Standardisert og skalerbar analyse for å studere Perfusert 3D angiogenic spirende av iPSC-avledet endothelial Cells in vitro

Summary

Denne metoden beskriver kulturen i iPSC-avledet endothelial celler som 40 perfusert 3D microårene i en standardisert mikrovæskebasert plattform. Denne plattformen muliggjør studiet av gradient-drevet angiogenic spirende i 3D, inkludert anastomose og stabilisering av angiogenic spirer i en skalerbar og høy gjennomstrømming måte.

Abstract

Pre-klinisk narkotika forskning av vaskulære sykdommer krever in vitro-modeller av blodkar som er amendable til høy gjennomstrømming screening. Men nåværende in vitro screening modeller som har tilstrekkelig gjennomstrømming bare har begrenset fysiologisk relevans, noe som hindrer oversettelsen av funnene fra in vitro til in vivo. På den annen side, mikrovæskebasert cellekultur plattformer har vist enestående fysiologiske relevans in vitro, men ofte mangler den nødvendige gjennomstrømning, skalerbarhet og standardisering. Vi viser en robust plattform for å studere angiogenese av endothelial celler avledet fra humane Pluripotent stamceller (iPSC-ECs) i fysiologiske, relevante cellulære mikromiljøet, inkludert og graderinger. IPSC-ECs er kultivert som 40 perfusert 3D-microårene mot et mønstret kollagen-1-stillas. Ved anvendelsen av en gradient av angiogenic faktorer, kan viktige kjennetegn ved angiogenese bli studert, inkludert differensiering i tip-og stilk cellen og dannelsen av perfusable lumen. Med fluorescerende Tracer fargestoffer muliggjør studiet av permeabilitet under og etter anastomose av angiogenic spirer. Som konklusjon, denne metoden viser muligheten for iPSC-avledet ECs i en standardisert og skalerbar 3D-angiogenic analysen som kombinerer fysiologiske relevante kultur forhold i en plattform som har den nødvendige robusthet og skalerbarhet for å bli integrert i stoffet screening infrastruktur.

Introduction

In vitro-modeller spiller en fundamental rolle i oppdagelse og validering av nye narkotika mål av vaskulære sykdommer. Men gjeldende in vitro screening modeller som har tilstrekkelig gjennomstrømming bare har begrenset fysiologisk relevans¹, som hindrer oversettelsen av funnene fra in vitro til in vivo. Derfor, for å fremme pre-klinisk vaskulær narkotika forskning, forbedret in vitro modeller av blodkar er nødvendig som kombinerer høy gjennomstrømming screening med en fysiologisk relevant 3D Cellular mikro-miljø.

I løpet av det siste tiåret har det blitt gjort betydelige fremskritt for å øke den fysiologiske relevansen til in vitro-modeller av blodkar. I stedet for dyrking endothelial celler på flate overflater som vev-kulturen plast, endothelial celler kan bygges inn i 3D stillaser, slik som fibrin og kollagen gels². Innenfor disse matriser, endothelial cellene viser en mer fysiologisk relevant fenotype forbundet med matrise degradering og lumen formasjon. Imidlertid, disse modeller bare demonstrere en undergruppe av det mange prosesser det finnes i løpet av angiogenic spirende idet betydelig stikkordene fra det cellular mikromiljøet er fremdeles mangler.

Mikrovæskebasert cellekultur plattformer er unikt egnet til ytterligere å øke den fysiologiske relevansen til in vitro-modeller av blodkar. For eksempel kan endothelial celler bli utsatt for skjær stress, som er en viktig biomekaniske stimulans for blodkar. Dessuten tillater muligheten til å romlig kontroll væsker innenfor materialer dannelsen av Biomolecular graderinger^3,4,5,6. Slike graderinger spiller en viktig rolle i vivo under dannelsen og mønsteret under angiogenese. Men mens mikrovæskebasert cellen kultur plattformer har vist enestående fysiologiske relevans over tradisjonelle 2D og 3D cellekultur metoder, de ofte mangler den nødvendige gjennomstrømning, skalerbarhet og standardisering som kreves for narkotika screening ⁷. også, mange av disse plattformene er ikke kommersielt tilgjengelig og krever sluttbrukere å microfabricate sine enheter før bruk⁸. Dette krever ikke bare produksjons apparater og teknisk kunnskap, men begrenser også nivået av kvalitetskontroll og påvirker negativt reproduserbarhet⁹.

