeres CTC, lo que nos lleva a la observación de que las células dentro de los clústeres muestran una mejor supervivencia y proliferación en ex vivo en comparación con los únicos CTCS. en general, nuestro flujo de trabajo ofrece una plataforma para diseccionar las características de los CTCS a nivel de célula única, con el objetivo de identificar vías relevantes para la metástasis y una mejor comprensión de la biología CTC.
Introduction
La manifestación clínica de la metástasis en órganos distantes representa la etapa final de la progresión del cáncer y supone más del 90% de las muertes relacionadas con el cáncer1. La transición de la enfermedad localizada a la metastásica es un proceso de varios pasos, a menudo mediado por células tumorales circulantes (CTCS)2,3,4. Estas células son derramadas del tumor primario en la circulación sanguínea y son transportadas a órganos distantes, donde pueden extravasar y establecer lesiones metastásicas5,6. Aunque los tumores sólidos pueden liberar un número relativamente alto de CTCs, la mayoría de los CTCs están destinados a morir, debido a las altas fuerzas de cizallamiento en circulación, la muerte celular mediada por anoikis, el ataque inmune o capacidades limitadas para adaptarse a un microambiente externo7. Por lo tanto, es fundamental establecer herramientas que permitan la disección de las características moleculares de los CTCs que están dotados de capacidad de propagación de metástasis. Estudios preclínicos y clínicos recientes sugieren que la presencia y la cantidad de los grupos de CTCS y CTC individuales se asocia con un resultado peor en pacientes con varios tipos de tumores sólidos8,9,10 , 11 , 12 , 13 , 14 . Los clusters CTC son grupos de dos o más CTCS Unidos entre sí durante la circulación y son más eficientes en la formación de metástasis en comparación con los únicos CTCS3,15,16. Las células dentro de un racimo mantienen una fuerte adherencia de las células celulares a través de los desmosomas y los cruces adherentes, lo que puede ayudar a vencer a los anoikis17,18. Recientemente, observamos que la agrupación de CTCs está ligada a la hipometilación de sitios de Unión para factores de transcripción asociados a la proliferación y a la proliferabilidad, lo que lleva a una mayor capacidad para iniciar con éxito la metástasis19. La disociación del clúster CTC da lugar a la remodelación de sitios clave de enlace y, en consecuencia, a la supresión de su potencial metastásico19. Adicionalmente a los grupos de células cancerosas, los CTCs también pueden asociarse a glóbulos blancos (con mayor frecuencia neutrófilos) para mantener altos niveles de proliferación en circulación y aumentar su capacidad metastásica20. Sin embargo, la biología de los CTCs se entiende sólo en parte y varias preguntas permanecen abiertas, incluyendo las características moleculares subyacentes y las vulnerabilidades de las células individuales y agrupadas.
En los últimos años, se han establecido varias estrategias que explotan los patrones de expresión de superficie celular, así como las propiedades físicas de los CTCs para su aislamiento21,22,23,24, 25. los métodos de aislamiento dependientes del antígeno dependen principalmente de la expresión de la superficie celular de la molécula de adhesión de células epiteliales (epcam)26. El más frecuentemente utilizado y (actualmente) la única plataforma aprobada por la FDA para la enumeración CTC, es el sistema CellSearch, que se basa en un procedimiento de dos pasos para aislar CTCs21. En el primer paso, los componentes de plasma se eliminan por centrifugación, mientras que los CTCs se capturan con ferrofluidos magnéticos acoplados a anticuerpos anti-EpCAM. En el segundo paso, la solución enriquecida con CTC se mancha para las células nucleadas (DAPI-positivas) que expresan citoqueratina (CK)8,18,19, mientras que los glóbulos blancos (WBCs) se identifican utilizando el marcador de panleucocitos CD45. Por último, las celdas capturadas se colocan en una plataforma de cribado integrada y los CTCs se identifican a través de la expresión de EpCAM, CKs y DAPI, mientras que son negativos para CD45. Aunque esto es considerado como el estándar de oro para la enumeración CTC, el análisis molecular descendente es desafiante con esta tecnología debido a las restricciones inherentes en la recuperación CTC. Adicionalmente, dado su procedimiento de aislamiento, CellSearch puede favorecer el enriquecimiento de CTCs con mayores niveles de EpCAM en comparación con los CTCs con una expresión EpCAM menor, debido, por ejemplo, a la heterogeneidad del cáncer27 o a la regulación descendente de los marcadores epiteliales 28,29. Para superar estas limitaciones, han surgido tecnologías independientes del antígeno para el enriquecimiento de los CTCs. Por ejemplo, el CTC-iChip integra la separación hidrodinámica de las células nucleadas, incluidos los CTCs y los glóbulos blancos de los componentes sanguíneos restantes, seguidos de un agotamiento inmunomagnético de los glóbulos blancos etiquetados con anticuerpos, lo que permite la purificación de CTCs no etiquetados y viables en solución25. Además, el hecho de que la mayoría de los CTCS son ligeramente más grandes que los glóbulos rojos (RBCs) o WBCs condujo al desarrollo de tecnologías de enriquecimiento CTC basadas en el tamaño23,30 (por ejemplo, el sistema parsortix (ángulo)) que hace uso de un tecnología basada en microfluidos, que comprende un canal de estrechamiento a través del cassette de separación, que lleva a las células a una brecha terminal de 10, 8, 6,5 o 4,5 μm (diferentes tamaños están disponibles dependiendo del diámetro esperado de las células cancerosas de destino). La mayoría de las células sanguíneas pasan a través de la estrecha brecha, mientras que los CTCs quedan atrapados debido a su tamaño (pero también debido a su menor deformabilidad) y, por lo tanto, se retienen en el cassette. Revertir la dirección del flujo permite la liberación de los CTCs capturados, que están en un Estado viable y adecuados para el análisis descendente. Sin embargo, independientemente del protocolo elegido para el aislamiento de CTC, los procedimientos típicos de post-enriquecimiento todavía producen CTCs que se mezclan con un número relativamente pequeño de glóbulos rojos y glóbulos blancos, lo que hace que el análisis de los CTCs puros o masivos sean un desafío. Para abordar este problema, establecimos un flujo de trabajo que permite la manipulación CTC sin sesgo potencial introducido por los contaminantes de las células sanguíneas. La adición de inmunostato previo, con combinaciones de anticuerpos variables, distingue los CTCs de las células sanguíneas e incluso permite identificar subgrupos CTC con perfiles de expresión de marcadores de superficie distintos. Este procedimiento altamente personalizable puede combinarse más adelante con aplicaciones derivadas específicas.
Aquí, describimos un flujo de trabajo que comienza desde un producto enriquecido CTC (obtenido con cualquier tecnología de enriquecimiento CTC de elección) y combina varios enfoques para obtener información sobre la biología CTC en la resolución de una sola célula. En pocas palabras, nuestro flujo de trabajo permite la identificación de los CTCs únicos, los clústeres CTC y los clústeres CTC-WBC por inmunostenación en vivo, seguidos por la micromanipulación de una sola célula y el análisis descendente utilizando protocolos de cultivo ex vivo , célula única secuenciación, y los ensayos de metástasis in vivo .
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Protocol
Todos los procedimientos que implican muestras de sangre de los pacientes se realizaron al consentimiento informado firmado de los participantes. Los procedimientos se ejecutan según los protocolos EKNZ BASEC 2016-00067 y EK 321/10, aprobados por la Junta de revisión ética e institucional (Comité ético noroeste/centro de Suiza [EKNZ]), y en cumplimiento de la declaración de Helsinki.
Todos los procedimientos relativos a los animales se realizaron de conformidad con las directrices institucionales y cantonales (Protocolo aprobado del ratón #2781, Oficina veterinaria cantonal de Basilea-Ciudad).
1. preparación de la muestra del paciente
- Antes de empezar, asegúrese de trabajar con soluciones asépticas y materiales para mantener la esterilidad durante todo el procedimiento.
- Retirar 7,5 mL de sangre periférica de un paciente con cáncer de mama en un tubo de recolección de sangre EDTA de 10 mL.
- Incubar los tubos que contienen sangre durante un corto período de tiempo (hasta 1 h) a temperatura ambiente (RT) en un agitador a 40 oscilación por minuto (OSC/min).
- Enriquecer para los clústeres únicos de CTCS y CTC utilizando un método de aislamiento CTC de la opción21,22,23,25. Libere CTCs en una solución 1x DPBS.
Nota: dependiendo de la tecnología de enriquecimiento CTC elegida, los glóbulos blancos restantes y los glóbulos rojos podrían estar presentes. Ajuste la presión de liberación para preservar las estructuras del cluster CTC. - Proceda inmediatamente al siguiente paso de la sección 3.
2. preparación de la muestra del ratón
- Antes de comenzar, prepare una jeringa de insulina de 1 mL con una aguja de 25G, una solución filtrada de EDTA de 5 mM y tubos de recolección de sangre EDTA de 2 mL.
- Asegúrese de trabajar con soluciones y materiales asépticos para mantener la esterilidad durante todo el procedimiento.
- Lave previamente la jeringa con una solución EDTA de 5 mM.
- Cargue la jeringa con 100 μL de EDTA de 5 mM y extraiga las burbujas.
- Eutanasia el ratón usando 80% CO2 /20% O2 gas inhalación y proceder inmediatamente al siguiente paso.
Nota: una alternativa al método de inhalación de CO2 es la anestesia isoflurana (3 vol% isoflurano y oxígeno (gas portador) a la velocidad de flujo de 600 ml/min) seguida de dislocación cervical, o inyección de sobredosis de solución de ketamina/xilazina. El método específico de eutanasia puede variar dependiendo del Protocolo de ratón aprobado. - Confirme la muerte del animal por la ausencia de actividad respiratoria, el reflejo corneal que falta y la micción sin estímulos externos.