Hittil primære menneskelige endothelial celler forblir den mest brukte cellen kilde til modell angiogenese in vitro¹⁰. Men primære menneskelige celler har en rekke begrensninger som hindrer deres rutine anvendelse i screening tilnærminger. Først er det en begrenset mulighet til å skalere opp og utvide primær celle-avledet kulturer. Derfor, for stor skala eksperiment, batcher fra ulike givere må brukes, noe som resulterer i genomisk forskjeller og batch-to-batch variasjoner. For det andre, etter noen få passasjer, mister primære endothelial celler vanligvis relevante egenskaper når kultivert i vitro^11,12.

Endothelial celler avledet fra menneskeskapte Pluripotent stamceller (iPSC) er et lovende alternativ: de ligner primære celler, men med en mer stabil genotype som også er mottagelig for presise Genova redigering. Videre iPSCs er i stand til selv-fornyelse og dermed kan utvides i nesten ubegrensede mengder, noe som gjør iPSC-avledede celler et attraktivt alternativ til primær celler for bruk innenfor in vitro screening modeller¹³.

Her beskriver vi en metode for å kultur endothelial celler som perfusable 3D-microårene i en standardisert, høy gjennomstrømming mikrovæskebasert cellekultur plattform. Bruk ved å plassere enheten på en rocker-plattform, som sikrer robust drift og øker skalerbarheten til analysen. Som microårene er kontinuerlig perfusert og utsatt for en gradient av angiogenic faktorer, angiogenic spirende er studert i en mer fysiologisk relevant mobilnettet mikromiljøet. Mens protokollen er kompatibel med mange forskjellige kilder til (Primær) endothelial celler^14,15, fokuserte vi på å bruke humant IPSC-avledet ECs for å øke standardisering av denne analysen og for å lette sin integrering innenfor vaskulær narkotika forskning.

Protocol

1. klargjøring av enheten

1. Overfør den mikrovæskebasert 384-brønn platen til en steril laminær.
2. Ta av lokket og tilsett 50 μL av vann eller fosfat-bufret salt væske (PBS) til hver av de 40 observasjons brønnene (figur 1B, brønn B2) ved bruk av en flerkanals eller gjentatt pipette.
   Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her. La platen være med lokket på i det sterile kultur kabinettet ved romtemperatur (RT).

2. Forbered gel og coating

1. Forbered 2,5 mL av 10 μg/mL fibronektin (FN) belegg løsning. Fortynne 25 μL av 1 mg/mL fibronektin lager oppløsning i 2,5 mL av Dulbecco PBS (dPBS, kalsium og magnesium fri). Plasser løsningen i vannbadet ved 37 ° c til bruk.
2. Forbered 100 μL av kollagen-1-løsning. Tilsett 10 μL av HEPES (1 M) til 10 μL av NaHCO₃ (37 g/L) og bland med pipettering. Plasser røret på is og tilsett 80 μL av kollagen-1 (5 mg/mL) for å gi en nøytralisert kollagen-1 konsentrasjon på 4 mg/mL. Bruk en pipette til å blande forsiktig og unngå dannelse av bobler.
3. Tilsett 1,5 μL av kollagen-1-oppløsning (4 mg/mL) til gel innløpet til hver mikrovæskebasert enhet (figur 1B, brønn B1). Sørg for at dråpe gel er plassert midt i hver brønn for at gelen skal kunne gå inn i kanalen (se figur 2a).
   Merk: Phaseguides hindre fylling av tilstøtende kanaler og muliggjør gel mønstre. Riktig gel lasting kan bekreftes under et brightfield mikroskop ved å observere menisk formasjon gjennom "observasjon vinduet" (vel B2) eller ved å bla platen opp ned. Hvis gelen ikke helt fyller kanalen, kan en ekstra dråpe på 1 μL legges til.
4. Plasser mikrovæskebasert platen i en inkubator (37 ° c, 5% CO₂) i 10 min til polymeres kollagen-1.
   Merk: Timing av polymerisering er avgjørende; på grunn av de lave volumene som brukes i materialer, kan fordampning allerede observeres etter 15 min av inkubasjons, noe som resulterer i gel kollaps eller krymping.
5. Ta tallerkenen ut av inkubator og overføre til en steril laminær-Flow hette.
6. Tilsett 50 μL av 10 μg/mL FN-belegg til utløpet av den øverste kanaltypen for hver mikrovæskebasert enhet (figur 1B, brønn a3). Trykk på pipette spissen mot siden av brønnen for korrekt fylling av brønnen uten å overlappe luftbobler (se figur 2b). Kanalen skal fylle, og væsken bør PIN på uttaket (vel C1) uten å fylle uttaket godt.
7. Plasser platen i inkubator (37 ° c, 5% CO₂) i minst 2 dager.
   Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her, som kollagen-1 gel sammen med belegget blandingen er stabil i minst 5 dager i inkubator. Hvis belegget blandingen er uthvilt, lengre perioder kan være mulig, men dette har ikke blitt testet. Avgjørende er nivået av FN-coating, da dette hindrer dehydrering av kollagen-1 gel.