- Realizar una punción cardíaca introduciendo cuidadosamente la aguja de la jeringa precargada EDTA con un ángulo de 30 ° en el tórax desde el esternón hacia el corazón.
Nota: para experimentadores inexpertos, se recomienda abrir primero la cavidad torácica, antes de realizar la punción cardíaca, para visualizar mejor el corazón. - Recuperar hasta 1 mL de sangre. Sin soltar el émbolo, extraiga la jeringa del cofre de animales, retire la aguja de forma segura, abra la tapa del tubo de recolección de sangre EDTA de 2 mL y dispense la sangre directamente dentro. Cierre la tapa e invierta el tubo 10X.
- Incubar los tubos que contienen sangre durante un corto período de tiempo (hasta 1 h) en RT en un agitador a 40 OSC/min.
PRECAUCIÓN: la aguja debe desecharse en una eliminación de peligro biológico de seguridad aguda.
Nota: múltiples pinchazos son posibles para aumentar el volumen total de la sangre. Utilice jeringas separadas precargadas con EDTA para diferentes marchantes para evitar la aspiración de sangre coagulada presente en la aguja anterior. - Enriquecer para los clústeres únicos de CTCS y CTC utilizando el método de aislamiento de CTCS de la opción21,22,23,25. Libere CTCs en una solución 1x DPBS.
Nota: dependiendo de la tecnología de enriquecimiento CTC elegida, pueden estar presentes los glóbulos blancos y glóbulos rojos restantes. Ajuste la presión de liberación para preservar las estructuras del cluster CTC. - Proceda inmediatamente al siguiente paso de la sección 3.
Nota: para todos los procedimientos siguientes, asegúrese de que se utiliza sangre no fija y recién aislada.
3. los CTCs viven inmunostaining
- Centrifugación de suspensión de células CTC enriquecida a 72 x g durante 4 min.
Nota: 72 x g corresponde a 800 rpm si el rotor tiene un diámetro de 100 mm. convierta el número de fuerza g según el rotor. - Reresuspenda suavemente el pellet en una solución de 1% de BSA en 1x DPBS y añada 2 μg/mL de anticuerpo anti-humano EpCAM-AF488 y 1 μg/mL de anticuerpo anti-BV605 de CD45 contra humanos o 2 μg/mL anticuerpo anti-ratón CD45-BV605 en un volumen total de 500 μL.
Nota: para el cáncer de mama, los CTCs derivados del paciente, EGFR-FITC anti-humano y HER2-AF488 anti-humano pueden añadirse Adicionalmente a anti-EpCAM y anti-CD45. Esto permite identificar mejor los CTCs que expresan niveles más bajos de EpCAM. - Incubar durante 30 min en RT y protegerlo de la luz.
- Lave la suspensión de CTCs utilizando 1 mL de 1% de BSA en 1x solución DPBS y centrifugación a 72 x g durante 4 min. Repita este lavado dos veces.
- Resuspend las células manchadas en 2 mL de 1% de BSA en 1x solución DPBS y transfiera el volumen total en 1 pozo de una placa de fijación ultra baja de 6 pozos.
- Incubar la placa por 10-15 min a 4 ° c protegida de la luz para permitir la sedimentación de CTCs y células sanguíneas residuales.
4. la micromanipulación de CTCs y el picking de una sola célula
Nota: antes de comenzar, tenga en cuenta que el micromanipulador requiere hasta 45 min para una puesta a punto completa. Una vez configurado, el procedimiento para la identificación CTC y la micromanipulación requiere hasta 2 minutos por célula (o cluster).
- Aseegurese terminar el procedimiento de selección CTC dentro de 2 h del final de la mancha.
- Encienda el software de micromanipulador y encienda el micromanipulador. Conecte el micromanipulador al ordenador e inicialice el brazo robótico así como la etapa del microscopio pulsando el botón de conexión seguido por el dispositivo int.
- Cierre el gabinete de protección después de cada manipulación de la máquina para poder maniobrar a través de la computadora.
- Limpie las superficies del polvo y los derrames rociando etanol y limpiando las superficies internas del gabinete. Un ambiente limpio asegurará la esterilidad del proceso.
- Instale un nuevo capilar de vidrio en el brazo robótico. Para el picking de una sola célula, utilice 20-30 μm capilar mientras que 30-50 μm es preferible para el picking del cluster CTC.
- Retire todas las burbujas presentes en el tubo mediante la dispensación o aspiración del aceite del sistema.
PRECAUCIÓN: el capilar de vidrio es agudo y frágil. Maneje con precaución. - Llene el tanque de esterilización 1 con etanol al 70%, el tanque de esterilización 2 con H2O libre de nucleasa estéril y el tanque intermedio con 1x DPBS estéril.
PRECAUCIÓN: no cierre las tapas de los tanques, ya que durante los próximos pasos el capilar tendrá que acceder libremente a los tanques. - Esterilizar el capilar dos veces con etanol al 70%.
- Reemplace el tanque de esterilización 1 con el tanque 2 y lave el capilar en H2O al menos tres veces usando la función de esterilización.