3. celle seeding/Microvessel kultur

1. Tilsett 5 mL fosterets kalv serum og 2,5 mL penn/strep til 500 mL basal endothelial cellekultur medium og filter sterilisere ved hjelp av en flaske topp filter med 0,22 μm pore størrelse. Dette mediet er nå referert til som basal medium.
2. Forbered vaskulær vekstmedium: tilsett 3 μL av 50 μg/mL vaskulær endothelial vekstfaktor (VEGF) og 2 μL av 20 μg/mL grunnleggende Fibroblast vekstfaktorer (bFGF) til 5 mL basal medium.
3. Tin den frosne iPSC-ECs raskt (< 1 min) i et 37 ° Cwater bad og Overfør til et 15 mL rør og fortynne i 10 mL basal medium.
4. Tell cellene.
   Merk: Et enkelt hetteglass inneholder 1 000 000 celler i 0,5 mL med > 90% levedyktighet.
5. Sentrifuger røret ved 100 x g i 5 min. aspirer supernatanten uten å forstyrre celle pellet og resuspend i basal medium for å gi en konsentrasjon på 2 x 10⁷ celler/ml.
6. Overfør mikrovæskebasert 384-brønn plate fra inkubator til en steril laminær.
7. Aspirer FN-coating løsning fra mengden innløp (brønn a1). Tilsett 25 μL av basal medium i innløps brønnene (brønn a1).
8. Legg til en 1 μL dråpe celle oppheng til hver topp-innløps brønn (figur 1B, brønn a1). Dråpe skal flate i løpet av få sekunder (se figur 3a, b for en illustrasjon av denne "passive pumping"-metoden).
   Merk: Kontroller under et mikroskop om seeding er homogen. Hvis ikke, tilsett ytterligere 1 μL i uttaket og vent til dråpe flater.
9. Ruge den mikrovæskebasert brønn platen for 1 time ved 37 ° c, 5% CO₂. Etter dette bør cellene ha levd opp. Hvis ikke, vent en annen 30 min.
10. Fjern basal mediet fra de øverste avløps uttaks brønnene (figur 1B, brønn a3). Legg til varmt fartøy kultur medium i den øverste luftinntaket og-uttaket (figur 1B, brønner a1 og a3). Plasser platen på rocker plattformen (sett på 7 ° vinkel, 8 min rocking intervall) i inkubator (37 ° c, 5% CO₂).
11. Image platen ved hjelp av et brightfield mikroskop med automatiserte scenen på dag 1 og 2 post-seeding for å bekrefte celle levedyktighet. Etter 2 dager, en confluent monolag bør ha dannet mot kollagen-1 stillaset.
    Merk: Hvis kanalene ikke ser ut til å være like confluent, kan microårene være kultivert for en ekstra 24 h.

4. Study angiogenic spirende inkludert tips-og stengel-celle dannelse

1. Forbered 4,5 mL angiogenic spirende medium ved å supplere basal medium med 4,5 μL av VEGF (50 μg/mL lager), 4,5 μL av phorbol 12-isopropylmyristat-13-acetate (PMA) (2 μg/mL lager), og 2,25 μL av sfingosin-1-fosfat (S1P) (1 mM lager).
2. Forbered 8,5 mL av fartøy vekstmedium (basal medium supplert med 30 ng/mL VEGF og 20 ng/mL bFGF).
3. Aspirer medium fra brønnene og tilsett 50 μL av friskt fartøy kultur medium i topp-og uttaks brønner og Påfyllings-og uttaks brønner (figur 1B, brønner a1, a3, B1 og B3).
4. Tilsett 50 μL av angiogenic i hver av de nederste kanal inntaks-og uttaks brønnene (fig.1B, brønner C1 og C3).
5. Sett enheten tilbake i inkubator (37 ° c, 5% CO₂) på rocker plattformen for å danne en gradering av angiogenic vekstfaktorer.
6. Bilde 1 dag og 2 dager etter tilsetning av angiogenic vekstfaktorer ved hjelp av et brightfield mikroskop med automatisert fase.
   Merk: Fortsett å dyrking microårene for å studere anastomose (gå til del 5) eller fiks og beis microårene for å kvantifisere spirende lengde og morfologi på dag 2 og dag 6 (gå til avsnitt 6).

5. studere anastomose og spire stabilisering

1. Bilde ved hjelp av et brightfield mikroskop med automatisert etappe.
2. Tilsett 1 μL av fluorescensmerkete merket albumin (0,5 mg/mL) til den øverste plate inntaket (figur 1B, brønn a1) og bland med en 50 μL pipette.
3. Overfør platen til et fluorescerende mikroskop med automatisert trinn og inkubator satt til 37 ° c. Still inn mikroskopet med 10x objektiv og korriger eksponeringsinnstillinger (f.eks. tetramethylrhodamine [TRITC]-kanal, 20 MS eksponering). Skaff deg tidsforløpbilder hvert minutt i 10 minutter.
4. Fjern platen fra mikroskopet og Overfør platen til en steril laminær.
5. Fjern alt medium fra brønnene og erstatt både fartøyets kultur medium og angiogenic spirende medium i de tilsvarende brønnene (se trinn 4,3 og 4,4).
6. Sett enheten tilbake i inkubator (37 ° c, 5% CO₂) for å fortsette angiogenic spirende.
7. Gjenta trinn 5.1 − 5.6 for å studere permeabilitet på dag 6.

6. fiksering, farging og bildebehandling

1. Aspirer alle kultur medier fra alle brønnene.
   Merk: Gjenværende medium eller væske i de mikrovæskebasert kanalene påvirker ikke fiksering på grunn av det lave volumet på 1 − 2 μL.
2. Tilsett 25 μL av 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS til alle strøminntaket (figur 1B, a1 og C1) og uttaks brønner (figur 1B, a3 og C3). Ruge i 10 min ved RT. Plasser enheten under en liten vinkel (± 5 °) for å indusere flyt (for eksempel ved å plassere den ene siden av platen på et lokk).
3. Aspirer PFA fra brønnene. Vask alle mengde innganger og uttak to ganger med 50 μL av Hank ' s balanserte saltløsning (HBSS). Aspirer HBSS fra brønner.
4. Permeabilize ved RT i 10 minutter ved å tilsette 50 μL av 0,2% ioniske overflateaktivt middel til alle uttak og stikkontakter.
5. Aspirer det Ioniske overflateaktivt middel fra brønner. Vask kanal kanalene to ganger ved å tilsette 50 μL av HBSS til alle luft inntaks-og uttaks brønner. Aspirer HBSS fra brønner.
6. Beis kjernene ved hjelp av Hoechst (1:2000) og F-utgangen ved hjelp av phalloidin (1:200) i HBSS. Forbered 2,2 mL for 40 enheter, og tilsett 25 μL i hvert enkelt innløps inntak og-utløp. Plasser platen under en liten vinkel og ruge på RT i minst 30 min.
7. Vask to ganger med 50 μL av HBSS i alle mengde innganger og-uttak.
8. Direkte bilde ved hjelp av et fluorescerende mikroskop med automatisert fase eller Oppbevar platen beskyttet mot lys ved 4 ° c for senere bruk.

Representative Results

Den mikrovæskebasert 3D-celle kulturen plattformen består av 40 perfusert mikrovæskebasert enheter (figur 1a, b), som brukes til å studere angiogenic spirende av perfusert microårene mot en mønstret kollagen-1 gel (figur 1C). Disse microårene er kontinuerlig perfusert og utsatt for en stigning på angiogenic vekstfaktorer (figur 3a-d). Den angiogenic spirer kan enten studert 2 dager etter gradient eksponering eller kultivert for mer enn 5 dager etter gradient eksponering for å studere anastomose og spire stabilisering (se tidslinje, figur 1d).

Seeding iPSC-ECs ved hjelp av passiv pumpe metoden skal resultere i homogen seeding tetthet (figur 4a, b). Kultur under kontinuerlig serie resulterte i confluent microårene i 2 dager, med cellene helt lining omkretsen av mikrovæskebasert kanalen og dannelsen av en confluent monolag mot mønstret kollagen-1 gel.

Eksponering for en gradering av angiogenic faktorer resulterte i retningsbestemt angiogenic spirende av microårene innenfor mønstret kollagen-1 gel (figur 5a-g). Clear spissen celle formasjon og invasjon i kollagen-1 gel var synlig 24 h etter tilsetning av angiogenic gradient, mens stilk celler inkludert lumen formasjon var synlig etter 48 h (figur 5a).