- Con el software de micromanipulador, inicie un nuevo experimento y elija el tipo de experimento de picking entre los modos de selección automática y manual.
Nota: elija el tipo de experimento basado en el punto final de la manipulación. El modo manual permite maniobrar un brazo robótico después de que el capilar entra en la suspensión celular. Este paso es necesario para la disociación de los clusteres CTC en las células individuales. Es posible cambiar el tipo de picking durante el experimento. - Configure la bandeja de la cubierta especificando la posición del tanque de esterilización (líquido 1), el tanque de amortiguación (líquido 2) y la bandeja depositante (objetivo 1 o 2). El objetivo 1 permite depositar en placas, el objetivo 2 permite depositar en tubos de PCR o placas de PCR.
- Ajuste la temperatura de los depósitos líquidos y la bandeja depositante elegida a 4 ° c.
Nota: el proceso de picking puede llevar mucho tiempo. Por lo tanto, se aconseja el enfriamiento de los tanques líquidos y la bandeja depositante - Coloque la placa de sujeción ultrabaja que contiene la solución de CTCs liberada bajo el microscopio dentro del gabinete de micromanipulador. Retire la tapa de la placa y cierre el gabinete. Mantenga la placa en RT durante el resto de la instalación y durante el procedimiento de picking.
- Seleccione manualmente el objetivo del microscopio para picking (10-20x) y el tiempo de exposición de todos los canales necesarios (canales Brightfield, FITC y TRITC).
- Seleccione Mostrar navegador de pozo desde la barra de herramientas para visualizar y seleccionar el tipo de placa de recogida (placa de 6-Well).
Nota: cualquier placa o formato de pozo solo puede ser instalado por el fabricante. - Calibrar la posición de recogida en medio del pozo que contiene la solución de CTCs, pero sin células en el centro del campo de visión. La calibración realizada en los bordes de los pozos puede resultar en una calibración defectuosa debido a una superficie de pozo desigual.
- Utilice el sensor para tocar suavemente la parte inferior de la placa con el capilar (velocidad 0,01 mm/paso y 1% de velocidad).
- Ajuste la posición de recogida 0,05 mm por encima de la parte inferior de la placa.
Nota: Asegúrese de abrir y quitar las tapas de las placas y los tanques antes de continuar. El capilar puede romperse en una tapa cerrada o no quitada.
PRECAUCIÓN: Si el capilar se rompe al entrar en contacto con las tapas, se puede encontrar vidrio roto en el entorno o en las soluciones. - Seleccione el tipo de celda y los parámetros de picking. El parámetro de picking se puede configurar y cargar en cada inicio. Para el picking de una sola celda, seleccione el modo manual.
- Dentro de la configuración de preparación de picking :
- Fije el volumen airgap entre el aceite del sistema y la muestra a 1 μl
- Configure el volumen de líquido del búfer para que se tome antes de cada picking a 0,5 μl.
Nota: el volumen de líquido del búfer se ajusta al volumen de captación máximo total. Los volúmenes pequeños no afectan a la eficiencia de picking o depósito. - Ajuste la velocidad de aspiración del líquido tampón entre el 1-6%.
- Fije el tiempo de espera después de la aspiración del buffer a 1 s.
Nota: la opción de tomar el buffer de la blanco bien en lugar del tanque de líquido del buffer se puede utilizar si es necesario - Set para reutilizar capilares de vidrio y sin esterilización entre selecciones.
Nota: la esterilización entre selecciones se puede realizar manualmente si es necesario. Realizar múltiples lavados en H2o entre selecciones o dos esterilización en etanol seguido de múltiples lavados en h2o.
- Dentro de la configuración de picking :
- Cambie los ajustes de la cámara durante el picking y el tiempo de exposición bajo el microscopio a 7.500 μs.
- Seleccione altura de picking fija.
Nota: en su lugar, se podría elegir el sensor de herramientas o el enfoque automático. Sin embargo, pequeñas imperfecciones de la placa pueden alterar la sensibilidad del sensor o el enfoque automático que puede causar un impacto del capilar en la placa. - Ajuste la velocidad de aspiración del capilar entrando en la placa fuente a 7-15%.
- Habilite el picking interactivo.
- Fije el volumen de aspiración en μl a 0-0,05.
- Ajuste la velocidad de aspiración al 5%.
- Fije el tiempo de espera después de la aspiración en s a 0-1.
- Establezca el número de partículas seleccionadas por capilar en 1.
- No establezca ninguna selección múltiple en la misma posición y sin funciones de raspado. Las propiedades de aspiración deben establecerse según el tipo de experimento (por ejemplo, el modo de picking automático puede requerir volúmenes de aspiración más grandes).
- Dentro de los ajustes de depósito :
Nota: los ajustes de depósito dependen estrictamente de la placa/tubo depositante.- Para el picking de una sola célula, defina la velocidad del capilar entrando en la placa objetivo al 25%.
- Ajuste la velocidad de dosificación al 6%.
- Establezca el tiempo de espera después de la dispensación en s a 0.
- Establezca la cantidad de aire hueco dispensada en el pozo objetivo al 100%.
- No enjuague después de depositar.
Nota: la esterilización se puede realizar después de depositar para limpiar el capilar. - Establecer la cantidad máxima de partículas de depósito por pozo y el número de objetivos para distribuir partículas a 1.
- Calibrar la altura del depósito en la posición a1 del objetivo 1 para las placas o en la posición a1 del objetivo 2 para los tubos. Coloque un tubo abierto o una placa sin tapa para la calibración y utilice el sensor para tocar suavemente el pozo depositante (velocidad 0,01 mm/paso y 1% de velocidad). Ajuste la altura depositante 1 mm por encima de la parte inferior de la placa.
- Dentro de la configuración:
- Ajuste la velocidad del escenario durante el picking a 5-10%.
Nota: los movimientos rápidos de la placa pueden resultar en el movimiento de las células en suspensión y las dificultades en la recolección de múltiples células debido al mal posicionamiento. - Establecer propiedades de esterilización utilizando el volumen de enjuague a 1 μl, 3 bucles de enjuague y 2 s de tiempo de espera por ronda de esterilización.
- Aplique los cambios antes de cerrar.
- Ajuste la velocidad del escenario durante el picking a 5-10%.
- Navegar por el capilar de vidrio utilizando el joystick en el pozo y colocarlo en la parte superior de la célula única de interés. Elija levantar posiciones a una distancia segura del borde del pozo (1 mm), ya que el capilar puede romperse en el borde del pozo.
- Añada manualmente partículas utilizando el botón del joystick o seleccionando manualmente en el menú.
- Seleccione seleccionar partículas activadas para iniciar el picking.
- El capilar se detendrá 0,05 mm por encima de la parte inferior de la placa y en la parte superior de la posición de recogida seleccionada debido a la selección interactiva (modo manual). Gire suavemente el mando del joystick hacia la derecha para aspirar manualmente la partícula y la solución DPBS circundante. El volumen máximo no se fija cuando el modo manual está encendido. Sin embargo, el volumen máximo permitido en la jeringa será de 25 μL.
- Dispense el exceso de solución DPBS o partículas no deseadas girando suavemente la perilla del joystick en sentido antihorario. Demasiada dispensación liberará el espacio aéreo de la jeringa formando burbujas en su solución y comprometiendo la visibilidad.
- Pulse siguiente para continuar con el depósito.
- Observar el capilar entrando en el tubo de PCR depositante o placa PCR, liberando el volumen y volviendo a la posición inicial con un capilar vacío.
Nota: Si queda volumen en el capilar, proceda con la esterilización. A continuación, vuelva a comprobar la configuración, el nivel de aceite y la altura del aceite antes de realizar un nuevo picking. - Proceda del punto 26 de la sección 4 para iniciar un nuevo picking de una sola célula. Durante el picking podría ser necesario reemplazar el capilar. Después de la instalación, se debe realizar una nueva calibración de la posición de recogida. Al final de la calibración, seleccione la función aplicar cambios calibrados en altura Z para depositar la altura con el fin de corregir la altura del depósito a la nueva calibración capilar y omitir la calibración de la altura del depósito (sección 4,16).
Nota: los pasos descritos en la sección 1-4 se aplican a la mayoría de los métodos de enriquecimiento y aislamiento de los CTCs. Aquí se informan pasos opcionales para el análisis específico de CTCs.
5. el picking y la siembra de una sola célula para el análisis de supervivencia y proliferación
- Asegúrese de trabajar con soluciones y materiales asépticos para mantener la esterilidad durante todo el procedimiento.
- Prepare una placa de pozo 384 para contener los CTCs individuales seleccionados para el cultivo con 20 μL de medio de cultivo CTC31. Asegúrese de que los CTCs se sembren en pequeños volúmenes del medio después de la manipulación (p. ej., 10-20 μL para una placa de pozo 384).
- Gire la solución hasta el fondo de la placa. Colocar 384 placa de pozo en el objetivo 1 y mantener a 4 ° c.
- Realice todos los pasos con el micromanipulador descrito en la sección 4 para configurar el micromanipulador e iniciar un nuevo picking.
Nota: las selecciones múltiples de las celdas individuales provocarán la formación de una lista de selección. Las partículas serán recogidas y depositadas una por una en pozos consecutivos (ver sección 4.22.6). Sin embargo, el modo interactivo (modo manual) detendrá el capilar justo antes de la aspiración, permitiendo así que el experimentante controle este paso crítico y garantice un picking exitoso. Movimientos rápidos de la placa pueden resultar en el movimiento de las células en suspensión y dificultades en la recolección de múltiples células. - Después de depositar, repita el paso 4 para iniciar un nuevo picking.
- Al final del picking, Centrifugue la placa a 72 x g durante 4 min para asegurarse de que las células seleccionadas se colocan en la parte inferior del pozo.
6. CTC ruptura de clúster y picking de una sola célula para la secuenciación
- Asegúrese de trabajar con soluciones y materiales asépticos para mantener la esterilidad durante todo el procedimiento.