Etter fiksering og farging kan kapillær nett verket visualisere ved hjelp av phalloidin for å få flekker på F-utgangen og bruke Hoechst 33342 for å få flekker på kjernen (figur 5B, c). Disse spirer kan være kvantifisert (f. eks form og lengde¹⁴). Uten tilsetning av vekstfaktorer bør ingen invasjon i kollagen-1-gelen observeres (fig.5D). Konfokalmikroskopi Imaging ble brukt til å bestemme spire diameter og for å bekrefte lumen formasjon (figur 5e-g).

Spirer fortsetter å vokse mot retningen av graderingen og nå motsatt kanal innen 3 − 4 dager etter tilsetning av angiogenic vekstfaktorer. Dette resulterer i ombygging av vaskulære nettverk, med en klar reduksjon i antall angiogenic spirer (figur 6a). Lumen formasjon ble vurdert av blod av vaskulære nettverk med fluorescensmerkete merket makromolekyler (f. eks, albumin eller dextrans). Perfusing microårene med 0,5 mg/mL merket albumin før og etter anastomose avdekket en klar forskjell i spire permeabilitet etter 10 min (figur 6b-e), noe som tyder på at blodkar stabilisere og modne etter anastomose.

Figur 1: mikrovæskebasert cellekultur protokoll for IPSC-avledet microårene. (a) bunnen av mikrovæskebasert cellekultur enheten er vist viser 40 mikrovæskebasert enheter som er integrert under 384-brønn plate. Større visning viser en av de 40 mikrovæskebasert enhetene. (b) hver mikrovæskebasert enhet er plassert under 9 brønner med 3 inntaks brønner og 3 uttaks brønner. De mikrovæskebasert kanalene er adskilt av rygger (' phaseguides '), som gjør det mulig å mønstre av hydrogeler i den sentrale kanalen (' gel Channel '), mens det fortsatt er kontakt med tilstøtende kanaler (' kanal kanaler '). (c) metode for å kultur en perfusert microvessel innenfor mikrovæskebasert enheten, som brukes til å studere gradient drevet angiogenic spirende gjennom en mønstret kollagen-1 matrise. (d) tidslinje for å studere angiogenic spirende og/eller anastomose. Dette tallet har blitt modifisert fra Van Duinen et al.¹⁴. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: laste prosedyrer for gel og medium. (a) eksempler på korrekt og feil gel deponering. Riktig arkivering resulterer i en mønstret kollagen-1 gel i midten kanalen, som senere polymerisert. (b) eksempler på korrekt og feilfylling av brønnene. Brønner fylles i rekkefølgen 1 − 4 for å forhindre luftboble overlapping i de mikrovæskebasert kanalene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: kontinuerlig hydrostatisk trykk drevet flyt og gradert stabilisering. (a) hydrostatisk trykkforskjeller mellom brønnene fører til passiv nivellering og flyt i mikrovæskebasert kanaler. (b) å plassere enheten på en rocker-plattform som er innstilt på 7 ° og 8 min syklustid, resulterer i kontinuerlig, toveis bruk innenfor mikrovæskebasert kanaler. (c) graderinger dannes ved å innføre to ulike konsentrasjoner i brønnene, som kontinuerlig oppdateres av passiv utjevning. (d) gradient visualisering ved hjelp fluorescein ISOTHIOCYANATE (FITC)-dextran. Toveis flyt stabiliserer gradient opp til 3 dager. Scale bar = 200 μm. Dette tallet har blitt modifisert fra Van Duinen et al.¹⁴. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: passiv pumpe metode for celle seeding. (a) passiv pumping er drevet av trykkforskjeller som er forårsaket av forskjeller i overflatespenning. Dette resulterer i en strømning fra dråpe (høyt indre trykk) mot reservoaret (lavt indre trykk). (b) tidsforløp av en dråpe (grå omriss) som er plassert på toppen av innløpet (hvit omriss) av mikrovæskebasert kanalen (blå omriss). Rett etter addisjon (figur 4b, i), dråpe på toppen av innløpet krymper (figur 4b, II: 1 s etter tillegg; IV: 2 s etter addisjon), som resulterer i en strømning mot utløpet. Dette fortsetter til dråpe menisk er festet ved innløpet (figur 4b, IV). Scale bar = 400 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: robuste 3D-spirende av IPSC-EC-microårene. (a) spirende av IPSC-EC over tid. Microårene ble dyrket for 48 h (høyre) og deretter stimulert med en angiogenic cocktail inneholdende 50 ng/mL VEGF, 500 nM S1P, og 2 ng/mL PMA. Det første tipset-celler som invaderer kollagen-1 stillaset (midten) er synlige 24 h etter eksponering. De første lumen er synlige (piler) 48 h etter eksponering (høyre) mens spissen-cellene har migrert videre i retning av gradient. (b) Array av 15 microårene som ble STIMULERT med VEGF, S1P og PMA for 2 dager og beiset for F-utgangen (gul) og kjerner (blå). Scale bar = 200 μm. (c) stimulert microvessel (positiv kontroll). (d) Unstimulated microvessel (negativ kontroll). (e) maksimal projeksjon av en enkelt kapillær i gelen. (f) samme som (g), men fokusert på midten. Prikket linje angir posisjonen til den ortogonale visningen i panel g. skala stolper (a-d: 200 μm; e-g: 20 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: visualisering av angiogenic spire permeabilitet før og etter anastomose. (a) anastomose med basal kanal utløser beskjæring og modning av angiogenic spirer. Nærbilde av kapillær seng ved 2, 4, 6 og 7 dager etter stimulering med angiogenic vekstfaktorer. (b) angiogenic spirer etter 2 dager etter tilsetning av angiogenic vekstfaktorer. Angiogenic spirer dannes innen gel, men er ennå ikke koblet til bunn kanalen. (c) microvessel med 0,5 mg/ml albumin-Alexa 555 løsning. Fluorescerende bilder oppnådd ved 0 og 10 min. (d, e) samme som i paneler b og c, men etter 7 dager med stimulering. Spirer er koblet til den andre siden og dannet en confluent microvessel i basal kanal. Skala bars = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Problem	Forårsake	Løsning
Kollagen-1 går ikke inn eller fyller kanalen helt	Kollagen-1 dråpe er ikke plassert på toppen av innløpet	Plasser dråpe høyden forsiktig på toppen av innløpet fra gel-
	Volum av kollagen-1 er for lav	Bruk 1,5 μL av gelen til å fylle kanalen helt
	Kollagen-1 er for tyktflytende	Bruk en annen gruppe med kollagen-1
Kollagen-1 renner inn i	Kollagen-1 er Pipet tert direkte inn i inntaket av gel kanal	Plasser dråpe høyden forsiktig på toppen av innløpet fra gel-
Kollagen-1 er ikke klart/fiber formasjon	Kollagen-1 er ikke lagret riktig	Oppbevar kollagen-1 ved 4 ° c, ikke Frys
	NaHCO3 og HEPES er ikke blandet godt før du legger kollagen-1	Bland forsiktig NaHCO3 og HEPES av pipettering før du legger til kollagen-1
Dråpe krymper ikke ved hjelp av passiv pumpe metode	Dråpe holder på siden av brønnen	Aspirer dråpe og Legg til ny dråpe på toppen av innløpet
		Pass på at utløps brønnen er fylt med minst 20 μL av medium
Ingen spirende er observert	Vekstfaktorer er ikke lagt til eller alikvoter lagres ikke på riktig måte	Forbered friskt angiogenic spirende medium
	Luftboble blokker/gradient formasjon	Fjern luftbobler med en P20-eller P200-pipette
	Volumforskjeller mellom brønner	Volumer i alle brønner må være like for å danne en lineær gradient
Celler ikke levedyktig	Plate ikke plassert på rocker plattform/rocker plattform slått av	Kontroller at rocker plattformen er på og har riktig syklustid/vinkel (8 min/7 °)
	Ikke mulig å kunne være tilgjengelig på grunn av tilstedeværelsen av luftbobler	Fjern luftbobler med en P20-eller P200-pipette
Ingen lumen dannes, celler migrerer som enkeltceller	Angiogenic spirende blandingen ble tilsatt før en monolag ble dannet	Vent ytterligere 24 timer før du legger til angiogenic vekstfaktorer
Stor variasjon i spirende tetthet	Forskjeller i celle tetthet etter seeding	Kontroller om celle tettheten er homogen og sammenlignbar mellom mikrovæskebasert enheter. Legg til en annen dråpe av celle suspensjon hvis nødvendig

Tabell 1: feilsøking av vanlige feil.

Discussion

Denne metoden beskriver kulturen i 40 perfusable endothelial microårene innenfor en robust og skalerbar mikrovæskebasert cellekultur plattform. Sammenlignet med tradisjonelle 2D og 3D cellekultur metoder, viser denne metoden hvordan en fysiologisk relevant cellulær mikromiljøet som inkluderer graderinger og kontinuerlig produksjon kan kombineres med 3D cellekultur med tilstrekkelig gjennomstrømming for screening Formål.