- Prepare tubos de PCR únicos o una placa de PCR que contendrá las células individuales del racimo roto con la solución de lising celular total de 2,5 μL que comprende 1 U/μL de inhibidor de ARN.
- Gire rápidamente la solución hasta la parte inferior del tubo. Coloque los recipientes depositantes en el objetivo 2 y Manténlos a 4 ° c.
- Realice todos los pasos descritos en la sección 4 con el micromanipulador para configurar el micromanipulador.
- Comience un nuevo picking. El capilar se detendrá 0,05 mm por encima de la parte inferior de la placa y en la parte superior del clúster CTC seleccionado debido a la selección interactiva (modo manual).
- Gire suavemente el mando del joystick hacia la derecha para aspirar manualmente el racimo y la solución DPBS circundante. Dispense el volumen aspirado incluyendo el cluster CTC girando suavemente el mando del joystick en sentido antihorario.
- Relance la aspiración/la disposición del cluster CTC descrito en el paso 6 hasta que las células individuales que forman el cluster se separen.
Nota: demasiada dispensación liberará el espacio aéreo de la jeringa formando burbujas en su solución y comprometiendo la visibilidad. - Siga por ojo la posición de las células individuales. Agregue manualmente las partículas usando el botón del joystick o seleccionando manualmente en el menú.
Nota: las selecciones múltiples de las celdas individuales provocarán la formación de una lista de selección. Las partículas serán recogidas y depositadas una por una en tubos/pozos de PCR consecutivos (ver sección 4.22.6). Sin embargo, el modo interactivo (modo manual) detendrá el capilar justo antes de la aspiración, lo que permitirá al experimentante controlar este paso crítico y garantizar un picking exitoso. - Seleccione seleccionar partículas activadas para iniciar el picking.
Nota: la cantidad de solución de alisado celular permitirá que una sola célula se Lise completamente. Sin embargo, la exposición prolongada del contenido lisado al agente de alisado puede degradar el ADN o el mRNA. Por lo tanto, proceda inmediatamente al siguiente paso. - Cierre inmediatamente el tubo que contiene la célula individual escogida y transfiera en hielo seco para congelar la presión.
- Gire rápidamente el tubo y Compruebe la ausencia de gotas en los lados del tubo para asegurar una correcta Lise de la célula depositada.
- Repita el paso 5 para iniciar un nuevo picking.
Nota: la etapa del microscopio se moverá de una partícula agregada a otra a la velocidad descrita en la sección 4.23.1. La suspensión de CTCs en la placa de sujeción ultra baja puede moverse, causando un picking defectuoso debido al mal posicionamiento.
7. el aislamiento de CTCs para la inyección del ratón
- Asegúrese de trabajar con soluciones y materiales asépticos para mantener la esterilidad durante todo el procedimiento.
- Preparar un tubo de PCR con 5 μL de 1x DPBS estéril.
- Gire rápidamente la solución hasta la parte inferior del tubo. Coloque los recipientes depositantes en el objetivo 2 y Manténlos a 4 ° c.
- Dentro de los ajustes de depósito aplicar un cambio en el paso 4.22.6: establecer la cantidad máxima de partículas de depósito por pozo a 1.000 y el número de objetivos para distribuir partículas a 1. Este paso asegura que las celdas seleccionadas serán depositadas en el mismo tubo por 1.000 veces.
- Utilice únicamente el modo interactivo (modo manual) para controlar con precisión el paso de picking y mantener la solución recolectado libre de células contaminantes.
Nota: si se necesitan más de 1.000 células, aumente el número de objetivos para distribuir las partículas a fin de evitar la pérdida de la muestra después de 1.000 células. - Continúe con los pasos de la sección 4,26 para iniciar un nuevo picking. Repita el paso 6 para realizar varias pickings. Anote el número de celdas recogidas en cada picking con el fin de realizar un seguimiento del número de celdas disponibles para la inyección del ratón.
- Al final de la recolección, centrifugar el tubo a 72 x g durante 4 min (ver sección 3,1.) y aspirar el sobrenadante.
- Resuspend los CTCs recogidos en el búfer de elección, adecuado para la inyección de ratón. Para la inyección de la almohadilla de grasa mamaria, resuspender los CTCs recogidos en una relación de 1 a 1 de 1x DPBS y la membrana basal reconstituida extraída, y mantener a 4 ° c hasta la inyección. Para la inyección intravenosa, reresuspend los CTCs recogidos en DPBS solamente.
Nota: el volumen de la solución depende estrictamente del número de CTCs que se inyectarán. Se aconseja inyectar en la almohadilla de grasa mamaria o por vía intravenosa un máximo de 100 μL por ratón. Al calcular el volumen, siempre tenga en cuenta el volumen muerto para la manipulación y la carga de la jeringa.
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Representative Results
El flujo de trabajo presentado permite la preparación de CTCs individuales, ya sea desde un único CTCs o separado de los clústeres CTC. Los CTCs de pacientes o ratones portadores de tumores se enriquecen a partir de sangre entera con métodos de enriquecimiento CTC disponibles y luego se tiñen con anticuerpos contra marcadores asociados al cáncer (p. ej., EpCAM, verde) y marcadores específicos de WBC (p. ej., CD45, rojo) (figura 1A ). El producto CTC manchado se transfiere a la estación de micromanipulación, se recogen células individuales, se depositan en tubos de PCR o placas multipozo y se preparan para el análisis descendente, incluyendo la secuenciación de una sola célula, la cultura in vitro o ensayos in vivo (figura 1B).
La confiabilidad de este método se basa en una distinción de celda de destino adecuada durante la recolección manual de células. El inmunostenciamiento en vivo con anticuerpos anti-EpCAM visualiza las células cancerosas en la suspensión y permite una distinción precisa de los eventos CD45-positivos (muy probablemente, WBCs) (figura 2A). Cuando está debidamente calibrado y mantenido, CellCelector proporciona una manipulación de células bien controlada. El aislamiento preciso de CTC se caracteriza por la aspiración de sólo el objetivo deseado sin las células contaminantes circundantes (glóbulos rojos o WBCs), como se muestra en las imágenes tomadas antes y después de la aspiración del cluster CTC (figura 2B, C).
Como se describió anteriormente, los clústeres CTC muestran un fenotipo más metastásico cuando se comparan con los únicos CTCs19coincidentes. Sin embargo, si la presencia de células vecinas es suficiente para aumentar la tasa de proliferación de las células dentro de los clústeres es desconocida. Para abordar esta pregunta, 1009 los clústeres únicos CTC y 1008 CTC que oscilan entre 2-17 células (con el 89,5% de ellos siendo los clústeres de células 2-5) derivados de la línea de células BR16 derivada del CTC20 fueron micromanipulados en pozos individuales de 384-Well placas de sujeción ultrabaja. El número de células vivas en cada pozo se contó manualmente bajo el microscopio y se registró semanalmente. Todos los análisis se realizaron después de la normalización del número de célula (es decir, el cluster de tres células fue analizado como tres células individuales). Las colonias infructuosas se caracterizaron por la falta de células vivas en el pozo al final del experimento. Como se sospecha, los conglomerados de CTC mostraron una mayor supervivencia en comparación con los CTCs únicos y dieron lugar a colonias celulares dentro de los 56 días de cultivo in vitro (figura 3a, 3B). En particular, los clústeres CTC también mostraron una mayor tasa de proliferación y por lo tanto alcanzaron números de células finales más altos (Figura 3C), lo que indica que el contacto directo con otras células tumorales tiene un impacto en su tasa de viabilidad y proliferación.
Por último, proporcionamos datos de secuenciación de ARN de una sola célula de CTCs directamente aislados de pacientes con cáncer de mama. En particular, mostramos una incrustación de vecino estocástico distribuido por t (tSNE) de celdas individuales derivadas de un solo CTCs, clústeres CTC o clústeres CTC-WBC (figura 4). Este enfoque permite la identificación de células con un perfil de expresión génica similar, así como la distinción de las poblaciones celulares que difieren en función de la expresión de genes particulares.
Figura 1 . Representación esquemática del flujo de trabajo experimental. (A) los CTCS se obtienen de la sangre de los pacientes con cáncer o de los modelos de cáncer de ratón, enriquecidos utilizando los métodos disponibles y etiquetados con anticuerpos para discriminar las células tumorales (verde) de los glóbulos blancos (rojo). (B) la micromanipulación precisa de CTCS facilita múltiples procedimientos y aplicaciones, por ejemplo, la secuenciación de una sola célula, la cultura CTC o los experimentos de trasplante in vivo . Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Imágenes representativas de CTCs antes y después de la micromanipulación. (A) imágenes representativas de CTCS derivadas de un xenoinjerto derivado de CTC (NSG-CDX-BR16) y teñidas con anticuerpos anti-epcam (verde) y anti-CD45 (rojo) para permitir la visualización de CTCS y glóbulos blancos, respectivamente. Se muestra la ampliación 40x. (B, C) La micromanipulación permite la separación precisa de los CTCs de las células no deseadas como se muestra en las imágenes antes de (izquierda) y después (derecha) procedimiento de aspiración celular. Aumento 10X. Se muestra el campo de visión (B) más amplio y el campo de visión (C) más estrecho, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Análisis de supervivencia y proliferación de los grupos de CTCs y CTC individuales. Las células individuales de los únicos CTCs o de los clusteres CTC de las células cultivadas BR16 derivadas del CTC fueron micromanipuladas en placas de 384-well. (A) diagrama de Kaplan-Meier que muestra la probabilidad de supervivencia de células individuales sembradas versus racimos celulares. P< 0.0001 mediante una prueba de rango logaritmo en parejas. (B) gráfico de barras que represente la proporción de colonias que consistían en células vivas al final del experimento (día 56). P< 0.0001 por prueba de Chi-cuadrado. (C) Heatmaps visualizando la distribución normalizada del número de células en el transcurso del experimento (día 0, 8, 32, 56). Cada bloque representa una celda de inicio y el mapa térmico muestra el número de celdas por pozo en un determinado punto de tiempo. d = día. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Secuenciación de ARN de una sola célula. Visualización de los datos de expresión del ARN CTC mediante la incrustación de vecino estocástico distribuido por t (tSNE). Cada punto representa una sola célula derivada de un solo CTC, de un cluster CTC o de un cluster CTC-WBC. Los colores de los puntos corresponden a la identificación del donante. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La caracterización molecular de los CTCs tiene la promesa de mejorar nuestra comprensión del proceso metastásico y guiar el desarrollo de nuevas terapias contra la metástasis. Aquí proporcionamos una descripción detallada de los protocolos que permiten la micromanipulación CTC y el análisis descendente, incluyendo tanto ensayos funcionales basados en células simples, análisis de expresión génica y trasplante in vivo para potencial metastásico evaluación20.