En av de store fordelene sammenlignet med sammenlignbare mikrovæskebasert analyser er at denne metoden ikke er avhengig av pumper for bruk, men bruker en rocker-plattform for å indusere kontinuerlig bruk i alle mikrovæskebasert enheter samtidig. Dette sikrer at analysen er robust og skalerbar: platene kan stables på en rocker plattform. Viktigere, alle mikrovæskebasert enheter forblir individuelt adresserbare, som gjør at denne metoden skal gjennomføres innenfor narkotika screening inkludert generering av en dose-respons kurve. Videre, uten en pumpe, er Imaging og medium erstatning langt enklere med mindre risiko for (cross)-forurensning.

En annen fordel med denne metoden er bruk av en standardisert, pre-produsert plattform, mens sammenlignbare mikrovæskebasert cellekultur plattformer må fabrikkert av sluttbrukerne. Denne tilgjengeligheten forenkler innføringen av denne analysen blant andre akademiske og farmasøytiske forskningsgrupper, som fører til standardisering. I motsetning til mikrovæskebasert prototyper sikrer også 384-brønn plate grensesnittet kompatibilitet med gjeldende laboratorieutstyr (f.eks. aspirators, plate handlers og flerkanals Pipetter), og forenkler integreringen innenfor gjeldende screening-infrastruktur. .

Det er flere viktige trinn i å utføre denne analysen. Kollagen-1 gel skal fylle gel kanalen helt. Under gel lasting, kan denne fylling observeres ved å inspisere mikrovæskebasert kanaler enten gjennom observasjon vinduet (figur 2a) eller ved å bla platen opp ned (som vist i figur 1a). Under fylling bør kollagen gel forbli i senterkanalen, uten å strømme inn tilstøtende kanaler. Vi la merke til at kvaliteten på kollagen-1 gel er avgjørende for riktig analysen ytelse. Kollagen-1-batcher med for høy viskositet vil føre til ufullstendig fylling av gel-kanalen. Etter 10 min av polymerisering ved 37 ° c, skal gelen være homogen og klar. Hvis kollagen-1 ikke er lagret riktig (for eksempel på grunn av varierende temperaturer i kjøleskapet), vil kollagen polymeres i kanalene med klart synlig fiber formasjon. Dette kan føre til invasjon av ECs i gelen uten tilsetning av angiogenic faktorer, men uten riktig lumen utvikling.

Når cellene er sådd, fibronektin belegg løsningen er fjernet fra brønnene, slik at bare de mikrovæskebasert kanaler fylt med belegg løsning. Aspirasjon av belegget løsning fra mikrovæskebasert kanaler kan forårsake gel avbrudd eller gel aspirasjon. Celle suspensjonen må erstatte/fortrenge dette belegget løsning. Dette fungerer best når cellen suspensjonen er sådd ved hjelp av passiv pumping metoden, som direkte pipettering cellen suspensjonen inn i kanalene viser mindre reproduserbar seeding tettheten.

Som microårene danner en stabil monolag mot gel, disse små forskjellene bare resultere i ulike tider som trengs for å nå confluency. Dermed er analysen startpunktet bestemmes av confluency stedet kultur tid. Om nødvendig kan dyrking tid utvides til en klar monolag er formet mot gelen.

Innenfor brønnene kan luftbobler fanges av feilfylling av brønnene (se figur 2b). Disse luftboblene vil begrense flyten av medium, selv når enheten er plassert på en rocker plattform, og resultere i kollaps av microvessel og uriktig gradient formasjon. Å trykke på pipette spissen mot sideveggen av brønnene vil øke suksessen til helt fylle brønnen. Hvis en luftboble er fanget i brønnene, kan den fjernes ved å forsiktig sette inn en steril pipette spiss i glass bunnen. Luftbobler kan også forekomme i de mikrovæskebasert kanalene. Når medium er fjernet fra brønnene, er fordampning av medium merkbar fra mikrovæskebasert kanaler etter 30 min (på grunn av mikroliter volumer i kanalene). Dermed blir middels endringer fortrinnsvis utført så raskt som mulig. Når medium legges til i en kanal med fordampet medium, vil luftbobler bli fanget inne i de mikrovæskebasert kanalene. Disse luftbobler innenfor mikrovæskebasert kanaler kan fjernes manuelt ved å plassere en P20 pipette direkte på enten innløp eller utløp og tvinge medium gjennom materialer fra motsatt brønnen. Vellykket fjerning av luftbobler resulterer i en liten, men merkbar reduksjon i volum i den andre brønnen. Tabell 1 lister opp vanlige feil og hvordan du feilsøker dem.