Entre los pasos más críticos de nuestro protocolo, la micromanipulación de productos enriquecidos con CTC tiene como objetivo obtener una resolución de célula única a partir de suspensiones celulares relativamente heterogéneas, es decir, permitiendo alcanzar los más altos niveles de pureza y mejorar la calidad de Análisis funcionales o moleculares posteriores. Por ejemplo, el picking de celdas únicas de CTCs nos ha permitido a nosotros y a otros investigar la heterogeneidad de CTC (por ejemplo, diferencias entre los CTCs únicos, los clústeres CTC y los clústeres CTC-WBC), tanto desde un punto de vista molecular como desde la perspectiva de poder evaluar capacidad de iniciación a la metástasis. Si bien generalmente favorecemos los protocolos de selección de celdas que permiten al experimentador aislar manualmente los CTCs (es decir, permitiendo un mayor grado de flexibilidad dependiendo de las características de los objetivos individuales), ahora hay soluciones automatizadas disponibles para facilitar la recolección de células y acelerar el proceso de aislamiento CTC en experimentos bien controlados.
Al considerar la micromanipulación de una sola célula en el contexto del análisis CTC, el tiempo es un factor limitante muy crítico. Dado que nuestro protocolo está destinado a ser llevado a cabo en las células vivas, es imperativo proceder lo más rápido posible para minimizar los cambios debidos al entorno ex vivo, como la regulación de la preregulación o downregulation de los genes que dependen del contexto. En comparación con las técnicas existentes para el análisis CTC, la micromanipulación de células individuales de CTCs en vivo ofrece una mayor flexibilidad para el análisis descendente de elección, que van desde la secuenciación de una sola célula hasta ensayos funcionales directos.
En este manuscrito, también proporcionamos nuevos datos que destacan las diferencias importantes entre los CTCs individuales y agrupados por micromanipular y sembrar más de mil clústeres de CTCs o CTC individuales (con un tamaño claramente definido) de una línea celular derivada de CTC en pozos individuales de una placa de microtitulación. En primer lugar, observamos que los clústeres CTC (es decir, la presencia de células vecinas) son suficientes para lograr mejores tasas de supervivencia de las células sembradas, apoyando nuestros datos in vivo sugiriendo tasas apopónticas más bajas de los clústeres CTC sobre la siembra en un sitio lejano 19. Además, incluso después de la normalización del número de células sembradas, las células cancerosas cultivadas como racimos muestran tasas de proliferación mucho más elevadas, reforzando aún más el concepto de que los CTCs agrupados son contribuyentes de metástasis altamente eficientes.
Juntos, presentamos los protocolos específicos para el análisis CTC con el propósito de promover las investigaciones de la sola célula-relacionadas en el campo CTC. En el futuro, Anticipamos que estos protocolos podrían ser útiles para las investigaciones relacionadas con el CTC, con el objetivo de lograr una mejor comprensión de la biología que caracteriza la metástasis transmitida por la sangre en varios tipos de cáncer.
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Disclosures
N.A. y B.M.S. se enumeran como inventores en las solicitudes de patente relacionadas con células tumorales circulantes y el tratamiento del cáncer. N.A. es un consultor de pago para las compañías farmacéuticas y de seguros con un interés en la biopsia líquida.
Acknowledgments
Agradecemos a todos los pacientes que donaron sangre para nuestro estudio, así como a todos los médicos involucrados y enfermeras de estudio. Agradecemos a Jens Eberhardt, Uwe Birke y la Dra. Katharina Uhlig de ALS Automated Lab Solutions GmbH por su apoyo continuo. Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de aceto por sus comentarios y discusiones. La investigación en el laboratorio de aceto está respaldada por el Consejo Europeo de investigación, la Unión Europea, la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza, la liga suiza contra el cáncer, la Liga de cáncer de Basilea, los dos cantones de Basilea a través de la ETH Zürich, y la Universidad de Basilea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
| 1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
| 6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
| Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
| Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
| Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
| BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
| Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
| CellD software | ALS | version 3.0 | |
| Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
| Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
| PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
| SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |
References
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