Mangelen på en pumpe er en begrensning når kontinuerlig bildebehandling er nødvendig, som rocker plattformen begrenser brukeren til bildet på sekvensielle tidsintervaller. Videre består mengden av medium i denne plattformen av toveis flyt med lave nivåer av skjær stress, mens blodkar in vivo er eksponert for enveis flyt med høyere nivåer av skjær stress. Selv om vi ikke observerer negative effekter av toveis flyt med hensyn til angiogenic spirende, flyt er en viktig biomekaniske stimulans og fortrinnsvis kontrollert. Men mens det er kommersielt tilgjengelige pumpen oppsett, grensesnitt med 384-brønn plate fortsatt utfordrende og pumpe oppsett alvorlig hemme skalerbarhet av denne analysen.

Muligheten til å bruke iPSC-ECs til å studere angiogenic spirende åpner for nye muligheter i sykdoms modellering og narkotika forskning. I motsetning til primære ECs, disse cellene kan genereres i nesten ubegrensede mengder med en stabil genotype og ved hjelp av Genova redigering teknikker, celler kan genereres som inkluderer gen Knockouts og knock-ins. Imidlertid, idet protokollene å skille ut ECs fra iPSC er relativt ny, det er en fremdeles uklarert hva innlede å iPSC-ECs det best reflektere primære ECs og hvilke under typer av EF er eller kan utviklet. Dessuten er det fortsatt gjenværende spørsmål om relevans deres. For eksempel gjør iPSC-ECs fortsatt viser plastisitet som er typisk for endothelial celler? Og i hvilken grad gjør iPSC-avledede celler reagerer på og samhandler med sine cellulære mikromiljøet? Den standardiserte plattformen som presenteres her kan brukes til å besvare noen av disse spørsmålene for å ytterligere validere bruken av iPSC-avledet ECs in vitro.

Den mest rett fram fremtiden retning for denne analysen vil være integreringen av andre celletyper som spiller en viktig rolle under angiogenese, slik som pericytes og makrofager. Dette vil lette evnen til å studere rollen til makrofager under anastomose mellom spirer eller overholdelse av pericytes etter kapillær dannelse. Dessuten er det mulig å kultur ulike andre celletyper innenfor eller mot en ekstracellulære matrise (f. eks, har vi vist kulturen av neurons og ulike epitel strukturer som proksimale tubuli og små tarmen), som kan kombineres med vaskulære senger generert ved hjelp av denne metoden. Til slutt vil det være interessant å studere angiogenic spirende i syntetiske hydrogeler, som deres definerte sammensetning ytterligere øker standardisering av analysen og tillater tuning av stivhet og bindende motiver som påvirker celle-matrise interaksjoner.

Som konklusjon, denne metoden viser muligheten for iPSC-avledet ECs i en standardisert og skalerbar 3D-angiogenic analysen som kombinerer fysiologiske relevante kultur forhold i en plattform som har den nødvendige robusthet og skalerbarhet for å bli integrert i stoffet screening infrastruktur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-10 μL Electronic repeater pipette	Sigma	Z654566-1EA
1 M HEPES	Gibco	15630-056
3-lane OrganoPlate	Mimetas	4003-400B
4% PFA in PBS	Alfa Aesar	J61899
Basal culture medium	NCardia
Collagen-1	Cultrex	3447-020-01
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL	VWR	613-2071
dPBS	Gibco	14190-094
Eppendorf Repeater M4 pieptte	VWR	613-2890
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F4759-1MG	1 mg/mL in milliQ water
HBSS	Gibco	14025-050
Hoechst	Molecular Probes	H3569	10 mg/mL solution in water
iPSC-derived endothelial cells	NCardia
NaHCO3	Sigma	S5761	37 g/L in milliQ water
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini	Mimetas		Rocker platform used to provide flow
Pen/Strep	Sigma	P4333
Phalloidin	Sigma	P1951	1 mg/mL in DMSO
PMA	Focus-Biomolecules	10-2165	2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO
S1P	Ecehelon Biosciences	S-2000	1 mM in methanol containing 1% acetic acid
TRITC-albumin	Invitrogen	A34786
VEGF	Peprotech	450-32-10	50 μg/mL in water containing 0.1% BSA